CN118028378A - 敲除小胶质细胞源性的vdbp基因的模型鼠及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠及其构建方法。该构建方法包括步骤：构建VDBPloxp/loxp基因鼠；将VDBPloxp/loxp基因鼠与Cre/ERT2基因鼠杂交，得到Cre+/‑‑VDBP+/+基因鼠，Cre/ERT2基因鼠的小胶质细胞中携带有Cre基因；诱导Cre+/‑‑VDBP+/+基因鼠中Cre基因表达，得到敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠。上述构建方法基于Cre‑loxP重组可特异性敲除模型鼠的小胶质细胞中维生素D结合蛋白，实现在小胶质细胞中特异性的敲减了维生素D结合蛋白基因的表达，敲减效率达到80%以上，有利于更加细致地研究该分子在脑中的功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠及其构建方法。
背景技术
维生素D结合蛋白 ( vitamin D binding protein，VBDP )含有4581个氨基酸残基，维生素D1具有高度亲和力，在血液中仅有51%的结合位点被占据，各种维生素D1与VBDP的结合能力不一。VBDP升高主要见于雌激素治疗后及妊娠。VBDP降低主要见于肾病综合征。现有的研究中在小鼠体内对维生素D结合蛋白基因进行了整体的敲减，不利于该VBDP在特定部位上的功能研究。
发明内容
基于此，本申请提供一种敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠及其构建方法。
一种敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠的构建方法，包括如下步骤：
构建VDBPloxp/loxp基因鼠；
将所述VDBPloxp/loxp基因鼠与Cre/ERT2基因鼠杂交，得到Cre+/-- VDBP+/+基因鼠，其中，所述Cre/ERT2基因鼠的小胶质细胞中携带有Cre基因；
诱导所述Cre+/-- VDBP+/+基因鼠中所述Cre基因表达，得到所述敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠。
上述构建方法基于Cre-loxP重组可以特异性敲除鼠模型的小胶质细胞中的维生素D结合蛋白，有利于更加细致地研究该分子在脑中的功能。经试验验证，构建的小鼠模型实现了在小胶质细胞中特异性的敲减了维生素D结合蛋白基因的表达，敲减效率达到了80%以上。
在其中一个实施例中，所述Cre/ERT2基因鼠为Cx3cr1tm2.1-cre/ERT2基因鼠，诱导所述Cre+/-- VDBP+/+基因鼠中Cre基因表达的步骤包括：向所述Cre+/-- VDBP+/+基因鼠注射tamoxifen。
在其中一个实施例中，构建所述VDBPloxp/loxp基因鼠的步骤包括：
将Cas9/sgRNA质粒和打靶载体通过显微注射至野生型鼠受精卵中，然后移植至假孕母鼠并产出获得F0代鼠；
将所述F0代鼠与野生型鼠交配繁育获得杂合子F1代鼠；
将所述杂合子F1代鼠进行交配繁育获得所述VDBPloxp/loxp基因鼠。
在其中一个实施例中，所述将Cas9/sgRNA质粒和打靶载体通过显微注射至野生型鼠受精卵中的步骤之前，还包括构建所述Cas9/sgRNA质粒的步骤：将sgRNA连接到携带有Cas9基因的载体中，得到所述Cas9/sgRNA质粒，其中，所述sgRNA有多条，多条所述sgRNA分别位于VDBP基因的第一内含子和第四内含子下游的非保守区中。
在其中一个实施例中，所述sgRNA有16条，在5’靶位点和3’靶位点区域分别设计8条所述sgRNA，5’靶位点区域设计的8条所述sgRNA对应的靶向序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.8所示，3’靶位点区域设计的8条所述sgRNA对应的靶向序列如SEQ ID NO.9-SEQ IDNO.16所示；
及/或，所述携带有Cas9基因的载体为pCS-4G载体。
在其中一个实施例中，所述sgRNA 分别设计在 EGE-YMX-011-A 基因 Intron1 和Intron4 下游的非保守区中，所述打靶载体为EGE-YMX-011-A LSCKO-2G-LR-A-RR，5'端同源臂的长度为1.7kb，3'端同源臂的长度为0.9kb。
在其中一个实施例中，获得所述F0代鼠的步骤之后，还包括对所述获得F0代鼠进行基因型鉴定的步骤：采用第一鉴定引物组合物对所述F0代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，以鉴定所述F0代鼠是否为阳性flox鼠，所述第一鉴定引物组合物包括碱基序列如SEQID NO.17-SEQ ID NO.20所示的引物。
在其中一个实施例中，获得所述杂合子F1代鼠的步骤之后，还包括对所述杂合子F1代鼠进行基因型鉴定的步骤：
