CN118028165B - 一株肠膜明串珠菌及其应用 - Google Patents

一株肠膜明串珠菌及其应用

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CN118028165B CN202410229738.9A CN202410229738A CN118028165B CN 118028165 B CN118028165 B CN 118028165B CN 202410229738 A CN202410229738 A CN 202410229738A CN 118028165 B CN118028165 B CN 118028165B
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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株肠膜明串珠菌及其应用。所述的肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，其菌株号为Lm10，已于2023年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29370。本发明所述的肠膜明串珠菌Lm10，其能够耐受高糖环境，可适用于含糖量高的食品发酵，能高效转化蔗糖高产葡聚糖，葡聚糖产量高达100.39g/L，可以作为良好的食品稳定剂。该菌株在应用于发酵饮品(发酵核桃乳、发酵胡萝卜汁、菌菇蛋白发酵奶、酸豆奶或发酵双蛋白奶)的生产中，改善了产品品质的同时，增强了产品的稳定性，在食品工业中具有广阔的应用前景。

Description

一株肠膜明串珠菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株肠膜明串珠菌及其应用。
背景技术
肠膜明串珠菌是一种G+C含量低于50％的乳酸菌，能够在发酵过程中产生柠檬酸、苹果酸等有机酸和芳香族化合物，并广泛应用于发酵食品，且肠膜明串珠菌肠膜亚种属于《可用于食品的菌种名单》目录中，具有广泛的应用前景。作为专一性的异型发酵乳酸菌，肠膜明串珠菌可以通过磷酸戊糖途径在葡萄糖代谢过程中产乳酸和二氧化碳，并生成多种风味化合物(双乙酰，乙偶姻，乙酸盐和2,3-丁二醇等)，从而改善产品质地和风味。肠膜明串珠菌作为产胞外多糖的典型代表益生菌菌株，最为熟知的就是利用蔗糖合成葡聚糖。肠膜明串珠菌在生长过程中可以合成葡聚糖蔗糖酶，后者以蔗糖为底物，在无其他受体的情况下，催化蔗糖分解生成与酶连接的D-葡萄糖基和果糖,然后将D-葡萄糖基转移到右旋糖酐残基上从而合成葡聚糖。在食品加工领域，葡聚糖(Dextran)及其它类型的胞外多糖均可用作食品添加剂，提高产品的粘度指标，改善食品品质；作为稳定剂，可以与水分子以及食品中其他组分发生作用，减弱蛋白质的脱水收缩作用，提高产品的稳定性。
蛋白含量高的乳制品和果蔬汁是一个复杂的体系，其中各类大分子之间的作用会使得产品稳定性变差，这些物质受体系的pH值、温度、离子强度等因素的影响，因此在产品制作过程中应选择适宜的工艺条件。胞外多糖是提高产品稳定性和品质的重要途径，因此筛选高产多糖、且生产多糖对产品稳定效果好的乳酸菌意义重大，且能够在食品工业中具有广阔的前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株肠膜明串珠菌。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述肠膜明串珠菌的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株肠膜明串珠菌，分类命名为Leuconostoc mesenteroides，菌株号为Lm10，已于2023年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29370，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
其中，所述的肠膜明串珠菌，其菌落形态呈白色，圆形，表面湿润，不透明，且在含有蔗糖的培养基上能产生粘性多糖。通过扫描电镜观察菌株表面形态，细胞呈现短杆状(图1)。并且该菌在发酵过程产生乳酸、乙酸、葡聚糖等产物。
