CN118022384B - 一种尿皮质醇萃取组合物、萃取方法与萃取装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种尿皮质醇萃取组合物、萃取方法与萃取装置，萃取方法包括如下步骤：推动尿皮质醇萃取装置的套环在内管体上移动，直至套环封堵出液孔；在尿皮质醇萃取装置的内套管内依次加入萃取液、空心浮球与待测标本，然后将内套管进行涡旋震荡；在外套管内加入生理盐水，然后将震荡后的内套管插入外套管中，并向下按压内套管，套环的底部接触限位台后停止移动，继续按压内套管直至出液孔露出，萃取液从出液孔流出至外套管中后萃取完成。本发明所述的尿皮质醇萃取方法采用双重管结构的萃取装置进行萃取，极大简化上机检测前的萃取实验步骤，并提升萃取精度和效果。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，尤其是涉及一种尿皮质醇萃取组合物、萃取方法与萃取装置。
背景技术
血液中的皮质类固醇会与类固醇结合蛋白结合，仅有10 %为游离状态且能发挥生物学功能。尿皮质醇（Cor）是血游离的皮质醇经肾小球过滤而来，其含量与血液中发挥生理功能的游离皮质醇浓度及其变化成正相关。24 h尿皮质游离皮质醇（Urinary FreeCortisol, UFC）相对不受昼夜节律变化影响，更能精准反映肾上腺皮质功能，是诊断皮质醇增多症的最可靠指标。
UFC的检测目前依赖于2种方法学：免疫法与质谱法。免疫法中较常用的是自动化化学发光（Chemiluminescence Immunoassay, CLIA）免疫测定。质谱法中最先进技术是液相色谱-串联质谱法（Liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)，但该方法中串联质谱仪结构复杂，且对环境的温度、湿度等要求高，维护成本高。质谱仪是高精密仪器，在实验室使用时要经过专门培训的技术职员才能操纵质谱仪，整体检测速度慢，而且功能复杂，影响分析工作的效率，LC-MS/MS的临床应用还受到标准化方案不规范以及缺乏临床证明的单一参考范围或诊断临界值的阻碍，因此，其在国内UFC的临床检测中尚未得到推广。
虽有观点认为Cor萃取-化学发光法（Chemiluminescence Immunoassay, CLIA）检测尿皮质醇受萃取步骤干扰，应逐渐用LC-MS/MS替代；但主流实验室还以该方法为主，关键是它仍然保持成本低、通量高、重复性好等诸多优点。可使用检测其他内分泌激素项目的多功能免疫发光分析仪，无需为其单独另购仪器。但需要提前对尿标本进行萃取，且这一过程暂未实现全自动化，萃取过程难免受诸多影响因素干扰，对结果造成一定影响，目前临床也尚无公认的理想萃取方法。
现有技术中，技术人员多采用较为传统的二氯甲烷液相萃取-化学发光检测法：大致步骤为：（1）取24 h尿0.5 mL与二氯甲烷1 mL混于干净的玻璃管中；（2）涡旋振荡仪上振荡5 min，离心5 min（3000 rpm/min）；（3）取下层400 μL于玻璃空管中水浴锅内挥发蒸干；（4）加入200 μL生理盐水将样本复溶后CLIA检测（使用IMMULITE2000仪器）。之后根据实测的浓度传入电脑Lis系统中，利用预设的计算公式（仪器所测Cor的量，是指200 μL生理盐水中的Cro浓度，来源于500μL尿液，仪器结果原始单位是μg/dL；假设实测浓度n，患者尿量是x（mL），患者24小时尿Cor总量是N，n/100000指体积单位换算成μL时的浓度即μg/μL，则(n/100000)×200指复溶剂生理盐水中的Cor总含量，单位μg；(n/100000×200)/400是指每μL萃取液二氯甲烷中的Cor量，单位μg/μL；(n/100000×200)/400×1000则是指1 mL二氯甲烷萃取500 μL尿液后的Cor总量，单位μg/mL。乘以记录的患者24 h尿量x（mL），最终N = ((n/100000×200)/400×1000)/500×1000x = nx/100 μg/24 h；当n低于仪器检测下限时，会报n＜1，此时需按n=1根据上述公式计算结果，再人工填报“＜”至最终结果中）；即最终的24h尿的UFC值。