采用第一鉴定引物组合物对所述杂合子F1代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，得到PCR检测结果，所述第一鉴定引物组合物包括碱基序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.20所示的引物；
根据所述PCR检测结果筛出为flox阳性的所述杂合子F1代鼠，然后进行Southernblot检测及测序，验证所述杂合子F1代鼠是否为阳性F1代flox鼠。
在其中一个实施例中，所述将杂合子F1代鼠进行交配繁育获得所述VDBPloxp/loxp基因鼠的步骤包括：
将所述杂合子F1代鼠进行交配繁育，得到Fn+1代鼠，n大于或等于1；
采用第二鉴定引物组合物对所述Fn+1代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，根据PCR扩增检测结果对所述Fn+1代鼠进行基因型鉴定，并筛出纯合子Fn+1代鼠，得到所述VDBPloxp/loxp基因鼠，其中，所述第二鉴定引物组合物包括包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对用于检测待鉴定鼠基因组中是否整合有5’端loxp位点，所述第二引物对用于检测所述待鉴定鼠基因组中是否整合有3’端loxp位点。
在其中一个实施例中，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.21-SEQ IDNo.22所示，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.23- SEQ ID No.24所示。
在其中一个实施例中，所述野生型鼠为C57BL/6N小鼠。
一种敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠，由上述的构建方法构建得到。
附图说明
图1为打靶载体示意图；
图2为Southern blot 筛选策略的示意图；
图3为precut pCS载体图谱；
图4为sgRNA的活性检测结果，其中：（a）为sgRNA1-sgRNA8活性检测图，（b）为sgRNA9- sgRNA16活性检测图；
图5为打靶载体图谱；
图6为酶切鉴定和测序检测结果；
图7为flox小鼠基因型检测的引物设计原则示意图；
图8为EGE-YMX-011-A-L-GT-F/cKO-5’-DO-F引物对对F0代小鼠的检测结果，其中：（a）、（b）为E7X11-0010基因5’端等位基因插入凝胶电泳检测图，（c）、（d）为E7X11-0025、E7X11-0027、E7X11-0033基因5’端等位基因插入凝胶电泳检测图，（e）、（f）为E7X11-0105基因5’端等位基因插入凝胶电泳检测图；
图9为cKO-3’-DO-R/EGE-YMX-011-A-R-GT-R引物对对F0代小鼠的检测结果，其中：（a）、（b）为E7X11-0010基因3’端等位基因插入凝胶电泳检测图；
图10为cKO-3’-DO-R/EGE-YMX-011-A-R-GT-R引物对对F0代小鼠的检测结果，其中：（a）、（b）为E7X11-0025、E7X11-0027、E7X11-0033基因3’端等位基因插入凝胶电泳检测图，（c）、（d）为E7X11-0105基因3’端等位基因插入凝胶电泳检测图；
图11为EGE-YMX-011-A-L-GT-F/cKO-5’-DO-F引物对对F1代小鼠的检测结果，其中：（a）、（b）为1E7X11-0001、1E7X11-0007、1E7X11-0009、1E7X11-0012基因5’端等位基因插入凝胶电泳检测图，（c）、（d）为1E7X11-0033基因5’端等位基因插入凝胶电泳检测图；
图12为cKO-3’-DO-R/EGE-YMX-011-A-R-GT-R引物对对F1代小鼠的检测结果，其中：（a）、（b）、（c）为1E7X11-0001 、1E7X11-0007、1E7X11-0009、1E7X11-0012、1E7X11-0033基因3’端等位基因插入凝胶电泳检测图；
图13为Southern blot检测结果，其中：（a）、（b）为1E7X11-0001 、1E7X11-0007、1E7X11-0009、1E7X11-0012、1E7X11-0033小鼠基因3’端与5’端Southern blot检测结果；
图14为野生型及突变型等位基因示意图；
图15为EGE-YMX-011-A-5’loxP-F/EGE-YMX-011-A-5’loxP-R引物对的PCR 产物的凝胶电泳图，其中：（a）、（b）为证明EGE-YMX-011-A-5’loxP-F/EGE-YMX-011-A-5’loxP-R引物对可有效鉴定1E7X11-0001、1E7X11-0007、1E7X11-0009、1E7X11-0012、1E7X11-0033小鼠5’端等位基因插入的凝胶电泳检测图；