其中，所述的肠膜明串珠菌，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述肠膜明串珠菌在发酵产葡聚糖中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的发酵，其发酵条件为：发酵温度为20～30℃，发酵时间为30～48h；其发酵培养基配方为：150～350g/L蔗糖，蛋白胨5～15g/L，K2HPO4 3～6g/L和NaCl1.5～3g/L。
优选的，所述的发酵，其发酵条件为：30℃发酵30h，其发酵培养基配方为：300g/L蔗糖，蛋白胨10g/L，K2HPO4 5g/L和NaCl 2g/L。
其中，所述的肠膜明串珠菌，其种子液接种于发酵培养基中的接种量为1％～4％v/v；优选的接种量为3％v/v。
其中，所述的肠膜明串珠菌在发酵产葡聚糖时还具有很强的耐高糖能力。
具体的，在30℃培养48h后，肠膜明串珠菌能在含300～400g/L蔗糖的发酵培养基中生长。
上述肠膜明串珠菌在制备发酵饮品中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的肠膜明串珠菌，其接种于发酵饮品中的菌体浓度为105～106CFU/mL。
其中，所述的发酵饮品为发酵核桃乳、发酵胡萝卜汁、菌菇蛋白发酵奶、酸豆奶或发酵双蛋白奶。
上述发酵饮品在发酵制备前，其对应的发酵原料(核桃乳、胡萝卜汁、菌菇蛋白奶、豆乳、双蛋白奶)需要经过预处理。
具体的，在本发明的实施例中，所述的核桃乳的预处理是将新鲜核桃仁去皮，每150kg核桃仁加入400kg 65℃纯净水进行打浆并过滤，并向滤渣中加入400kg 65℃纯净水进行二次打浆，过滤，弃去残渣并合并两次浆液，加入80kg蔗糖，加水定容至1000kg，并在65℃下25MPa均质2次，于100℃杀菌8min，冷却后得到核桃乳。
具体的，在本发明的实施例中，所述的胡萝卜汁的预处理是将新鲜胡萝卜清洗干净后切成1～2cm厚的薄片，沸水热烫3～5min后冷却，按料液比1:3加纯净水榨汁，并加入胡萝卜质量0.01％柠檬酸和0.1％抗坏血酸护色，0.05％果胶酶于50℃酶解2h以提高出汁率，得到胡萝卜浆。用60目滤网过滤，向得到的胡萝卜汁中添加4～10％蔗糖，于50℃下20MPa均质2次，95℃杀菌5min后冷却得到胡萝卜汁。
具体的，在本发明的实施例中，所述的菌菇蛋白奶的预处理是将菌菇蛋白粉(购于陕西天农生物科技公司)按照1:3～1:6(质量比)加入纯净水，并向其中加入2～8％蔗糖，经108℃灭菌20min得到菌菇蛋白奶。
具体的，在本发明的实施例中，所述的豆乳的预处理是将大豆浸泡后，沥干，加入大豆质量5～8倍的水进行磨浆，经过滤后得到生豆乳，向豆乳中加入0～8％蔗糖，经108℃灭菌20min得到熟豆乳。
具体的，在本发明的实施例中，所述的双蛋白奶的预处理是将大豆浸泡后，沥干，加入大豆质量5～8倍的水进行磨浆，经过滤后得到生豆乳，按照体积比1:0.4～1:3向豆乳中加入牛乳得到双蛋白奶，向双蛋白奶中加入2～8％蔗糖，经108℃灭菌20min得到热处理的双蛋白奶。
其中，所述的发酵核桃乳，其发酵处理条件为：25～32℃发酵6～10h，pH控制在4.5～4.7，冷却至15℃后，4000rpm搅拌10min，再110℃杀菌10～25s，20～35Mpa均质2～5次；所述的发酵胡萝卜汁，其发酵处理条件为：25～32℃发酵6～8h后，4℃冷藏10～12h；所述的菌菇蛋白发酵奶，其发酵处理条件为：26～32℃发酵6～10h后，4℃后熟10～12h；所述的酸豆奶，其发酵处理条件为：25～30℃发酵至pH 4.6～4.8，达到发酵终点，50rpm搅拌后，再4℃后熟10～12h；所述的发酵双蛋白奶，其发酵处理条件为：26～30℃发酵至pH 4.8，达到发酵终点。
上述肠膜明串珠菌在制备食品发酵剂中的应用也在本发明所保护的范围之内。
具体的，在本发明的实施例中，通过将肠膜明串珠菌的菌体按照5％(v/v)接种于10kg核桃乳中进行扩大培养，获得了一种肠膜明串珠菌数量达到107～108CFU/mL的核桃乳发酵剂。在制备发酵核桃乳时，将核桃乳发酵剂按照体积比1:100接种到核桃乳中再进行发酵制备核桃乳。
一种食品发酵剂，它包含了所述的肠膜明串珠菌，也在本发明所保护的范围之内。
有益效果：
1、本发明从桦树汁中分离筛选得到了一株肠膜明串珠菌Lm10，其能够耐受高糖环境，可适用于含糖量高的食品发酵。
2、本发明所述的肠膜明串珠菌Lm10能高效转化蔗糖，从而高产葡聚糖，提高产品的粘度指标，改善食品品质。