上方法中存在如下问题：1、萃取剂二氯甲烷的职业危害及腐蚀性。2、塑料溶解性，迫使实验中不得不改用易碎且需重复使用与清洗的玻璃容器。3、操作不便捷：上机前的萃取过程需要四个步骤，如上所述，增加了检测结果的不稳定性。4、耗材、人力成本高，萃取实验一旦开始不便延迟或中断，二氯甲烷沸点低，极易挥发。5、二氯甲烷萃取Cor的回收率较低（使用已知靶值的Cor质控品溶液进行萃取实验的结果证实其萃取回收率显著低于乙酸乙酯，二氯甲烷回收率常低于70%，而乙酸乙酯可达90%以上）。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种尿皮质醇萃取组合物、萃取方法与萃取装置。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种尿皮质醇萃取组合物，所述的尿皮质醇萃取组合物包括体积与质量比为1 mL：0.01-0.4 mL：1-22mg的乙酸乙酯、乙醇与没食子酸。
优选的，所述的尿皮质醇萃取组合物包括体积与质量比为1mL：0.01-0.2 mL：10-22 mg的乙酸乙酯、乙醇与没食子酸。
本发明还提供了一种尿皮质醇的萃取方法，包括如下步骤：
步骤1是：推动尿皮质醇萃取装置的套环在内管体上移动，直至套环封堵出液孔；
步骤2是：在尿皮质醇萃取装置的内套管内依次加入含有尿皮质醇萃取组合物的萃取液、空心浮球与待测标本，然后将内套管进行涡旋震荡，所述的萃取液中含有所述的尿皮质醇萃取组合物；
步骤3是：在外套管内加入生理盐水，然后将步骤2中震荡后的内套管插入外套管中，并向下按压内套管，套环的底部接触限位台后停止移动，继续按压内套管直至出液孔露出，萃取液从出液孔流出至外套管中后萃取完成。
进一步，所述的步骤2中的尿皮质醇萃取组合物占所述的萃取液总质量的80-100%。
进一步，所述的空心浮球的材料为聚丙烯。
进一步，所述的空心浮球的外径为直径2-4 mm；所述的空心浮球的投加量为空心浮球的过球心的截面的面积之和大于所述的内套管的内侧横截面的面积。常用型号的内套管的内径为0.5-2 cm2。
进一步，所述的步骤2中的萃取液与待测标本的体积比为1：0.1-1；所述的步骤2中的萃取液与所述的步骤3中的生理盐水的体积比为1：0.1-1。
优选的，所述的步骤2中的萃取液与待测标本的体积比为1：0.2-1；所述的步骤2中的萃取液与所述的步骤3中的生理盐水的体积比为1：0.1-0.5。
更优选的，所述的步骤2中的萃取液与待测标本的体积比为1：0.5；所述的步骤2中的萃取液与所述的步骤3中的生理盐水的体积比为1：0.5。
本发明还提供了一种尿皮质醇萃取装置，用于实现所述的尿皮质醇的萃取方法，所述的尿皮质醇萃取装置包括内套管与外套管，所述的内套管置于所述的外套管内，所述的内套管上设有出液孔，所述的内套管的外侧设置有套环，所述的套环位于外套管的内侧。
进一步，所述的内套管的外侧上部设置有上限位层，所述的内套管的内侧下部设置有下限位层，所述的上限位层位于所述的下限位层的上方，所述的出液孔位于所述的下限位层与上限位层之间，所述的套环的内径大于所述的内套管的外径，并小于所述的上限位层的外径，所述的套环的宽度大于等于所述的出液孔的外径；所述的上限位层的外径与套环的外径均小于所述的外套管的内径；所述的萃取装置还设置有推杆，所述的推杆的底部置于所述的内套管内，所述的推杆的底部外径大于所述的下限位层的内径。
进一步，所述的外套管的内侧设置有内限位层，所述的内限位层的内径小于所述的套环的外径，并大于所述的内套管的外径；所述的内限位层的内径大于等于所述的上限位层的外径。
