CN118028193A - 生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用 - Google Patents
生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118028193A CN118028193A CN202211414723.7A CN202211414723A CN118028193A CN 118028193 A CN118028193 A CN 118028193A CN 202211414723 A CN202211414723 A CN 202211414723A CN 118028193 A CN118028193 A CN 118028193A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rhamnolipid
- phosphoenolpyruvate carboxykinase
- microorganism
- recombinant microorganism
- pseudomonas aeruginosa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 82
- FCBUKWWQSZQDDI-UHFFFAOYSA-N rhamnolipid Chemical compound CCCCCCCC(CC(O)=O)OC(=O)CC(CCCCCCC)OC1OC(C)C(O)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 FCBUKWWQSZQDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 57
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims abstract description 74
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 74
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 claims description 52
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 31
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 18
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- PPMPLIBYTIWXPG-MSJADDGSSA-N L-rhamnosyl-3-hydroxydecanoyl-3-hydroxydecanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(CC(O)=O)OC(=O)CC(CCCCCCC)O[C@@H]1O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O PPMPLIBYTIWXPG-MSJADDGSSA-N 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101100463018 Mus musculus Pck1 gene Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 5
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 4
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 241000022319 bacterium PA3 Species 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000022320 bacterium PA4 Species 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000005067 remediation Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于微生物改造技术领域，具体涉及生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用。本发明提供的生产鼠李糖脂的重组微生物通过增强磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶或其突变体的表达，可以提高微生物的鼠李糖脂产量，并显著提高了李糖脂中双鼠李糖脂的占比。
Description
技术领域
本发明涉及微生物改造技术领域，具体涉及一种生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用，以及一种鼠李糖脂的生产方法。
背景技术
鼠李糖脂是由假单胞菌或伯克氏菌类产生的一种生物代谢性质的生物表面活性剂，同时也是一种研究时间最长、应用技术最为成熟的一种生物表面活性剂。相比于化学合成的表面活性剂，其具有更优秀的理化性质及环境友好等特点，被广泛应用于微生物采油、环境污染修复等工程中。
微生物合成的鼠李糖脂是由多种同系物组成的混合物，鼠李糖脂结构主要包括鼠李糖和具有不同碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸。根据鼠李糖个数的不同，鼠李糖脂分为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂，不同类型的鼠李糖脂具有不同的性质。在微生物强化采油中，单、双鼠李糖脂具有不同的界面活性、润湿性能、洗油效率等性质。另外，在医药领域，双鼠李糖脂在抗乳腺癌方面效果更佳。
发明内容
本发明目的在于提供一种生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用，旨在保证较高鼠李糖脂产量的基础上提高双鼠李糖脂的占比。
为了实现上述发明目的，本发明的发明人在研究中发现，如果增强磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达，进而加强糖异生作用，则有利于提高产鼠李糖脂的微生物的鼠李糖脂产量，并提高鼠李糖脂中双鼠李糖脂的占比。进一步地，通过对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶进行突变，并使微生物表达该磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体，可以进一步提高李糖脂中双鼠李糖脂的占比。