3、本发明所述的肠膜明串珠菌Lm10能提高发酵饮品(发酵核桃乳，发酵胡萝卜汁，菌菇蛋白发酵奶，豆酸奶和双蛋白酸奶)的稳定性，避免了外源稳定剂的添加，减少生产成本的同时也符合“清洁标签”的趋势。
4、本发明所述的肠膜明串珠菌Lm10能够提高发酵饮品(胡萝卜汁)的抗氧化性，提高了发酵产品的功能价值。
5、本发明还提供了一种食品发酵剂，其制备过程简单，在食品工业领域中具有广阔的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1肠膜明串珠菌Lm10的扫描电镜图片；
图2肠膜明串珠菌Lm10基因组图谱；
图3肠膜明串珠菌Lm10 COG功能注释；
图4肠膜明串珠菌Lm10 KEGG功能注释；
图5肠膜明串珠菌Lm10 CAZy功能注释；
图6蔗糖添加量对肠膜明串珠菌Lm10产葡聚糖含量的影响；
图7接种量对肠膜明串珠菌Lm10产葡聚糖含量的影响；
图8发酵温度对肠膜明串珠菌Lm10产葡聚糖含量的影响；
图9发酵时间对肠膜明串珠菌Lm10产葡聚糖含量的影响；
图10不同发酵时间下肠膜明串珠菌Lm10发酵核桃乳氨基态氮含量变化；
图11肠膜明串珠菌Lm10发酵胡萝卜汁储藏稳定性；
图12不同蔗糖添加量下肠膜明串珠菌Lm10发酵酸豆奶中葡聚糖含量变化；
图13不同蔗糖添加量下肠膜明串珠菌Lm10发酵酸豆奶保水力变化；
图14肠膜明串珠菌Lm10发酵豆酸奶中提取多糖的高效凝胶渗透色谱图；
图15肠膜明串珠菌Lm10发酵豆酸奶中提取多糖的单糖组成；
图16肠膜明串珠菌Lm10发酵豆酸奶中提取多糖的糖苷键组成；
图17肠膜明串珠菌Lm10与其他乳酸菌发酵双蛋白奶中多糖含量比较；
图18肠膜明串珠菌Lm10与其他乳酸菌发酵双蛋白奶保水性比较。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述的MRS液体培养基，其配方为：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏15g，酵母浸出粉5g，无水乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，K2HPO4·3H2O 2.62g，MnSO4·H2O 0.198g，MgSO4·7H2O 0.58g，吐温80 1.0mL，蒸馏水1L，pH 6.2～6.4。
实施例1菌株的分离、鉴定及其全基因组测序
1、菌株的分离：2021年8月16日从中国内蒙古采集桦树汁，利用梯度稀释平板法，吸取1mL桦树汁加入装有9mL生理盐水的无菌离心管中，震荡充分后，取1mL稀释液加入到装有9mL生理盐水的无菌离心管中，重复该步骤，得到10-3，10-4，10-5三个稀释梯度。取以上三个梯度的稀释液各100μL，分别涂布于MRS固体培养基上，置于30℃培养箱中培养2天。将单菌落挑出、编号后，用接种环接种到MRS液体培养基中，30℃培养24h后，甘油保藏。
2、菌株Lm10的鉴定
(1)形态特征与理化特性：Lm10菌落呈白色，圆形，表面湿润，不透明，且在含有蔗糖的培养基上能产生粘性多糖。通过扫描电镜观察菌株表面形态，细胞呈现短杆状(图1)。并且该菌在发酵过程产生乳酸、乙酸、葡聚糖等产物。
(2)分子生物学分析：根据HeroGen试剂盒(创英生物，MDP)说明分离得到的单菌基因组DNA，并以其为模板，利用通用引物对27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)PCR扩增菌株的16S rDNA基因片段(16S rDNA序列如SEQ IDNo.1所示)。将PCR产物送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并将测序结果在NCBI的Genbank数据库中(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，选择同源性较高的模式菌株16S rDNA序列，结果表明菌株Lm10同源性最高的菌株是Leuconostocmesenteroides。因此，鉴定菌株Lm10为Leuconostoc mesenteroides。
对菌株Lm10进行保藏，分类命名为：肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides，菌株号：Lm10，已于2023年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29370，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