本发明提供了一种尿皮质醇萃取组合物的应用，所述的组合物在检测尿激素类物质中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的尿皮质醇萃取组合物采用乙酸乙酯与乙醇、没食子酸进行复配对尿皮质醇进行萃取，乙醇的加入在24 h内可维持乙酸乙酯稳定性，防止其被待测尿液中的水分子水解，没食子酸的加入可抑制乙酸乙酯的挥发，其本身还被报道具有抗菌效应。同时，空心浮球的加入也可抑制乙酸乙酯的挥发，没食子酸、乙醇与空心浮球的联合使用保障了延迟萃取，并提升了萃取回收率，降低了毒物效应。
本发明所述的尿皮质醇萃取方法采用双重管结构的萃取装置进行萃取，极大简化上机检测前的萃取实验步骤，并提升萃取精度和效果；该方法将生理盐水置于外套管中，含有尿皮质醇的萃取液从内套管定量流入至外套管中，其中的尿皮质醇换溶于生理盐水中，即可采用直接加热法加热后进行上机检测。
本发明所述的尿皮质醇萃取装置采用内套管与外套管的结构，并在内套管外侧设置有封堵出液孔的套环，可通过内套管与外套管的外限位层的配合，使内套管中的萃取液定量进入外套管中，该装置使用方便、结构简单，便于医护人员与普通患者操作。
附图说明
图1为本发明实施例所述的尿皮质醇萃取装置（萃取前的状态）的示意图；
图2为本发明实施例所述的尿皮质醇萃取装置（萃取中的状态）的示意图；
图3为本发明实施例2所述的乙酸乙酯挥发实验曲线图；
图4为本发明实施例3所述的乙酸乙酯水解反应曲线图；
图5为本发明实施例1所述的尿皮质醇萃取方法的流程图。
附图标记说明：
1、内套管；2、外套管；3、套环；4、推杆；11、上限位层；12、下限位层；13、出液孔；21、内限位层。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种尿皮质醇萃取方法，包括如下步骤：
步骤1是：推动尿皮质醇萃取装置的套环在内管体上移动，直至套环封堵出液孔；
步骤2是：在内套管内加入萃取液1.1 mL（1mL乙酸乙酯和无水乙醇100 μL、没食子酸22 mg）与空心浮球（直径4 mm，16个），利用巴氏吸管深入上述液体底部加入待测尿液标本0.5mL，然后将内套管进行涡旋震荡；
步骤3是：在外套管内加入0.2 mL生理盐水，然后将步骤2中震荡后的内套管插入外套管中，并向下按压内套管，套环的底部接触限位台后停止移动，继续按压内套管直至出液孔露出，萃取液从出液孔定量流出至外套管中，内管中使用活塞推杆加速并彻底排出400μL萃取液，然后取出内套管，将外套管内400 μL的萃取液77℃加热10min后上机检测。
所述的尿皮质醇萃取装置，包括内套管与外套管，所述的内套管置于所述的外套管内，所述的内套管上设有出液孔（孔的底部位于内套管的1.2mL刻度处，孔径2mm），所述的内套管的外侧设置有套环，所述的套环位于外套管的内侧，流程图如图5所示。
所述的内套管（内径12mm）的外侧上部设置有上限位层（内径10mm），所述的内套管的内侧下部设置有下限位层（外径14mm），所述的上限位层位于所述的下限位层的上方，所述的出液孔位于所述的下限位层与上限位层之间，所述的套环的内径大于所述的内套管的外径，并小于所述的上限位层的外径，所述的套环的宽度大于等于所述的出液孔的外径；所述的上限位层的外径与套环的外径均小于所述的外套管的内径；所述的萃取装置还设置有推杆，所述的推杆的底部置于所述的内套管内，所述的推杆的底部外径大于所述的下限位层的内径。所述的下限位层用于限位推杆在内套管中的位置。
所述的外套管（内径15mm）的内侧设置有内限位层，所述的内限位层的内径小于所述的套环的外径，并大于所述的内套管的外径；所述的内限位层的内径大于等于所述的上限位层的外径。内限位层对套环与上限位层起到限位作用，用于控制萃取液的流出。
实施例2 没食子酸抗乙酸乙酯挥发效果
乙酸乙酯相较于传统萃取剂二氯甲烷虽有更低毒、萃取效率高的优点，但其密度0.902 g/cm3＜尿液（密度范围：1.010-1.030 g/cm3），覆盖于尿液之上，直接暴露于空气之中。一旦临床样本过多，操作时间过长，乙酸乙酯挥发较为迅速，则可能影响萃取和检测结果。需要寻找一种添加剂能阻止乙酸乙酯的挥发，从而保障萃取效果。