具体地，第一方面，本发明提供了一种生产鼠李糖脂的重组微生物，其磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶或其突变体的表达增强。
第二方面，本发明提供了一种重组微生物的构建方法，其包括：
提供微生物和表达载体；
以所述微生物的基因组为模板进行扩增，得到磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因；
将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因连接至所述表达载体，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体转入所述微生物中，得到重组微生物。
第三方面，本发明提供了所述重组微生物、所述构建方法构建得到的重组微生物在生产鼠李糖脂中的应用。
第四方面，本发明提供了一种鼠李糖脂的生产方法，其包括：
对所述重组微生物、所述构建方法构建得到的重组微生物进行发酵培养，得到鼠李糖脂。
第五方面，本发明提供了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
第六方面，本发明提供了一种重组载体，其包含所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体。
第七方面，本发明提供了所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体在生产鼠李糖脂中的应用。
本发明首次通过增强磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达来提高微生物的鼠李糖脂产量，并显著提高了鼠李糖脂中双鼠李糖脂的占比。同时，本发明还首次提供了磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体，表达该突变体的微生物的鼠李糖脂产量以及鼠李糖脂中双鼠李糖脂的占比可以进一步提高。
附图说明
图1为本发明实施例1所得磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因表达载体pUCP18-pepck示意图；
图2为实施例6中对原始铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC21100所产鼠李糖脂的组分分析结果；
图3为实施例6中对菌株PA3所产鼠李糖脂的组分分析结果；
图4为实施例6中对菌株PA4所产鼠李糖脂的组分分析结果。
具体实施方式
本发明实施例提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶是以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CICC(中国工业微生物菌种保藏中心)21100的基因组为模板，通过PCR扩增获得。本发明实施例提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体是以铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CICC 21100的基因组为模板，通过易错PCR扩增获得。具体地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO:3所示，编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
MTQANNAVYTDISAAQLVEEAIRRGEGELAANGSLVVRTGHRTGRSPVDRF
IVEEPSTKDAIAWGNINRPFPADKFDALWARVEAFNNAQDHFVSHVHVGSA
EAYYLPVKMTTATAWQNLFGRCLFIEPEQYNPAGKDEWQVLNVANFECVPE
RDGTNSDGCVILNFAQKKVLIAGMRYAGEMKKAMFSVQNFLLPERDVLPM
HCAANIGEAGDVTLFFGLSGTGKTTLSADESRYLIGDDEHGWGEGVVFNV
EGGCYAKCIDLSEKNEPVIWKAIKFGAVLENVVLDEERVPNYADDSLTQNS
RAAYPLEHVEKRSEKNLGGEPNAVIFLTCDLTGVLPPVSILNNEQAAYHFLS
GYTALVGSTEMGSGGGIKSTFSTCFGAPFFPRPAGVYAELLIKRIKAFGSKVY
LVNTGWTGGGYGVGKRFNIPTTRGVIAAIQSGALIGAETEHLEIINLDVPKA
VPGVETNLLNPRNTWADKAAYDEAAKGLAKQFIENFKKFEVSDAIKAAGP
QL
来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)：
atgacgcaagccaacaacgccgtgtacaccgatatcagcgccgcccaactggtagaagaagccattcgccgcggtg
agggcgaactggccgccaacggctcgctggtcgtacgtaccggccatcgcaccggccgttcgccggtcgaccgtttc
atcgtcgaagagccgagcaccaaggacgcgatcgcctggggcaacatcaaccgtccgttcccggccgacaagttcg
atgcgctgtgggcccgcgtggaagcgttcaacaacgcccaggaccatttcgtttcccatgttcatgtaggttccgccga
ggcttactacctgccggtgaagatgaccaccgctaccgcctggcagaatctgttcggccgttgcctgttcatcgagccg
gagcagtacaacccggccggcaaggacgagtggcaggtcctcaatgtcgccaacttcgaatgcgtgcccgagcgcg
acggcaccaactccgacggttgcgtgatcctcaatttcgcccagaagaaagtgctgatcgcaggcatgcgctatgccg
gcgagatgaagaaagccatgttctccgtgcagaacttcctgctgcccgagcgcgacgtgctgccgatgcactgcgctg
ccaacatcggcgaagcgggcgatgtgaccctgttcttcggcctgtccggcaccggcaagaccaccctgtccgccgat
gaaagccgttacctgatcggtgacgacgagcacggctggggcgagggcgtggtgttcaacgtcgaaggcggttgcta