3、肠膜明串珠菌Lm10的全基因组测序与分析
(1)全基因组测序：将培养的肠膜明串珠菌Lm10菌体送至南京集思慧远生物科技有限公司进行DNA提取。构建Illumina Novaseq 6000文库和Nanopore全基因文库，采用二代+三代测序技术对其基因组进行拼接，并利用生物信息学分析手段完成菌株的全基因组完成图绘制。结果发现，肠膜明串珠菌Lm10的全基因组有效序列长度为1932747bp，GC含量为37.67％，可以被翻译为蛋白质的编码序列区域CDS有1884个，rRNA和tRNA分别有12和71个。此外，肠膜明串珠菌Lm10还含有一个片段长度为45561bp的质粒，GC含量为33.76％。肠膜明串珠菌Lm10染色体图谱如图2所示。
(2)注释结果分析：基于COG数据库注释结果，肠膜明串珠菌Lm10有1504个基因得到注释，占总编码基因的79.83％，结果如图3所示。数量最多的是一般功能预测基因(General function prediction only)，其次为氨基酸的运输和代谢(Amino acidtransport and metabolism)，未知功能(function unknown)，翻译、核糖体结构和生物合成(translation,ribosomal structure and biogenesis)和碳水化合物运输和代谢(carbohydrate transport and metabolism)。使用KEGG通路对注释基因组进行功能分析如图4所示，共有1889个基因被注释，其中与碳水化合物代谢和氨基酸代谢相关的基因分别有132和114个，这是肠膜明串珠菌Lm10最丰富的基因。通过碳水化合物酶相关的专业数据库CAZy获得的注释结果，分析肠膜明串珠菌Lm10催化碳水化合物降解、修饰、以及生物合成的相关酶系家族(图5)，发现糖基转移酶(GT)相关基因有26个，糖基转移酶能够参与低聚糖和多糖的生产以及糖的生物合成过程，这些基因有助于促进肠膜明串珠菌Lm10胞外多糖的合成。此外，通过基因组注释从肠膜明串珠菌Lm10基因组上找到了三个葡聚糖蔗糖酶基因序列，分别命名为Gtf879，Gtf1674，和Gtf1679，对应的蛋白为Gtf879，Gtf1674和Gtf1679，相应的氨基酸序列如SEQ ID No.2～SEQ IDNo.4所示。
尽管菌株Lm10的16S rRNA序列与目前在NCBI上已经报道肠膜明串珠菌16SrRNA序列具有100％同源性，但根据Lm10全基因组序列和注释结果表明，Lm10菌株与其他肠膜明串珠菌菌株在基因组上存在差异，具有非常强的碳水化合物代谢能力和多糖合成能力。
实施例2肠膜明串珠菌Lm10产葡聚糖发酵条件的优化与耐高糖测试
本实施例通过优化蔗糖浓度、接种量、发酵温度和发酵时间优化肠膜明串珠菌Lm10产葡聚糖最佳发酵条件。
将肠膜明串珠菌Lm10接种于MRS液体培养基中，于30℃培养24h，再以3％(v/v)接种量转接到MRS液体培养基中，于30℃培养24h，得到Lm10种子液。后续将种子液接种于发酵培养基中进行发酵产葡聚糖。其中，发酵培养基配方为：蔗糖180g/L，蛋白胨10g/L，K2HPO45g/L和NaCl 2g/L。121℃高压灭菌20min。葡聚糖含量的测定方法如下：向10mL离心管中加入约50mg发酵液和3mL 80％乙醇溶液，沸水浴5min，然后再加入3mL乙醇溶液，混合均匀后，于10000g离心10min，向沉淀中加入5mL乙醇溶液重悬，离心后用4.5mL柠檬酸钠缓冲溶液(pH 5.5)溶解，沸水浴5min。冷却至室温后，加入葡聚糖酶和α-葡萄糖苷酶水解葡聚糖，水解48h后沸水浴终止反应。离心后测定上清液中葡萄糖的含量，即为发酵液中葡聚糖含量。
(1)当接种量为3％v/v，发酵温度为30℃，发酵时间为48h时，研究不同浓度蔗糖添加量(150g/L，200g/L，250g/L，300g/L，350g/L和400g/L)对葡聚糖产量的影响。由图6所示，随着蔗糖添加量的增加，葡聚糖含量呈现先增加后降低的趋势，当蔗糖添加量为300g/L时，葡聚糖产量最高，为95.27g/L。
(2)当蔗糖浓度为300g/L时，发酵温度为30℃，发酵时间为48h时，研究不同接种量(1％v/v，2％v/v，3％v/v，4％v/v和5％v/v)对葡聚糖产量的影响。由图7所示，随着接种量的上升，葡聚糖含量呈先上升后降低的趋势，当接种量为3％v/v时，葡聚糖产量达到最大，为95.27g/L。