图16为EGE-YMX-011-A-3’loxP-F/EGE-YMX-011-A-3’loxP-R引物对的PCR 产物的凝胶电泳图，其中：（a）、（b）为证明EGE-YMX-011-A-3’loxP-F/EGE-YMX-011-A-3’loxP-R引物对可有效鉴定1E7X11-0001、1E7X11-0007、1E7X11-0009、1E7X11-0012、1E7X11-0033小鼠3’端等位基因插入的凝胶电泳检测图；
图17为琼脂糖凝胶电泳所用 DNA marker；
图18为大小鼠的编码及标记规则示意图；
图19为通过流式细胞术筛选出了不同类型的神经细胞的检测结果图；
图20为将流式筛选出的细胞提RNA后进行RT-qPCR验证VDBP基因表达的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本申请一实施方式提供一种敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠的构建方法，包括如下步骤S110-S130：
S110、构建VDBPloxp/loxp基因鼠；
S120、将VDBPloxp/loxp基因鼠与Cre/ERT2基因鼠杂交，得到Cre+/-- VDBP+/+基因鼠，其中，Cre/ERT2基因鼠的小胶质细胞中携带有Cre基因；
S130、诱导Cre+/-- VDBP+/+基因鼠中Cre基因表达，得到敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠。
上述构建方法基于Cre-loxP重组可以特异性敲除鼠模型的小胶质细胞中的维生素D结合蛋白，有利于更加细致地研究该分子在脑中的功能。经试验验证，构建的小鼠模型实现了在小胶质细胞中特异性的敲减了维生素D结合蛋白基因的表达，敲减效率达到了80%以上。
在其中一些实施例中，Cre/ERT2基因鼠为Cx3cr1tm2.1-cre/ERT2基因鼠，诱导Cre+/-- VDBP+/+基因鼠中Cre基因表达的步骤包括：向Cre+/-- VDBP+/+基因鼠注射tamoxifen（即他莫昔芬）。
在其中一些实施例中，构建VDBPloxp/loxp基因鼠的步骤包括S111-S113：
S111、将Cas9/sgRNA质粒和打靶载体通过显微注射至野生型鼠受精卵中，然后移植至假孕母鼠并产出获得F0代鼠；
S112、将F0代鼠与野生型鼠交配繁育获得杂合子F1代鼠；
S113、将杂合子F1代鼠进行交配繁育获得所述VDBPloxp/loxp基因鼠。
分析VDBP 基因的结构，VDBP 基因的 Exon2-4可被flox。sgRNA 分别设计在VDBP基因 Intron1 和 Intron4 下游的非保守区中。
其中，将Cas9/sgRNA质粒和打靶载体通过显微注射至野生型鼠受精卵中的步骤之前，还包括构建Cas9/sgRNA质粒的步骤：将sgRNA连接到携带有Cas9基因的载体中，得到Cas9/sgRNA质粒，sgRNA有多条，多条sgRNA分别位于VDBP基因的第一内含子和第四内含子下游的非保守区中。
进一步地，sgRNA有16条，在5’靶位点和3’靶位点区域分别设计8条sgRNA，5’靶位点区域设计的8条sgRNA对应的靶向序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示，3’靶位点区域设计的8条sgRNA对应的靶向序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.16所示。
具体地，16条sgRNA对应的靶向序列如下表1：
表116条sgRNA对应的靶向序列
在一个具体示例中，携带有Cas9基因的载体为pCS-4G载体。
其中，sgRNA 分别设计在 EGE-YMX-011-A 基因 Intron1 和 Intron4 下游的非保守区中，所述打靶载体为EGE-YMX-011-A LSCKO-2G-LR-A-RR，5'端同源臂的长度为1.7kb，3'端同源臂的长度为0.9kb。
其中，获得F0代鼠的步骤之后，还包括对获得F0代鼠进行基因型鉴定的步骤：采用第一鉴定引物组合物对F0代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，以鉴定所述F0代鼠是否为阳性flox鼠，第一鉴定引物组合物包括碱基序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.20所示的引物。
具体地，第一鉴定引物组合物如下表2：
表2 第一鉴定引物组合物
其中，获得杂合子F1代鼠的步骤之后，还包括对杂合子F1代鼠进行基因型鉴定的步骤S1121-S1122：
S1121、采用第一鉴定引物组合物对杂合子F1代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，得到PCR检测结果。
第一鉴定引物组合物的描述详见上文，此处不再赘述。
S1122、根据PCR检测结果筛出为flox阳性的杂合子F1代鼠，然后进行Southernblot检测及测序，验证杂合子F1代鼠是否为阳性F1代flox鼠。
其中，将杂合子F1代鼠进行交配繁育获得VDBPloxp/loxp基因鼠的步骤包括S1131-S1132：
S1131、将杂合子F1代鼠进行交配繁育，得到Fn+1代鼠，n大于或等于1。