tgccaagtgcatcgacctgtccgagaagaacgagccggtcatctggaaagccatcaagttcggcgccgtgctggaga
acgtggttcttgacgaagagcgcgtgcccaactacgccgatgacagcctgacccagaacagccgcgccgcctaccc
gctggagcacgtcgagaagcgttcggagaagaacctcggcggcgagcccaacgcggtgatcttcctgacctgcgac
ctgaccggcgtactgccgccggtatcgatcctgaacaatgagcaggcggcctaccacttcctgtccggctacaccgcg
ctggtcggctccaccgagatgggttccggcggcggtatcaagtcgaccttctccacctgcttcggtgctcctttcttcccg
cgtccggccggcgtttatgccgagctgctgatcaagcgcatcaaggccttcggctccaaggtctacctggtcaacactg
gctggaccggcggtggctacggcgtcggcaagcgcttcaacatcccgaccacccgtggcgtgatcgcggcgatcca
gagcggcgcgctgatcggcgcggaaaccgagcacctggagatcatcaacctggacgtgccgaaggccgttccggg
cgtcgagaccaatctgctcaacccgcgcaacacctgggctgacaaggctgcctacgacgaggcggcgaagggcctg
gccaagcagttcatcgaaaacttcaagaaattcgaggtttccgatgcgatcaaggccgccggcccgcagctgtaa
来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：
MTQANNAVYTDISAAQLVEEAIRRGEGELAANGSLVVRTGHRTGRSPVDRF
IVEEPSTKDAIAWGNINRPFPADKFDALWARVEAFNNAQDHFVSHVHVGSA
EAYYLPVKMTTATAWQNLFGRCLFIEPEQYNPAGKDEWQVLNVANFECVPE
RDGTNSDGCVILNFAQKKVLIAGMSYAGEMKKAMFSVQNFLLPERDVLPM
HCAANIGEAGDVTLFFGLSGTGKTTLSADESRYLIGDDEHGWGEGVVFNV
EGGCYAKCIDLSEKNEPVIWKAIKFGAVLENVVLDEERVPNYADDSLTQNS
RAAYPLEHVEKRSEKNLGGEPNAVIFLTCDLTGVLPPVSILNNEQAAYHFLS
GDTALVGSTEMGSGGGIKSTFSTCFGAPFFPRPAGVYAELLIKRIKAFGSKVY
LVNTGWTGGGYGVGKRFNIPTTRGVIAAIQSGALIGAETEHLEIINLDVPKA
VPGVETNLLNPRNTWADKAAYDEAAKGLAKQFIENFKKFEVSDAIKAAGP
QL
来源于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：
atgacgcaagccaacaacgccgtgtacaccgatatcagcgccgcccaactggtagaagaagccattcgccgcggtg
agggcgaactggccgccaacggctcgctggtcgtacgtaccggccatcgcaccggccgttcgccggtcgaccgtttc
atcgtcgaagagccgagcaccaaggacgcgatcgcctggggcaacatcaaccgtccgttcccggccgacaagttcg
atgcgctgtgggcccgcgtggaagcgttcaacaacgcccaggaccatttcgtttcccatgttcatgtaggttccgccga
ggcttactacctgccggtgaagatgaccaccgctaccgcctggcagaatctgttcggccgttgcctgttcatcgagccg
gagcagtacaacccggccggcaaggacgagtggcaggtcctcaatgtcgccaacttcgaatgcgtgcccgagcgcg
acggcaccaactccgacggttgcgtgatcctcaatttcgcccagaagaaagtgctgatcgcaggcatgagctatgccg
gcgagatgaagaaagccatgttctccgtgcagaacttcctgctgcccgagcgcgacgtgctgccgatgcactgcgctg
ccaacatcggcgaagcgggcgatgtgaccctgttcttcggcctgtccggcaccggcaagaccaccctgtccgccgat
gaaagccgttacctgatcggtgacgacgagcacggctggggcgagggcgtggtgttcaacgtcgaaggcggttgcta
tgccaagtgcatcgacctgtccgagaagaacgagccggtcatctggaaagccatcaagttcggcgccgtgctggaga
acgtggttcttgacgaagagcgcgtgcccaactacgccgatgacagcctgacccagaacagccgcgccgcctaccc
gctggagcacgtcgagaagcgttcggagaagaacctcggcggcgagcccaacgcggtgatcttcctgacctgcgac
ctgaccggcgtactgccgccggtatcgatcctgaacaatgagcaggcggcctaccacttcctgtccggcgacaccgc
gctggtcggctccaccgagatgggttccggcggcggtatcaagtcgaccttctccacctgcttcggtgctcctttcttccc
gcgtccggccggcgtttatgccgagctgctgatcaagcgcatcaaggccttcggctccaaggtctacctggtcaacact
ggctggaccggcggtggctacggcgtcggcaagcgcttcaacatcccgaccacccgtggcgtgatcgcggcgatcc
agagcggcgcgctgatcggcgcggaaaccgagcacctggagatcatcaacctggacgtgccgaaggccgttccgg
gcgtcgagaccaatctgctcaacccgcgcaacacctgggctgacaaggctgcctacgacgaggcggcgaagggcct
ggccaagcagttcatcgaaaacttcaagaaattcgaggtttccgatgcgatcaaggccgccggcccgcagctgtaa