(3)当蔗糖浓度为300g/L时，接种量为3％v/v，发酵时间为48h时，研究不同发酵温度(20℃，25℃，30℃，35℃和40℃)对葡聚糖产量的影响。由图8所示，随着发酵温度的上升，葡聚糖含量呈先上升后降低的趋势，当发酵温度为30℃时，多葡聚糖产量达到最大，为95.27g/L。
(4)当蔗糖浓度为300g/L时，接种量为3％v/v，发酵温度为30℃时，研究不同发酵时间(18h，24h，30h，36h，42h和48h)对葡聚糖产量的影响。由图9所示，随着发酵时间的增加，多糖产量呈先上升后趋于平稳，当发酵时间为30h时，葡聚糖产达到最大，为100.39g/L。
(5)肠膜明串珠菌Lm10耐高糖测试：比较肠膜明串珠菌Lm10、干酪乳杆菌Jm01、副干酪乳杆菌GD110、植物乳杆菌SR1-9在不同终浓度蔗糖添加量(150g/L，200g/L，250g/L，300g/L，350g/L和400g/L)条件下对微生物数量的影响，结果如表1所示。在30℃培养48h后，仅肠膜明串珠菌Lm10能在含300～400g/L蔗糖培养基中生长，其具有很强的耐高糖能力。
表1不同蔗糖浓度下乳酸菌的生长状况
注：“+++”表示乳酸菌生长数量多，菌液浑浊；“++”表示乳酸菌生长数量较多，浓度较大，菌液比较浑浊；“+”表示有少量的乳酸菌生长，菌液稍显浑浊；“-”表示乳酸菌不生长。
实施例3肠膜明串珠菌Lm10在发酵核桃乳中的应用
(1)制备核桃乳：将新鲜核桃仁去皮，每150kg核桃仁加入400kg 65℃纯净水进行打浆并过滤，并向滤渣中加入400kg 65℃纯净水进行二次打浆，过滤，弃去残渣并合并两次浆液，加入80kg蔗糖，加水定容至1000kg，并在65℃下25MPa均质2次，于100℃杀菌8min，冷却后得到核桃乳。
(2)肠膜明串珠菌Lm10发酵：将肠膜明串珠菌Lm10接种于MRS培养基中，于30℃活化2次，将清洗干净的菌体按照5％(v/v)体积接种于10kg核桃乳中进行扩大培养，使核桃乳中肠膜明串珠菌Lm10数量达到107～108CFU/mL得到核桃乳发酵剂。将核桃乳发酵剂按照体积比1:100接种到核桃乳中，菌体浓度达到105～106CFU/mL，30℃发酵8h，发酵液pH控制在4.6。将发酵后的核桃乳冷却至15℃，并在4000rpm的搅拌速度下剪切10min，使发酵核桃乳更加平滑均一。经超高温瞬时杀菌(110℃，15s)、均质(30MPa，2次)后得到发酵核桃乳。本产品无需添加额外的稳定剂，降低成本的同时，也符合目前产品“清洁标签”的趋势。
采用氢氧化钠甲醛电位滴定法测定发酵过程发酵核桃乳的氨基态氮含量的变化，测定方法参照氨基态氮含量参考GB 5009.235-2016《食品中氨基态氮的测定》中酸度计法进行测定，结果如图10所示。随发酵时间的延长，发酵核桃乳的氨基态氮含量呈整体上升的趋势。发酵8h后，氨基态氮含量由7.35mg/100mL上升到20.28mg/100mL，这表明发酵过程伴随着蛋白质降解和游离氨基酸的生成，且氨基态氮含量的升高丰富了核桃乳的香气成分，提高了其感官品质。
比较肠膜明串珠菌Lm10、干酪乳杆菌Jm01、副干酪乳杆菌GD110和植物乳杆菌SR1-9发酵核桃乳的感官得分，评分细则如表2所示，不同乳酸菌发酵制备发酵核桃乳的感官评价如表3所示。从表3可以看出，肠膜明串珠菌Lm10发酵核桃乳的外观、滋味、组织状态和香气明显优于其他乳酸菌，这主要是因为在发酵过程中，肠膜明串珠菌Lm10能产生葡聚糖，改善发酵核桃乳的滋味和组织状态；另一方面，肠膜明串珠菌发酵过程伴随着蛋白质降解，氨基态氮含量增高，提高了发酵核桃乳的香气成分。
表2发酵核桃乳评分细则
项目 评分标准 评分/分
外观(25分) 颜色均一一致，呈乳白色或白色微显灰色 18～25
颜色略不均匀，呈灰白色 10～17
颜色明显不均匀，呈灰色或青灰色 0～9
滋味(25分) 酸甜可口，稠厚适中 18～25
略酸或略甜，略有粘稠感 10～17
过酸或过甜，有糊口感 0～9
组织状态(25分) 细腻光滑，无分层、沉淀 18～25
组织略粗糙，无分层、沉淀 10～17
有分层、沉淀，组织粗糙 0～9
香味(25分) 具有浓郁的发酵核桃香气，无异味 18～25
核桃香稍淡，但无异味 10～17
核桃乳香气和发酵香气微弱，有明显异味 0～9
表3不同乳酸菌发酵制备发酵核桃乳的感官评价