没食子酸可溶于乙醇、乙酸乙酯，微溶于常温水。没食子酸溶于乙酸乙酯、乙醇后所形成的混合体系理论上比未加没食子酸的体系更具抑制挥发的效果：没食子酸是一种苯环上拥有3个羟基的有机物，没食子酸与乙酸乙酯混合后进一步触发了疏水效应并增强了两者间的范德华力，3羟基结构与乙酸乙酯间存在更强的电荷吸引力，使得两者结合紧密，从而抑制了乙酸乙酯的挥发。在加入尿液标本后，进行震荡后，因没食子酸密度较大可溶于下方的乙醇-尿溶液（乙醇因更易溶于尿液中而改变其在体系中的分布相），且不影响萃取物质的分离检测（即使少量没食子酸溶于乙酸乙酯中也不会影响免疫法检测）。
空心浮球采用PP（聚丙烯）材料制作，PP材料是加样枪枪头的生产原料，其密度范围为0.89~0.91g/cm3与乙酸乙酯密度0.902g/cm3近似。但若生产成空心球将会漂浮于乙酸乙酯之上，且耐乙酸乙酯腐蚀，定制直径4 mm空心小球加入足够数量后完全遮盖乙酸乙酯，可起到一定程度隔绝作用，进一步防止其挥发。
挥发实验（室温24 ℃，通风橱风速0.4 m/s），取1mL乙酸乙酯观察挥发实验的测试结果如图3所示，其中，没食子酸添加量为22 mg（按其在乙酸乙酯及标本中的溶解度计算所得），浮球的添加数目为16个（按基本覆盖液面所需面积计算所得）。
由此可见，没食子酸的加入在较长时间内达到了抑制乙酸乙酯挥发的效果。空心浮球的加入主要是一定程度上隔绝了乙酸乙酯与空气的接触，从而也达到了抑制挥发的效果，但也不会影响利用吸管深入萃取液中加样的操作，也不影响目标物质的萃取分离。将乙酸乙酯、没食子酸、空心浮球组合在一起后，其抗挥发效果更佳，经过15 h后损失也微乎其微。
实施例3 乙醇添加比例及抗乙酸乙酯水解效果
乙酸乙酯易水解，常温下有水存在时，也会缓慢水解生成乙酸和乙醇，是一种可逆反应，当处于酸性条件下则水解反应加速。添加乙醇可使得水解反应被抑制，保护乙酸乙酯。同时，乙醇是一种极性溶剂，其极性比水略小，因此可以在水相和油相之间形成较好的中间相，使得油中的活性物质更容易被溶解，从而提高萃取效率。此外，乙醇作为萃取剂可以使得萃取物更具有生物活性，可以帮助提取一些不溶于水的活性成分，从而使得萃取物更加纯净、有效，但添加比例需要摸索。本实施案例主要探讨生理酸性尿标本对乙酸乙酯水解的影响、添加乙醇抑制水解反应的最优比例及萃取效率。
分别采用不同的配比萃取液对同一待测临床标本（调整pH值5.0），进行萃取后即时检测，探讨乙醇最佳添加量，检测结果如表1所示。
表1 乙醇不同添加量检测结果
注：各组检测重复三次，取均值统计分析。与#代表与B组有统计学差异。
由表1可见，1 mL乙酸乙酯+100 μL乙醇为最佳添加量，既方便计量又不影响检测结果。
乙酸乙酯密度：0.902 g/cm3、乙酸密度：1.05 g/cm3、乙醇密度：0.7893 g/cm3、尿液密度范围：1.010-1.030 g/cm3；0.5 mL尿液+乙醇后的混合液密度＞乙酸乙酯密度（0.902 g/cm3），保障乙酸乙酯萃取液分布在萃取相上层。即乙醇的添加量需＜0.479 mL，否则萃取相将无法分层。若仍吸取上层400 μL萃取液检测Cor值将降低，所以萃取液G组设置临界量480 μL乙醇添加量，发现确实影响萃取。
萃取液H组为1mL乙醇添加量时，萃取分层受很大影响，上层萃取液层中Cor不集中，量可能变少，萃取的皮质醇Cor单位体积的浓度变低，当按旧操作流程吸取400 μL萃取液蒸干复溶后会发现测量的Cor值严重下降，结果发现下降近一半。
待确定乙醇的最佳添加量后，我们进一步探索了乙醇添加到乙酸乙酯中对其水解的抑制效果，结果如图4所示（室温24℃，试管加盖屏蔽挥发因素造成的影响）。
由此可见，乙醇的添加相较于仅乙酸乙酯成分体现了抗水解效果，对于这种pH5.0的酸性尿，乙酸乙酯被其水解的速度大约是15 μL/ h，虽短期内影响不大，但一旦萃取液与标本混合后在16 h时就损失约1/4。虽然此类酸性尿标本不算常见，但乙醇添加剂将有效避免这种极限情况带来的影响。
实施例4 不同萃取组合物延迟检测的萃取效果
本实施例探讨使用最佳乙醇、没食子酸的添加比例后联合空心浮球形成的萃取组合物的萃取效率、新萃取液对于延时检测的干扰影响；因为乙酸乙酯的水解产物中也含有乙酸，所以本案例也同时探讨添加水解反应产物乙酸替换乙醇是否可行。