本发明实施例还提供了一种重组载体，其包括编码所述葡萄糖脱氢酶突变体的核酸分子。具体地，所述重组载体包括克隆载体和表达载体，所述克隆载体用于复制相关序列，所述表达载体用于表达相关基因。在一些实施方案中，所述重组载体为pUCP18-△pepck。
本发明实施例还提供了一种生产鼠李糖脂的重组微生物，其磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶或其突变体的表达增强。
其中，增强所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶或其突变体的表达方法可以是通过在微生物原本表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基础上额外转入表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶或其突变基因的方式，从而使磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶高表达或过表达；还可以是通过增强启动子的方式提高磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶或其突变体的表达。在一些实施方案中，通过转入表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因或其突变基因的方式来增强磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的表达，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶可以是原始酶，也可以是原始酶的突变体，其中，所述原始酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在一些实施方案中，所述重组微生物为表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶或其突变体的细菌；优选地，所述重组微生物为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
在一些实施方案中，所述鼠李糖脂包括单鼠李糖脂和/或双鼠李糖脂。
相应地，本发明实施例还提供了一种重组微生物的构建方法，其包括：
(1)提供微生物和表达载体；
(2)以所述微生物的基因组为模板进行扩增，得到磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因；
(3)将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因连接至所述表达载体，得到重组表达载体；
(4)将所述重组表达载体转入所述微生物中，得到重组微生物。
具体地，步骤(1)中，所述微生物为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；更优选地，所述微生物为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100，即，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100作为出发菌株进行改造。
所述表达载体可以是本领域已知的适当的表达载体。在一些实施方案中，所述表达载体为pUCP18质粒。
步骤(2)中，微生物的基因组DNA的获得方法可以是本领域已知方法。在一些实施方案中，当所述微生物为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100时，根据其基因组DNA设计带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的引物pepck-F(如SEQ ID NO:5所示)和引物pepck-R(如SEQ ID NO:6所示)，进行磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因的扩增。
引物pepck-F(SEQ ID NO:5)：
5'-ggatcttccagagataagcttATGACGCAAGCCAACAACG-3'
引物pepck-R(SEQ ID NO:6)：
5'-ctgccgttcgacgatgaattcTTACAGCTGCGGGCCGGC-3'
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因扩增的反应体系如下：
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，循环30次，72℃，后延伸10分钟。
步骤(3)中，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因为原始磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pepck。在一些实施方案中，所得重组表达载体为pUCP18-pepck。
步骤(4)中，将所述重组表达载体(含有磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pepck的表达载体)转入所述微生物中的方法可以是本领域已知方法，包括但不限于电转化。
在制备得到所述重组表达载体(包含原始磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pepck的重组载体，在一些实施方案中为pUCP18-pepck)后，还进一步包括制备表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体的重组微生物的步骤。
具体地，本发明实施例提供了一种重组微生物的构建方法，其包括：
(1)提供微生物和表达载体；
(2)以所述微生物的基因组为模板进行扩增，得到磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因；
(3)将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因连接至所述表达载体，得到第一重组表达载体；
(4)将所述第一重组表达载体转入所述微生物中，得到第一重组微生物；
(5)以所述微生物的基因组为模板，进行易错PCR扩增，以获得磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因(△pepck)；
(6)将步骤(5)所得磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因连接至所述表达载体，得到第二重组表达载体；