外观 滋味 组织状态 香味
肠膜明串珠菌Lm10 24.07±1.21 23.20±1.06 24.73±0.28 21.27±0.76
干酪乳杆菌Jm01 19.94±0.79 18.23±0.62 16.38±0.51 20.14±0.83
副干酪乳杆菌GD110 21.87±1.22 16.47±1.37 15.52±0.84 18.95±1.15
植物乳杆菌SR1-9 16.04±0.83 17.69±1.08 16.83±1.22 17.82±0.85
实施例4肠膜明串珠菌Lm10在发酵胡萝卜汁中的应用
(1)制备胡萝卜汁：将新鲜胡萝卜清洗干净后切成1～2cm厚的薄片，沸水热烫3～5min后冷却，按料液比1:3加纯净水榨汁，并加入胡萝卜质量0.01％柠檬酸和0.1％抗坏血酸护色，0.05％果胶酶于50℃酶解2h以提高出汁率，得到胡萝卜浆。用60目滤网过滤，向得到的胡萝卜汁中添加6％蔗糖，于50℃下20MPa均质2次，95℃杀菌5min后冷却。
(2)肠膜明串珠菌Lm10发酵：将肠膜明串珠菌Lm10在MRS培养基中活化2次，活化的菌株以2％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基中，30℃培养24h。将肠膜明串珠菌Lm10培养液5000rpm离心5min获得菌体沉淀，用无菌水清洗5次后接种于冷却的胡萝卜汁中，使胡萝卜汁中菌体浓度为105～106CFU/mL。胡萝卜汁于30℃发酵6h后置于4℃冷藏12h，即得到发酵胡萝卜汁。
比较不同储藏期发酵胡萝卜汁的稳定性，试验方法如下：向离心管中称取40g发酵胡萝卜汁，于4000rpm离心30min，称取沉淀物质量，离心沉淀率＝(离心沉淀物质量/发酵饮料质量)×100％。由于离心沉淀率与稳定性成反比，则计算离心沉淀率即可得到发酵胡萝卜汁稳定性。如图11所示，肠膜明串珠菌Lm10发酵胡萝卜汁在储藏12个月内能够保持较好的稳定性，这主要是由于发酵过程产生的葡聚糖能够起到增稠和稳定的作用。
比较发酵前后胡萝卜汁的抗氧化情况，由表4可知，肠膜明串珠菌Lm10发酵后的胡萝卜汁的DPPH和ABTS自由基清除能力显著提高，抗氧化活性增强，这可能是因为发酵使氨基酸转氨生成α-酮酸，进一步降解产生醛类、多酚类和羧酸等抗氧化活性物质。
表4肠膜明串珠菌Lm10发酵前后胡萝卜汁的自由基清除能力比较
DPPH自由基清除率 ABTS自由基清除率
发酵前 85.36±2.38a 82.19±1.55a
发酵后 72.83±3.01b 70.91±2.73b
实施例5肠膜明串珠菌Lm10在菌菇蛋白发酵奶中的应用
(1)制备菌菇蛋白奶：将菌菇蛋白粉(购于陕西天农生物科技公司)按照1:4(质量比)加入纯净水，并向其中加入2～8％蔗糖，经108℃灭菌20min得到菌菇蛋白奶。
(2)肠膜明串珠菌Lm10发酵：将肠膜明串珠菌Lm10接种于MRS培养基中活化2次，菌株以2％(v/v)接种量接种于MRS液体培养基中，30℃培养24h后，5000rpm离心5min获得菌体沉淀，用无菌水清洗3次。向冷却的菌菇蛋白奶中加入肠膜明串珠菌Lm10菌体，使菌体浓度为105～106CFU/mL。将其于30℃发酵7h，再4℃后熟12h，得到成品菌菇蛋白发酵奶。
比较肠膜明串珠菌Lm10、干酪乳杆菌Jm01、副干酪乳杆菌GD110和植物乳杆菌SR1-9菌菇蛋白发酵奶的感官得分，评分细则如表5所示，不同乳酸菌发酵制备菌菇蛋白发酵奶感官评价如表6所示。从表6可以看出，肠膜明串珠菌Lm10菌菇蛋白发酵奶的色泽、滋味、组织状态和香气明显优于其他乳酸菌，这主要是因为在发酵过程中肠膜明串珠菌Lm10能产生葡聚糖改善菌菇蛋白发酵奶的组织形态，减少乳清析出；另一方面肠膜明串珠菌Lm10可以通过磷酸戊糖途径在葡萄糖代谢过程中产生双乙酰类等多种风味物质，为产品带来了独特风味。
表5菌菇蛋白发酵奶评分细则
项目 评分标准 评分/分
色泽(25分) 乳白色，色泽均匀 20～25
乳白偏黄，色泽均匀 10～19
颜色偏暗，色泽不均匀 0～9
滋味(25分) 口感细腻润滑，无苦涩 20～25
口感较好，无苦涩 10～19
口感粗糙，有异味 0～9
组织状态(25分) 组织光滑，无分层、沉淀 20～25
组织略粗糙，无分层、沉淀 10～19
有分层、沉淀，组织粗糙 0～9
香味(25分) 具有浓郁的发酵香气，无异味 20～25
香味稍淡，但无异味 10～19
香气微弱，有明显异味 0～9
表6不同乳酸菌发酵制备菌菇蛋白发酵奶的感官评价