S1132、采用第二鉴定引物组合物对Fn+1代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，根据PCR扩增检测结果对Fn+1代鼠进行基因型鉴定，并筛出纯合子Fn+1代鼠，得到VDBPloxp/loxp基因鼠，其中，第二鉴定引物组合物包括包括第一引物对和第二引物对，第一引物对用于检测待鉴定鼠基因组中是否整合有5’端loxp位点，第二引物对用于检测所述待鉴定鼠基因组中是否整合有3’端loxp位点。
其中，第一引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.21-SEQ ID No.22所示，第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.23- SEQ ID No.24所示。
具体地，如SEQ ID No.21所示的序列：CAGCAGAGCCTGGAGCAGATTACAG；如SEQ IDNo.22所示的序列：CAACATGACCTGTGGTAAAGGCACT；如SEQ ID No.23所示的序列：TGGCATCATGGAGATGGTGGAAACA；如SEQ ID No.24所示的序列：CTGAAACTTGCAGCAATCCCCTGC。采用上述核酸组合物检测待鉴定鼠基因组中是否插入有等位基因位点，能够利用基因工程手段进行鼠基因型鉴定，快速且准确。
第一引物对和第二引物对的设计策略示意图如图14。图14中，箭头代表引物设计的位置及方向。从图14可知，第一引物对命名为EGE-YMX-011-A-5’loxP-F、EGE-YMX-011-A-5’loxP-R。第一引物对用于确认 5’端loxP位点是否已整合进基因组中，两条引物分别设计在一个loxP位点的两侧；对于杂合动物，使用这对引物进行 PCR 时会得到 2 个产物：野生型等位基因的 PCR 产物、突变型等位基因的 PCR 产物。所以使用这对引物能够区分动物的基因型：纯合子/杂合子/野生型。第二引物对命名为EGE-YMX-011-A-3’loxP-F、EGE-YMX-011-A-3’loxP-R。第二引物对用于确认 3’端loxP位点是否已整合进基因组中，两条引物分别设计在一个loxP位点的两侧；对于杂合动物，使用这对引物进行 PCR 时会得到 2 个产物：野生型等位基因的 PCR 产物、突变型等位基因的 PCR 产物。所以使用这对引物能够区分动物的基因型：纯合子/杂合子/野生型。
在其中一个实施例中，野生型鼠为C57BL/6N小鼠。需要说明的是，野生型鼠不限于为C57BL/6N小鼠，还可以为其他鼠模型。
Cre-loxP重组是一种特定位点的重组酶技术，可在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位，用该系统可以针对特定的细胞类型或采用特定的外部刺激，对细胞中DNA进行修改。在真核和原核系统中均适用。现有的研究中在小鼠体内对维生素D结合蛋白基因进行了整体的敲减，本研究利用Cre-loxP重组酶系统对小鼠小胶质细胞中的维生素D结合蛋白(Vitamin D Binding Protein，VDBP)进行了特异性敲除，有利于更加细致的研究该分子在脑中的功能。
已通过流式细胞术对小鼠的小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞细胞等进行筛选，而后进行RT-qPCR实验对维生素D结合蛋白基因的表达进行验证，结果证明本申请构建的小鼠模型实现了在小胶质细胞中特异性的敲减了维生素D结合蛋白基因的表达，敲减效率达到了80%以上。
以下为具体实施例。
实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1EGE-YMX-011-A flox模式小鼠的设计思路
1、打靶策略
EGE-YMX-011-A 基因在 5 号染色体反链上，全长 40.4 kb。Gene ID: 14473。分析EGE-YMX-011-A基因的结构，发现EGE-YMX-011-A基因的Exon2-4 可被flox。sgRNA 别设计在EGE-YMX-011-A基因Intron1和Intron4下游的非保守区中。5'端和 3'端的同源臂分别为 1.7kb 和 0.9kb。基于CRISPR/Cas9 开发的 EGE 系统制备模式小鼠。打靶载体示意图如图1。
2、Southern blot筛选策略
为了筛选到发生正确重组的基因打靶小鼠，我们采用 PCR 和 Southern blot方法验证，利用 3'Probe 和 LR Probe 验证 F1 代阳性小鼠。Southern blot 筛选策略的示意图如图2。
具体设计如下表3：
表3
利用NcoI和AseI作为 Southern blot 酶切位点。3’Probe 用于检测是否发生正确重组，若发生正确重组，将会出现野生型和突变型两个条带 LR Probe 用于检测是否含有随机插入，若没有随机插入，将会出现野生型和突变型两个条带。
实施例2 EGE-YMX-011-A flox模式小鼠的制备