同一待测标本进行萃取，利用如下表2所示的不同萃取组合物，在不同时间点下进行萃取检测，详细结果如表2所示。
表2 检测结果
注：各时间点重复三次实验，取均值统计分析。、#与△代表与萃取液B的0 h测量值比，有统计学差异。
如表2所示，萃取液I中添加了无水乙醇及没食子酸及空心浮球可维持乙酸乙酯稳定性，防止其被尿液中水分子水解及挥发，保障萃取回收率。萃取液B虽然在短时间（2 h）内影响不大，但尿液与乙酸乙酯混合时间达4小时后，其萃取后的检测值明显上升且具有统计学差异。说明乙酸乙酯水解反应或挥发对于检测结果出现了显著影响，需加以抑制；而组合萃取液I组在延迟萃取长达24 h的检测结果与0 h的B组萃取液相比无差异，说明组合萃取剂达到抑制水解反应和可延时检测的效果（24 h时间点未做萃取液B的实验，是因为其挥发后剩余量无法满足实验分离萃取液量的需求了。未做J组，是因为在2 h时就已发现乙酸添加剂不可行）。
需要注意的是，纯乙酸乙酯萃取液即B组其他时间点相较于0 h出现值出现升高的现象，是因为随着乙酸乙酯水解、挥发导致其量或体积下降，但对于萃取皮质醇来说仍是过量的，则单位体积内萃取的皮质醇浓度升高，当仍按原流程分离定量的乙酸乙酯萃取液换溶后上机检测，则所测皮质醇值也较原始值升高。
如表2所示，加入乙酸后对反应方程：CH3COOCH2CH3（乙酸乙酯）+H2O（弱酸条件下）CH3COOH（乙酸）+CH3CH2OH（乙醇）产生了严重影响，乙酸加强了酸性条件，反而更有利于乙酸乙酯的水解，将可逆反应向右推进，导致萃取效率严重下降，因此，证实不能加入乙酸。
实施例5 不同萃取液尿皮质醇的后处理方式
分别用实施例4中的萃取组合物I对不同靶值的质控品进行不同方法的萃取后处理；将萃取液通过常用的间接复溶法进行复溶，具体操作为：将萃取后的萃取液在77℃下加热10分钟，待乙酸乙酯挥发完成后，加入至生理盐水中进行复溶；将萃取后的萃取液I采用直接换溶法进行换溶，具体操作为：将使用实施例1中萃取装置萃取后（外管事先已加入200μL生理盐水）的萃取液C在77℃水浴加热10 min，待乙酸乙酯挥发后即成（乙酸乙酯密度轻，浮于生理盐水之上，直接挥发后，皮质醇直接溶于下层生理盐水中，摸索最佳时间为10min）。上机检测后结果如表3所示。
表3检测结果
由表3可知，使用乙酸乙酯与乙醇、没食子酸复配的萃取液在复溶时直接换溶法可替代间接换溶法，其检测值并无差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种尿皮质醇萃取装置，用于实现尿皮质醇的萃取方法，其特征在于：所述的尿皮质醇萃取装置包括内套管与外套管，所述的内套管置于所述的外套管内，所述的内套管上设有出液孔，所述的内套管的外侧设置有套环，所述的套环位于外套管的内侧；
所述的内套管的外侧上部设置有上限位层，所述的内套管的内侧下部设置有下限位层，所述的上限位层位于所述的下限位层的上方，所述的出液孔位于所述的下限位层与上限位层之间，所述的套环的内径大于所述的内套管的外径，并小于所述的上限位层的外径，所述的套环的宽度大于等于所述的出液孔的外径；所述的上限位层的外径与套环的外径均小于所述的外套管的内径；所述的萃取装置还设置有推杆，所述的推杆的底部置于所述的内套管内，所述的推杆的底部外径大于所述的下限位层的内径；
所述的外套管的内侧设置有内限位层，所述的内限位层的内径小于所述的套环的外径，并大于所述的内套管的外径；所述的内限位层的内径大于等于所述的上限位层的外径；
所述的尿皮质醇的萃取方法，包括如下步骤：
步骤1是：推动尿皮质醇萃取装置的套环在内管体上移动，直至套环封堵出液孔；
步骤2是：在尿皮质醇萃取装置的内套管内依次加入萃取液、空心浮球与待测标本，然后将内套管进行涡旋震荡，所述的萃取液中含有尿皮质醇萃取组合物；
步骤3是：在外套管内加入生理盐水，然后将步骤2中震荡后的内套管插入外套管中，并向下按压内套管，套环的底部接触限位台后停止移动，继续按压内套管直至出液孔露出，萃取液从出液孔流出至外套管中后萃取完成；
所述的尿皮质醇萃取组合物包括体积与质量比为1 mL：0.01-0.4 mL：1-22mg的乙酸乙酯、乙醇与没食子酸。
2.根据权利要求1所述的尿皮质醇萃取装置，其特征在于：所述的尿皮质醇萃取组合物包括体积与质量比为1 mL：0.01-0.2 mL：10-22 mg的乙酸乙酯、乙醇与没食子酸。
3.根据权利要求1所述的尿皮质醇萃取装置，其特征在于：所述的步骤2中的萃取液的尿皮质醇萃取组合物占所述的萃取液总质量的80-100%。
4.根据权利要求1所述的尿皮质醇萃取装置，其特征在于：所述的空心浮球的材料为聚丙烯。
5.根据权利要求4所述的尿皮质醇萃取装置，其特征在于：所述的空心浮球的外径为直径2-4 mm；所述的空心浮球的投加量为空心浮球的过球心的截面的面积之和大于所述的内套管的内侧横截面的面积。
6.根据权利要求1所述的尿皮质醇萃取装置，其特征在于：所述的步骤2中的萃取液与待测标本的体积比为1：0.1-1；所述的步骤2中的萃取液与所述的步骤3中的生理盐水的体积比为1：0.1-1。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN207891341U (zh) * | 2018-01-25 | 2018-09-21 | 昆明市儿童医院 | 一种儿童白血病淋巴细胞分离提取装置 |
| CN209234768U (zh) * | 2018-10-17 | 2019-08-13 | 广州品知医疗器械有限公司 | 一种封闭式玻璃化冷冻载体 |
| WO2019178378A1 (en) * | 2018-03-14 | 2019-09-19 | University Of South Florida | Galloylated procyanidins for increasing intracellular nitric oxide production |
| CN210151065U (zh) * | 2019-04-26 | 2020-03-17 | 陕西省人民医院 | 一种白血病细胞分离提取装置 |
| CN114181066A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-03-15 | 安徽理工大学 | 一种没食子酸类似物及其制备方法、应用 |
| CN218725882U (zh) * | 2022-10-18 | 2023-03-24 | 天津市金一诺生物科技有限公司 | 一种新型萃取管 |
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN207891341U (zh) * | 2018-01-25 | 2018-09-21 | 昆明市儿童医院 | 一种儿童白血病淋巴细胞分离提取装置 |
| WO2019178378A1 (en) * | 2018-03-14 | 2019-09-19 | University Of South Florida | Galloylated procyanidins for increasing intracellular nitric oxide production |
| CN209234768U (zh) * | 2018-10-17 | 2019-08-13 | 广州品知医疗器械有限公司 | 一种封闭式玻璃化冷冻载体 |
| CN210151065U (zh) * | 2019-04-26 | 2020-03-17 | 陕西省人民医院 | 一种白血病细胞分离提取装置 |
| CN114181066A (zh) * | 2021-11-12 | 2022-03-15 | 安徽理工大学 | 一种没食子酸类似物及其制备方法、应用 |
| CN218725882U (zh) * | 2022-10-18 | 2023-03-24 | 天津市金一诺生物科技有限公司 | 一种新型萃取管 |
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