色泽 滋味 组织状态 香味
肠膜明串珠菌Lm10 18.37±1.05 20.54±1.20 23.91±0.61 20.40±0.50
干酪乳杆菌Jm01 15.23±0.82 15.84±1.24 16.92±0.55 18.76±0.84
副干酪乳杆菌GD110 16.45±1.38 17.42±0.48 15.63±0.93 18.59±0.37
植物乳杆菌SR1-9 15.19±0.67 10.32±0.34 17.36±1.32 16.39±0.73
实施例6肠膜明串珠菌Lm10在发酵酸豆奶中的应用
(1)制备豆乳：大豆浸泡后，沥干，加入大豆质量6倍的水进行磨浆，经过滤后得到生豆乳，向豆乳中加入0～8％蔗糖，经108℃灭菌20min得到熟豆乳。
(2)肠膜明串珠菌Lm10发酵：将肠膜明串珠菌Lm10接种于MRS培养基中活化2次，菌株以2％(v/v)接种量于MRS液体培养基中，30℃培养24h后，5000rpm离心5min获得菌体沉淀，用无菌水清洗3次。向冷却的熟豆乳中加入肠膜明串珠菌Lm10菌体，使熟豆乳中菌体浓度为105～106CFU/mL。将其于30℃发酵至pH 4.8，达到发酵终点，获得酸豆乳。酸豆乳冷却后搅拌(50rpm)，再4℃后熟12h，得到成品酸豆奶。
比较不同蔗糖添加量下(0％、2％、4％、6％、8％)葡聚糖含量变化，如图12所示。随着蔗糖添加量的增加，发酵豆酸奶中葡聚糖的含量也随之增加。蔗糖的添加不仅有利于肠膜明串珠菌Lm10的生长，而且还可以将蔗糖作为葡聚糖合成的底物。
保水能力是酸奶的一项重要质量指标，图13为加入不同蔗糖量的发酵豆酸奶持水力变化图。发酵豆酸奶的持水力在87.00～100.00％之间，这与原位合成的葡聚糖有关。乳酸发酵过程中产生的这些多糖可以缓解豆酸奶的乳清分离，这主要与葡聚糖高水结合能力以及葡聚糖-大豆蛋白网络结构的形成有关。此外，发酵豆酸奶保水能力的提高能够抵抗运输、储存和处理过程中的机械损伤。
从肠膜明串珠菌Lm10发酵酸豆奶中提取多糖，并对其单糖组成、分子量和糖苷键组成进行测定。
多糖的提取和纯化：肠膜明串珠菌Lm10发酵酸豆奶用无菌去离子水稀释。在4℃，12000g离心15min得到含有多糖的上清液。通过加入80％(w/v)的三氯乙酸使上清液终浓度为4％(w/v)，并在4℃下放置6～8h以沉淀蛋白质。4℃，12000g离心15min除去蛋白质。使用0.45μm膜过滤器过滤上清液，并添加三倍体积的95％(v/v)乙醇，在4℃下冷藏过夜，4℃，12000g离心15min获得多糖沉淀。将沉淀的多糖溶解于去离子水中，于8000～14000Da透析48h(4℃)，然后冷冻干燥。将纯多糖通过DEAE 52纤维素的阴离子交换色谱柱和SephadexG-100凝胶色谱柱进行分离、洗脱，得到纯化的多糖。
单糖组成测定：使用2M三氟乙酸(TFA)于120℃水解多糖样品。加入甲醇，进行蒸馏除去多余的TFA，重复三次。通过PMP衍生化将所得水解产物转化为其衍生物。然后，将水解产物通过0.22μm有机膜过滤并注入HPLC系统。通过对比单糖标准品的出峰时间和峰面积，测定多糖的单糖组成和摩尔比。
分子量测定：将多糖溶液通过Shodex OHpak系列SB 806HQ柱，柱温保持在40℃，并用0.02w/v NaN3的去离子水以1.0mL/min的流速洗脱。根据其各自分子量的对数绘制洗脱体积，根据葡聚糖标准曲线，以确定多糖的分子量。
糖苷键组成的测定：将完全干燥的样品溶解在1mL二甲基亚砜中，并在氮气环境下超声30min。加入10.0mg NaOH干燥粉末并超声20min。然后加入0.3mL CH3I，并在18～20℃下通过超声30min。用1.0mL 4mmol/L Na2S2O3溶液停止反应，提取反应产物并用氯仿收集。然后，使用2M TFA在120℃下水解2h，使甲基化样品完全水解。然后，用10mg/mL NaBH4还原甲基化组分，再用4M乙酸溶液中和。将反应溶液蒸发至干燥，并在120℃下用吡啶乙酸酐(1:1v/v)乙酰化30min。最后，使用气相色谱联合质谱分析甲基化的醛醇乙酸酯，并确定多糖的糖苷键组成。
如图14所示，酸豆奶中多糖的高效凝胶渗透色谱图呈现单峰，且尖锐对称，表明该提取的多糖具有良好的均一性，分子量约为1.97×106Da。图15为PMP衍生化后的单糖标准品和酸豆奶中多糖的HPLC色谱图，结果表明酸豆奶中提取的多糖单糖组成为葡萄糖。(注：Man：甘露糖；Rib：核糖；Rha：鼠李糖；GlcA：葡萄糖醛酸；GalA：半乳糖醛酸；Glc：葡萄糖；Gal：半乳糖；Xyl：木糖；Ara：阿拉伯糖；Fuc：果糖)。基于单糖组成，通过多糖的甲基化分析了酸豆奶中多糖的糖苷键链接方式。如图16所示，酸豆奶中提取的多糖中只存在一种糖苷键，为α-1,6糖苷键(即图中标注的→6)-Glcp-(1→)。