1、CRISPR/sgRNA 设计及构建
（1）sgRNA 的设计
基于sgRNA的设计原则，在5’靶位点和3’靶位点区域分别设计8条sgRNA，其对应的靶向序列如表1，具体见上文，此处不再赘述。
（2）Cas9/sgRNA 质粒的构建
按照已设计sgRNA序列合成oligos，通过 Gibson 的方式连入pCS-4G 载体，连接产物转化后送样测序验证正确。precut pCS载体图谱如图3。
2、sgRNA 活性检测
采用现有通用的CRISPR/Cas9活性检测方法-UCATM方式进行。其具有无物种限制、高通量、适应性广、灵敏度高、简便性等优点。综合选择EGE-YMX-011-A-sgRNA1和EGE-YMX-011-A-sgRNA9进行下一步实验。sgRNA的活性检测结果如图4所示。
3、打靶载体的构建
根据实施例1的打靶策略，设计引物构建打靶载体，并通过酶切鉴定和测序，确认打靶载体构建完成。打靶载体图谱如图5所示。酶切鉴定和测序检测结果如图6所示。
4、受精卵显微注射
Cas9/sgRNA、打靶载体显微注射到小鼠受精卵中，注射后F0代小鼠出生情况如下表4所示。
表4
5、F0 代flox小鼠基因型鉴定
本申请使用 Cas9/sgRNA 注射受精卵的方法制备flox小鼠。由于受精卵注射方法得到 0代小鼠可能为嵌合体/杂合/纯合，以 F0代小鼠鼠尾进行基因型鉴定得到的 F0代鼠的基因型仅供参考，不能代表其一定为可遗传的基因突变型，可遗传的基因型需待 F1代小鼠基因型鉴定后确定。
flox小鼠基因型检测的引物设计原则如图7所示（用于检测是否正确重组）。引物的具体信息如上表2，此处不再赘述。PCR 反应条件(Touchdown)如下表5，PCR反应所用酶：KOD-FX。鉴定结果如图8-图10所示。图8为EGE-YMX-011-A-L-GT-F/cKO-5’-DO-F引物对对F0代小鼠的检测结果；图9为cKO-3’-DO-R/EGE-YMX-011-A-R-GT-R引物对对F0代小鼠的检测结果；图10为cKO-3’-DO-R/EGE-YMX-011-A-R-GT-R引物对对F0代小鼠的检测结果。
从图8-图10可以看出，通过 PCR 扩增及产物测序，表明 E7X11-0027 和 E7X11-0033 和为 F0代阳性flox小鼠。E7X3-0010, E7X11-0025，E7X11-0105 为 F0 代疑似 PCR阳性flox小鼠。
表5
6、F1 代小鼠基因型及 Southern blot 鉴定
选择部分上述 F0 代阳性小鼠与野生型小鼠交配得到 F1 代。交配结果如下表6。F1 代小鼠基因型鉴定引物设计原则与 F0 代基因型鉴定方法一样，鉴定结果如图11和图12。图11为EGE-YMX-011-A-L-GT-F/cKO-5’-DO-F引物对对F1代小鼠的检测结果；图12为cKO-3’-DO-R/EGE-YMX-011-A-R-GT-R引物对对F1代小鼠的检测结果。
从图11和图12可知，通过 PCR 鉴定，结果表明1E7X11-0001, 1E7X11-0007,1E7X11-0009, 1E7X11-0012和1E7X11-0033为 PCR 阳性 F1代flox小鼠。
表6
7、F1代 PCR 阳性小鼠 Southern blot 检测
提取部分上述 PCR 鉴定为阳性的 F1 小鼠鼠尾 DNA 进行 Southern blot 检测及测序（Southern blot筛选策略见实施例1）。Southern blot检测结果如图13所示。从图13可知，检测结果表明: 1E7X11-0001, 1E7X11-0007, 1E7X11-0009, 1E7X11-0012和1E7X11-0033 均为正确重组，且没有随机插入。
综上所述，1E7X11-0001, 1E7X11-0007, 1E7X11-0009, 1E7X11-0012 和1E7X11-0033均为 PCR 检测阳性，Southern blot 检测正确重组且无随机插入，测序正确，为阳性F1代flox小鼠。
实施例3
（一）阳性Fn+1代flox纯合子小鼠的交配方案：
将F1代杂合子小鼠（+/flox）进行自交，繁育的后代中，25%的纯合cKO小鼠（flox/flox），50%的杂合cKO小鼠（+/flox），25%的野生型小鼠。
（二）F1代和Fn+1代小鼠的基因型验证：
如无特别说明，以下所用试剂如表7所示。
表7 试剂清单
1、实验动物的信息如表8所示。
表 8：实验动物的信息
说明：
1）标记：标记的编号说明见“4 大小鼠的编码及标记规则”；
2）fl：flanked by loxP的缩写，指突变型等位基因；+：野生型等位基因。fl/+：杂合子基因型。
2、运输动物的基因型鉴定信息
用于基因型鉴定的组织样品来源于运输动物的尾巴，每只运输的动物至少将尾巴组织取样 2 次，提取基因组 DNA，进行基因型鉴定。设计能够鉴定野生型及突变型等位基因的 PCR 引物，用于区分动物的具体基因型：纯合/杂合/野生型
2.1 引物设计策略
第一引物对和第二引物对的设计策略示意图如图14。图14中，箭头代表引物设计的位置及方向。