(7)将含有磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因△pepck的所述第二重组表达载体转入所述微生物中，得到第二重组微生物。
具体地，步骤(1)至步骤(4)如上所述，此处不再赘述；其中，步骤(5)用于扩增的引物为引物pepck-F和引物pepck-R。
步骤(6)中，包含磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因△pepck的重组表达载体(第二重组表达载体)为pUCP18-△pepck。
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因扩增的反应体系如下：
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，循环30次，72℃，后延伸10分钟。
步骤(7)中，将所述重组表达载体(含有磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因△pepck的表达载体)转入所述微生物中的方法可以是本领域已知方法，包括但不限于电转化。
在一些实施方案中，所述第一重组表达载体包含原始磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因pepck，转入所述微生物后，经氨苄抗性筛选，得到第一重组微生物，该第一重组微生物高产鼠李糖脂。
在一些实施方案中，所述第二重组表达载体包含磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因△pepck，转入所述微生物后，经氨苄抗性筛选，建立磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突变体文库，再通过摇瓶筛选，得到第二重组微生物，该第二重组微生物高产鼠李糖脂。优选地，所述摇瓶筛选培养基配方为：大豆油40g/L、硝酸钠7.5g/L、蛋白胨5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.5g/L，加去离子水定容至1L。
在一些实施方案中，与改造之前的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC21100相比，所述第一重组微生物的鼠李糖脂产量提升7.88％，其中双鼠李糖脂占比提升40.94％。
在一些实施方案中，与改造之前的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC21100相比，所述第二重组微生物生产的鼠李糖脂中，双鼠李糖脂占比提升78.01％。
相应地，本发明实施例还提供了所述重组微生物(第一重组微生物和/或第二重组微生物)、所述构建方法构建得到的重组微生物在生产鼠李糖脂中的应用。
相应地，本发明实施例还提供了一种鼠李糖脂的生产方法，其包括：对所述重组微生物(第一重组微生物和/或第二重组微生物)、所述构建方法构建得到的重组微生物进行发酵培养，得到鼠李糖脂。
在一些实施方案中，所述发酵培养条件为：温度25-40℃，pH6.5-8.5，转速为300-600r/min，通气比为0.2-1.5，发酵周期为96-120h。
在一些实施方案中，所述发酵培养所用的发酵培养基包括如下组分：植物油100g/L、硝酸钠7.5g/L、蛋白胨5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.5g/L。其中，所述植物油可以为大豆油、玉米油、菜籽油、棕榈油等，优选大豆油。
在一些实施方案中，所述鼠李糖脂包括单鼠李糖脂和/或双鼠李糖脂。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用的进步性能显著地体现，以下通过实施例来举例说明上述技术方案。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子生物学领域常规的实验方法进行，包括但不限于M.R.格林所著《分子克隆实验指南》[Molecular Cloning:ALaboratory Manual]、Robert·F·Weaver所著《分子生物学》[Molecular Biology]等所述的实验方法，或按照试剂盒及仪器设备厂商所建议的实验方法。实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
实施例1：pUCP18-pepck载体的构建
(11)查找铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100的基因组，根据其DNA序列中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因的序列设计带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的引物pepck-F和pepck-R(其序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示)，进行磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因的扩增，扩增得到的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因的序列如SEQ ID NO:2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
反应体系为：
反应程序为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，循环30次，72℃，后延伸10分钟，4℃保存。
(12)以步骤(11)获得的PCR产物纯化后经HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶同时处理30min并纯化回收，与同样经过HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶处理的载体pUCP18经DNA连接酶16℃过夜连接，获得pUCP18-pepck载体。
实施例2：pepck基因过表达菌株的构建
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100感受态细胞制备：
(21)将菌株接种于2ml的LB培养基中30℃，200rpm过夜培养；
1)按照1％接种量，转接至50ml LB培养基中，30℃，200rpm培养至OD600为0.6左右；
2)将菌液8000rpm 4℃离心10min，取上清；
3)用30mL提前预冷的300mM的蔗糖溶液重悬，洗涤2-3次；
4)加入0.5ml的300mM的蔗糖溶液重溶，即完成铜绿假单胞菌感受态细胞制备。