实施例7肠膜明串珠菌Lm10在发酵双蛋白奶中的应用
(1)制备双蛋白奶：大豆浸泡后，沥干，加入大豆质量6倍的水进行磨浆，经过滤后得到生豆乳，按照体积比1:1向豆乳中加入牛乳得到双蛋白奶，向双蛋白奶中加入4％蔗糖，经108℃灭菌20min得到热处理的双蛋白奶。
(2)肠膜明串珠菌Lm10发酵：将肠膜明串珠菌Lm10接种于MRS培养基中活化2次，菌株以2％(v/v)接种量于MRS液体培养基中，30℃培养24h后，5000rpm离心5min获得菌体沉淀，用无菌水清洗3次。向冷却的双蛋白奶加入肠膜明串珠菌Lm10菌体，使双蛋白奶中菌体浓度为105～106CFU/mL。将双蛋白奶于30℃发酵至pH4.8，达到发酵终点，得到成品发酵双蛋白奶。
按照肠膜明串珠菌Lm10发酵双蛋白奶的方法，分别采用干酪乳杆菌Jm01，副干酪乳杆菌GD110和植物乳杆菌SR1-9发酵双蛋白奶，并比较各个乳酸菌发酵制得的双蛋白奶的多糖含量和保水性。如图17和图18所示，在4种乳酸菌发酵双蛋白奶中，肠膜明串珠菌Lm10在双蛋白奶中产多糖含量最高，保水性更强，具有更好的稳定性。
本发明提供了一株肠膜明串珠菌及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一株肠膜明串珠菌，分类命名为Leuconostoc mesenteroides，菌株号为Lm10，已于2023年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.29370；
其中，所述的肠膜明串珠菌，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其基因组上有3个正常表达的葡聚糖蔗糖酶编码基因，分别为Gtf879、Gtf1674和Gtf1679，其编码基因相应蛋白的氨基酸序列依次如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。
2.权利要求1所述的肠膜明串珠菌在发酵产葡聚糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵，其发酵条件为：发酵温度20～30℃，发酵时间30～48h；其发酵培养基配方为：150～350g/L蔗糖，蛋白胨5～15g/L，K2HPO43～6g/L和NaCl 1.5～3g/L。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肠膜明串珠菌，其种子液接种于发酵培养基中的接种量为1％～4％v/v。
5.权利要求1所述的肠膜明串珠菌在制备发酵饮品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肠膜明串珠菌，其接种于发酵饮品中的菌体浓度为105～106CFU/mL。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的发酵饮品为发酵核桃乳、发酵胡萝卜汁、菌菇蛋白发酵奶、酸豆奶或发酵双蛋白奶。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的发酵核桃乳，其发酵处理条件为：25～32℃发酵6～10h，pH控制在4.5～4.7，冷却至15℃后，4000rpm搅拌10min，再110℃杀菌10～25s，20～35Mpa均质2～5次；所述的发酵胡萝卜汁，其发酵处理条件为：25～32℃发酵6～8h后，4℃冷藏10～12h；所述的菌菇蛋白发酵奶，其发酵处理条件为：26～32℃发酵6～10h后，4℃后熟10～12h；所述的酸豆奶，其发酵处理条件为：25～30℃发酵至pH 4.6～4.8，达到发酵终点，50rpm搅拌后，再4℃后熟10～12h；所述的发酵双蛋白奶，其发酵处理条件为：26～30℃发酵至pH 4.8，达到发酵终点。
9.权利要求1所述的肠膜明串珠菌在制备食品发酵剂中的应用。
10.一种食品发酵剂，其特征在于，它包含了权利要求1所述的肠膜明串珠菌。
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