从图14可知，第一引物对命名为EGE-YMX-011-A-5’loxP-F、EGE-YMX-011-A-5’loxP-R。第一引物对用于确认 5’端loxP位点是否已整合进基因组中，两条引物分别设计在一个loxP位点的两侧；对于杂合动物，使用这对引物进行 PCR 时会得到 2 个产物：野生型等位基因的 PCR 产物、突变型等位基因的 PCR 产物。所以使用这对引物能够区分动物的基因型：纯合子/杂合子/野生型。第二引物对命名为EGE-YMX-011-A-3’loxP-F、EGE-YMX-011-A-3’loxP-R。第二引物对用于确认 3’端loxP位点是否已整合进基因组中，两条引物分别设计在一个loxP位点的两侧；对于杂合动物，使用这对引物进行 PCR 时会得到 2 个产物：野生型等位基因的 PCR 产物、突变型等位基因的 PCR 产物。所以使用这对引物能够区分动物的基因型：纯合子/杂合子/野生型。
2.2 引物设计详细信息如表9，表9中，WT：野生型等位基因；Mut：突变型等位基因。
表9 引物及产物信息
3、DNA Marker
琼脂糖凝胶电泳所用 DNA marker如图17所示。
4、大小鼠的编码及标记规则
大小鼠的编码及标记规则示意图如图18。
4.1 标记规则说明如下
4.1.1 仔鼠出生 7 天左右，剪去不同脚趾的末节，通过不同脚趾的缺失排布以确定该鼠的编号。此法不需麻醉，只截去趾的末节以防指甲重长。
4.1.2 符号说明：前肢用字母 F（front leg）表示，后肢用字母 R（rear leg）表示。第 1 只鼠，标记为 R1；第 11 只鼠标记为 R10R1；第 51 只鼠标记为 F4R1。
4.1.3 用此方法结合鼠的 ID，可以标记所有剪尾巴的鼠，包括：F1 代鼠、F2代鼠……。
4.1.4 如果编号超过 100，将结合水平剪 1/3 右耳朵，编制 101-200 的鼠 ID时，遵循本标记规则的同时剪右耳，所以第 101 只鼠标记为 RR1；第 111 只鼠标记为RR10R1；第 151 只鼠标记为 RF4R1。
4.1.5 如果编号超过 200，将结合水平剪 1/3 左耳朵，编制 201-300 的鼠 ID时，遵循本标记规则的同时剪左耳，所以第 201 只鼠标记为 LR1；第 211 只鼠标记为LR10R1；第 251 只鼠标记为 LF4R1。
4.1.6 如果编号超过 300，将结合同时水平剪 1/3 左右耳朵，编制 301-400 的鼠ID时，遵循本标记规则的同时剪左右耳，所以第301只鼠标记为RLR1；第 311 只鼠标记为RLR10R1；第 351 只鼠标记为 RLF4R1。
4.1.7 如果编号超过 400，将结合同时剪右耳朵缺刻，编制 401-600 的鼠 ID时，遵循本标记规则的同时剪右耳缺刻，所以第 401 只鼠标记为 R 缺一 R1；第 411 只鼠标记为 R 缺一 R10R1；第 451 只鼠标记为 R 缺一 F4R1；第501 只鼠标记为 R 缺二 R1；第 511 只鼠标记为 R 缺二 R10R1；第 551只鼠标记为 R 缺二 F4R1。
4.1.8 如果编号超过 600，将结合同时剪左耳朵缺刻，编制 601-800 的鼠 ID时，遵循本标记规则的同时剪左耳缺刻，所以第 601 只鼠标记为 L 缺一 R1；第 611 只鼠标记为 L 缺一 R10R1；第 651 只鼠标记为 L 缺一 F4R1；第701 只鼠标记为 L 缺二 R1；第 711 只鼠标记为 L 缺二 R10R1；第 751只鼠标记为 L 缺二 F4R1。
4.1.9 如果编号超过 800，将结合同时剪右左耳朵缺刻，编制 801-1000 的鼠 ID时，遵循本标记规则的同时剪右左耳缺刻，所以第 801 只鼠标记为 RL缺一 R1；第 811 只鼠标记为 RL 缺一 R10R1；第 851 只鼠标记为 RL 缺一 F4R1；第 901 只鼠标记为 RL 缺二 R1；第 911 只鼠标记为 RL 缺二R10R1；第 951 只鼠标记为 RL 缺二 F4R1。
5. 鼠尾基因组 DNA 的提取
5.1 鼠尾裂解液的配制
鼠尾裂解液的组成及浓度见表10，鼠尾裂解液的配制体系示例如表11。
表 10：鼠尾裂解液的浓度
表 11：鼠尾裂解液配制体系（总体积：10 mL）
5.2 鼠尾基因组 DNA 的提取步骤
5.2.1 在仔鼠出生 7 天左右就可以开始剪尾，剪下来的尾巴长度为 0.5 cm，立即放入置于冰袋上的 1.5 mL 离心管中。
5.2.2 剪尾后建议立即开始鼠尾的裂解并提取基因组 DNA。如果当天不能裂解鼠尾，需要将剪下来的鼠尾置于-80℃冰箱。如果需要运输，运输过程中
也要保持低温状态，建议用干冰或冰块。
5.2.3 每管加入 500 μL配制好的裂解液（含 10 mg/mL 的蛋白酶 K 5 μL）。
5.2.4 放入 55℃的杂交炉中旋转，孵育过夜。
5.2.5 从杂交炉中取出离心管，在室温静置 10-15 min，使样品温度降至室温，将离心管颠倒混匀。
5.2.6 13000 rpm，室温离心 15 min。
5.2.7 吸取 400 μL上清至另一个新的离心管中。
5.2.8 加入等体积的异丙醇，立即温和地上下翻转，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀，室温下 12000 rpm 离心 10 min，弃上清。
5.2.9 往离心管中加入 700 μL冰冷的 75%乙醇漂洗，温和地上下翻转混匀。
5.2.10 12000 rpm，室温离心 5 min，弃上清，瞬离后，吸除残留液体。
5.2.11 在超净台中风干约 3-5 min。
5.2.12 用 50-100 μL Gibco 纯水(根据 DNA 量确定用水量)重悬，55℃溶解 2h，溶解过程中需颠倒混匀，保证 DNA 溶解完全。
5.2.13 检测 DNA 的浓度，取 100-200 ng 的 DNA 用做 PCR 的模板。
6、PCR反应
采用表9所示的引物对“5.2鼠尾基因组 DNA 的提取步骤”提取到的基因组DNA进行PCR反应。PCR 反应体系如表12。PCR 反应程序如表13。
表122xTaq Plus Master Mix(Dye Plus) DNA 聚合酶的 PCR 反应体系（总体积：20 μL）。
表 13：2xTaq Plus Master Mix(Dye Plus) DNA 聚合酶 PCR 反应程序
7、对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
检测结果如图15和图16所示。图15为EGE-YMX-011-A-5’loxP-F/EGE-YMX-011-A-5’loxP-R引物对的PCR 产物的凝胶电泳图；图16为EGE-YMX-011-A-3’loxP-F/EGE-YMX-011-A-3’loxP-R引物对的PCR 产物的凝胶电泳图；图15和图16中，使用2%的琼脂糖凝胶对DNA 进行电泳分离，PC：阳性对照样品的基因型为fl/+；WT：野生型对照样品的基因型为+/+；H2O：空白对照。
8、判断动物基因型的参考标准，如表14。
表14中，N：凝胶电泳未检测到预期长度的 PCR 产物；Y：凝胶电泳检测到预期长度的 PCR 产物；fl/fl：纯合子基因型；fl/+：杂合子基因型；+/+：野生型。
表 14：根据 2 组 PCR 产物的预期凝胶电泳结果判断动物的基因型
经鉴定，纯合子Fn+1代鼠即为VDBPloxp/loxp基因鼠。
实施例4 小胶质源性VDBP敲除小鼠的构建
将B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm2.1(cre/ERT2)Litt/WganJ基因鼠与上述实施例构建的VDBPloxp/loxp基因鼠进行杂交得到Cre+/-- VDBP+/+基因鼠。
向Cre+/-- VDBP+/+基因鼠腹腔注射75mg/kg的tamoxifen连续5天，注射后正常饲喂，得到小胶质源性VDBP敲除小鼠。
实施例5 构建的模型小鼠的维生素D结合蛋白基因切除情况检测
流式细胞术筛选与基因敲除鉴定：
取实施例4构建得到的小胶质源性VDBP敲除小鼠的脑组织制成单细胞悬液，使用BD FACSLyric流式分选系统对小胶质细胞进行筛选，首先通过圈门去除团块细胞后选择单细胞群，通过DAPI信号获得活细胞群，通过CD11bhi和 CD45low抗体信号区分小胶质细胞与巨噬细胞完成分选。快速提取小胶质细胞的RNA后逆转录为cDNA，使用荧光DNA结合染料，其荧光强度与PCR产物分子收集荧光信号强度成正比，通过将荧光强度与循环数作图，qPCR仪生成扩增曲线，其表示在整个PCR过程中产物的累积，通过这个过程，即可实现量化。实验结果如图19-图20所示。图19为通过流式细胞术筛选出了不同类型的神经细胞的检测结果图；图20为将流式筛选出的细胞提RNA后进行RT-qPCR验证VDBP基因表达的检测结果图。从图19和图20可知，通过流式细胞术对小鼠的小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞细胞等进行筛选，而后进行RT-qPCR实验对维生素D结合蛋白基因的表达进行验证，结果证明该小鼠实现了在小胶质细胞中特异性的敲减了维生素D结合蛋白基因的表达，敲减效率达到了80%以上。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.一种敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建VDBPloxp/loxp基因鼠；
将所述VDBPloxp/loxp基因鼠与Cre/ERT2基因鼠杂交，得到Cre+/- - VDBP+/+基因鼠，其中，所述Cre/ERT2基因鼠的小胶质细胞中携带有Cre基因；
诱导所述Cre+/- - VDBP+/+基因鼠中所述Cre基因表达，得到所述敲除小胶质细胞源性的VDBP基因的模型鼠。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述Cre/ERT2基因鼠为Cx3cr1tm2.1-cre/ERT2基因鼠，诱导所述Cre+/- - VDBP+/+基因鼠中Cre基因表达的步骤包括：向所述Cre+/- - VDBP+/+基因鼠注射tamoxifen。
3.根据权利要求1-2任一项所述的构建方法，其特征在于，构建所述VDBPloxp/loxp基因鼠的步骤包括：
将Cas9/sgRNA质粒和打靶载体通过显微注射至野生型鼠受精卵中，然后移植至假孕母鼠并产出获得F0代鼠；
将所述F0代鼠与野生型鼠交配繁育获得杂合子F1代鼠；
将所述杂合子F1代鼠进行交配繁育获得所述VDBPloxp/loxp基因鼠。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述将Cas9/sgRNA质粒和打靶载体通过显微注射至野生型鼠受精卵中的步骤之前，还包括构建所述Cas9/sgRNA质粒的步骤：将sgRNA连接到携带有Cas9基因的载体中，得到所述Cas9/sgRNA质粒，其中，所述sgRNA有多条，多条所述sgRNA分别位于VDBP基因的第一内含子和第四内含子下游的非保守区中。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA有16条，在5’靶位点和3’靶位点区域分别设计8条所述sgRNA，5’靶位点区域设计的8条所述sgRNA对应的靶向序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8所示，3’靶位点区域设计的8条所述sgRNA对应的靶向序列如SEQID NO.9-SEQ ID NO.16所示；
及/或，所述携带有Cas9基因的载体为pCS-4G载体。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述sgRNA 分别设计在 EGE-YMX-011-A 基因 Intron1 和 Intron4 下游的非保守区中，所述打靶载体为EGE-YMX-011-ALSCKO-2G-LR-A-RR，5'端同源臂的长度为1.7kb，3'端同源臂的长度为0.9kb。
7.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，获得所述F0代鼠的步骤之后，还包括对所述获得F0代鼠进行基因型鉴定的步骤：采用第一鉴定引物组合物对所述F0代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，以鉴定所述F0代鼠是否为阳性flox鼠，所述第一鉴定引物组合物包括碱基序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.20所示的引物。
8.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，获得所述杂合子F1代鼠的步骤之后，还包括对所述杂合子F1代鼠进行基因型鉴定的步骤：
采用第一鉴定引物组合物对所述杂合子F1代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，得到PCR检测结果，所述第一鉴定引物组合物包括碱基序列如SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.20所示的引物；
根据所述PCR检测结果筛出为flox阳性的所述杂合子F1代鼠，然后进行Southern blot检测及测序，验证所述杂合子F1代鼠是否为阳性F1代flox鼠。
9.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，将所述杂合子F1代鼠进行交配繁育获得所述VDBPloxp/loxp基因鼠的步骤包括：
将所述杂合子F1代鼠进行交配繁育，得到Fn+1代鼠，n大于或等于1；
采用第二鉴定引物组合物对所述Fn+1代鼠的基因组DNA进行PCR扩增检测，根据PCR扩增检测结果对所述Fn+1代鼠进行基因型鉴定，并筛出纯合子Fn+1代鼠，得到所述VDBPloxp /loxp基因鼠，其中，所述第二鉴定引物组合物包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对用于检测待鉴定鼠基因组中是否整合有5’端loxp位点，所述第二引物对用于检测所述待鉴定鼠基因组中是否整合有3’端loxp位点。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述第一引物对的核苷酸序列如SEQID No.21-SEQ ID No.22所示，所述第二引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.23- SEQ IDNo.24所示。
11.根据权利要求4-9任一项所述的构建方法，其特征在于，所述野生型鼠为C57BL/6N小鼠。
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| KR20220040573A (ko) * | 2020-09-23 | 2022-03-31 | 재단법인대구경북과학기술원 | 알츠하이머 동물모델 및 이의 용도 |
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