(22)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100电转化：
1)取pUCP18-pepck载体约500ng与100μL铜绿假单胞菌感受态细胞混合，冰上静置10min；
2)将电转混合液转入电转杯中，电转条件25μF，200Ω，2.5kw，电击；
3)电击过后加入1ml LB培养基，转移至离心管中，30℃，100rpm培养2h；
4)涂布到含有氨苄抗性的LB平板上，30℃，过夜培养筛选获得铜绿假单胞菌pepck的过表达菌株PA3。
实施例3：pUCP18-△pepck载体的构建
(31)以以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100的基因组为模板，以引物pepck-F和pepck-R采用即用型易错PCR试剂盒(北京天恩泽基因科技有限公司)扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因：
反应体系为：
反应程序为：95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，61℃退火30秒，72℃延伸1.5分钟，循环30次，72℃，后延伸10分钟，4℃保存。
(32)将PCR产物纯化后经HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶同时处理30min并纯化回收，与同样经过HindⅢ和EcoRⅠ限制性内切酶处理的载体pUCP18经DNA连接酶16℃过夜连接即获得pUCP18-△pepck载体。
实施例4：
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100感受态细胞制备：
1)将菌株接种于2ml的LB培养基中30℃，200rpm过夜培养；
2)按照1％接种量，转接至50ml LB培养基中，30℃，200rpm培养至OD600为0.6左右；
3)将菌液8000rpm 4℃离心10min，取上清；
4)用30mL提前预冷的300mM的蔗糖溶液重悬，洗涤2-3次；
5)加入0.5ml的300mM的蔗糖溶液重溶，即完成铜绿假单胞菌感受态细胞制备。
(42)铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100电转化：
1)取pUCP18-△pepck载体约500ng与100μL铜绿假单胞菌感受态细胞混合，冰上静置10min；
2)将电转混合液转入电转杯中，电转条件25μF，200Ω，2.5kw，电击；
3)电击过后加入1ml LB培养基，转移至离心管中，30℃，100rpm培养2h；
4)涂布到含有氨苄抗性的LB平板上，30℃，过夜培养筛选，建立磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因突变体文库。
实施例5：高产鼠李糖脂菌株筛选
将氨苄抗性的LB平板上平板筛克隆子，转接至摇瓶培养基(大豆油40g/L，硝酸钠7.5g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.5g/L，加去离子水定容至1L)中，30℃、200rpm震荡培养6天。取发酵液8000rpm，常温离心10min，取上清，采用蒽酮法测定鼠李糖脂含量，其中鼠李糖脂的含量以鼠李糖含量乘以系数3.4。另取发酵液上清溶解于甲醇中，经0.45μm有机滤膜过滤后进行HPLC-RI分析。HPLC-RI的相关参数：进样量10μL，甲醇：0.1％甲酸水溶液＝8：2等度洗脱，柱温：40℃，1.0mL/min流速。分析鼠李糖脂组分。最终筛选得到1株双鼠李糖脂占比显著提升的突变菌株PA4。
以引物pepck-F和pepck-R为引物，以突变菌株PA4的基因组为模板，扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变基因后，送至上海生工进行测序。结果如SEQ ID NO:4所示，其中第532位胞嘧啶C被修饰为腺嘌呤A，第1072位腺嘌呤T被修饰为胞嘧啶G。其编码氨基酸序列如SEQID NO:3所示，其中第178位精氨酸被修饰为丝氨酸，第358位酪氨酸被修饰为天冬氨酸。
实施例6：
种子培养基：酵母粉15g/L，蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，加去离子水定容至1L。
发酵培养基：大豆油100g/L，硝酸钠7.5g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.5g/L，加去离子水定容定容至1L。
将铜绿假单胞菌CICC 21100、PA3和PA4分别接入种子培养基中，在30℃，200rpm振荡培养24h后，按10％(v/v)的接种量分别接入含有25L发酵培养基的50L发酵罐中，控制发酵温度为30℃，pH7.5，转速为500r/min，通入无菌空气，通气比为0.5，发酵120h，结束发酵。取发酵液，8000rpm，常温离心10min，取上清，采用蒽酮法测定鼠李糖脂含量，其中鼠李糖脂的含量以鼠李糖含量乘以系数3.4。取发酵液上清溶解于甲醇中，经0.45μm有机滤膜过滤后进行HPLC-RI分析。HPLC-RI的相关参数：进样量10μL，甲醇：0.1％甲酸水溶液＝8：2等度洗脱，柱温：40℃，1.0mL/min流速。分析鼠李糖脂组分。具体结果如下表：
| 发酵菌株 | 鼠李糖脂含量g/L | 双鼠李糖脂占比 |
| 铜绿假单胞菌CICC21100 | 69.8 | 49.88％ |
| 重组菌PA3 | 75.3 | 70.30％ |
| 重组菌PA4 | 75.7 | 88.79％ |
由上表可以看出，采用重组菌PA3进行发酵，鼠李糖脂产量提升7.88％，双鼠李糖脂占比提升40.94％；采用重组菌PA4进行发酵，双鼠李糖脂占比大幅提升78.01％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生产鼠李糖脂的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶或其突变体的表达增强。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述鼠李糖脂包括单鼠李糖脂和/或双鼠李糖脂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的重组微生物，其特征在于，所述重组微生物为表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的细菌；优选地，所述重组微生物为铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。
6.权利要求1-5任一项所述重组微生物的构建方法，其特征在于，包括：
提供微生物和表达载体；
以所述微生物的基因组为模板进行扩增，得到磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因；
将所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因连接至所述表达载体，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体转入所述微生物中，得到重组微生物。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因的序列如SEQ ID NO:2所示；所述微生物为表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的细菌；优选地，所述微生物为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；更优选地，所述微生物为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CICC 21100。
8.权利要求1-5任一项所述的重组微生物、权利要求6或7所述构建方法构建得到的重组微生物在生产鼠李糖脂中的应用。
9.一种鼠李糖脂的生产方法，其特征在于，包括：
对权利要求1-5任一项所述的重组微生物、权利要求6或7所述构建方法构建得到的重组微生物进行发酵培养，得到鼠李糖脂。
10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述鼠李糖脂包括单鼠李糖脂和/或双鼠李糖脂；所述发酵培养条件为：温度25-40℃，pH6.5-8.5，转速为300-600r/min，通气比为0.2-1.5，发酵周期为96-120h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211414723.7A CN118028193A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211414723.7A CN118028193A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118028193A true CN118028193A (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=90999242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211414723.7A Pending CN118028193A (zh) | 2022-11-11 | 2022-11-11 | 生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118028193A (zh) |
-
2022
- 2022-11-11 CN CN202211414723.7A patent/CN118028193A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109777793B (zh) | 一种gdsl脂肪酶、基因工程菌及其应用 | |
| CN106636020A (zh) | 短链脱氢酶的突变体、重组表达载体、基因工程菌和应用 | |
| WO2017133331A1 (zh) | 一株铜绿假单胞菌及其在生产蛋白酶中的应用 | |
| JP2022512771A (ja) | アオサ多糖リアーゼおよびそのコード遺伝子と応用 | |
| CN115960875A (zh) | 一种热稳定性提高的褐藻胶裂解酶的突变体酶 | |
| CN113637654A (zh) | 一种重组磷脂酶d突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用 | |
| KR101132839B1 (ko) | 로도박터 스페로이드의 하이드로게나제 또는 니트로게나제로 형질전환된 숙주세포 및 이들을 이용한 수소 생산방법 | |
| CN101250509B (zh) | 一种高温角质酶及其基因序列 | |
| CN118028193A (zh) | 生产鼠李糖脂的重组微生物及其构建方法和应用 | |
| CN105969751B (zh) | 一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用 | |
| CN104403969A (zh) | 一种可降解孔雀石绿的过氧化物酶及其制备方法 | |
| CN114085820A (zh) | 来源于Candida viswanathii的酮基泛解酸内酯还原酶 | |
| CN113913399A (zh) | 来源于Candida maltosa Xu316的酮基泛解酸内酯还原酶 | |
| CN118028192A (zh) | 一种重组工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN105112351B (zh) | 一种利用甘油发酵生产苯酚的工程菌株的构建方法及应用 | |
| CN114438000B (zh) | 一株铜绿假单胞菌及其构建方法与应用 | |
| CN114875003B (zh) | 一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用 | |
| AU2021100409A4 (en) | Recombinant low-temperature catalase, recombinant vector and engineered strain thereof | |
| CN111575258B (zh) | 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用 | |
| CN116875522B (zh) | 含有醇脱氢酶突变体基因的工程菌及其应用 | |
| CN110964704B (zh) | 羟基氧化酶cyb5a突变体与环系列产品的制备方法 | |
| CN110982831B (zh) | 基因AlgL23具有冷适应性的用途 | |
| CN114150036B (zh) | 一种用于制备光学纯的6-氟-色满-2-羧酸的连续双相分批拆分工艺 | |
| CN114164223B (zh) | 一种南极土壤来源的酯酶及其编码基因与应用 | |
| CN116855477A (zh) | 一种低温α-L-鼠李糖苷酶及其编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |