CN118019765A

CN118019765A - 特异性靶向间皮素的表达car的免疫细胞及其用途

Info

Publication number: CN118019765A
Application number: CN202280065594.7A
Authority: CN
Inventors: G·夏皮罗; 武千央; 葛西义明; 何星月; C·库恩
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2021-07-29
Filing date: 2022-07-28
Publication date: 2024-05-10

Abstract

本文公开了特异性识别间皮素并表达IL‑15和任选CCL19的工程化免疫细胞。本文还公开了分离的核酸分子、载体、包含所述核酸分子的药物组合物以及使用所述工程化免疫细胞的方法，所述核酸分子包含：编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述CAR包含特异性识别间皮素的抗体和4‑IBB胞内区；和编码IL‑15的多核苷酸；以及任选地编码CCL19的多核苷酸。

Description

特异性靶向间皮素的表达CAR的免疫细胞及其用途

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C§119(e)要求2022年2月4日提交的美国临时申请号63/306,862和2021年7月29日提交的美国临时申请号63/227,115的优先权，临时申请特此通过引用整体并入。

技术领域

本发明涉及表达特异性识别人间皮素的细胞表面分子、白细胞介素15(IL-15)和任选趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19)的免疫细胞，包含所述免疫细胞的药物组合物，包含编码特异性识别间皮素的细胞表面分子的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸的表达载体，使用方法，以及产生表达特异性识别人间皮素的细胞表面分子、IL-15和任选CCL19的免疫细胞的方法，所述方法包括将编码特异性识别人间皮素的细胞表面分子的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸引入免疫细胞。

背景技术

恶性肿瘤是影响世界上许多人的疾病，并且通常通过化学疗法、放射疗法或手术疗法来广泛治疗。然而，存在各种问题，诸如不良反应的发生、一些功能的丧失以及无法治疗的复发或转移。因此，近年来，为了维持患者更高的生活质量(QOL)，已经推进了免疫细胞疗法的开发。免疫细胞疗法包括从患者采集免疫细胞，进行增强所采集的免疫细胞的免疫功能的程序，扩增细胞，以及将细胞重新施用回患者。例如，免疫细胞疗法可以包括从患者收集T细胞，将编码嵌合抗原受体(组成型雄甾烷受体：在下文，也称为“CAR”)的核酸引入T细胞，并将T细胞重新施用回患者。尽管已经观察到CAR-T疗法在血癌中的早期成功；但是也观察到了在实体瘤治疗中的致命毒性和明显缺乏功效。因此，需要改良CAR-T疗法。

现有技术文献

专利文件

专利文件1：WO2020/045610

专利文件2：US2020/0101142

专利文件3：WO2013/063419

发明内容

本发明要解决的客观技术问题

用T细胞免疫疗法存在许多挑战，诸如向实体瘤的运输不足、对正常组织的高毒性、不能克服免疫抑制肿瘤微环境以及内源性免疫应答的激活不足。此外，已经证实经修饰以表达特异性识别间皮素的CAR的免疫细胞表现出最低的治疗功效。因此，要解决的客观技术问题是提供优化的经修饰的免疫细胞以靶向表达间皮素的癌症。

解决客观技术问题的手段

本发明人已经发现，经修饰以表达特异性识别间皮素的CAR、IL-15和任选CCL19的免疫细胞可以提高免疫疗法的治疗功效并提高存活率。

一种分离的核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一多核苷酸和编码白细胞介素15(IL-15)的第二多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含特异性识别人间皮素的抗体和4-1BB胞内区。在一些实施方案中，CAR还包含CD8铰链区、CD8跨膜区和CD3ζ胞内区。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码CAR的第一多核苷酸和编码IL-15的第二多核苷酸。在一些实施方案中，分离的核酸分子还包含编码CCL19的第三多核苷酸。在一些实施方案中，IL-15是人IL-15。在一些实施方案中，CCL19是人CCL19。在一些实施方案中，抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含三个包含SEQ ID NO:16-18的互补决定区(CDR)，并且其中所述VL包含三个包含SEQ ID NO:19-21的CDR。在一些实施方案中，VH包含SEQ ID NO:22并且所述VL包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，抗体包含单链可变片段(scFv)形式。在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，4-1BB胞内区位于所述分离的核酸分子中CD3ζ胞内区的上游。在一些实施方案中，CD8铰链区包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，CD8跨膜区包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，CAR还包含长度为3至10个氨基酸残基的连接所述抗体和所述CD8铰链区的肽接头。在一些实施方案中，肽接头包含SEQ ID NO:4。在一些实施方案中，CAR分子还包含信号肽。在一些实施方案中，信号肽位于所述分离的核酸分子中特异性识别人间皮素的所述抗体的上游。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，编码IL-15的第二多核苷酸和任选编码CCL19的第三多核苷酸各自独立地在启动子下转录，所述启动子包含编码自裂解2A肽(2A肽)的多核苷酸。在一些实施方案中，2A肽包含SEQ ID NO:5。在一些实施方案中，IL-15包含选自SEQ ID NO:8-11的序列。在一些实施方案中，IL-15包含选自SEQID NO:28或29的序列。在一些实施方案中，CCL19包含SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，编码所述CAR的所述第一多核苷酸和编码IL-15的所述第二多核苷酸在所述核酸分子中从5’末端到3’末端排列为编码所述CAR的所述第一多核苷酸-编码IL-15的所述第二多核苷酸。在一些实施方案中，编码所述CAR的所述第一多核苷酸、编码IL-15的所述第二多核苷酸和编码CCL19的所述第三多核苷酸在所述核酸分子中从5’末端到3’末端排列为编码所述CAR的所述第一多核苷酸-编码IL-15的所述第二多核苷酸-编码CCL19的所述第三多核苷酸。在一些实施方案中，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:14或31的多肽。在一些实施方案中，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:34、35、36或15的多肽。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:37、38、39或40。

在某些实施方案中，本文公开了包含本文所述的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体，任选地是表达载体。在一些实施方案中，病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方案中，病毒载体是pSFG载体、pMSGV载体或pMSCV载体。在一些实施方案中，载体是质粒。

在某些实施方案中，本文公开了包含本文所述的核酸分子或本文所述的载体的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞还包含编码gamma-TCR(γTCR)的多核苷酸和编码delta-TCR(δTCR)的多核苷酸。在一些实施方案中，γTCR是V gamma 9TCR(Vγ9TCR)，并且所述δTCR是V delta 2TCR(Vδ2TCR)。

在某些实施方案中，本文公开了一种免疫细胞，所述免疫细胞表达：a)嵌合抗原受体(CAR)，其包含特异性识别人间皮素的抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区；和b)IL-15；和c)任选CCL19。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、抗原呈递细胞或粒细胞，任选地是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，免疫细胞源自诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，免疫细胞不表达alpha TCR(αTCR)和/或beta TCR(βTCR)，任选地不表达αβTCR。在一些实施方案中，免疫细胞表达γδTCR。在一些实施方案中，γδTCR包括Vγ9TCR和Vδ2TCR。

在某些实施方案中，本文公开了包含本文所述的免疫细胞和药学上可接受的添加剂的药物组合物。

在某些实施方案中，本文公开了一种治疗表达间皮素的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是实体瘤，任选地选自间皮瘤、结直肠癌、胰腺癌、胸腺癌、胆管癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈癌、子宫癌、肝癌、肾癌、脾癌、气管癌、支气管癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、睾丸癌、卵巢癌和骨癌。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是造血系统癌症。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是肉瘤，任选地选自软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是复发性癌症或难治性癌症。在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用附加治疗剂或附加治疗方案。在一些实施方案中，附加治疗剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂、靶向疗法、放射疗法或其组合。在一些实施方案中，附加治疗方案包括一线疗法。在一些实施方案中，附加治疗方案包括手术。在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物和附加治疗剂同时施用。在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物和附加治疗剂依序施用。在一些实施方案中，在施用附加治疗剂之前，向受试者施用本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，在施用附加治疗剂之后，向受试者施用本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，受试者是人。

在某些实施方案中，本文公开了一种降低肿瘤细胞增殖的方法，其包括使所述肿瘤细胞与本文所述的免疫细胞接触，从而降低所述肿瘤细胞增殖。在一些实施方案中，方法是体外方法。在一些实施方案中，方法是体内方法。

在某些实施方案中，本文公开了一种产生表达特异性识别人间皮素的细胞表面分子、IL-15和任选CCL19的免疫细胞的方法，所述方法包括：将上述核酸分子或上述载体引入免疫细胞，以诱导所述免疫细胞表达特异性识别人间皮素的细胞表面分子、IL-15和任选CCL19。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、抗原呈递细胞或粒细胞，任选地是T细胞或NK细胞。

在某些实施方案中，本文公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含：上述核酸分子；上述载体、上述免疫细胞或上述药物组合物，以及使用说明。

发明效果

本发明的免疫细胞具有针对表达间皮素(例如，人间皮素)的癌细胞的细胞毒性活性，并且能够阻抑表达间皮素(例如，人间皮素)的肿瘤的形成。此外，本发明的免疫细胞对癌细胞的复发具有阻抑作用。

附图说明

图1A示出了示例性载体的草图图示，该示例性载体包含编码特异性识别间皮素的嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸和编码IL-15的多核苷酸。

图1B示出了示例性载体的草图图示，该示例性载体包含编码特异性识别间皮素的嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。

图1C示出了表达特异性识别间皮素的CAR和IL-15的经修饰的免疫细胞的草图图示。

图1D示出了表达特异性识别间皮素的CAR、IL-15和CCL19的经修饰的免疫细胞的草图图示。

图2示出了通过使用抗体集(Vδ1Myltenyi FITC、Vδ2Miltenyi APC、γδTCR BDBV510、CD3BioLegend APC/Cy7和αβTCR eBi oscience FITC)对获取的细胞进行染色而获得的结果。填充峰示出了未染色组的结果，空白峰示出了使用每种抗原特异性抗体的染色结果。

图3示出了通过使用抗体组(Vδ1Miltenyi FITC、Vδ2Miltenyi APC、γδTCR BDBV510、CD3BioLegend APC/Cy7和αβTCR eBi oscience FITC)对获取的细胞进行染色而获得的流式细胞术结果。

图4示出了iPS细胞来源的γδT细胞(iγδT细胞)的细胞增殖的测量结果。纵轴示出了细胞增殖率，横轴示出了从开始用抗CD3抗体(UCHT1)和抗CD30抗体刺激的当天起经过的天数。

图5示出了通过将Vγ9Vδ2TCR基因引入iPS细胞而分化的γδT细胞(iγ9δ2T细胞)的细胞膜表面上CD3和γδTCR分子的表达。

图6示出了iMesothelin-CAR/IL-15γ9δ2T细胞的细胞增殖的测量结果。纵轴示出了细胞数目，横轴示出了从开始用抗CD3抗体(UCHT1)刺激的当天起经过的天数。

图7A示出了肿瘤细胞系上的间皮素染色。

图7B示出iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞在体外以剂量依赖性方式杀伤间皮素阳性细胞系。

图8示出包含共刺激结构域CD28或4-1BB的iMeso-CAR/IL-15γδT细胞优于其它测试的共刺激结构域。

图9A-图9D示出具有mIL15/Ra或sushi15的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞表现出比其它测试的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞更高的抗肿瘤功效。图9A和图9B示出了第1组臂方案(5×10⁶个细胞)。图9C和图9D示出了第2组臂方案(1.5×10⁶个细胞)。

图9E示出包含4-1BB的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞表现出比包含CD28的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞更高的抗肿瘤效果。

图10示出了肿瘤内注射iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞的GSU皮下异种移植物。表达mIL15/Ra或sushi15的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞表现出比其它测试的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞更高的功效。

图11示出了在腹膜内GSU-redLuc异种移植物模型中腹膜内和静脉内施用的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞的功效。

图12A示出了通过流式细胞术计数的CAR-T细胞和在指定时间点进行的FACS表型分析。

图12B示出了在抗Msln CAR-T细胞中的细胞毒性百分比，所述细胞共表达针对Msln的CAR以及TGFβ调节剂(例如，TGFβR2-VH或dnTGFbR2)或针对GFP的对照VH(Msln-对照VH)。

具体实施方式

工程化免疫细胞

在某些实施方案中，本文公开了表达特异性结合间皮素的工程化细胞表面分子、白细胞介素15(IL-15)和任选趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19)的工程化免疫细胞。在一些实施方案中，工程化细胞表面分子包含特异性识别间皮素的嵌合抗原受体(CAR)或特异性结合间皮素的T细胞受体(TCR)。

在一些实施方案中，工程化免疫细胞包含编码工程化细胞表面分子的外源核酸、编码IL-15的外源核酸和任选编码CCL19的外源核酸。在一些实施方案中，工程化免疫细胞表达特异性识别间皮素的表面分子、IL-15和任选CCL19。

间皮素(MSLN)是一种细胞表面结合的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白，其中正常表达限于来自胸膜、心包、腹膜、鞘膜、卵巢或输卵管的间皮细胞。然而，还已证实MSLN在多种癌症中过表达，诸如恶性间皮瘤、卵巢癌、乳腺癌(例如三阴性乳腺癌，TNBC)、胰腺癌、肺癌、胃癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胆管癌、子宫浆液性癌、胆管癌和小儿急性骨髓性白血病。此外，已经将MSLN表达增加与TNBC、卵巢癌、肺腺癌、胆管癌和胰腺腺癌患者预后不良相关联。

MSLN的生理和生物学功能尚未完全阐明。然而，MSLN已被证实会参与几种癌症发病机理。例如，在上皮卵巢癌中，与表达较低MSLN水平的化学疗法敏感患者相比，在手术切除的卵巢癌组织中表现出较高MSLN mRNA表达水平的患者显示出对铂和环磷酰胺化学疗法的抗性(Tang等人，“The role of mesothelin in tumor progression and targetedtherapy,”Anticancer Agents Med Chem.13(2):276-280(2013))。还已经发现MSLN以高亲和力与表面粘蛋白MUC16(或CA125)结合，并且已经提出该结合会介导卵巢癌细胞粘附至间皮细胞并促进转移(Rump等人，“Binding of ovarian cancer antigen CA125/MUC16tomesothelin mediates cell adhesion,”J Biol Chem279(10):9190-9198,2004；Gubbels等人，“Mesothelin-MUC16binding is a high affinity,N-glycan dependentinteraction that facilitates peritoneal metastasis of ovarian tumors,”MolCancer 5(1):50,2006)。此外，已证实MSLN会参与体外和体内胰腺癌中的肿瘤进展、细胞存活和增殖(Li等人，“Mesothelin is a malignant factor and therapeutic vaccinetarget for pancreatic cancer,”Mol Cancer Ther.7(2):286-296,2008)。

嵌合抗原受体(CAR)

A.抗间皮素抗体

在一些实施方案中，工程化细胞表面分子包含嵌合抗原受体(CAR)，其包含特异性识别间皮素的抗体。在一些实施方案中，抗体特异性识别哺乳动物间皮素，例如，啮齿动物间皮素、非人灵长类间皮素或人间皮素。

人间皮素，一种40kDa的蛋白质，是由MSLN基因编码的。关于人间皮素的序列信息可以通过搜索公知的文献或数据库诸如NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)适当获得。关于人间皮素的氨基酸序列信息的实例可以包括GenBank登录号NP_037536.2,AAV87530.1及其同种型。

在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:16中所示的CDRH1、SEQ ID NO:17中所示的CDRH2和SEQ ID NO:18中所示的CDRH3；和轻链可变区(VL)，其包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:19中所示的CDRL1、SEQID NO:20中所示的的CDRL2和SEQ ID NO:21中所示的的CDRL3。参见表1。

表1

*抗间皮素抗体在本文中也称为P4。

在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约80％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约80％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约85％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约90％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约95％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约96％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约97％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约98％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含：重链可变区(VH)，其包含与SEQ ID NO:22具有约99％序列同一性的序列；和轻链可变区(VL)，其包含与SEQ ID NO:23具有约99％序列同一性的序列。抗间皮素抗体可以包含含有SEQ ID NO:22的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:23的轻链可变区(VL)。抗间皮素抗体可以包含由SEQ ID NO:22组成的重链可变区(VH)和由SEQ IDNO:23组成的轻链可变区(VL)。

在一些实施方案中，在抗间皮素抗体中框架区内的一个或多个残基经修饰，在VH区或VL区产生80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。术语“框架区”是指抗体中不包括互补决定区(CDR)的区域。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:22具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:22具有85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:22具有90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ IDNO:22具有95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:22具有96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:22具有97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:22具有98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:22具有99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:23具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:23具有85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:23具有90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:23具有95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:23具有96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:23具有97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ ID NO:23具有98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素抗体在框架区内包含一个或多个修饰，并且具有与SEQ IDNO:23具有99％序列同一性的序列。

在一些实施方案中，抗间皮素抗体包含单链可变片段(scFv)形式。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含：VH，所述VH包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:16中所示的CDRH1、SEQ ID NO:17中所示的CDRH2和SEQ ID NO:18中所示的CDRH3；和VL，所述VL包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:19中所示的CDRL1、SEQ ID NO:20中所示的CDRL2和SEQ IDNO:21中所示的CDRL3。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含：VH，所述VH包含与SEQID NO:22具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列；和VL，所述VL包含与SEQ ID NO:23具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。

在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体的VH和VL通过肽接头连接。肽接头可以包括3个或更多个氨基酸残基，例如，约3至约30、约3至约25、3至约20、约4至约30、约4至约20、约4至约10、约5至约30、约5至约20或约5至约10个氨基酸残基。肽接头可以包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个氨基酸残基。

肽接头可以包括多个聚丙氨酸、聚甘氨酸或丙氨酸和甘氨酸残基的混合物。肽接头可以包括(Gly₄Ser)n接头，其中n是1至30的整数，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，进一步优选15、16、17、18、19或20。在一些情况下，肽接头包含GILGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:45)肽接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:30)。在一些情况下，肽接头包含GSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:41)。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含与具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列，其中所述接头为斜体。抗间皮素scFv在本文中也称为P4。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含与SEQ ID NO:1具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含与SEQ ID NO:1具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含与SEQ ID NO:1具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含与SEQ ID NO:1具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含与SEQ ID NO:1具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含与SEQ ID NO:1具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含与SEQ ID NO:1具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体由SEQ ID NO:1组成。

B.CAR的信号肽

在一些实施方案中，本文公开的嵌合抗原受体(CAR)包含信号肽(例如，作为前导序列)。信号肽可以将CAR定位到细胞表面。信号肽可以包括免疫球蛋白重链、免疫球蛋白轻链、CD8、T细胞受体α链和β链、CD3ζ、CD28、CD3E、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154或GITR来源的信号肽(前导序列)的多肽。

在一些实施方案中，信号肽可以包括免疫球蛋白重链的多肽。在一些实施方案中，信号肽包含与MDWTWRILFLVAAATGAHS(SEQ ID NO:2)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:2具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:2具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:2具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:2具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:2具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:2具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:2具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，信号肽包含SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，信号肽由SEQ ID NO:2组成。

C.跨膜区

在一些实施方案中，抗间皮素抗体连接到一个或多个跨膜结构域和胞内信号传导结构域。跨膜区可以源自天然来源或合成来源。示例性的跨膜区可包括源自CD8、T细胞受体α链和β链、CD3ζ、CD28、CD3E(CD3ε)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154和GITR的跨膜区的多肽。在一些实施方案中，跨膜区包含CD8跨膜区(例如，人CD8跨膜区)。

在一些实施方案中，跨膜区源自CD8。在一些实施方案中，跨膜区包含与IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCN(SEQ ID NO:27)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:27具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:27具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:27具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:27具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:27具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:27具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:27具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，跨膜区由SEQ ID NO:27组成。在一些实施方案中，跨膜区包含与IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:63)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQID NO:63具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:63具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:63具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:63具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:63具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:63具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含与SEQ ID NO:63具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，跨膜区包含SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，跨膜区由SEQ ID NO:63组成。

D.胞外铰链区

包含任意寡肽或多肽或由任意寡肽或多肽组成的胞外铰链区可以位于识别间皮素的细胞表面分子与跨膜区之间。胞外铰链区长度的实例可包括1至100个氨基酸残基，优选10至70、10至50或10至30个氨基酸残基。示例性的胞外铰链区可以包括源自CD8、CD28和CD4的铰链区，以及免疫球蛋白铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含人CD8的铰链区。

在一些实施方案中，胞外铰链区是CD8铰链区，其包含与PTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:26)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:26具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:26具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:26具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:26具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:26具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:26具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:26具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含SEQ ID NO:26。在一些实施方案中，CD8铰链区由SEQ ID NO:26组成。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:64)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:64具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:64具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:64具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:64具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:64具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:64具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含与SEQ ID NO:64具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD8铰链区包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，CD8铰链区由SEQ ID NO:64组成。

在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体通过肽接头连接到铰链区。肽接头可以包括3个或更多个氨基酸残基，例如，约3至约30、约3至约20、3至约10、约4至约30、约4至约20、约4至约10、约5至约30、约5至约20或约5至约10个氨基酸残基。肽接头可以包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个氨基酸残基。

肽接头可以包括多个聚丙氨酸、聚甘氨酸、丙氨酸和甘氨酸残基的混合物，或者丙氨酸或甘氨酸与一种或多种另外的氨基酸的混合物。在一些实施方案中，肽接头包含ArgAlaAlaAla(“RAAA”)(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，肽接头是ArgAlaAlaAla(“RAAA”)(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，肽接头包含AlaAlaAla(“AAA”)。在一些实施方案中，肽接头是三丙氨酸接头或AlaAlaAla(“AAA”)。

在一些实施方案中，抗间皮素scFv抗体在没有接头的情况下连接到铰链区。

E.胞内信号传导区(共刺激结构域)

在一些实施方案中，CAR包含一个或多个胞内信号传导区。胞内信号传导区(注意，胞内信号传导区在本文中也称为“共刺激结构域”)可以包含当细胞表面分子识别间皮素时能够将信号转导到细胞中的区域。胞内信号传导区可包含选自CD28、4-1BB(CD137)、GITR、CD27、OX40、HVEM、CD3ζ或Fc受体相关γ链的多肽的胞内区的至少一个或多个成员。在一些实施方案中，胞内信号传导区包含CD28胞内区(共刺激结构域)的多肽、4-1BB胞内区(共刺激结构域)的多肽、CD3胞内区的多肽或其组合。

在一些实施方案中，CAR包含4-1BB胞内区(共刺激结构域)。在一些实施方案中，4-1BB胞内区(共刺激结构域)包含与KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQID NO:24)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含与SEQ ID NO:24具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含与SEQ ID NO:24具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含与SEQ ID NO:24具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含与SEQ ID NO:24具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含与SEQ ID NO:24具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含与SEQ ID NO:24具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含与SEQ ID NO:24具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，4-1BB胞内区包含SEQ ID NO:24。在一些实施方案中，4-1BB胞内区由SEQ ID NO:24组成。

在一些实施方案中，CAR还包含CD3ζ胞内区。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含与RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:25)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含与SEQ ID NO:25具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含与SEQ ID NO:25具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含与SEQID NO:25具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含与SEQ IDNO:25具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含与SEQ ID NO:25具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含与SEQ ID NO:25具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含与SEQ ID NO:25具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区包含SEQ ID NO:25。在一些实施方案中，CD3ζ胞内区由SEQ ID NO:25组成。

IL-15

白细胞介素15(IL-15)参与淋巴细胞的发育、分化和稳态。IL-15还刺激CD8T细胞并诱导自然杀伤(NK)细胞激活。在肿瘤微环境中，已将IL-15的表达与增强的抗肿瘤应答联系起来。此外，IL-15的表达已经在T细胞离体扩增期间显示出益处，并且增强CAR-T细胞的效力。

如本文所用，术语“IL-15”不仅涵盖全长IL-15蛋白，而且包括片段，只要IL-15在本发明的效果中的功能得以保持。此外，术语“IL-15”涵盖野生型IL-15及其包含一个或多个突变的变体。在一些情况下，突变包括缺失、取代和/或添加。例如，IL-15可以包含一个或多个取代。IL-15还可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个或更多个氨基酸残基的截短，其中截短可以位于IL-15的N末端、C末端或内部区域。此外，IL-15或其变体可以与另一种蛋白连接形成融合蛋白(例如，与IL-15Rα的整个或一部分连接)。IL-15可以是膜结合蛋白或分泌蛋白。

A.mIL15/Ra

在一些情况下，IL-15包括与IL-15受体α链(IL-15Rα)融合的膜结合的IL-15。融合IL-15蛋白在本文中称为mIL15/Ra。IL-15Rα涵盖整个野生型IL-15Rα(没有信号肽)，但也涵盖其功能片段(例如，IL-15Rα的胞外结构域或sushi结构域)，以及IL-15Rα的变体，所述变体任选包含一个或多个取代、缺失或添加。

在一些情况下，mIL15/Ra融合蛋白包含IL-15Rα多肽，其直接或经由接头间接融合到膜结合的IL-15多肽的C末端。肽接头可以包括1个或多个氨基酸残基，例如，约1至约30、约3至约20、3至约10、约4至约30、约4至约20、约4至约10、约5至约30、约5至约20或约5至约10个氨基酸残基。肽接头可以包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个氨基酸残基。

肽接头可以包括多个聚丙氨酸、聚甘氨酸或丙氨酸和甘氨酸残基的混合物。肽接头可以包括(Gly₄Ser)n接头，其中n是1至30的整数，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，进一步优选15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些情况下，肽接头包含SGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQ(SEQ ID NO:32)。在一些情况下，肽接头包含SGGSGGGGSGGGSGGGGSLQ(SEQ ID NO:33)。在一些情况下，肽接头包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO:30)。在一些情况下，肽接头包含GSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:41)。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞表达mIL15/Ra。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含与NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO:8)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含与SEQ ID NO:8具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含与SEQ ID NO:8具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含与SEQ ID NO:8具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含与SEQ ID NO:8具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含与SEQ ID NO:8具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含与SEQ ID NO:8具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含与SEQ ID NO:8具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，mIL15/Ra包含SEQID NO:8。在一些实施方案中，mIL15/Ra由SEQ ID NO:8组成。

在一些情况下，mIL15/Ra还包含IL-2信号肽(IL2sp)。在一些情况下，IL2sp包含MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:6)。在一些情况下，IL2sp由SEQ ID NO:6组成。

在一些情况下，本文所述的免疫细胞表达与MYRMQLLSCIALSLALVTNSATSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ ID NO:28)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IL2sp-mIL15/Ra多肽。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽与SEQ ID NO:28具有约85％序列同一性。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽与SEQ ID NO:28具有约90％序列同一性。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽与SEQ ID NO:28具有约95％序列同一性。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽与SEQ ID NO:28具有约96％序列同一性。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽与SEQ ID NO:28具有约97％序列同一性。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽与SEQ IDNO:28具有约98％序列同一性。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽与SEQ ID NO:28具有约99％序列同一性。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽包含SEQ ID NO:28。在一些情况下，IL2sp-mIL15/Ra多肽由SEQ ID NO:28组成。

B.sushi15

在一些情况下，IL-15包含与IL-15融合的IL-15受体α链(IL-15Rα)sushi结构域。该融合IL-15蛋白在本文中称为sushi15。IL-15Rαsushi结构域直接或经由接头间接融合到IL-15多肽的C末端。

在一些情况下，IL-15Rα的sushi结构域经由接头间接融合到IL-15多肽。肽接头可以包括1个或多个氨基酸残基，例如，约1至约30、约3至约20、3至约10、约4至约30、约4至约20、约4至约10、约5至约30、约5至约20或约5至约10个氨基酸残基。肽接头可以包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个氨基酸残基。

肽接头可以包括多个聚丙氨酸、聚甘氨酸或丙氨酸和甘氨酸残基的混合物。肽接头可以包括(Gly₄Ser)n接头，其中n是1至30的整数，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，进一步优选15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:32。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:33。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:30。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:41。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞表达sushi15。在一些实施方案中，sushi15包含与ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERY ICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ IDNO:10)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，sushi15包含与SEQ ID NO:10具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，sushi15包含与SEQ ID NO:10具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，sushi15包含与SEQ ID NO:10具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，sushi15包含与SEQ ID NO:10具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，sushi15包含与SEQ ID NO:10具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，sushi15包含与SEQ ID NO:10具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，sushi15包含与SEQ I D NO:10具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，sushi15包含SEQ ID NO:10。在一些情况下，sushi15由SEQ ID NO:10组成。

在一些情况下，sushi15还包含IL-15Rα信号肽(IL15Rasp)。在一些情况下，IL15Rasp包含MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPAT RG(SEQ ID NO:7)。在一些情况下，IL15Rasp由SEQ ID NO:7组成。

在一些情况下，本文所述的免疫细胞表达与MAPRRARGCRTL GLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ IDNO:29)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的IL15Rasp-sushi15多肽。在一些情况下，IL15Ras p-sushi15多肽与SEQ ID NO:29具有约85％序列同一性。在一些情况下，IL15Rasp-sushi15多肽与SEQ ID NO:29具有约90％序列同一性。在一些情况下，IL15Rasp-sushi15多肽与SEQ ID NO:29具有约95％序列同一性。在一些情况下，IL15Rasp-sushi15多肽与SEQ ID NO:29具有约96％序列同一性。在一些情况下，IL15Rasp-sushi15多肽与SEQ ID NO:29具有约97％序列同一性。在一些情况下，IL15Rasp-sushi15多肽与SEQID NO:29具有约98％序列同一性。在一些情况下，IL15Rasp-sushi15多肽与SEQ ID NO:29具有约99％序列同一性。在一些情况下，IL15Rasp-sushi15多肽包含SEQ ID N O:29。在一些情况下，IL15Rasp-sushi15多肽由SEQ ID NO:29组成。

C.mIL15/Ra-LSP

在一些情况下，IL-15包含融合到IL-15受体α链(IL-15Rα)的膜结合的IL-15、IL15前肽和IL-15(LSP)融合蛋白的长信号肽。该融合IL-15蛋白在本文中称为mIL15/Ra-LSP。IL-15Rα多肽包含没有信号肽的全长IL-15Rα链。IL-15Ra直接或经由接头间接融合到IL-15多肽的C末端。IL15前肽直接或间接融合到LSP的C末端。IL15前肽直接或间接地融合到IL-15Rα多肽的C末端。在一些情况下，IL15前肽包含GIHVFILGCFSAGLPKTEA(SEQ ID NO:48)。在一些情况下，IL15前肽由SEQ ID NO:48组成。在一些情况下，LSP包含MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEA(SEQ ID NO:47)。在一些情况下，LSP由SEQ ID NO:47组成。

在一些情况下，IL-15Ra经由接头间接融合到IL-15多肽的C末端。肽接头可以包括1个或多个氨基酸残基，例如，约1至约30、约3至约20、3至约10、约4至约30、约4至约20、约4至约10、约5至约30、约5至约20或约5至约10个氨基酸残基。肽接头可以包括3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个氨基酸残基。

肽接头可以包括多个聚丝氨酸、聚甘氨酸或丝氨酸和甘氨酸残基的混合物。肽接头可以包括(Gly₄Ser)n接头，其中n是1至30的整数，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，进一步优选15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:32。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:33。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:30。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:41。在一些情况下，肽接头包含SEQ ID NO:45。

在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞表达mIL15/Ra-LSP。在一些实施方案中，mIL15/Ra-LSP包含与MRISKPHLRSISIQCYLC LLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHL(SEQ IDNO:9)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，mIL15/Ra-LSP包含与SEQ ID NO:9具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，mIL15/R a-LSP包含与SEQ ID NO:9具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，mIL15/Ra-LSP包含与SEQ ID NO:9具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，mIL15/Ra-LSP包含与SEQ ID NO:9具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，mIL15/Ra-LSP包含与SEQID NO:9具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，mIL15/Ra-LSP包含与SEQ ID NO:9具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，mIL15/Ra-LSP包含与SEQ ID NO:9具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，mIL15/Ra-LSP包含SEQ ID NO:9。在一些情况下，mIL15/Ra-LSP由SEQ ID NO:9组成。

在一些情况下，mIL15/Ra-LSP还包含IL-2信号肽(IL2sp)。在一些情况下，IL2sp包含SEQ ID NO:6。在一些情况下，IL2sp由SEQ IDNO:6组成。

D.sIL15-LSP

在一些实施方案中，IL-15包含IL-15多肽、IL-15前肽和IL-15(LSP)融合蛋白的长信号肽。该融合IL-15蛋白在本文中称为sIL15。IL15前肽直接或间接融合到LSP的C末端。IL-15多肽直接或间接融合到IL-15前肽的C末端。在一些情况下，IL15前肽包含SEQ ID NO:48。在一些情况下，IL15前肽由SEQ ID NO:48组成。在一些情况下，LSP包含SEQ ID NO:47。在一些情况下，LSP由SEQ ID NO:47组成。在一些情况下，本文所述的免疫细胞表达sIL15。在一些实施方案中，sIL15包含与MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:11)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，sIL15包含与SEQIDNO:11具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，sIL15包含与SEQ ID NO:11具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，sIL15包含与SEQ ID NO:11具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，sIL15包含与SEQ ID NO:11具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，sIL15包含与SEQ ID NO:11具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，sIL15包含与SEQ ID NO:11具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，sIL15包含与SEQ ID NO:11具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，sIL15包含SEQ ID NO:11。在一些情况下，sIL15由SEQ ID NO:11组成。

CCL19

趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19)，也称为EBl1配体趋化因子(ELC)和巨噬细胞炎性蛋白-3-β(MIP-3-β)，在淋巴细胞再循环和归巢中发挥作用。CCL19由淋巴结的树突细胞或巨噬细胞表达，并具有经由其受体CCR7启动T细胞、B细胞或成熟树突细胞迁移的功能。

在某些实施方案中，本文所述的免疫细胞还表达CCL19。在一些实施方案中，CCL19包含与GTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS(SEQ ID NO:13)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CCL19包含与SEQ ID NO:13具有约85％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CCL19包含与SEQ ID NO:13具有约90％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CCL19包含与SEQ ID NO:13具有约95％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CCL19包含与SEQ ID NO:13具有约96％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CCL19包含与SEQ ID NO:13具有约97％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CCL19包含与SEQ IDNO:13具有约98％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CCL19包含与SEQ ID NO:13具有约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，CCL19包含SEQ ID NO:13。在一些实施方案中，CCL19由SEQ ID NO:13组成。

在一些实施方案中，CCL19还包含信号肽，MALLLALSLLVLWTSPAPTLS(SEQ ID NO:12)(在本文中也称为endosp)。在一些情况下，本文所述的免疫细胞表达信号肽SEQ ID NO:12和包含与SEQ ID NO:13具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CCL19。在一些情况下，CCL19融合到endosp的C末端。

另外的免疫功能控制因子

本发明的免疫细胞还可表达另外的免疫功能控制因子，诸如CCL21、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IP-10、干扰素-γ、MIP-1α、GM-CSF、M-CSF、TGF-β、XCL1、FLT3L或TNF-α。在一些实施方案中，另外的免疫功能控制因子包括IL-2。在一些实施方案中，另外的免疫功能控制因子包括IL-7。在一些实施方案中，另外的免疫功能控制因子包括干扰素-γ。在一些实施方案中，另外的免疫功能控制因子包括GM-CSF。在一些实施方案中，另外的免疫功能控制因子包括TGF-β。在一些实施方案中，另外的免疫功能控制因子包括TNF-α。在一些实施方案中，另外的免疫功能控制因子优选是除IL-12之外的免疫功能控制因子。

每个区域的排列

在某些实施方案中，本文公开了包含一种或多种多核苷酸的分离的核酸分子，所述多核苷酸编码特异性结合间皮素的工程化细胞表面分子(例如，特异性结合间皮素的CAR)、IL-15和任选CCL19。在一些实施方案中，分离的核酸分子包含：编码CAR的第一多核苷酸，所述CAR包含特异性识别人间皮素的抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区；和编码IL-15的第二多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子包含：编码CAR的第一多核苷酸，所述CAR包含特异性识别人间皮素的抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区；编码IL-15的第二多核苷酸；和编码CCL19的第三多核苷酸。在一些实施方案中，编码CAR、IL-15和CCL19的多核苷酸位于核酸分子中的两个或更多个不同的多核苷酸上。在其它实施方案中，分离的核酸分子包含编码CAR和IL-15的多核苷酸，编码CAR和CCL19的多核苷酸，或编码CAR、IL-15或CCL19的多核苷酸。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸包含特异性识别人间皮素的抗体上游的信号肽。在一些实施方案中，抗体通过肽接头(例如，SEQ ID NO:41)连接到CD8铰链区。在一些实施方案中，4-1BB胞内区位于多核苷酸中CD3ζ胞内区的上游。

所述多核苷酸可编码包含与 (本文也称为ssVH-P4)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:3具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:3具有约90％序列同一性的序列。CAR可以包含与SEQ ID NO:3具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:3具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQID NO:3具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:3具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:3具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:3。CAR可由SEQ ID NO:3组成。

所述多核苷酸可编码包含与 (本文也称为ssVH-P4-CAR)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:46具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:46具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ IDNO:46具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:46具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:46具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:46具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:46具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:46。CAR可由SEQ ID NO:46组成。

所述多核苷酸可编码包含与/> (本文也称为ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:43具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:43具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:43具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:43具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:43具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:43具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:43具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:43。CAR可由SEQ ID NO:43组成。

多核苷酸可编码包含与具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:65具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:65具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:65具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:65具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:65具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:65具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:65具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:65。CAR可由SEQID NO:65组成。

多核苷酸可编码包含与

具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:66具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:66具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:66具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:66具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:66具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:66具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:66具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:66。CAR可由SEQ ID NO:66组成。

多核苷酸可编码包含与/>具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:67具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:67具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:67具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:67具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:67具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:67具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:67具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:67。CAR可由SEQID NO:67组成。

多核苷酸可编码包含与具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:68具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:68具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:68具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:68具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:68具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:68具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:68具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:68。CAR可由SEQID NO:68组成。

所述多核苷酸可编码包含与具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:69具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ IDNO:69具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:69具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:69具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:69具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:69具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:69具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:69。CAR可由SEQ ID NO:69组成。

所述多核苷酸可编码包含与 /> 具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:70具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ IDNO:70具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:70具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:70具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:70具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:70具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:70具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:70。CAR可由SEQ ID NO:70组成。

所述多核苷酸可编码包含与具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:71具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ IDNO:71具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:71具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:71具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:71具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:71具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:71具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:71。CAR可由SEQ ID NO:71组成。

所述多核苷酸可编码包含与/> 具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:72具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ IDNO:72具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:72具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:72具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:72具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:72具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:72具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:72。CAR可由SEQ ID NO:72组成。

所述多核苷酸可编码包含与具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:73具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ IDNO:73具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:73具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:73具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:73具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:73具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:73具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:73。CAR可由SEQ ID NO:73组成。

所述多核苷酸可编码包含与具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:74具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ IDNO:74具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:74具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:74具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:74具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:74具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:74具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:74。CAR可由SEQ ID NO:74组成。

所述多核苷酸可编码包含与/>具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列的CAR。CAR可包含与SEQ ID NO:75具有约85％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:75具有约90％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:75具有约95％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:75具有约96％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:75具有约97％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:75具有约98％序列同一性的序列。CAR可包含与SEQ ID NO:75具有约99％序列同一性的序列。CAR可包含SEQ ID NO:43。CAR可由SEQID NO:75组成。

本文所述的编码CAR的多核苷酸可包含与ATGGACTGGACATGGCGGATACTCTTCCTCGTCGCTGCTGCAACCGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGGCCAGGTTTGGTGACTCCTAGTCAGACATTGAGCTTGACTTGTGCTATCAGCGGAGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCAACTTGGAACTGGATTCGGCAGTCCCCCAGCCGGGGGCTCGAGTGGTTGGGTCGGACCTACTATCGGAGCAAATGGTACAATGACTATGCAGTGAGCGTCAAATCAAGAATGAGCATCAATCCTGACACAAGCAAGAACCAGTTTAGCCTTCAGCTTAATAGCGTGACTCCAGAGGACACAGCTGTGTACTATTGCGCGAGAGGCATGATGACATACTATTACGGAATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACTACTGTTACAGTGTCAAGCGGAATCCTCGGTAGCGGAGGCGGCGGTTCCGGCGGAGGGGGTAGTGGTGGCGGGGGTAGTCAACCTGTGCTGACCCAGAGCAGCTCTCTTAGTGCTAGCCCAGGTGCAAGTGCAAGTCTTACCTGTACACTGCGCTCCGGTATTAATGTGGGCCCTTACCGAATTTACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCTCCCCTCCCCAGTATCTGCTGAACTATAAGTCTGACTCAGACAAACAGCAGGGCTCCGGTGTGCCATCCCGATTTAGTGGCTCAAAGGATGCTAGTGCAAATGCCGGTGTTCTCCTGATCAGCGGACTCAGATCAGAGGACGAAGCAGACTATTACTGTATGATTTGGCATAGCAGCGCTGCTGTCTTCGGAGGAGGGACTCAGCTCACTGTCTTGAGTCGGGCCGCTGCACCTACCACTACCCCTGCCCCTCGACCCCCTACTCCCGCCCCAACTATCGCATCCCAACCACTCTCTCTCAGACCCGAAGCCTGTAGACCCGCAGCCGGTGGCGCTGTGCATACTCGCGGACTTGATTTTGCTTGTGATATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGAACTTGTGGAGTTCTCCTGCTGTCTCTCGTAATCACCCTTTATTGTAACAAACGGGGGCGCAAAAAACTTCTTTACATTTTCAAGCAGCCCTTTATGCGGCCCGTGCAGACCACACAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCAGAGGAAGAAGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGAGTAAAGTTCAGCCGGAGCGCCGATGCACCTGCATACCAGCAGGGTCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAATATGATGTACTCGACAAGAGAAGGGGACGCGATCCAGAGATGGGCGGCAAACCACGGCGGAAAAATCCGCAGGAGGGGCTCTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCAGAAGCCTACTCAGAAATTGGCATGAAAGGAGAGAGAAGGAGGGGAAAGGGCCATGATGGCCTTTACCAAGGGTTGTCTACTGCCACCAAGGATACGTACGATGCACTCCATATGCAGGCTCTTCCTCCCCGA(SEQ ID NO:50)、ATGGACTGGACATGGCGGATACTCTTCCTCGTCGCTGCTGCAACCGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGGCCAGGTTTGGTGACTCCTAGTCAGACATTGAGCTTGACTTGTGCTATCAGCGGAGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCAACTTGGAACTGGATTCGGCAGTCCCCCAGCCGGGGGCTCGAGTGGTTGGGTCGGACCTACTATCGGAGCAAATGGTACAATGACTATGCAGTGAGCGTCAAATCAAGAATGAGCATCAATCCTGACACAAGCAAGAACCAGTTTAGCCTTCAGCTTAATAGCGTGACTCCAGAGGACACAGCTGTGTACTATTGCGCGAGAGGCATGATGACATACTATTACGGAATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACTACTGTTACAGTGTCAAGCGGAATCCTCGGTAGCGGAGGCGGCGGTTCCGGCGGAGGGGGTAGTGGTGGCGGGGGTAGTCAACCTGTGCTGACCCAGAGCAGCTCTCTTAGTGCTAGCCCAGGTGCAAGTGCAAGTCTTACCTGTACACTGCGCTCCGGTATTAATGTGGGCCCTTACCGAATTTACTGGTACCAGCAGAAACCAGGATCCCCTCCCCAGTATCTGCTGAACTATAAGTCTGACTCAGACAAACAGCAGGGCTCCGGTGTGCCATCCCGATTTAGTGGCTCAAAGGATGCTAGTGCAAATGCCGGTGTTCTCCTGATCAGCGGACTCAGATCAGAGGACGAAGCAGACTATTACTGTATGATTTGGCATAGCAGCGCTGCTGTCTTCGGAGGAGGGACTCAGCTCACTGTCTTGAGTCGGGCCGCTGCACCTACCACTACCCCTGCCCCTCGACCCCCTACTCCCGCCCCAACTATCGCATCCCAACCACTCTCTCTCAGACCCGAAGCCTGTAGACCCGCAGCCGGTGGCGCTGTGCATACTCGCGGACTTGATTTTGCTTGTGATATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGAACTTGTGGAGTTCTCCTGCTGTCTCTCGTAATCACCCTTTATTGTAACAAACGGGGGCGCAAAAAACTTCTTTACATTTTCAAGCAGCCCTTTATGCGGCCCGTGCAGACCACACAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCAGAGGAAGAAGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGAGTAAAGTTCAGCCGGAGCGCCGATGCACCTGCATACCAGCAGGGTCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAATATGATGTACTCGACAAGAGAAGGGGACGCGATCCAGAGATGGGCGGCAAACCACGGCGGAAAAATCCGCAGGAGGGGCTCTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCAGAAGCCTACTCAGAAATTGGCATGAAAGGAGAGAGAAGGAGGGGAAAGGGCCATGATGGCCTTTACCAAGGGTTGTCTACTGCCACCAAGGATACGTACGATGCACTCCATATGCAGGCTCTTCCTCCCCGA(SEQ IDNO:51)或ATGGATTGGACCTGGCGAATACTCTTCCTCGTCGCAGCGGCCACTGGTGCCCATTCACAAGTCCAACTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGTCAGACTCTCAGCCTGACTTGTGCAATCAGCGGCGATAGTGTGTCTAGTAATTCTGCAACATGGAACTGGATCAGACAATCACCAAGTCGGGGACTGGAGTGGCTCGGTAGAACCTATTATAGGTCCAAATGGTATAACGATTATGCAGTGTCCGTGAAGTCCCGAATGTCTATCAACCCTGATACTAGTAAGAATCAATTCAGTCTGCAGCTTAACAGCGTAACCCCCGAAGATACTGCTGTGTATTACTGTGCCCGGGGTATGATGACTTACTACTACGGAATGGATGTGTGGGGGCAGGGAACAACCGTTACTGTTTCATCCGGCATTCTCGGGAGCGGAGGCGGTGGAAGCGGTGGGGGAGGGTCCGGGGGAGGAGGATCTCAGCCTGTTCTTACTCAATCTTCTTCCCTCTCCGCCTCACCCGGGGCCTCCGCCTCACTGACCTGCACTCTGCGATCAGGCATCAACGTTGGGCCTTATAGAATCTACTGGTACCAGCAAAAGCCTGGATCACCGCCCCAGTACCTGCTGAACTATAAATCAGACTCAGACAAGCAGCAGGGCTCCGGCGTGCCGAGTCGATTTAGCGGGAGCAAGGACGCGTCTGCTAATGCCGGCGTGCTTCTCATCAGCGGGCTCCGCAGTGAGGATGAGGCAGATTACTACTGCATGATTTGGCATAGCAGTGCAGCCGTATTTGGCGGAGGAACACAGCTGACTGTCCTCTCTCGCGCCGCCGCTCCGACCACCACCCCTGCACCACGCCCACCTACTCCTGCGCCAACCATTGCCAGCCAGCCTCTCTCTCTCCGACCCGAGGCCTGTAGACCTGCCGCTGGCGGTGCAGTTCATACTCGGGGTCTCGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCACCACTGGCTGGCACTTGTGGCGTTTTGCTCCTGTCCCTGGTGATCACTCTCTACTGTAATAAGAGGGGGAGGAAGAAACTCCTGTATATTTTCAAACAACCCTTTATGCGCCCTGTCCAAACCACCCAGGAAGAAGATGGATGTAGTTGCAGATTCCCAGAAGAAGAGGAGGGTGGGTGTGAACTTAGGGTGAAGTTTAGTCGCAGTGCCGACGCTCCCGCTTACCAACAGGGTCAGAACCAACTCTACAATGAGCTGAATCTGGGGAGGCGCGAAGAATACGACGTTCTGGATAAAAGACGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGGAAACCGCGGAGAAAGAACCCACAGGAAGGATTGTACAATGAGCTCCAGAAAGATAAGATGGCAGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGGGAGCGAAGGCGCGGGAAAGGACACGATGGGCTGTACCAGGGTCTTTCAACCGCGACAAAGGACACCTATGATGCTCTCCATATGCAGGCCCTCCCGCCACGC(SEQ ID NO:52)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列。所述多核苷酸可包含与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52具有约85％序列同一性的核酸序列。所述多核苷酸可包含与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQID NO:52具有约90％序列同一性的核酸序列。所述多核苷酸可包含与SEQ ID NO:50、SEQID NO:51或SEQ ID NO:52具有约95％序列同一性的核酸序列。所述多核苷酸可包含与SEQID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52具有约96％序列同一性的核酸序列。所述多核苷酸可包含与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52具有约97％序列同一性的核酸序列。所述多核苷酸可包含与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52具有约98％序列同一性的核酸序列。所述多核苷酸可包含与SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52具有约99％序列同一性的核酸序列。所述多核苷酸可包含SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52。所述多核苷酸可由SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:52组成。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸各自独立地在启动子下转录，所述启动子包含编码自裂解2A肽(2A肽)或内部核糖体进入位点(IRES)的多核苷酸。在一些实施方案中，编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸各自独立地在包含编码2A肽或IRES的多核苷酸的启动子下转录。在一些实施方案中，编码IL-15的多核苷酸在包含编码2A肽或IRES的多核苷酸的启动子下转录。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸各自独立地在包含编码2A肽的多核苷酸的启动子下转录。2A肽家族有四个成员：P2A、E2A、F2A和T2A。P2A源自猪捷申病毒-1 2A。E2A源自马鼻炎A病毒。F2A源自口蹄疫病毒18。T2A病毒源自2A病毒。2A肽成员的示例性序列包括：

P2A-ATNFSLLKQAGDVEENPGP；

E2A-QCTNYALLKLAGDVESNPGP；

F2A-VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP；和

T2A–EGRGSLLTCGDVEENPGP。

在一些实施方案中，进一步将肽接头添加到2A肽的末端，例如N末端。在一些实施方案中，肽接头包含GSG。在一些情况下，P2A包含GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:5)。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸各自独立地在包含编码2A肽的多核苷酸的启动子下转录。在一些情况下，编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸各自在包含相同2A肽的启动子下转录。在一些情况下，编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸各自在包含两种不同2A肽的启动子下转录。在一些情况下，编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸各自独立地在包含不同2A肽的启动子下转录。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸各自独立地在包含编码P2A肽的多核苷酸的启动子下转录。P2A肽可包含ATNFSLLKQAGDVEENP GP。P2A肽也可包含SEQ ID NO:5。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸和编码IL-15的多核苷酸在核酸分子中从5’末端到3’末端排列如下：

编码CAR的多核苷酸-编码IL-15的多核苷酸；或者

编码IL-15的多核苷酸-编码CAR的多核苷酸。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸在核酸分子中从5’末端到3’末端排列如下：

编码CAR的多核苷酸-编码IL-15的多核苷酸-编码CCL19的多核苷酸；

编码CAR的多核苷酸-编码CCL19的多核苷酸-编码IL-15的多核苷酸；

编码IL-15的多核苷酸-编码CAR的多核苷酸-编码CCL19的多核苷酸；

编码CCL19的多核苷酸-编码CAR的多核苷酸-编码IL-15的多核苷酸；

编码IL-15的多核苷酸-编码CCL19的多核苷酸-编码CAR的多核苷酸；或者

编码CCL19的多核苷酸-编码IL-15的多核苷酸-编码CAR的多核苷酸。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码mIL-15/Ra的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与MYRMQLLSCIALSLALVTNSATSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQGHSDTTVAISTSTVLLCGLSAVSLLACYLKSRQTPPLASVEMEAMEALPVTWGTSSRDEDLENCSHHLGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS(SEQ ID NO:14)(本文也称为mIL15/Ra-P2A-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:14具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:14具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:14具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:14具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:14具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:14具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:14具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQID NO:14的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:14组成的多肽。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码sushi15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与MAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS(SEQ IDNO:31)(本文也称为IL15Rasp-sushi15-P2A-endosp-CCL19或sushi15-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SE Q ID NO:31具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:31具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:31具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:31具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:31具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:31具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:31具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:31的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:31组成的多肽。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸和编码mIL-15/Ra的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与 (本文也称为ssVH-P4-CAR-P2A-IL2sp-mIL15/Ra或P4-BB-mIL15/Ra)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:34具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:34具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:34具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:34具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:34具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:34具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:34具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:34的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:34组成的多肽。

在一些实施方案中，编码ssVH-P4-CAR-P2A-IL2sp-mIL15/Ra或P4-BB-mIL15/Ra的分离的核酸分子包含与ATGGACTGGACATGGCGGATACTCTTCCTCGTCGCTGCTGCAACCGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGGCCAGGTTTGGTGACTCCTAGTCAGACATTGAGCTTGACTTGTGCTATCAGCGGAGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCAACTTGGAACTGGATTCGGCAGTCCCCCAGCCGGGGGCTCGAGTGGTTGGGTCGGACCTACTATCGGAGCAAATGGTACAATGACTATGCAGTGAGCGTCAAATCAAGAATGAGCATCAATCCTGACACAAGCAAGAACCAGTTTAGCCTTCAGCTTAATAGCGTGACTCCAGAGGACACAGCTGTGTACTATTGCGCGAGAGGCATGATGACATACTATTACGGAATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACTACTGTTACAGTGTCAAGCGGAATCCTCGGTAGCGGAGGCGGCGGTTCCGGCGGAGGGGGTAGTGGTGGCGGGGGTAGTCAA

CCTGTGCTGACCCAGAGCAGCTCTCTTAGTGCTAGCCCAGGTG

CAAGTGCAAGTCTTACCTGTACACTGCGCTCCGGTATTAATGT

GGGCCCTTACCGAATTTACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCTCC

CCTCCCCAGTATCTGCTGAACTATAAGTCTGACTCAGACAAAC

AGCAGGGCTCCGGTGTGCCATCCCGATTTAGTGGCTCAAAGGA

TGCTAGTGCAAATGCCGGTGTTCTCCTGATCAGCGGACTCAGA

TCAGAGGACGAAGCAGACTATTACTGTATGATTTGGCATAGCA

GCGCTGCTGTCTTCGGAGGAGGGACTCAGCTCACTGTCTTGAG

TCGGGCCGCTGCACCTACCACTACCCCTGCCCCTCGACCCCCTA

CTCCCGCCCCAACTATCGCATCCCAACCACTCTCTCTCAGACCC

GAAGCCTGTAGACCCGCAGCCGGTGGCGCTGTGCATACTCGCG

GACTTGATTTTGCTTGTGATATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCC

GGAACTTGTGGAGTTCTCCTGCTGTCTCTCGTAATCACCCTTTA

TTGTAACAAACGGGGGCGCAAAAAACTTCTTTACATTTTCAAG

CAGCCCTTTATGCGGCCCGTGCAGACCACACAGGAAGAAGATG

GCTGCAGCTGCAGGTTCCCAGAGGAAGAAGAGGGCGGCTGCG

AGCTGCGAGTAAAGTTCAGCCGGAGCGCCGATGCACCTGCATA

CCAGCAGGGTCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAACCTGGGC

AGAAGAGAGGAATATGATGTACTCGACAAGAGAAGGGGACGC

GATCCAGAGATGGGCGGCAAACCACGGCGGAAAAATCCGCAG

GAGGGGCTCTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCAGAA

GCCTACTCAGAAATTGGCATGAAAGGAGAGAGAAGGAGGGGA

AAGGGCCATGATGGCCTTTACCAAGGGTTGTCTACTGCCACCA

AGGATACGTACGATGCACTCCATATGCAGGCTCTTCCTCCCCG

AGGTTCAGGCGCAACAAATTTTTCACTTCTTAAACAAGCTGGC

GATGTCGAGGAAAACCCAGGTCCCATGTATAGAATGCAGCTTC

TGTCATGTATCGCACTGAGTCTGGCCCTGGTGACCAACAGTGC

CACCAGCAACTGGGTGAATGTGATAAGCGACCTTAAGAAAAT

AGAAGACCTTATTCAGTCCATGCACATAGATGCCACACTGTAC

ACCGAGAGCGATGTGCACCCTTCCTGCAAAGTGACAGCTATGA

AATGCTTCCTTCTGGAACTGCAAGTAATTTCATTGGAATCTGGC

GATGCTTCCATACATGACACCGTGGAAAACCTTATTATTTTGGC

TAACAATTCATTGAGCTCAAATGGAAACGTGACAGAATCCGGT

TGTAAGGAATGTGAAGAGCTGGAAGAAAAAAATATCAAGGAA

TTCCTGCAGAGCTTTGTTCACATTGTGCAAATGTTTATTAATAC

ATCCTCAGGGGGCGGTTCCGGAGGCGGGGGAAGTGGCGGAGG

AGGAAGCGGCGGAGGAGGAAGCGGAGGAGGATCACTTCAAAT

CACATGTCCCCCCCCTATGAGTGTTGAACATGCTGACATCTGG

GTGAAATCCTATTCCCTTTATTCAAGAGAACGATACATATGTA

ATTCCGGGTTTAAGAGGAAAGCAGGCACATCATCTCTCACCGA

ATGTGTCCTGAATAAGGCGACAAACGTAGCTCACTGGACTACG

CCCTCCCTCAAATGCATTAGAGACCCAGCACTCGTGCACCAAA

GGCCAGCCCCCCCAAGCACCGTCACTACTGCAGGTGTAACCCC

GCAACCAGAATCCCTCTCACCAAGCGGAAAAGAGCCAGCCGC

ATCTTCTCCTAGTTCCAATAATACAGCCGCGACAACAGCCGCA

ATTGTCCCTGGAAGCCAGTTGATGCCATCAAAGTCCCCAAGTA

CGGGTACGACCGAAATCTCCTCCCACGAAAGCAGCCACGGAA

CACCAAGCCAGACTACCGCCAAGAACTGGGAGCTGACCGCTTC

TGCATCACATCAGCCGCCGGGAGTGTATCCACAGGGGCACTCT

GATACCACAGTAGCAATCTCAACCTCCACCGTCCTGCTGTGTG

GCCTTAGCGCTGTGTCTCTCCTCGCATGTTACCTCAAATCCAGG

CAGACCCCCCCCCTTGCTAGTGTCGAAATGGAGGCAATGGAAG

CACTTCCCGTGACATGGGGCACTTCTAGCAGAGATGAGGACCTTGAAAACTGCTCACACCACCTC(SEQID NO:37)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:37具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ IDNO:37具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:37具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:37具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:37具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:37具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:37具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:37。在一些情况下，分离的核酸分子由SEQ ID NO:37组成。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸和编码sushi15的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:35)(本文也称为ssVH-P4-CAR-P2A-sushi15或P4-BB-sushi15)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:35具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQID NO:35具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQID NO:35具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:35具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:35具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:35具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:35具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:35的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:35组成的多肽。

在一些实施方案中，编码ssVH-P4-CAR-P2A-sushi15或P4-BB-sushi15的分离的核酸分子包含与ATGGACTGGACATGGCGGATACTCTTCCTCGTCGCTGCTGCAACCGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGGCCAGGTTTGGTGACTCCTAGTCAGACATTGAGCTTGACTTGTGCTATCAGCGGAGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCAACTTGGAACTGGATTCGGCAGTCCCCCAGCCGGGGGCTCGAGTGGTTGGGTCGGACCTACTATCGGAGCAAATGGTACAATGACTATGCAGTGAGCGTCAAATCAAGAATGAGCATCAATCCTGACACAAGCAAGAACCAGTTTAGCCTTCAGCTTAATAGCGTGACTCCAGAGGACACAGCTGTGTACTATTGCGCGAGAGGCATGATGACATACTATTACGGAATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACTACTGTTACAGTGTCAAGCGGAATCCTCGGTAGCGGAGGCGGCGGTTCCGGCGGAGGGGGTAGTGGTGGCGGGGGTAGTCAACCTGTGCTGACCCAGAGCAGCTCTCTTAGTGCTAGCCCAGGTGCAAGTGCAAGTCTTACCTGTACACTGCGCTCCGGTATTAATGTGGGCCCTTACCGAATTTACTGGTACCAGCAGAAACCAGGATCCCCTCCCCAGTATCTGCTGAACTATAAGTCTGACTCAGACAAACAGCAGGGCTCCGGTGTGCCATCCCGATTTAGTGGCTCAAAGGATGCTAGTGCAAATGCCGGTGTTCTCCTGATCAGCGGACTCAGATCAGAGG

ACGAAGCAGACTATTACTGTATGATTTGGCATAGCAGCGCTGC

TGTCTTCGGAGGAGGGACTCAGCTCACTGTCTTGAGTCGGGCC

GCTGCACCTACCACTACCCCTGCCCCTCGACCCCCTACTCCCGC

CCCAACTATCGCATCCCAACCACTCTCTCTCAGACCCGAAGCC

TGTAGACCCGCAGCCGGTGGCGCTGTGCATACTCGCGGACTTG

ATTTTGCTTGTGATATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGAACT

TGTGGAGTTCTCCTGCTGTCTCTCGTAATCACCCTTTATTGTAA

CAAACGGGGGCGCAAAAAACTTCTTTACATTTTCAAGCAGCCC

TTTATGCGGCCCGTGCAGACCACACAGGAAGAAGATGGCTGCA

GCTGCAGGTTCCCAGAGGAAGAAGAGGGCGGCTGCGAGCTGC

GAGTAAAGTTCAGCCGGAGCGCCGATGCACCTGCATACCAGCA

GGGTCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAACCTGGGCAGAAG

AGAGGAATATGATGTACTCGACAAGAGAAGGGGACGCGATCC

AGAGATGGGCGGCAAACCACGGCGGAAAAATCCGCAGGAGGG

GCTCTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCAGAAGCCTA

CTCAGAAATTGGCATGAAAGGAGAGAGAAGGAGGGGAAAGG

GCCATGATGGCCTTTACCAAGGGTTGTCTACTGCCACCAAGGA

TACGTACGATGCACTCCATATGCAGGCTCTTCCTCCCCGAGGG

TCTGGCGCTACGAATTTCTCTCTCCTTAAACAGGCCGGAGACG

TGGAAGAAAATCCCGGCCCGATGGCGCCCCGCAGGGCCCGCG

GGTGTCGAACATTGGGTCTGCCTGCTCTCTTGCTGCTGTTGCTT

CTCAGACCTCCCGCCACACGCGGAATTACGTGCCCTCCCCCCA

TGTCTGTGGAACATGCCGACATATGGGTCAAGTCTTACAGTCT

TTACTCTAGAGAACGGTATATCTGCAATAGCGGGTTCAAAAGA

AAAGCAGGGACTTCCAGCCTGACAGAGTGCGTACTGAATAAG

GCCACTAACGTTGCTCACTGGACCACCCCATCATTGAAGTGTA

TTCGATCAGGAGGCGGAAGCGGTGGTGGGGGCTCAGGGGGTG

GCGGTAGTGGAGGCGGGGGCAGCGGAGGGGGCTCTTTGCAAA

ACTGGGTTAATGTTATTAGCGACCTTAAGAAAATCGAGGACCT

GATACAGTCCATGCACATCGATGCGACCCTGTACACTGAGAGC

GATGTGCATCCCAGTTGCAAAGTGACTGCTATGAAATGCTTTC

TGCTCGAGTTGCAGGTGATCTCCCTGGAAAGCGGCGACGCCTC

AATACACGACACGGTCGAAAATCTGATCATTCTCGCCAACAAC

TCTCTCTCAAGTAACGGGAATGTGACAGAAAGTGGATGCAAAG

AATGCGAGGAACTTGAGGAGAAAAACATTAAAGAATTCCTCCAGTCCTTCGTCCACATCGTGCAGATGTTTATCAATACTTCC(SEQ ID NO:38)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:38具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:38具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:38具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:38具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:38具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:38具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID N O:38具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:38。在一些情况下，分离的核酸分子由SEQ I D NO:38组成。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码mIL-15/Ra的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与 (本文也称为ssVH-P4-CAR-P2A-IL2sp-mIL15/Ra-P2A-CCL19或P4-BB-mIL15-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:36具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:36具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:36具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:36具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:36具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:36具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:36具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:36的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ IDNO:36组成的多肽。

在一些实施方案中，编码ssVH-P4-CAR-P2A-IL2sp-mIL15/Ra-P2A-CCL19或P4-BB-mIL15-CCL19的分离的核酸分子包含与ATGGATTGGACCTGGCGAATACTCTTCCTCGTCGCAGCGGCCACTGGTGCCCATTCACAAGTCCAACTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGTCAGACTCTCAGCCTGACTTGTGCAATCAGCGGCGATAGTGTGTCTAGTAATTCTGCAACATGGAACTGGATCAGACAATCACCAAGTCGGGGACTGGAGTGGCTCGGTAGAACCTATTATAGGTCCAAATGGTATAACGATTATGCAGTGTCCGTGAAGTCCCGAATGTCTATCAACCCTGATACTAGTAAGAATCAATTCAGTCTGCAGCTTAACAGCGTAACCCCCGAAGATACTGCTGTGTATTACTGTGCCCGGGGTATGATGACTTACTACTACGGAATGGATGTGTGGGGGCAGGGAACAACCGTTACTGTTTCATCCGGCATTCTCGGGAGCGGAGGCGGTGGAAGCGGTGGGGGAGGGTCCGGGGGAGGAGGATCTCAGCCTGTTCTTACTCAATCTTCTTCCCTCTCCGCCTCACCCGGGGCCTCCGCCTCACTGACCTGCACTCTGCGATCAGGCATCAACGTTGGGCCTTATAGAATCTACTGGTACCAGCAAAAGCCTGGATCACCGCCCCAGTACCTGCTGAACTATAAATCAGACTCAGACAAGCAGCAGGGCTCCGGCGTGCCGAGTCGATTTAGCGGGAGCAAGGACGCGTCTGCTAATGCCGGCGTGCTTCTCATCAGCGGGCTCCGCAGTGAGGATGAGGCAGATTACTACTGCATGATTTGGCATAGCAGTGCAGCCGTATTTGGCGGAGGAACACAGCTGACTGTCCTCTCTCGCGCCGCCGCTCCGACCACCACCCCTGCACCACGCCCACCTACTCCTGCGCCAACCATTGCCAGCCAGCCTCTCTCTCTCCGACCCGAGGCCTGTAGACCTGCCGCTGGCGGTGCAGTTCATACTCGGGGTCTCGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCACCACTGGCTGGCACTTGTGGCGTTTTGCTCCTGTCCCTGGTGATCACTCTCTACTGTAATAAGAGGGGGAGGAAGAAACTCCTGTATATTTTCAAACAACCCTTTATGCGCCCTGTCCAAACCACCCAGGAAGAAGATGGATGTAGTTGCAGATTCCCAGAAGAAGAGGAGGGTGGGTGTGAACTTAGGGTGAAGTTTAGTCGCAGTGCCGA

CGCTCCCGCTTACCAACAGGGTCAGAACCAACTCTACAATGAG

CTGAATCTGGGGAGGCGCGAAGAATACGACGTTCTGGATAAA

AGACGCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGGAAACCGCGGAGA

AAGAACCCACAGGAAGGATTGTACAATGAGCTCCAGAAAGAT

AAGATGGCAGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGGGAG

CGAAGGCGCGGGAAAGGACACGATGGGCTGTACCAGGGTCTT

TCAACCGCGACAAAGGACACCTATGATGCTCTCCATATGCAGG

CCCTCCCGCCACGCGGAAGTGGAGCAACTAATTTTAGCCTTCT

GAAACAAGCTGGCGATGTTGAGGAAAATCCTGGGCCGATGTA

CAGGATGCAGCTGCTTTCTTGCATTGCACTGAGTTTGGCACTCG

TCACCAACTCTGCCACATCAAATTGGGTTAACGTTATCAGCGA

TCTGAAGAAAATCGAGGATTTGATCCAGAGTATGCATATTGAC

GCAACCTTGTATACAGAATCTGATGTGCACCCAAGCTGTAAAG

TCACAGCTATGAAATGCTTTTTGCTGGAACTCCAAGTGATCTCC

CTCGAATCCGGCGATGCATCCATCCACGATACTGTCGAAAACC

TTATAATTTTGGCCAATAACAGCCTCAGCAGCAATGGCAACGT

GACAGAGTCTGGGTGTAAGGAGTGTGAAGAACTGGAGGAGAA

AAATATTAAAGAATTCCTGCAGTCCTTTGTACACATTGTGCAA

ATGTTCATTAACACTTCAAGTGGCGGCGGGAGCGGCGGGGGTG

GTTCAGGTGGTGGCGGCAGCGGTGGTGGGGGGTCTGGCGGGG

GTAGTCTCCAAATTACTTGTCCTCCCCCAATGAGCGTTGAACAC

GCCGACATTTGGGTCAAGTCTTATTCACTGTACAGCCGAGAAA

GATATATCTGTAACTCTGGATTTAAGCGCAAGGCCGGAACGTC

TAGTCTGACTGAGTGCGTGCTGAATAAGGCCACTAATGTTGCC

CACTGGACTACCCCCAGCCTGAAGTGTATTCGCGATCCTGCCTT

GGTGCACCAACGACCCGCGCCACCCAGCACAGTCACTACTGCC

GGTGTGACTCCACAGCCCGAGTCTTTGTCCCCGAGCGGAAAGG

AGCCCGCCGCATCTTCACCTTCTTCAAATAACACGGCCGCCAC

AACCGCTGCAATCGTCCCAGGTAGTCAACTGATGCCCTCTAAA

AGCCCCTCTACGGGGACAACTGAGATAAGCAGCCACGAGTCTA

GTCACGGCACACCAAGCCAGACTACCGCCAAAAACTGGGAGC

TGACCGCCTCTGCCTCACACCAACCACCAGGCGTGTATCCCCA

GGGGCACAGCGACACCACTGTGGCAATCAGCACCAGCACGGT

ACTGTTGTGCGGACTCTCTGCCGTCAGTCTGCTGGCCTGCTACC

TGAAATCCAGACAGACTCCCCCCCTGGCCAGCGTGGAAATGGA

AGCTATGGAGGCTCTGCCCGTGACCTGGGGGACTAGCTCCAGA

GATGAAGACTTGGAGAACTGCAGTCACCATCTCGGGTCCGGAG

CCACGAATTTCTCTCTCCTCAAACAAGCTGGGGATGTTGAGGA

GAACCCTGGGCCAATGGCCCTCTTGCTCGCACTGTCCCTCCTGG

TCCTGTGGACATCACCCGCCCCCACCCTGTCCGGCACGAATGA

CGCAGAAGACTGCTGCCTGTCTGTCACGCAGAAACCCATCCCC

GGCTATATAGTGCGGAACTTCCATTACCTGCTGATCAAGGACG

GATGTAGGGTGCCAGCCGTCGTCTTCACCACCCTGCGAGGGCG

CCAGCTGTGCGCTCCTCCTGACCAGCCCTGGGTGGAGCGGATC

ATTCAACGCTTGCAGCGCACCTCAGCAAAAATGAAAAGAAGAAGTAGT(SEQ ID NO:39)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:39具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:39具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID N O:39具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:39具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:39具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:39具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQID NO:39具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:39。在一些情况下，分离的核酸分子由SEQ ID NO:39组成。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码sushi15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMAPRRARGCRTLGLPALLLLLLLRPPATRGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS(SEQ ID NO:15)(本文也称为ssVH-P4-CAR-P2A-sushi15-P2A-CCL19或P4-BB-sushi15-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:15具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQID NO:15具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ IDNO:15具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:15具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:15具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:15具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:15具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:15的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:15组成的多肽。

在一些实施方案中，编码ssVH-P4-CAR-P2A-sushi15-P2A-CCL19或P4-BB-sushi15-CCL19的分离的核酸分子包含与ATGGATTGGACCTGGCGAATACTCTTCCTCGTCGCAGCGGCCACTGGTGCCCATTCACAAGTCCAACTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGTCAGACTCTCAGCCTGACTTGTGCAATCAGCGGCGATAGTGTGTCTAGTAATTCTGCAACATGGAACTGGATCAGACAATCACCAAGTCGGGGACTGGAGTGGCTCGGTAGAACCTATTATAGGTCCAAATGGTATAACGATTATGCAGTGTCCGTGAAGTCCCGAATGTCTATCAACCCTGATACTAGTAAGAATCAATTCAGTCTGCAGCTTAACAGCGTAACCCCCGAAGATACTGCTGTGTATTACTGTGCCCGGGGTATGATGACTTACTACTACGGAATGGATGTGTGGGGGCAGGGAACAACCGTTACTGTTTCATCCGGCATTCTCGGGAGCGGAGGCGGTGGAAGCGGTGGGGGAGGGTCCGGGGGAGGAGGATCTCAGCCTGTTCTTACTCAATCTTCTTCCCTCTCCGCCTCACCCGGGGCCTCCGCCTCACTGACCTGCACTCTGCGATCAGGCATCAACGTTGGGCCTTATAGAATCTACTGGTACCAGCAAAAGCCTGGATCACCGCCCCAGTACCTGCTGAACTATAAATCAGACTCAGACAAGCAGCAGGGCTCCGGCGTGCCGAGTCGATTTAGCGGGAGCAAGGACGCGTCTGCTAATGCCGGCGTGCTTCTCATCAGCGGGCTCCGCAGTGAGGATGAGGCAGATTACTACTGCATGATTTGGCATAGCAGTGCAGCCGTATTTGGCGGAGGAACACAGCTGACTGTCCTCTCTCGCGCCGCCGCTCCGACCACCACCCCTGCACCACGCCCACCTACTCCTGCGCCAACCATTGCCAGCCAGCCTCTCTCTCT

CCGACCCGAGGCCTGTAGACCTGCCGCTGGCGGTGCAGTTCAT

ACTCGGGGTCTCGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCAC

CACTGGCTGGCACTTGTGGCGTTTTGCTCCTGTCCCTGGTGATC

ACTCTCTACTGTAATAAGAGGGGGAGGAAGAAACTCCTGTATA

TTTTCAAACAACCCTTTATGCGCCCTGTCCAAACCACCCAGGA

AGAAGATGGATGTAGTTGCAGATTCCCAGAAGAAGAGGAGGG

TGGGTGTGAACTTAGGGTGAAGTTTAGTCGCAGTGCCGACGCT

CCCGCTTACCAACAGGGTCAGAACCAACTCTACAATGAGCTGA

ATCTGGGGAGGCGCGAAGAATACGACGTTCTGGATAAAAGAC

GCGGCCGCGACCCCGAGATGGGCGGGAAACCGCGGAGAAAGA

ACCCACAGGAAGGATTGTACAATGAGCTCCAGAAAGATAAGA

TGGCAGAAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGGGAGCGAA

GGCGCGGGAAAGGACACGATGGGCTGTACCAGGGTCTTTCAA

CCGCGACAAAGGACACCTATGATGCTCTCCATATGCAGGCCCT

CCCGCCACGCGGAAGTGGAGCAACTAATTTTAGCCTTCTGAAA

CAAGCTGGCGATGTTGAGGAAAATCCTGGGCCGATGGCACCTA

GACGGGCACGCGGGTGTAGAACGCTGGGCCTCCCCGCACTGTT

GTTGCTCTTGCTTCTGAGACCTCCCGCTACAAGGGGGATAACTT

GCCCTCCACCTATGAGCGTCGAGCATGCTGACATTTGGGTGAA

GTCCTATTCACTCTATTCCCGGGAGCGGTACATCTGTAACTCTG

GATTCAAGAGGAAAGCCGGCACCAGCAGTCTGACCGAGTGCG

TGCTGAATAAGGCCACCAATGTGGCCCACTGGACAACCCCTAG

CCTTAAATGTATACGGTCAGGGGGCGGATCTGGAGGCGGCGGC

TCCGGTGGAGGCGGGAGTGGGGGCGGGGGCTCTGGAGGTGGT

AGCCTGCAGAATTGGGTTAACGTGATTAGCGACCTCAAAAAAA

TCGAAGATCTTATCCAGAGCATGCATATAGACGCAACCCTGTA

CACAGAAAGCGATGTTCACCCGTCCTGCAAGGTAACGGCTATG

AAGTGTTTTCTTTTGGAGTTGCAAGTCATATCACTGGAAAGTG

GGGATGCCTCAATTCACGATACCGTGGAGAACCTCATCATCCT

CGCAAATAACAGCCTGAGCTCCAATGGCAATGTCACAGAGTCA

GGTTGCAAAGAGTGTGAAGAGCTGGAAGAGAAAAACATCAAA

GAGTTCCTCCAGTCATTTGTGCACATTGTCCAGATGTTCATTAA

CACTAGTGGTAGTGGTGCCACAAATTTTAGTCTGTTGAAACAG

GCCGGGGACGTCGAAGAAAACCCGGGGCCTATGGCCCTCTTGC

TCGCACTGTCCCTCCTGGTCCTGTGGACATCACCCGCCCCCACC

CTGTCCGGCACGAATGACGCAGAAGACTGCTGCCTGTCTGTCA

CGCAGAAACCCATCCCCGGCTATATAGTGCGGAACTTCCATTA

CCTGCTGATCAAGGACGGATGTAGGGTGCCAGCCGTCGTCTTC

ACCACCCTGCGAGGGCGCCAGCTGTGCGCTCCTCCTGACCAGC

CCTGGGTGGAGCGGATCATTCAACGCTTGCAGCGCACCTCAGCAAAAATGAAAAGAAGAAGTAGT(SEQID NO:40)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:40具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:40具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:40具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:40具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID N O:40具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:40具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:40具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:40。在一些情况下，分离的核酸分子由SEQ ID NO:40组成。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸和编码mIL15/Ra-LSP的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与 (本文也称为ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-mIL15/Ra或ssVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:53具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:53具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:53具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:53具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:53具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:53具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:53具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:53的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ IDNO:53组成的多肽。

在一些实施方案中，编码ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-mIL15/Ra或ssVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP的分离的核酸分子包含与ATGGACTGGACATGGCGGATACTCTTCCTCGTCGCTGCTGCAACCGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGGCCAGGTTTGGTGACTCCTAGTCAGACATTGAGCTTGACTTGTGCTATCAGCGGAGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCAACTTGGAACTGGATTCGGCAGTCCCCCAGCCGGGGGCTCGAGTGGTTGGGTCGGACCTACTATCGGAGCAAATGGTACAATGACTATGCAGTGAGCGTCAAATCAAGAATGAGCATCAATCCTGACACAAGCAAGAACCAGTTTAGCCTTCAGCTTAATAGCGTGACTCCAGAGGACACAGCTGTGTACTATTGCGCGAGAGGCATGATGACATACTATTACGGAATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACTACTGTTACAGTGTCAAGCGGAATCCTCGGTAGCGGAGGCGGCGGTTCCGGCGGAGGGGGTAGTGGTGGCGGGGGTAGTCAACCTGTGCTGACCCAGAGCAGCTCTCTTAGTGCTAGCCCAGGTGCAAGTGCAAGTCTTACCTGTACACTGCGCTCCGGTATTAATGTGGGCCCTTACCGAATTTACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCTCCCCTCCCCAGTATCTGCTGAACTATAAGTCTGACTCAGACAAACAGCAGGGCTCCGGTGTGCCATCCCGATTTAGTGGCTCAAAGGATGCTAGTGCAAATGCCGGTGTTCTCCTGATCAGCGGACTCAGATCAGAGGACGAAGCAGACTATTACTGTATGATTTGGCATAGCAGCGCTGCTGTCTTCGGAGGAGGGACTCAGCTCACTGTCTTGAGTCGGGCCGCTGCACCTACCACTACCCCTGCCCCTCGACCCCCTACTCCCGCCCCAACTATCGCATCCCAACCACTCTCTCTCAGACCCGAAGCCTGTAGACCCGCAGCCGGTGGCGCTGTGCATACTCGCGGACTTGATTTTGCTTGTGATATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGAACTTGTGGAGTTCTCCTGCTGTCTCTCGTAATCACCCTTTATTGTAACAAACGGGG

GCGCAAAAAACTTCTTTACATTTTCAAGCAGCCCTTTATGCGGC

CCGTGCAGACCACACAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCAGGT

TCCCAGAGGAAGAAGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGAGTAAAGT

TCAGCCGGAGCGCCGATGCACCTGCATACCAGCAGGGTCAGA

ACCAGCTCTACAATGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAAT

ATGATGTACTCGACAAGAGAAGGGGACGCGATCCAGAGATGG

GCGGCAAACCACGGCGGAAAAATCCGCAGGAGGGGCTCTATA

ACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCAGAAGCCTACTCAGAAA

TTGGCATGAAAGGAGAGAGAAGGAGGGGAAAGGGCCATGATG

GCCTTTACCAAGGGTTGTCTACTGCCACCAAGGATACGTACGA

TGCACTCCATATGCAGGCTCTTCCTCCCCGAGGCTCAGGAGCC

ACCAACTTCTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGA

ACCCAGGTCCTATGAGAATCTCAAAACCCCATCTTAGAAGCAT

CTCTATACAGTGTTATCTGTGTCTCTTGCTGAACTCCCACTTTTT

GACAGAAGCTGGGATACATGTCTTTATCCTGGGATGTTTTTCCG

CCGGGCTCCCTAAAACCGAGGCCAACTGGGTAAACGTAATCTC

AGACCTTAAAAAGATTGAGGACCTGATTCAGTCAATGCATATC

GATGCAACTTTGTACACGGAGAGCGATGTTCACCCAAGTTGTA

AAGTGACCGCGATGAAATGTTTTCTCCTCGAATTGCAGGTGAT

CTCCCTCGAGTCAGGCGACGCGTCTATCCACGATACTGTGGAA

AACCTTATCATTTTGGCGAACAATAGCCTCTCATCTAATGGTAA

CGTGACCGAGTCCGGCTGCAAGGAATGTGAGGAACTGGAGGA

GAAAAATATCAAGGAATTCCTGCAGTCATTTGTACACATCGTG

CAAATGTTTATCAACACTTCTTCAGGAGGCGGGTCAGGAGGGG

GAGGCTCAGGCGGCGGAGGTAGTGGAGGAGGAGGAAGTGGAG

GCGGCAGTCTCCAGATCACCTGTCCACCACCAATGAGTGTGGA

ACACGCGGACATTTGGGTCAAGTCATATTCTCTTTACTCCAGA

GAGCGATACATATGCAACAGTGGTTTCAAGCGGAAAGCGGGT

ACTTCTTCACTTACCGAGTGCGTGCTCAATAAAGCAACCAACG

TCGCGCACTGGACAACACCTAGCCTGAAATGCATAAGAGATCC

TGCCCTGGTTCACCAGCGGCCAGCGCCACCGTCCACAGTGACA

ACAGCTGGTGTGACACCCCAGCCGGAGAGCCTTAGCCCTAGCG

GCAAAGAGCCGGCCGCAAGCTCACCAAGCTCAAATAACACAG

CCGCGACAACTGCTGCTATCGTGCCCGGTTCACAATTGATGCC

GAGCAAATCACCAAGCACCGGAACTACCGAAATCTCAAGTCAT

GAAAGTAGTCACGGTACTCCTAGCCAGACGACGGCAAAGAAT

TGGGAGCTGACTGCCTCTGCGAGCCACCAGCCGCCGGGTGTTT

ACCCTCAGGGGCATTCAGATACTACTGTGGCTATCTCTACTTCC

ACCGTCCTCTTGTGCGGCTTGTCTGCTGTGTCTCTTCTGGCTTG

CTATTTGAAAAGTAGACAGACACCACCCCTTGCAAGTGTCGAG

ATGGAAGCGATGGAGGCATTGCCTGTGACCTGGGGAACCAGTAGTAGGGACGAGGACCTGGAAAATTGTAGTCACCACCTGTGA(SEQ ID NO:58)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:58具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:58具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:58具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:58具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:58具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:58具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID N O:58具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:58。在一些情况下，分离的核酸分子由SEQ I D NO:58组成。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸和编码sIL15-LSP的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGP GLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:54)(本文也称为ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15或ssVHsp-P4-BB-sIL15-LSP)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:54具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:54具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:54具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:54具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:54具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID N O:54具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:54具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:54的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:54组成的多肽。

在一些实施方案中，编码ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15或ssVHsp-P4-BB-sIL15-LSP的分离的核酸分子包含与ATGGACTGGACATGGCGGATACTCTTCCTCGTCGCTGCTGCAACCGGAGCCCACAGCCAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGGCCAGGTTTGGTGACTCCTAGTCAGACATTGAGCTTGACTTGTGCTATCAGCGGAGACTCTGTTTCATCTAATTCTGCAACTTGGAACTGGATTCGGCAGTCCCCCAGCCGGGGGCTCGAGTGGTTGGGTCGGACCTACTATCGGAGCAAATGGTACAATGACTATGCAGTGAGCGTCAAATCAAGAATGAGCATCAATCCTGACACAAGCAAGAACCAGTTTAGCCTTCAGCTTAATAGCGTGACTCCAGAGGACACAGCTGTGTACTATTGCGCGAGAGGCATGATGACATACTATTACGGAATGGACGTGTGGGGCCAGGGAACTACTGTTACAGTGTCAAGCGGAATCCTCGGTAGCGGAGGCGGCGGTTCCGGCGGAGGGGGTAGTGGTGGCGGGGGTAGTCAACCTGTGCTGACCCAGAGCAGCTCTCTTAGTGCTAGCCCAGGTGCAAGTGCAAGTCTTACCTGTACACTGCGCTCCGGTATTAATGTGGGCCCTTACCGAATTTACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCTCCCCTCCCCAGTATCTGCTGAACTATAAGTCTGACTCAGACAAACAGCAGGGCTCCGGTGTGCCATCCCGATTTAGTGGCTCAAAGGATGCTAGTGCAAATGCCGGTGTTCTCCTGATCAGCGGACTCAGATCAGAGGACGAAGCAGACTATTACTGTATGATTTGGCATAGCAGCGCTGCTGTCTTCGGAGGAGGGACTCAGCTCACTGTCTTGAGTCGGGCCGCTGCACCTACCACTACCCCTGCCCCTCGACCCCCTACTCCCGCCCCAACTATCGCATCCCAACCACTCTCTCTCAGACCCGAAGCCTGTAGACCCGCAGCCGGTGGCGCTGTGCATACTCGCGGACTTGATTTTGCTTGTGATATTTATATCTGGGCCCCCCTTGCCGGAACTTGTGGAGTTCTCCTGCTGTCTCTCGTAATCACCCTTTATTGTAACAAACGGGGGCGCAAAAAACTTCTTTACATTTTCAAGCAGCCCTTTATGCGGCCCGTGCAGACCACACAGGAAGAAGATGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCAGAGGAAGAAGAGGGCGGCTGCGAGCTGCGAGTAAAGTTCAGCCGGAGCGCCGATGCACCTGCATACCAGCAGGGTCAGAACCAGCTCTACAATGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAATATGATGTACTCGACAAGAGAAGGGGACGCGATCCAGAGATGGGCGGCAAACCACGGCGGAAAAATCCGCAGGAGGGGCTCTATAACGAGCTCCAGAAGGACAAGATGGCAGAAGCCTACTCAGAAATTGGCATGAAAGGAGAGAGAAGGAGGGGAAAGGGCCATGATGGCCTTTACCAAGGGTTGTCTACTGCCACCAAGGATACGTACGATGCACTCCATATGCAGGCTCTTCCTCCCCGAGGTTCAGGCGCAACAAATTTTTCACTTCTTAAACAAGCTGGCGATGTCGAGGAAAACCCAGGTCCCATGCGGATCTCTAAACCCCACTTGCGGAGCATTTCTATCCAGTGTTATCTTTGCCTCCTGCTTAACTCCCACTTTCTCACAGAAGCAGGGATACACGTGTTCATCCTGGGCTGTTTTTCTGCCGGTCTCCCCAAAACAGAAGCCAACTGGGTGAATGTGATCAGTGATCTTAAGAAAATAGAAGACCTCATCCAGTCAATGCACATCGATGCCACCTTGTACACTGAGAGCGACGTGCACCCTTCCTGCAAGGTGACAGCTATGAAGTGCTTCCTGCTTGAGCTCCAGGTCATATCCCTTGAGTCTGGAGATGCAAGTATCCACGATACGGTGGAAAACCTTATTATACTGGCCAATAATTCTCTTTCTTCCAATGGCAATGTTACCGAATCAGGGTGTAAAGAGTGCGAAGAGCTGGAGGAGAAAAATATCAAAGAGTTTTTGCAGTCATTTGTGCACATCGTCCAGATGTTTATTAATACAAGTTGA(SEQ ID NO:59)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:59具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:59具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:59具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:59具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:59具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQID NO:59具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:59具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含SEQ ID NO:59。在一些情况下，分离的核酸分子由SEQ ID NO:59组成。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码mIL15/Ra-LSP的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与MDWTWRILFLVAAATGAHSQVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLSRAAAPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS(SEQ ID NO:55)(本文也称为ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ IDNO:55具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:55具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:55具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:55具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:55具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:55具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:55具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:55的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:55组成的多肽。

在一些实施方案中，编码ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP-CCL19的分离的核酸分子包含与ATGGATTGGACCTGGCGAATACTCTTCCTCGTCGCAGCGGCCACTGGTGCCCATTCACAAGTCCAACTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGTCAGACTCTCAGCCTGACTTGTGCAATCAGCGGCGATAGTGTGTCTAGTAATTCTGCAACATGGAACTGGATCAGACAATCACCAAGTCGGGGACTGGAGTGGCTCGGTAGAACCTATTATAGGTCCAAATGGTATAACGATTATGCAGTGTCCGTGAAGTCCCGAATGTCTATCAACCCTGATACTAGTAAGAATCAATTCAGTCTGCAGCTTAACAGCGTAACCCCCGAAGATACTGCTGTGTATTACTGTGCCCGGGGTATGATGACTTACTACTACGGAATGGATGTGTGGGGGCAGGGAACAACCGTTACTGTTTCATCCGGCATTCTCGGGAGCGGAGGCGGTGGAAGCGGTGGGGGAGGGTCCGGGGGAGGAGGATCTCAGCCTGTTCTTACTCAATCTTCTTCCCTCTCCGCCTCACCCGGGGCCTCCGCCTCACTGACCTGCACTCTGCGATCAGGCATCAACGTTGGGCCTTATAGAATCTACTGGTACCAGCAAAAGCCTGGATCACCGCCCCAGTACCTGCTGAACTATAAATCAGACTCAGACAAGCAGCAGGGCTCCGGCGTGCCGAGTCGATTTAGCGGGAGCAAGGACGCGTCTGCTAATGCCGGCGTGCTTCTCATCAGCGGGCTCCGC

AGTGAGGATGAGGCAGATTACTACTGCATGATTTGGCATAGCA

GTGCAGCCGTATTTGGCGGAGGAACACAGCTGACTGTCCTCTC

TCGCGCCGCCGCTCCGACCACCACCCCTGCACCACGCCCACCT

ACTCCTGCGCCAACCATTGCCAGCCAGCCTCTCTCTCTCCGACC

CGAGGCCTGTAGACCTGCCGCTGGCGGTGCAGTTCATACTCGG

GGTCTCGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCACCACTGG

CTGGCACTTGTGGCGTTTTGCTCCTGTCCCTGGTGATCACTCTC

TACTGTAATAAGAGGGGGAGGAAGAAACTCCTGTATATTTTCA

AACAACCCTTTATGCGCCCTGTCCAAACCACCCAGGAAGAAGA

TGGATGTAGTTGCAGATTCCCAGAAGAAGAGGAGGGTGGGTG

TGAACTTAGGGTGAAGTTTAGTCGCAGTGCCGACGCTCCCGCT

TACCAACAGGGTCAGAACCAACTCTACAATGAGCTGAATCTGG

GGAGGCGCGAAGAATACGACGTTCTGGATAAAAGACGCGGCC

GCGACCCCGAGATGGGCGGGAAACCGCGGAGAAAGAACCCAC

AGGAAGGATTGTACAATGAGCTCCAGAAAGATAAGATGGCAG

AAGCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGGGAGCGAAGGCGCG

GGAAAGGACACGATGGGCTGTACCAGGGTCTTTCAACCGCGAC

AAAGGACACCTATGATGCTCTCCATATGCAGGCCCTCCCGCCA

CGCGGAAGTGGAGCAACTAATTTTAGCCTTCTGAAACAAGCTG

GCGATGTTGAGGAAAATCCTGGGCCGATGCGCATTAGCAAGCC

ACATCTGAGGAGTATCAGCATCCAGTGCTACCTTTGCCTGCTG

CTCAACTCTCACTTTCTGACAGAAGCTGGCATCCACGTCTTCAT

CCTGGGGTGCTTCAGCGCCGGCTTGCCGAAGACCGAAGCCAAC

TGGGTGAATGTGATCTCCGACCTCAAGAAGATCGAGGACCTGA

TCCAGAGTATGCATATTGATGCTACACTTTACACCGAGTCCGA

TGTTCACCCTAGTTGTAAGGTGACTGCCATGAAATGTTTCTTGC

TGGAGCTTCAGGTAATAAGCCTTGAGTCTGGGGATGCAAGCAT

TCATGACACGGTTGAGAATCTCATCATCCTGGCAAATAATTCA

CTGTCTTCAAATGGTAACGTTACAGAGAGCGGCTGTAAGGAGT

GCGAAGAGCTTGAAGAGAAAAACATCAAGGAATTCCTCCAGA

GTTTCGTGCACATCGTGCAAATGTTCATCAACACGAGCTCTGG

AGGCGGATCAGGAGGCGGAGGATCAGGGGGGGGAGGGTCAG

GCGGAGGGGGATCTGGTGGAGGCAGCCTTCAAATCACATGCCC

GCCACCTATGTCCGTTGAGCACGCCGACATATGGGTGAAGTCA

TATTCACTGTATAGTCGGGAGAGGTACATTTGTAATTCAGGTTT

CAAGCGAAAAGCTGGGACATCAAGCCTGACAGAATGCGTACT

TAACAAGGCCACAAATGTCGCCCATTGGACCACTCCGAGTCTG

AAGTGTATACGAGATCCCGCACTGGTGCACCAGCGACCTGCTC

CCCCTAGTACAGTAACAACCGCGGGCGTTACGCCCCAGCCTGA

ATCCCTGAGCCCATCTGGCAAGGAGCCTGCAGCTAGCTCTCCG

AGCAGCAATAATACTGCAGCGACCACTGCAGCCATCGTCCCCG

GCTCCCAGCTCATGCCTAGTAAAAGTCCGTCTACAGGAACGAC

CGAAATCTCCAGCCACGAGTCTAGTCACGGGACCCCGAGTCAG

ACCACTGCCAAGAACTGGGAGCTTACGGCCAGTGCCTCCCATC

AACCCCCGGGCGTCTACCCGCAAGGCCATAGCGACACCACAGT

CGCCATTAGCACATCTACTGTCCTCTTGTGCGGGCTCTCCGCTG

TGTCCCTCCTGGCCTGTTATCTCAAGAGCAGACAGACCCCCCC

ATTGGCAAGCGTTGAGATGGAGGCAATGGAGGCTCTGCCCGTT

ACTTGGGGGACTTCTTCACGCGACGAGGATCTGGAGAACTGCT

CCCACCACCTGGGAAGTGGTGCCACAAATTTCAGCCTGCTCAA

GCAGGCCGGGGATGTTGAAGAGAACCCAGGGCCGATGGCCCT

CTTGCTCGCACTGTCCCTCCTGGTCCTGTGGACATCACCCGCCC

CCACCCTGTCCGGCACGAATGACGCAGAAGACTGCTGCCTGTC

TGTCACGCAGAAACCCATCCCCGGCTATATAGTGCGGAACTTC

CATTACCTGCTGATCAAGGACGGATGTAGGGTGCCAGCCGTCG

TCTTCACCACCCTGCGAGGGCGCCAGCTGTGCGCTCCTCCTGA

CCAGCCCTGGGTGGAGCGGATCATTCAACGCTTGCAGCGCACCTCAGCAAAAATGAAAAGAAGAAGTAGTTGA(SEQ ID NO:60)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:60具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含SEQ I D NO:60。在一些情况下，分离的核酸分子由SEQ ID NO:60组成。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码sIL15-LSP的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与 (本文也称为ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-BB-sIL15-LSP-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ IDNO:56具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:56具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:56具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:56具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:56具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:56具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:56具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:56的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:56组成的多肽。

在一些实施方案中，编码ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-BB-sIL15-LSP-CCL19的分离的核酸分子包含与ATGGATTGGACCTGGCGAATACTCTTCCTCGTCGCAGCGGCCACTGGTGCCCATTCACAAGTCCAACTGCAGCAGAGCGGACCTGGCCTGGTGACACCCAGTCAGACTCTCAGCCTGACTTGTGCAATCAGCGGCGATAGTGTGTCTAGTAATTCTGCAACATGGAACTGGATCAGACAATCACCAAGTCGGGGACTGGAGTGGCTCGGTAGAACCTATTATAGGTCCAAATGGTATAACGATTATGCAGTGTCCGTGAAGTCCCGAATGTCTATCAACCCTGATACTAGTAAGAATCAATTCAGTCTGCAGCTTAACAGCGTAACCCCCGAAGATACTGCTGTGTATTACTGTGCCCGGGGTATGATGACTTACTACTACGGAATGGATGTGTGGGGGCAGGGAAC

AACCGTTACTGTTTCATCCGGCATTCTCGGGAGCGGAGGCGGT

GGAAGCGGTGGGGGAGGGTCCGGGGGAGGAGGATCTCAGCCT

GTTCTTACTCAATCTTCTTCCCTCTCCGCCTCACCCGGGGCCTC

CGCCTCACTGACCTGCACTCTGCGATCAGGCATCAACGTTGGG

CCTTATAGAATCTACTGGTACCAGCAAAAGCCTGGATCACCGC

CCCAGTACCTGCTGAACTATAAATCAGACTCAGACAAGCAGCA

GGGCTCCGGCGTGCCGAGTCGATTTAGCGGGAGCAAGGACGC

GTCTGCTAATGCCGGCGTGCTTCTCATCAGCGGGCTCCGCAGT

GAGGATGAGGCAGATTACTACTGCATGATTTGGCATAGCAGTG

CAGCCGTATTTGGCGGAGGAACACAGCTGACTGTCCTCTCTCG

CGCCGCCGCTCCGACCACCACCCCTGCACCACGCCCACCTACT

CCTGCGCCAACCATTGCCAGCCAGCCTCTCTCTCTCCGACCCGA

GGCCTGTAGACCTGCCGCTGGCGGTGCAGTTCATACTCGGGGT

CTCGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCACCACTGGCTG

GCACTTGTGGCGTTTTGCTCCTGTCCCTGGTGATCACTCTCTAC

TGTAATAAGAGGGGGAGGAAGAAACTCCTGTATATTTTCAAAC

AACCCTTTATGCGCCCTGTCCAAACCACCCAGGAAGAAGATGG

ATGTAGTTGCAGATTCCCAGAAGAAGAGGAGGGTGGGTGTGA

ACTTAGGGTGAAGTTTAGTCGCAGTGCCGACGCTCCCGCTTAC

CAACAGGGTCAGAACCAACTCTACAATGAGCTGAATCTGGGG

AGGCGCGAAGAATACGACGTTCTGGATAAAAGACGCGGCCGC

GACCCCGAGATGGGCGGGAAACCGCGGAGAAAGAACCCACAG

GAAGGATTGTACAATGAGCTCCAGAAAGATAAGATGGCAGAA

GCCTACTCCGAGATCGGCATGAAGGGGGAGCGAAGGCGCGGG

AAAGGACACGATGGGCTGTACCAGGGTCTTTCAACCGCGACAA

AGGACACCTATGATGCTCTCCATATGCAGGCCCTCCCGCCACG

CGGAAGTGGAGCAACTAATTTTAGCCTTCTGAAACAAGCTGGC

GATGTTGAGGAAAATCCTGGGCCGATGCGCATCTCCAAGCCCC

ATCTGAGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGTCTGCTGCT

CAACAGCCACTTCCTGACGGAAGCAGGCATTCATGTCTTTATC

CTGGGATGCTTTTCTGCCGGCCTGCCAAAGACAGAAGCAAACT

GGGTTAACGTTATCAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGACCTGAT

CCAGTCCATGCATATTGACGCTACGCTGTATACAGAGTCCGAC

GTCCACCCATCATGCAAGGTGACCGCTATGAAGTGTTTCCTGC

TGGAACTGCAGGTTATCAGCTTGGAAAGTGGCGACGCTTCCAT

TCACGATACGGTGGAGAACTTGATAATCCTTGCGAATAATAGT

CTGAGCAGCAACGGCAACGTTACTGAAAGCGGGTGCAAAGAA

TGTGAAGAGCTCGAAGAGAAAAACATCAAAGAATTTTTGCAGT

CTTTCGTGCATATTGTTCAGATGTTTATTAACACCAGTGGATCA

GGAGCAACTAACTTCTCTCTTCTTAAGCAAGCTGGCGATGTAG

AGGAAAACCCTGGGCCTATGGCCCTCTTGCTCGCACTGTCCCT

CCTGGTCCTGTGGACATCACCCGCCCCCACCCTGTCCGGCACG

AATGACGCAGAAGACTGCTGCCTGTCTGTCACGCAGAAACCCA

TCCCCGGCTATATAGTGCGGAACTTCCATTACCTGCTGATCAA

GGACGGATGTAGGGTGCCAGCCGTCGTCTTCACCACCCTGCGA

GGGCGCCAGCTGTGCGCTCCTCCTGACCAGCCCTGGGTGGAGC

GGATCATTCAACGCTTGCAGCGCACCTCAGCAAAAATGAAAAGAAGAAGTAGTTGA(SEQ ID NO:61)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:61具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:61具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:61具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:61具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:61具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQID NO:61具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含与SEQ ID NO:61具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，分离的核酸分子包含SEQID NO:61。在一些情况下，分离的核酸分子由SEQ ID NO:61组成。

在一些实施方案中，分离的核酸分子包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码sushi15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，分离的核酸分子编码与/>

(本文也称为ssVH-P4-CD28铰链-TM-CD28cyto-CD3z-P2A-IL15Rasp-IL15Ra(sushi)-20aa接头-IL15-P2A-endospCCL19或SSVHsp-P4-CD28-sushi15-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:57具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:57具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:57具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:57具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID N O:57具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:57具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码与SEQ ID NO:57具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:57的多肽。在一些情况下，分离的核酸分子编码由SEQ ID NO:57组成的多肽。

载体

在一些实施方案中，一种或多种载体涵盖编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸。在一些实施方案中，载体(例如，表达载体)包含核酸分子，所述核酸分子包含：编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含特异性识别人间皮素的抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区；编码IL-15的多核苷酸；和任选编码CCL19的多核苷酸。参见图1A和图1B。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸和编码IL-15的多核苷酸在载体(例如，表达载体)中从5’末端到3’末端排列如下：

编码CAR的多核苷酸-编码IL-15的多核苷酸；或者

编码IL-15的多核苷酸-编码CAR的多核苷酸。

在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸在载体(例如，表达载体)中从5’末端到3’末端排列如下：

在一些实施方案中，第一载体(例如，第一表达载体)包含编码CAR的多核苷酸，第二载体(例如，第二表达载体)包含编码IL-15的多核苷酸。

在一些实施方案中，第一载体(例如，第一表达载体)包含编码CAR的多核苷酸，第二载体(例如，第二表达载体)包含编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸，其中编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸任选地在第二载体(例如，第二表达载体)中从5’末端到3’末端排列为编码IL-15的多核苷酸-编码CCL19的多核苷酸或编码CCL19的多核苷酸-编码IL-15的多核苷酸。

在另外的实施方案中，第一载体(例如，第一表达载体)包含编码CAR的多核苷酸和编码IL-15的多核苷酸或编码CCL19的多核苷酸，并且第二载体(例如，第二表达载体)包含在第一载体中不包括的编码IL-15的多核苷酸或编码CCL19的多核苷酸。在一些实施方案中，第一载体(例如，第一表达载体)包含编码CAR的多核苷酸和编码IL-15的多核苷酸，并且第二载体(例如，第二表达载体)包含编码CCL19的多核苷酸。在其它实施方案中，第一载体(例如，第一表达载体)包含编码CAR的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸，并且第二载体(例如，第二表达载体)包含编码IL-15的多核苷酸。

在另外的实施方案中，第一载体(例如，第一表达载体)包含编码CAR的多核苷酸，第二载体(例如，第二表达载体)包含编码IL-15的多核苷酸，并且第三载体(例如，第三表达载体)包含编码CCL19的多核苷酸。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码mIL-15/Ra的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ IDNO:14(本文也称为mIL15/Ra-P2A-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ IDNO:14具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:14具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:14具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:14具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:14具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:14具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:14具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:14的多肽。在一些情况下，核酸序列编码由SEQ ID NO:14组成的多肽。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码sushi15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:31(本文也称为sushi15-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:31具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:31具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:31具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:31具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:31具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:31具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:31具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:31的多肽。在一些情况下，核酸序列编码由SEQ IDNO:31组成的多肽。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸和编码mIL-15/Ra的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:34(本文也称为ssVH-P4-CAR-P2A-IL2sp-mIL15/Ra或P4-BB-mIL15/Ra)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:34具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:34具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:34具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:34具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:34具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:34具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQID NO:34具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ IDNO:34的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQ ID NO:34组成的多肽。

在一些实施方案中，包含编码ssVH-P4-CAR-P2A-IL2sp-mIL15/Ra或P4-BB-mIL15/Ra的核酸序列的载体包含与SEQ ID NO:37具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:37具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:37具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:37具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:37具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:37具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:37具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:37具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ ID NO:37。在某些情况下，所述核酸序列由SEQ ID NO:37组成。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸和编码sushi15的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:35(本文也称为ssVH-P4-CAR-P2A-sushi15或P4-BB-sushi15)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:35具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:35具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:35具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:35具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:35具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQID NO:35具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:35具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:35的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQ ID NO:35组成的多肽。

在一些实施方案中，包含编码ssVH-P4-CAR-P2A-sushi15或P4-BB-sushi15的核酸序列的载体包含与SEQ ID NO:38具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:38具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:38具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:38具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:38具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:38具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:38具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:38具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ ID NO:38。在某些情况下，所述核酸序列由SEQ ID NO:38组成。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码mIL-15/Ra的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:36(本文也称为ssVH-P4-CAR-P2A-IL2sp-mIL15/Ra-P2A-CCL19或P4-BB-mIL15-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQID NO:36具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ I D NO:36具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:36具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:36具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:36具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与S EQ ID NO:36具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:36具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:36的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQ ID NO:36组成的多肽。

在一些实施方案中，包含编码ssVH-P4-CAR-P2A-IL2sp-mIL15/Ra-P2A-CCL19或P4-BB-mIL15-CCL19的核酸序列的载体包含与SE Q ID NO:39具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:39具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQID NO:39具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:39具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:39具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:39具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:39具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:39具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ ID NO:39。在某些情况下，所述核酸序列由SEQID NO:39组成。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码sushi15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:15(本文也称为ssVH-P4-CAR-P2A-sushi15-P2A-CCL19或P4-BB-sushi15-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ I D NO:15具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:15具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与S EQ ID NO:15具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:15的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQID NO:15组成的多肽。

在一些实施方案中，包含编码ssVH-P4-CAR-P2A-sushi15-P2A-CCL19或P4-BB-sushi15-CCL19的核酸序列的载体包含与SEQ ID NO:40具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQI D NO:40具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:40具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:40具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:40具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与S EQ ID NO:40具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:40具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:40具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ ID NO:40。在某些情况下，所述核酸序列由SEQ ID NO:40组成。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸和编码mIL15/Ra-LSP的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:53(本文也称为ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-mIL15/Ra或SSVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:53具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQID NO:53具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:53具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:53具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:53具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:53具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:53具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:53的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQ ID NO:53组成的多肽。

在一些实施方案中，包含编码ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-mIL15/Ra或SSVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP的核酸序列的载体包含与SEQ ID NO:58具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:58具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:58具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SE Q ID NO:58具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:58具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQID NO:58具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:58具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:58具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ ID NO:58。在某些情况下，所述核酸序列由SEQ ID NO:58组成。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸和编码sIL15-LSP的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:54(本文也称为ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15或SSVHsp-P4-BB-sIL15-LSP)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:54具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:54具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:54具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:54具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:54具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:54具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:54具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:54的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQID NO:54组成的多肽。

在一些实施方案中，包含编码ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15或SSVHsp-P4-BB-sIL15-LSP的核酸序列的载体包含与SEQ ID NO:59具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:59具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:59具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:59具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ IDNO:59具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:59具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:59具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:59具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ ID NO:59。在某些情况下，所述核酸序列由SEQ ID NO:59组成。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码mIL15/Ra-LSP的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:55(本文也称为ssVHsp-P4-CD8h/TM-B B-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:55具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:55具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ I D NO:55具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:55具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:55具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:55具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与S EQ ID NO:55具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:55的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQ ID NO:55组成的多肽。

在一些实施方案中，包含编码ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-BB-mI L15/Ra-LSP-CCL19的核酸序列的载体包含与SEQ ID NO:60具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:60具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:60具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:60具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:60具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:60具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:60具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:60具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ IDNO:60。在某些情况下，所述核酸序列由SEQ ID NO:60组成。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码sIL15-LSP的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:56(本文也称为ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-BB-sIL15-LSP-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:56具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:56具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:56具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:56具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:56具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:56具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQID NO:56具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ IDNO:56的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQ ID NO:56组成的多肽。

在一些实施方案中，包含编码ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-BB-sI L15-LSP-CCL19的核酸序列的载体包含与SEQ ID NO:61具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:61具有约85％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SE Q ID NO:61具有约90％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:61具有约95％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:61具有约96％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:61具有约97％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQ ID NO:61具有约98％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含与SEQID NO:61具有约99％序列同一性的序列。在一些情况下，所述核酸序列包含SEQ ID NO:61。在某些情况下，所述核酸序列由SEQ ID NO:61组成。

在一些实施方案中，本文所述的载体(例如，表达载体)包含编码特异性结合间皮素的CAR的多核苷酸、编码sushi15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸。在一些情况下，载体(例如，表达载体)包含编码与SEQ ID NO:57(本文也称为ssVH-P4-CD28铰链-TM-CD28cyto-CD3z-P2A-IL15Rasp-IL15Ra(sushi)-20aa接头-IL15-P2A-endospCCL19或ssVHsp-P4-CD28-sushi15-CCL19)具有约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽的核酸序列。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:57具有约85％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:57具有约90％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:57具有约95％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:57具有约96％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:57具有约97％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:57具有约98％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码与SEQ ID NO:57具有约99％序列同一性的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:57的多肽。在一些情况下，所述核酸序列编码由SEQ ID NO:57组成的多肽。

本发明的载体(例如，表达载体)可以包含一个或多个天然来源的核酸或人工合成的核酸，并且可以根据本发明的载体(例如，表达载体)将要引入的细胞类型进行适当选择。它们的序列信息可以通过搜索公知的文件或数据库如NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)适当获得。

本发明的载体可以是表达载体，通过将载体与细胞接触而引入免疫细胞或其前体细胞，以便其中编码的预定蛋白质(多肽)可以在免疫细胞中表达，以产生本发明的经修饰的免疫细胞。本发明的表达载体不受任何实施方案的特别限制。本领域的技术人员能够设计和产生容许所需蛋白质(多肽)在免疫细胞中表达的表达载体。包含编码特异性识别人间皮素的细胞表面分子的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸的本发明表达载体的实例可以包括用于产生本发明的免疫细胞的任何表达载体。

本发明的表达载体的类型可以是线性形式或环状形式，并且可以是非病毒载体诸如质粒，可以是病毒载体，或者可以是基于转座子的载体。此类载体可以含有控制序列，诸如启动子或终止子，或选择性标记序列，诸如药物抗性基因或报告基因。编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸可以可操作地排列在启动子序列的下游，使得每种多核苷酸都可以有效转录。

启动子的实例可以包括：病毒来源的启动子，诸如逆转录病毒L TR启动子、SV40早期启动子、巨细胞病毒启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子；以及哺乳动物来源的启动子，诸如磷酸甘油酸激酶(P GK)启动子、Xist启动子、β-肌动蛋白启动子和RNA聚合酶II启动子。在一些实施方案中，启动子可以优选包括逆转录病毒LTR启动子。逆转录病毒LTR启动子可包含CTGAATATGGGCCAAACAGG ATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCA。可替代地，可以使用由四环素诱导的四环素反应性启动子、由干扰素诱导的Mx1启动子等。在本发明的表达载体中使用由特定物质诱导的启动子容许根据癌症的治疗过程控制IL-15表达和任选CCL19表达的诱导，例如，当含有本发明的载体的免疫细胞用作用于治疗癌症的药物组合物时。

病毒载体的实例可以包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体，并且可以优选包括逆转录病毒载体，优选γ逆转录病毒载体，更优选pMSGV载体(Tamada k等人，Clin Cancer Res18:6436-6445(2002))、pMSCV载体(由Takara Bio Inc.制造)或pSFG载体。逆转录病毒载体的使用容许转基因的长期稳定表达，因为所述转基因被整合到宿主细胞的基因组中。

可以使用一种或多种测定法来证实本发明的表达载体包含在免疫细胞中。示例性的测定法可包括用于筛选工程化免疫细胞的CAR表达的流式细胞术、RNA印迹、DNA印迹、PCR(诸如RT-PCR)、ELISA或蛋白质印迹。在一些实施方案中，表达载体还包含标记基因(例如，编码荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或黄色荧光蛋白(YFP))，以检测免疫细胞对CAR、IL-15和/或CCL19的表达。

免疫细胞和生产方法

在某些实施方案中，本文所述的免疫细胞经修饰以表达特异性识别间皮素(例如，人间皮素)的细胞表面分子、IL-15和任选CCL19(图1C和图1D)。示例性的免疫细胞可包括淋巴样细胞诸如T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和B细胞，抗原呈递细胞诸如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或粒细胞诸如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞或肥大细胞。免疫细胞可源自干细胞，例如诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(ESC)、ESC来源的造血祖细胞(HPC)或造血内皮细胞(HEC)。免疫细胞可包括源自哺乳动物诸如人、狗、猫、猪或小鼠的T细胞，优选源自或分离自人的T细胞。免疫细胞(例如，T细胞)可以通过培养获得，例如离体培养获得，或者直接从哺乳动物收获。免疫细胞不受限制，只要该细胞参与免疫反应并能表达特异性识别间皮素(例如，人间皮素)的细胞表面分子，表达IL-15并任选表达CCL19。免疫细胞可以是从需要其进行后续治疗的受试者收获的自体细胞。免疫细胞也可以是有需要的受试者的同种异体细胞或同基因细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞经进一步修饰以由于在受试者中施用免疫细胞而削弱或改善受试者中的炎症或免疫反应。在一些情况下，炎症或免疫反应是移植物抗宿主病(GvHD)，并且免疫细胞经进一步修饰以削弱或改善GvHD。

在一些情况下，免疫细胞经修饰以削弱或去除T细胞受体(TCR)的α链和/或β链的表达。在一些情况下，免疫细胞经修饰以削弱或去除TCR的α链和β链(TCRα/β)的表达。在一些情况下，免疫细胞不表达TCR的α链和β链(TCRα/β)。在一些情况下，一个或多个另外的CD3结构域(例如，CD3δ、CD3γ或CD3ε)经修饰以削弱TCRα/β功能。

在一些情况下，免疫细胞表达γδT细胞受体(gdTCR或γδTCR)。γδT细胞是T细胞亚群，占所有T淋巴细胞的约0.5％-5％。在癌症背景下，已经证实γδT细胞基于细胞表面呈递的γ和δ受体的组合亚群而发挥促肿瘤活性和抗肿瘤活性。例如，表达含有γ链可变区9(Vγ9)和δ链可变区2(Vδ2)的TCR的γδT细胞，也称为Vγ9Vδ2T细胞，发挥抗肿瘤活性，包括但不限于抑制癌细胞增殖、血管生成、淋巴管生成并且增加癌细胞凋亡。γTCR的实例包括Vγ1TCR、Vγ2TCR、Vγ3TCR、Vγ4TCR、Vγ5TCR、Vγ6TCR、Vγ7TCR、Vγ8TCR和Vγ9TCR，并且δTCR的实例包括Vδ1TCR、Vδ2TCR、Vδ3TCR、Vδ4TCR、Vδ5TCR、Vδ6TCR、Vδ7TCR、Vδ8TCR和Vδ9TCR。虽然特定的γTCR和δTCR的组合不受限制，但是例如考虑到了Vγ3Vδ1TCR、Vγ4Vδ1TCR、Vγ9Vδ1TCR和Vγ9Vδ2TCR。在一些情况下，免疫细胞表达Vγ9TCR、Vδ2TCR或Vγ9Vδ2TCR。

在一些实施方案中，本文所述的表达γδT细胞受体(gdTCR或γδTCR)的免疫细胞由诱导多能干细胞(iPSC)产生。在一些情况下，iPSC是由αβT细胞以外的细胞建立的。在一些情况下，通过在分化成γδTCR细胞之前将Vγ9Vδ2基因插入iPSC的基因组中，进一步修饰iPSC。在一些情况下，Vγ9Vδ2基因编码与SEQ ID NO:44具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，Vγ9Vδ2基因编码由SEQ ID NO:44组成的多肽。

在一些实施方案中，本文公开的γδTCR细胞经修饰以表达特异性识别间皮素的CAR并表达IL-15。在一些情况下，γδTCR细胞经进一步修饰以表达CCL19。在一些情况下，γδTCR细胞是从用Vγ9Vδ2基因修饰的iPSC分化而来的。在一些情况下，γδTCR细胞由用Vγ9Vδ2基因修饰的iPSC分化而来，所述基因编码与SEQ ID NO:44具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽。在一些情况下，γδTCR细胞是从用编码由SEQ ID NO:44组成的多肽的Vγ9Vδ2基因修饰的iPSC分化而来的。

在某些实施方案中，本文公开了经修饰以表达特异性识别间皮素的CAR和IL-15的免疫细胞群。在一些情况下，免疫细胞群进一步表达CCL19。在一些实施方案中，免疫细胞群包含经修饰的T细胞(例如，离体扩增的或从哺乳动物收获的)，所述细胞表达特异性识别间皮素的CAR、IL-15和任选CCL19。免疫细胞群可包含约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高百分比的经修饰的T细胞。免疫细胞群可包含约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的经修饰的T细胞。免疫细胞群可包含基本上纯的经修饰的T细胞群。示例性的T细胞可以包括α-βT细胞、γ-δT细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、原初T细胞和自然杀伤T(NKT)细胞。

在一些实施方案中，经修饰以表达特异性识别间皮素的CAR、IL-15和任选CCL19的免疫细胞群包含少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少的污染细胞。如本文所用，术语“污染细胞”是指不表达特异性识别间皮素的CAR、IL-15和任选CCL19的细胞。污染细胞可以包括不表达特异性识别间皮素的CAR、IL-15和任选CCL19的T细胞，以及不表达特异性识别间皮素的CAR、IL-15和任选CCL19的其它类型的免疫细胞。污染细胞也可以指来自体液诸如血液或骨髓液、源自组织诸如脾组织、胸腺或淋巴结、或源自癌组织诸如原发性肿瘤组织、转移性肿瘤组织或癌性腹水的非免疫细胞。

用于产生本发明的免疫细胞的方法的实例可包括将编码细胞表面分子的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸引入免疫细胞的生产方法。所述生产方法可以包括例如WO2016/056228、WO2017/159736、WO2013/176915、WO2015/120096、WO2016/019300，或Vormittag P等人，Curr Opin Biotechnol 2018；53:164-81中描述的方法。替代实例可包括从转基因哺乳动物中纯化和获得免疫细胞的方法，所述转基因哺乳动物是通过以下方式产生的：将用于表达特异性识别间皮素(例如，人间皮素)的细胞表面分子和/或IL-15以及进一步任选CCL19的载体植入受精卵中，并且包括如果需要，将用于表达特异性识别间皮素(例如，人间皮素)的细胞表面分子和/或IL-15以及进一步任选CCL19的载体进一步引入从转基因哺乳动物中纯化和获得的免疫细胞中的生产方法。

在引入编码细胞表面分子的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸或上文描述的载体的情况下，该方法可以是用于将多核苷酸或载体引入免疫细胞的任何方法。实例可以包括电穿孔法(Cytotechnology,3,133(1990))、磷酸钙法(日本未审查专利申请公开号2-227075)、脂质转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84,7413(1987))和病毒感染法。示例性的病毒感染方法可包括用待引入的载体和包装质粒转染包装细胞诸如GP2-293细胞(由Takara Bio Inc.制造)、Plat-GP细胞(由CCosmo Bio Co.,Ltd.制造)、PG13细胞(ATCCCRL-10686)或PA317细胞(ATCC CRL-9078)以产生重组病毒，并用重组病毒感染免疫细胞的方法(参见例如WO2017/159736)。

在一些实施方案中，方法包括将一种或多种载体引入免疫细胞，所述载体包含编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和任选编码CCL19的多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括向免疫细胞引入包含核酸分子的载体(例如，表达载体)，所述核酸分子包含：编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含特异性识别人间皮素的抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区；编码IL-15的多核苷酸；和任选编码CCL19的多核苷酸。在一些实施方案中，方法包括将包含编码CAR的多核苷酸的第一载体(例如，第一表达载体)和包含编码IL-15的多核苷酸的第二载体(例如，第二表达载体)一起或分阶段引入免疫细胞。在一些实施方案中，方法包括将包含编码CAR的多核苷酸的第一载体(例如，第一表达载体)和包含编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸的第二载体(例如，第二表达载体)一起或分阶段引入免疫细胞。在一些实施方案中，方法包括将包含编码CAR的多核苷酸和编码IL-15的多核苷酸或编码CCL19的多核苷酸的第一载体(例如，第一表达载体)和包含在第一载体中不包含的编码IL-15的多核苷酸或编码CCL19的多核苷酸的第二载体(例如，第二表达载体)一起或分阶段引入免疫细胞。在一些实施方案中，方法包括将包含编码CAR的多核苷酸和编码IL-15的多核苷酸的第一载体(例如，第一表达载体)和包含编码CCL19的多核苷酸的第二载体(例如，第二表达载体)一起或分阶段引入免疫细胞。在一些实施方案中，方法包括将包含编码CAR的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸的第一载体(例如，第一表达载体)和包含编码IL-15的多核苷酸的第二载体(例如，第二表达载体)一起或分阶段引入免疫细胞。在一些实施方案中，方法包括将包含编码CAR的多核苷酸的第一载体(例如，第一表达载体)、包含编码IL-15的多核苷酸的第二载体(例如，第二表达载体)和包含编码CCL19的多核苷酸的第三载体(例如，第三表达载体)一起或分阶段引入免疫细胞。

编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸中的一种或多种可以整合到免疫细胞的基因组中。在一些实施方案中，编码CAR的多核苷酸、编码IL-15的多核苷酸和编码CCL19的多核苷酸不整合到基因组中(例如，游离体地)。

使用方法

在某些实施方案中，本文公开了一种治疗表达间皮素的癌症的方法。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用本文所述的免疫细胞，所述免疫细胞经修饰以表达特异性结合间皮素的工程化细胞表面分子、白细胞介素15(IL-15)和任选趋化因子(C-C基序)配体19(CCL19)。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以表达工程化细胞表面分子，其包含特异性识别间皮素的嵌合抗原受体(CAR)或特异性结合间皮素的T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，免疫细胞经修饰以表达CAR，其包含特异性识别人间皮素的抗体、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区和CD3ζ胞内区；IL-15；和任选CCL19。

在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是实体瘤。在一些实施方案中，实体瘤包括间皮瘤、结直肠癌、胰腺癌、胸腺癌、胆管癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈癌、子宫癌、肝癌、肾癌、胃癌(gastric cancer)、脾癌、气管癌、支气管癌、胃癌(stomach cancer)、食道癌、胆囊癌、睾丸癌、卵巢癌或骨癌。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是间皮瘤。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是胃癌。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、肺类癌、肺腺鳞癌、大细胞神经内分泌癌或唾液腺型肺癌)。在一些实施方案中，表达间皮素的癌症是NSCLC(例如，肺腺癌、鳞状细胞癌、大细胞未分化癌、肉瘤样癌或腺鳞癌)。

表达间皮素的癌症可以是造血系统癌症。造血系统癌症可以是B细胞造血系统癌症、T细胞造血系统癌症、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。造血系统癌症可以是急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤或华氏巨球蛋白血症。

造血系统癌症可以是肉瘤。肉瘤可包括软骨肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing’ssarcoma)、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤或软组织肉瘤。

表达间皮素的癌症可以是转移性癌症，例如转移性实体瘤或转移性造血系统癌症。表达间皮素的转移性癌症可以是转移性卵巢癌、转移性间皮瘤、转移性胃癌或转移性肺癌(例如转移性NSCLC)。

表达间皮素的癌症可以是复发性或难治性癌症，例如复发性或难治性实体瘤，或复发性或难治性造血系统癌症。复发性或难治性的表达间皮素的癌症可以是复发性或难治性卵巢癌、复发性或难治性间皮瘤、复发性或难治性胃癌、或复发性或难治性肺癌(例如，复发性或难治性NSCLC)。

在一些实施方案中，方法还包括向受试者施用附加治疗剂或附加治疗方案。附加治疗剂可以包括化学治疗剂、免疫治疗剂、靶向疗法、放射疗法或其组合。说明性的附加治疗剂包括但不限于烷化剂，诸如六甲蜜胺(altretamine)、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺、达卡巴嗪(dacarbazine)、洛莫司汀(lomustine)、美法仑(melphalan)、奥沙利铂(oxaliplatin)、替莫唑胺(temozolomide)或噻替派(thiotepa)；抗代谢物，诸如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨蝶呤(methotrexate)或培美曲塞(pemetrexed)；蒽环类药物，诸如柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)或伊达比星(idarubicin)；拓扑异构酶I抑制剂，诸如拓扑替康(topotecan)或伊立替康(irinotecan)(CPT-11)；拓扑异构酶II抑制剂，诸如依托泊苷(etoposide)(VP-16)、替尼泊苷(teniposide)或米托蒽醌(mitoxantrone)；有丝分裂抑制剂，诸如多西他赛(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine)、伊沙匹隆(ixabepilone)、紫杉醇、长春碱、长春新碱或长春瑞滨；或皮质类固醇，诸如泼尼松、甲基强的松龙或地塞米松。

在一些实施方案中，附加治疗剂包括一线疗法。如本文所用，“一线疗法”包括对患有癌症的受试者的初级治疗。在一些实施方案中，癌症是原发性癌症。在其它实施方案中，癌症是转移性或复发性癌症。在一些实施方案中，一线疗法包括化学疗法。在其它实施方案中，一线治疗包括放射疗法。熟练的技术人员很容易理解不同的一线治疗可适用于不同类型的癌症。

在一些实施方案中，附加治疗剂包含聚ADP核糖聚合酶(PARP)的抑制剂。示例性的PARP抑制剂包括但不限于奥拉帕尼(olaparib)(A ZD-2281，来自AstraZeneca)、卢卡帕尼(rucaparib)(PF-01367338，/>来自Clovis Oncology)、尼拉帕尼(niraparib)(M K-4827，/>来自Tesaro)、他拉唑帕尼(talazoparib)(BMN-673，来自BioMarin Pharmaceutical Inc.)、维利帕尼(veliparib)(ABT-888，来自AbbVie)、CK-102(原名CEP 9722，来自Teva Pharmaceutical Industries Ltd.)、E7016(来自Eisai)、伊尼帕尼(iniparib)(BSI 201，来自Sanofi)和帕米帕尼(pamiparib)(BGB-290，来自BeiGene)。

在一些实施方案中，附加治疗剂包括免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、曲美木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗(ipilimumab)。在一些实施方案中，检查点抑制剂包括PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、LAG3、B7-H3、KIR、CD137、PS、TFM3、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA(CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM的抑制剂。抑制剂可以是抗体或其片段(例如，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、RNAi分子或小分子。

在一些实施方案中，附加治疗剂包括抗体，诸如阿仑单抗(alemtuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine)或博纳吐单抗(blinatumomab)。

在一些实施方案中，附加治疗剂包括细胞因子。示例性的细胞因子包括但不限于IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-21或TNFα。

在一些实施方案中，附加治疗剂包括受体激动剂。在一些实施方案中，受体激动剂包含Toll样受体(TLR)配体。在一些实施方案中，TLR配体包括TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8或TLR9。在一些实施方案中，TLR配体包含合成配体，例如Pam3Cys、CFA、MALP2、Pam2Cys、FSL-1、Hib-OMPC、聚I:C、聚A:U、AGP、MPL A、RC-529、MDF2p、CFA或鞭毛蛋白。

在一些实施方案中，附加治疗剂包括氟达拉滨和环磷酰胺。

在一些实施方案中，附加治疗剂包括替沙仑赛(tisagenlecleucel)(K)、阿基仑赛(axicabtagene ciloleucel)/>或布瑞基奥仑赛(brexucabtagene autoleucel)/>

在一些实施方案中，附加治疗方案包括手术。

在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物和附加治疗剂同时施用。

在一些实施方案中，本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物和附加治疗剂依序施用。在一些实施方案中，在施用附加治疗剂之前，向受试者施用本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物。在其它实施方案中，在施用附加治疗剂之后，向受试者施用本文所述的免疫细胞或本文所述的药物组合物。

在一些实施方案中，受试者是人。

在一些实施方案中，本文还描述了一种用于产生免疫细胞的方法，所述免疫细胞表达特异性识别间皮素(例如，人间皮素)的细胞表面分子、IL-15和任选CCL19。所述方法包括将本文所述的核酸分子或包含所述核酸分子的载体引入免疫细胞，以诱导免疫细胞表达特异性识别人间皮素的细胞表面分子、IL-15和任选CCL19。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、抗原呈递细胞或粒细胞，任选地是T细胞或NK细胞。

药物组合物

在某些实施方案中，将上述免疫细胞配制成药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物通过多种施用途径施用于受试者，包括但不限于肠胃外、口服、舌下或经皮施用途径。在一些实施方案中，肠胃外施用包括静脉内、皮下、肌内、鼻内、动脉内、关节内、皮内、骨内输注、腹膜内、蛛网膜下、颅内、滑膜内、肿瘤内、皮内、髓内、心内或鞘内施用。在一些实施方案中，将药物组合物配制用于局部施用。在其它实施方案中，将药物组合物配制用于全身施用。

在一些实施方案中，药物组合物包含药学上可接受的添加剂。添加剂的实例可包括盐水、缓冲盐水、细胞培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、缓冲剂、防腐剂、张力剂、填充剂、润滑剂或其组合。

在一些实施方案中，药物组合物还包含pH调节剂或缓冲剂，其包括酸诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸，碱诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷，以及缓冲液诸如柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。包含将组合物的pH维持在可接受的范围内的量的此类酸、碱和缓冲液。

在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种盐，其量为使组合物的摩尔渗透压浓度在可接受的范围内所需的量。此类盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐，合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。

在一种示例性方法中，本发明的药物组合物可以独立地以一份或分几份每天施用4次、3次、两次或一次，间隔1天、2天、3天、4天或5天，每周一次，间隔7天、8天或9天，每周两次，每月一次，每月两次，每月三次或更多次。

在其中患者的状况确实改善的情况下，根据医生的判断，连续给予组合物的施用，可替代地，暂时减少施用的组合物的剂量或暂时停止一段时间(即“药物假期”)。在一些实施方案中，药物假期的长度在2天至1年之间变化，仅举例来说，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。药物假期期间的剂量减少10％-100％，仅举例来说，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，对应于此类量的给定CAR-T细胞的量根据诸如疾病的严重程度和需要治疗的受试者或宿主的特性(例如，体重)等因素而变化，但仍然是按照本领域已知的方式根据围绕病例的特定情况常规确定的，所述具体情况包括例如所施用的具体药剂、施用途径和所治疗的受试者或宿主。在一些实施方案中，期望的剂量方便地以单剂量呈现或作为同时(或在短时间内)或以适当的间隔施用的分剂量呈现，例如每天两次、三次、四次或更多次分剂量。

上述范围仅仅是建议性的，因为关于个体治疗方案的变量数目很大，并且与这些推荐值的相当大的偏差并不少见。此类剂量的改变取决于许多变量，不限于所用化合物的活性、待治疗的疾病或疾患、施用模式、个体受试者的需求、所治疗疾病或疾患的严重程度以及医师的判断。

在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗功效在细胞培养物或实验动物中通过标准制药程序测定，包括但不限于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比为治疗指数并且表示为LD50与ED50的比率。表现出高治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养测定和动物研究获得的数据用于配制一系列用于人的剂量。优选此类化合物的剂量处于包括ED50在内的有很小毒性的循环浓度范围内。剂量在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和利用的施用途径。

试剂盒/制品

在某些实施方案中，本文公开了试剂盒，其包含：上述核酸分子、包含上述核酸分子的载体、表达特异性识别间皮素(例如，人间皮素)的CAR、IL-15和任选CCL19的免疫细胞，或药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒可含有一种或多种包装材料，诸如陈述用于治疗癌症的使用方法等的包装插页、标签、包装等。由于本发明的药物组合物中的免疫细胞对肿瘤复发具有阻抑作用，因此本发明的药物组合物可用作用于阻抑肿瘤复发的药物组合物。此类用于阻抑肿瘤复发的药物组合物可以含有一种或多种包装材料，诸如陈述用于阻抑肿瘤复发的使用方法的包装插页、标签、包装等。

术语“包装材料”是指容纳试剂盒组分的物理结构。所述材料可以无菌保持组分，并且可以由通常用于此类目的的材料制成(例如纸、瓦楞纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)。

本发明的试剂盒可以包括标签或插页。标签或插页包括“印刷品”，例如纸或纸板，或分开的或固定到组件、试剂盒或包装材料(例如盒子)上，或附于含有试剂盒组分的安瓿、管或小瓶上。标签或插页可另外包括计算机可读介质，诸如盘(例如，软盘、ZIP盘)、光盘(诸如CD-或DVD-ROM/RAM、DVD、MP3)、磁带或电子存储介质(诸如RAM和ROM)或这些此类磁/光学存储介质、闪存介质或存储器型卡的混合。

标签或插页可包括其中一种或多种组分(例如，结合剂或药物组合物)的标识信息、剂量、活性剂的临床药理学，包括作用机制、药代动力学和药效学。标签或插页可包括标识生产商信息、批号及生产位置和日期的信息。

标签或插页可包括关于可以对其使用试剂盒组分的疾病的信息。标签或插页可包括临床医生或受试者在方法或治疗方法或治疗方案中使用一种或多种试剂盒组分的说明书。说明书可包括剂量、频率或持续时间，以及用于实施本文所述的任何方法、治疗方法或治疗方案的说明。

标签或插页可包括关于组分可提供的任何益处，诸如治疗益处的信息。标签或插页可包括关于潜在不良副作用的信息，诸如对受试者或临床医生关于不适于使用特定组合物(例如，本文所述的经修饰的免疫细胞)的情况的警告。例如，在活性剂的剂量、频率或持续时间较高的情况下，通常更有可能发生不良副作用，因此，说明书可以包括针对较高剂量、频率或持续时间的建议。当受试者已经、将要或正在服用一种或多种可能与所述组合物不相容的其它药物，或受试者已经、将要或正在进行另一种将会与所述组合物不相容的治疗方法或治疗方案时，也可能发生不良副作用或，因此，说明书可包括有关此类不相容性的信息。

定义

如说明书和权利要求书中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一种(个)”和“所述(该)”包括复数指示物。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

如本文所用，术语“包含”旨在意指所述组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。“基本上由......组成”在用于定义组合物和方法时将意味着排除对于针对预定用途的组合具有任何重要意义的其他要素。例如，基本上由本文定义的要素组成的组合物将不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载剂，诸如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由......组成”应该意指不包括其它成分的痕量要素和用于施用本文公开的组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的方面都在本公开的范围内。

如本文所用，术语“约”用于指示一个值包括用于测定该值的装置或方法的误差的标准偏差。术语“约”用在数字名称之前时，例如温度、时间、量和浓度，包括范围，指示可能变化(+)或(–)15％、10％、5％、3％、2％或1％的近似值。

也如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出项的任何和所有可能的组合，以及当以替代(“或”)解释时没有组合。

如本文所用，“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括事件或情况发生的实施方案和不发生的实施方案。

如本文所用，术语“抗体”是指分别经由重链和轻链可变结构域V_H和V_L与其它分子(抗原，例如间皮素)结合的蛋白质。术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体结构域。天然抗体的重链和轻链可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FRs)和三个CDR。(参见，例如，Kindt等人KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007)。单个VH或VL结构域足以赋予抗原结合特异性。此外，使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域以分别筛选互补的VL或VH结构域文库可以分离结合所述抗原的抗体。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature352:624-628(1991)。

本公开的抗体包括单克隆抗体。当关于抗体使用时，术语“单克隆”是指基于、获自或源自单个克隆的抗体，所述克隆包括任何真核、原核或噬菌体克隆。“单克隆”抗体因此在本文中以结构，而不是产生它的方法定义的。

单克隆抗体通过本领域已知的方法制备(Kohler等人，Nature,256:495(1975)；以及Harlow和Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,1999)。简单来说，单克隆抗体可以通过为小鼠注射抗原来获得。用于免疫动物的多肽或肽可以源自翻译的DNA或化学合成并缀合到载体蛋白上。与免疫肽化学偶联的常用载体包括，例如匙孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。抗体的产生通过以下方式验证：分析血清样品，取出脾脏以获得B淋巴细胞，将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对抗原的抗体的阳性克隆以及从杂交瘤培养物中分离抗体。单克隆抗体可通过各种已确立的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化，这些技术包括，例如，用蛋白-A琼脂糖凝胶的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法(参见例如，Coligan等人，Current Protocols in Immunology部分2.7.1-2.7.12和部分2.9.1-2.9.3；以及Barnes等人，“Methods in Molecular Biology,”10:79-104,Humana Press(1992))。

本公开的抗体可以属于任何抗体类别即IgM、IgG、IgE、IgA、IgD或亚类。IgG的示例性亚类为IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

本公开的抗体可以是人源化抗体。术语“人源化”是指在受体人免疫球蛋白分子中具有特异性结合抗原的一个或多个互补决定区(CDR)的非人氨基酸残基，并且在CDR侧翼的框架区(FR)中具有一个或多个人氨基酸残基的抗体序列。任何小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、非人灵长类动物(例如猿、黑猩猩、猕猴、猩猩等)或其它动物抗体可用作产生人源化抗体的CDR供体。人框架区残基可以用相应的非人残基(例如，来自供体可变区)置换。因此，人框架区中的残基可以用来自非人CDR供体抗体的相应残基取代。人源化抗体可以包括既不存在于人抗体中也不存在于供体CDR或框架序列中的残基。源自人源化单克隆抗体的抗体组分的使用减少了与非人区域的免疫原性相关的问题。产生人源化抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号5,225,539、5,530,101、5,565,332和5,585,089；Riechmann等人(1988)Nature 332:323；EP 239,400；W091/09967；EP 592,106；EP 519,596；PadlanMolecular Immunol.(1991)28:489；Studnicka等人，Protein Engineering(1994)7:805；Singer等人，J.Immunol.(1993)150:2844；及Roguska等人，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA(1994)91:969)。

本公开的抗体可以是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”是指其中不同的部分源自不同的动物物种的抗体，诸如那些具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，例如人源化抗体。在一些实施方案中，使用开发用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人，1984,Nature312:604-608；Takeda等人，1985,Nature 314:452-454)，通过将来自于具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自于具有适当生物活性的人抗体分子的基因剪接在一起。

本公开的抗体包括其结合片段。示例性的抗体片段包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、轻链可变区V_L、重链可变区V_H、三特异性(Fab₃)、双特异性(Fab₂)、双链抗体((V_L-V_H)₂或(V_H-V_L)₂)、三链抗体(三价)、四链抗体(四价)、微型抗体((scF_V-C_H)₂)、双特异性单链Fv(Bis-scFv)、IgGdeltaCH2、scFv-Fc、(scFv)₂-Fc和IgG4PE。此类片段可以具有作为全长抗体的结合亲和力，作为全长抗体的结合特异性，或作为全长抗体的一种或多种活性或功能，例如间皮素结合抗体的功能或活性。

抗体片段可以组合。例如，V_L或V_H子序列可以通过接头序列连接，从而形成V_L-V_H嵌合体。单链Fv(scFv)序列的组合可以通过接头序列连接，从而形成scFv-scFv嵌合体。抗体片段包括单链抗体或单独的可变区或与其它序列的全部或部分的组合。

抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，抗体是重组产生的片段，诸如包含非天然存在的排列的片段，诸如具有由合成接头(例如肽接头)连接的两个或更多个抗体区域或链的片段，和/或可能不是由天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些方面，抗体片段是scFv。

抗体片段也可以通过抗体的蛋白水解来制备，例如，通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化整个抗体来制备。用胃蛋白酶酶促裂解产生的抗体片段提供5S片段，表示为F(ab’)₂。该片段可以使用硫醇还原剂进一步裂解以产生3.5S Fab’单价片段。可替代地，使用胃蛋白酶的酶促裂解直接产生两个单价Fab’片段和Fc片段(参见，例如美国专利号4,036,945和4,331,647；和Edelman等人，Methods Enymol.1:422(1967))。也可以使用其它裂解抗体的方法，诸如分离重链以形成单价轻链-重链片段，进一步裂解片段，或其它酶促或化学方法。

在一些实施方案中，描述用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,694,778；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；及Ward等人，1989,Nature334:544-54)适于产生单链抗体。经由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段形成单链抗体，产生单链多肽。也可以任选地使用在大肠杆菌中组装功能性Fv片段的技术(Skerra等人，1988,Science242:1038-1041)。

如本文所用，“相同的”、“序列同一性”或百分比“同一性”，当在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中时，是指两个或更多个序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，例如，在指定区域上具有至少60％同一性，优选至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。可以使用本领域已知的软件程序，例如在Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，1987)增刊30，部分7.7.18，表7.7.1中描述的软件程序来测定比对和序列同一性。优选地，使用默认参数进行比对。优选的比对程序是BLAST，其使用缺省参数。具体来说，优选的程序是BLASTN和BLASTP，使用下列缺省参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；股＝两个；截留值＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序方式＝高分数；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可在下列网址中找到：ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST。术语“相同的”、“序列同一性”或百分比“同一性”也指或者可适用于测试序列的互补序列。所述术语还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如本文所述，优选的算法可以考虑空位等。优选地，同一性存在于长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为至少50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。“不相关”或“非同源”序列与本文公开的序列之一具有小于40％的同一性，或者可替代地具有小于25％的同一性。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换使用并且在其最广泛的意义上是指两个或多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚单位可通过肽键连接。在另一个方面，亚单位可以通过其它键(例如酯、醚等)连接。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质序列或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括全长天然多肽和“经修饰的”形式，诸如子序列、变体序列、融合/嵌合序列和显性负序列。如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸及D和L光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。

肽包括L-异构体和D-异构体及其组合。肽可以包括通常与蛋白质的翻译后加工相关的修饰，例如环化(例如，二硫键或酰胺键)、磷酸化、糖基化、羧基化、泛素化、肉豆蔻化或脂质化。经修饰的肽可以有一个或多个氨基酸残基被另一个残基取代、添加到序列中或从序列中缺失。具体实例包括一个或多个氨基酸取代、添加或缺失(例如，1-3、3-5、5-10、10-20个或更多个)。

如本文所用，术语“修饰”和“经修饰的”是指与参考抗体、蛋白质或多肽相比，抗体、蛋白质或多肽的一个或多个氨基酸残基的突变、取代、添加或缺失，所述参考抗体、蛋白质或多肽是没有修饰的抗体、蛋白质或多肽的等效物。在一些实施方案中，修饰包括保守取代。

“保守取代”是用生物学、化学或结构相似的残基置换一个氨基酸。生物学相似意指取代与未取代序列的活性或功能相容。结构相似意指氨基酸具有长度相似的侧链，诸如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，或具有相似的大小。化学相似性意指残基具有相同的电荷或者都是亲水性或疏水性的。特定实例包括一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个残基，或一个极性残基取代另一个残基，诸如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸，等等。

如本文所用，术语“核酸”是指DNA或RNA，包括天然的、合成的或人工的核苷酸类似物或碱基。在一些实施方案中，核苷酸类似物或人工核苷酸碱基包含在核糖部分的2’羟基处具有修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰包括H、OR、R、卤基、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN，其中R是烷基部分。示例性的烷基部分包括但不限于卤素、硫、硫醇、硫醚、硫酯、胺(伯胺、仲胺或叔胺)、酰胺、醚、酯、醇和氧。在一些实施方案中，烷基部分还包括修饰。在一些实施方案中，修饰包括偶氮基、酮基、醛基、羧基、硝基、亚硝基、腈基、杂环(例如咪唑、肼基或羟氨基)基团、异氰酸酯或氰酸酯基团、或含硫基团(例如，亚砜、砜、硫化物或二硫化物)。在一些实施方案中，烷基部分还包括杂取代。在一些实施方案中，杂环基团的碳被氮、氧或硫取代。在一些实施方案中，杂环取代包括但不限于吗啉代、咪唑和吡咯烷基。

在一些实施方案中，核苷酸类似物包含经修饰的碱基，诸如但不限于5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、1-甲基肌苷、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和在5位具有修饰的其它核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤代胞苷、5-卤代尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2,2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲氧基尿苷、脱氮核苷酸(诸如7-脱氮-腺苷、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷或6-偶氮胸苷)、5-甲基-2-硫代尿苷、其它硫碱基(诸如2-硫代尿苷、4-硫代尿苷和2-硫代胞苷)、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷、萘基和经取代的萘基、任何O-和N-烷基化嘌呤和嘧啶(诸如N6-甲基腺苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-氧乙酸尿苷、吡啶-4-酮或吡啶-2-酮)、苯基和经修饰的苯基(诸如氨基酚或2,4,6-三甲氧基苯)、作为G-钳位核苷酸的经修饰的胞嘧啶、8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代的尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。经修饰的核苷酸还包括就糖部分而言被修饰的那些核苷酸，以及具有非核糖基的糖或其类似物的核苷酸。例如，在一些实施方案中，糖部分是或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4′-硫代核糖和其它糖、杂环或碳环。术语核苷酸还包括本领域中已知的通用碱基。举例来说，通用碱基包括但不限于3-硝基吡咯、5-硝基吲哚或nebularine。

本发明的核酸分子可以通过公知技术，诸如化学合成法或PCR扩增法，基于每种核酸的核苷酸序列信息来产生。为了优化在感兴趣的宿主细胞中的核酸表达，可以对选择用于编码氨基酸的密码子进行工程改造。

在本发明中，T细胞的“IL-15表达”意指只要不丧失本发明的效果，各种形式的IL-15(例如，上述野生型、变体或融合蛋白)都可以表达。

如本文所用，术语“基本上”在描述T细胞群体时是指包含少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少污染细胞的群体。在一些实施方案中，污染细胞在T细胞群体中少于约20％。在一些实施方案中，污染细胞在T细胞群体中少于约15％。在一些实施方案中，污染细胞在T细胞群体中少于约10％。

如本文所用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等意指获得期望的药理和/或生理效果。就疾病症状的改善而言，或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言，所述效果可以是治疗性的。在一个方面，术语“治疗”不包括预防。

如本文所用,“治疗”还包括与病理相关的症状的全身性改善和/或症状发作的延迟。“治疗”的临床和亚临床证据将因病理、个体和治疗而异。在一个方面，治疗不包括预防。

术语“改善”意指受试者疾患的可检测的改良。可检测的改良包括由疾病引起的或与疾病相关的症状的发生、频率、严重程度、进展或持续时间的主观或客观降低、减少、抑制、阻抑、限制或控制，所述症状诸如一种或多种由疾病引起的或与疾病相关的不良症状、病症、不适、病理、疾病或并发症，或疾病的潜在原因或后果的改良，或疾病的逆转。

因此，治疗可以引起降低、减少、抑制、阻抑、限制、控制或预防疾病，或相关症状或后果，或潜在原因；降低、减少、抑制、阻抑、限制、控制或预防疾病、疾患、症状或后果或潜在原因的进展或恶化；或者疾病状况或症状的一种或多种附加症状的进一步恶化或出现。因此，成功的治疗结果导致降低、减少、抑制、阻抑、限制、控制或预防受试者中疾患、疾病或症状的一种或多种症状或潜在原因或后果，诸如由疾病或疾患引起或与之相关的一种或多种不良症状、病症、不适、病理、疾病或并发症的发生、频率、严重性、进展或持续时间的“治疗效果”或“益处”。因此，影响疾患、疾病或症状的一种或多种潜在原因的治疗方法被认为是有益的。稳定病症或疾患也是成功的治疗结果。

因此治疗益处或改良不需要是疾患或疾病相关的任何一种、大多数或所有症状、并发症、后果或潜在原因的完全消除。因此，当在短或长持续时间内(数小时、数天、数周、数月等)内，受试者的疾患存在递增改良，或在一种或多种相关的不良症状或并发症或后果或潜在原因，病症或疾病的生理、生物化学或细胞表现或特征中的一种或多种，诸如由疾病或疾患引起的或与之相关的一种或多种不良症状、病症、不适、病理、疾病或并发症的恶化或进展的发生、频率、严重程度、进展或持续时间方面存在部分降低、减少、抑制、阻抑、限制、控制或预防，或存在抑制或逆转(例如，稳定疾患、病症或疾病的一种或多种症状或并发症)时，达到满意的终点。

术语“可接受的”、“有效的”或“足够的”当用于描述本文公开的任何组分、范围、剂型等的选择时，意图是所述组分、范围、剂型等适于所公开的目的。

术语“受试者”、“宿主”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，指动物，通常是哺乳动物。任何合适的哺乳动物都可以通过本文所述的方法、细胞或组合物进行治疗。哺乳动物的非限制性实例包括人、非人灵长类动物(例如，猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猴子、猕猴等)、家养动物(例如，狗和猫)、农场动物(例如，马、牛、山羊、绵羊、猪)和实验动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。哺乳动物可以是任何年龄或任何发育阶段(例如，成年、青少年、儿童、婴儿或子宫内的哺乳动物)。哺乳动物可以是雄性或雌性。哺乳动物可以是妊娠雌性。在一些实施方案中，受试者是人。

如本文所用，术语“γδT细胞”意指表达CD3并且表达由TCRγ链(γTCR)和TCRδ链(δTCR)构成的TCR(下文有时称为“γδTCR”)的细胞。

如本文所用，术语“αβT细胞”意指表达CD3并且表达由TCRα链(αTCR)和TCRβ链(βTCR)构成的TCR(下文有时称为“αβTCR”)的细胞。在一些情况下，几乎所有αβT细胞通过αβTCR识别抗原肽-MHC(主要组织相容性复合体，在人的情况下为HLA：人白细胞抗原)复合物(这被称为MHC限制)。相比之下，γδT细胞通过γδTCR识别细胞表达的各种分子，不管MHC分子如何。

如本文所用，术语“调节”或“调节剂”是指组分正向或负向改变相关功能的能力。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约100％的变化。

在某些实施方案中，本文提供了能够改变或防止TGFβ受体进行信号传导的TGFβ信号传导调节剂。本领域技术人员将理解，这可以通过结合激活TGFβR信号传导的细胞因子(即，TGFβ)或受体本身(例如，TGFβ抗体或其片段、TGFBR抗体或其片段)来实现。因此，该术语涵盖结合TGFβ的分子和结合TGFβR的分子。在一个实施方案中，本公开的调节剂可以通过TGFβRII中和TGFβ信号传导。“中和”意指TGFβ的正常信号传导作用被阻断，使得TGFβ的存在对TGFβRII信号传导具有中性作用。在一些实施方案中，TGFβ调节剂改善宿主中的免疫反应。

如本文所用，术语“转化生长因子-β”、“TGF-beta”、“TGFb”、“TGFβ”和“转化生长因子-beta”在本文中可互换使用，是指具有来自人的任何TGF-β的全长天然氨基酸序列的分子家族，包括潜伏形式以及前体和成熟TGF-β(“潜伏TGF-beta”)的相关或非相关复合物。本文提及此类TGF-β应理解为提及任何一种目前鉴定的形式，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4和TGF-β5及其潜伏型式；以及未来鉴定的人TGF-β种类，包括源自任何已知TGF-β序列的多肽，并且与所述序列至少约75％，优选至少约80％，更优选至少约85％，还更优选至少约90％，甚至更优选至少约95％同源。特定术语“TGF-β1”、“TGF-β2”和“TGF-β3”，以及“TGF-β4”和“TGF-β5”，是指文献中定义的TGF-β，例如Derynck等人，Nature，同上；Seyedin等人，J.Biol.Chem.,262，同上；以及deMartin等人，同上。术语“TGF-β”是指编码人TGF-β的基因。优选的TGF-β是天然序列人TGF-β。

TGF-β家族成员被定义为在分子的成熟部分具有9个半胱氨酸残基，在成熟区域与其它已知的TGF-β序列具有至少65％的同源性，并且可以竞争相同受体的那些家族成员。另外，它们全部似乎都被编码为一个较大的前体，该前体在N末端附近具有高度同源的区域，并在前体的一部分中显示出三个半胱氨酸残基的保守性，该部分稍后将通过加工去除。此外，TGF-β似乎具有含四个或五个氨基酸的加工位点。

如本文所用，术语“转化生长因子-β受体”、“TGF-bR”或“TGF-b受体”或“TGF-β受体”或“TGFβR”用于涵盖TGFβR家族的所有三个亚型(即，TGFβR1、TGFβR2、TGFβR3)。TGFβ受体以丝氨酸/苏氨酸激酶活性为特征，并且以几种可以是同型二聚体或异二聚体的不同的同种型存在。

如本文所用，术语“TGFβ信号传导途径调节剂”、“TGFβ调节剂”、“TGFβ信号传导途径调节剂”或“TGFβ调节剂”，在本文中可互换使用，是指能够调节TGFβ信号传导途径(例如，具有抑制、阻断或中和作用)的分子(例如，抗体或其片段)，其可以结合TGFβ本身或者可以结合细胞上的TGFβ受体。在任一情况下，调节剂抑制TGFβ信号传导途径(例如，通过结合细胞因子(即，TGFβ)本身)或通过结合TGFβ受体。因此，该术语涵盖结合TGFβ和结合TGFβ受体的两类调节剂。在本文所述的各种实施方案中，TGFβ信号传导途径调节剂与嵌合抗原受体一起在经修饰的免疫细胞(例如CAR-T细胞)中表达。在本文所述的各种实施方案中，TGFβ信号传导途径调节剂从经修饰的免疫细胞中分泌或表达为结合在免疫细胞的膜上。表达此类TGFβ信号传导途径调节剂的CAR-T细胞在本文中被称为TGFβ装甲CAR-T细胞

如本文所用，术语“诱导多能干细胞”(下文有时称为“iPS细胞”)意指通过将重编程因子引入体细胞而建立的，具有容许分化成存在于活生物体中的许多细胞的多能性，并且还具有增殖能力的干细胞。它涵盖诱导成本发明中待使用的造血祖细胞的任何细胞。诱导多能干细胞优选源自哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、狗、猴子、猩猩、黑猩猩、人)，更优选源自人。

在一些情况下，通过将重编程因子引入任何体细胞，可以诱导或建立多能干细胞。示例性的重编程因子包括但不限于基因和基因产物，诸如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-My c、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3、Glis1等。这些重编程因子可以单独使用或组合使用。在一些情况下，重编程因子的组合由以下参考文献描述的组合举例说明：WO2007/069666、WO 2008/118820、WO 2009/007852、WO 2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO 2009/075119、WO 2009/079007、WO 2009/091659、WO 2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO 2009/114949、WO 2009/117439、WO 2009/126250、WO2009/126251、WO 2009/126655、WO 2009/157593、WO2010/009015、WO 2010/033906、WO2010/033920、WO 2010/042800、WO 2010/050626、WO 2010/056831、WO 2010/068955、WO2010/098419、WO 2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO 2010/115050、WO2010/124290、WO 2010/147395、WO2010/147612，Huangfu D等人(2008),Nat.Biotechnol.,26:795-797,Shi Y等人(2008),Cell Stem Cell,2:525-528,Eminli S等人(2008),StemCells.26:2467-2474,Huangfu D等人(2008),Nat.Biotechnol.26:1269-1275,Shi Y等人(2008),Cell Stem Cell,3,568-574,Zhao Y等人(2008),Cell Stem Cell,3:475-479,Marson A,(2008),CellStem Cell,3,132-135,Feng B等人(2009),Nat.Cell Biol.11:197-203,R.L.Judson等人(2009),Nat.Biotechnol.,27:459-461,Lyssiotis CA等人(2009),Proc Natl Acad Sci U S A.106:8912-8917,Kim J B等人(2009),Nature.461:649-643,Ichida JK等人(2009),Cell Stem Cell.5:491-503,Heng JC等人(2010),CellStem Cell.6:167-74,H an J等人(2010),Nature.463:1096-100,Mali P等人(2010),StemCel ls.28:713-720，以及Maekawa M等人(2011),Nature.474:225-9。

体细胞的实例包括但不限于胎儿体细胞、新生体细胞和成熟体细胞中的任一种，以及原代培养细胞、传代培养细胞和已建立的细胞系中的任一种。此外，上述细胞可以是健康细胞或患病细胞。体细胞的具体实例包括(1)组织干细胞(体干细胞)，诸如神经干细胞、造血祖细胞、间充质干细胞和牙髓干细胞；(2)组织祖细胞；和(3)分化细胞，诸如血细胞(例如，外周血细胞、脐带血细胞等)、单核细胞(例如，淋巴细胞(NK细胞、B细胞、除αβT细胞以外的T细胞(例如γδT细胞等)、单核细胞、树突细胞等)、粒细胞(例如，嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、巨核细胞)、上皮细胞、内皮细胞、肌细胞、成纤维细胞(例如皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(例如，胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞。其中，优选除αβT细胞以外的单核细胞，更具体地，优选单核细胞或γδT细胞。

示例性方法诸如磷酸钙共沉淀法、PEG法、电穿孔法、显微注射法、脂质转染法等可用于将重编程因子引入体细胞。另外的方法可以包括在Cell Engineering附加卷8，NewCell Engineering实验方案，263-267(1995)(published by Shujunsha),Virology,第52卷,456(1973)，及Folia Pharmacol.Jpn.，第119卷(第6期),345-351(2002)中描述的那些方法。当使用病毒载体时，将核酸引入合适的包装细胞(例如，Plat-E细胞)和互补细胞系(例如，293细胞)，回收培养上清液中产生的病毒载体，并且通过适于每种病毒载体的适当方法用载体感染细胞，从而将载体引入细胞。例如，当逆转录病毒载体用作载体时，在WO2007/69666,Cell,126,663-676(2006)及Cell,131,861-872(2007)等中公开了具体手段。特别地，当使用逆转录病毒载体时，通过使用重组纤连蛋白片段CH-296(由Takara BioInc.制造)可以高效转染到各种细胞中。

可以将RNA形式的重编程因子直接引入细胞并在细胞中表达。作为引入RNA的方法，可以使用已知的方法，例如，可以优选使用脂质转染法、电穿孔法等。当重编程因子为蛋白质形式时，可通过诸如脂质转染、与细胞膜穿透肽(例如，HIV来源的TAT和多聚精氨酸)融合、显微注射等方法将其引入细胞。

在一些实施方案中，将诱导多能干细胞分化成T细胞的方法没有特别限制，只要诱导多能干细胞可以分化成γδT细胞。在一些情况下，该方法包括将诱导多能干细胞分化成造血祖细胞，并将造血祖细胞分化成CD3阳性T细胞。用于将iPSC分化成造血祖细胞的示例性方法包括WO 2013/075222、WO 2016/076415及Liu S.等人，Cytotherapy,17(2015)；344-358中公开的那些方法。用于将造血祖细胞分化为CD3阳性T细胞的示例性方法包括WO2016/076415和WO 2017/221975中公开的方法。也参见WO2020/013315中公开的方法。

实施例

提供这些实施例仅用于说明的目的，并不限制本文提供的权利要求的范围。

实施例1

表达γδTCR的细胞的生产方法

使用由京都大学iPS细胞研究和应用中心(Center for iPS Cell Research andApplication,Kyoto University)提供的使用已知培养方法(例如，如Cell Reports 2(2012)1722-1735或WO 2017/221975中所述)从iPS细胞(Ff-I01s04株系：源自健康个体的外周血单核细胞)分化的悬浮细胞群来产生含有造血祖细胞(HPC)的细胞群。例如，将Ff-I01s04株系以6×10⁵个细胞/孔(第0天)接种在超低粘附处理的6孔板中，将10ng/ml BMP4、50ng/ml bFGF、15ng/ml VEGF、2μM SB431542添加到EB培养基(添加有10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、2mM L-谷氨酰胺、45mMα-硫代甘油和50μg/ml 2-磷酸抗坏血酸的StemPro34)，并且将细胞在低氧条件(5％O₂)下培养5天(第5天)。然后，添加50ng/ml SCF、30ng/ml TPO、10ng/ml FLT-3L，并将细胞培养5-9天(-第14天)以产生悬浮细胞群。在培养期间，每两天或三天更换一次培养基。使用表2所示的抗体集对所得的含有HPC的悬浮细胞群进行染色。

表2

抗CD34抗体	Abcam PE/Cy7
		抗CD43抗体	BD APC
抗CD45抗体	BioLegend BV510
		抗CD14抗体	BioLegend APC/eFluor780
抗CD235a抗体	BD FITC

通过FACSAria对经过上述染色的细胞群进行分选。根据已知方法(例如，在Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175和WO2017/221975中描述的方法)将获得的细胞级分分化成淋巴样细胞。例如，造血祖细胞群以2000个细胞/孔接种在重组h-DLL4/Fc嵌合体(Sino Biological)和Retronectin(Takara Bio Inc.)包被的48孔板中，并在5％CO₂、37℃条件下培养。在培养期间，每两天或三天更换一次培养基。αMEM培养基含有15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、55μμ2-巯基乙醇、50μg/ml 2-磷酸抗坏血酸、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸钠、50ng/ml SCF、50ng/ml IL-7、50ng/ml FLT-3L、100ng/ml TPO、15μM SB203580和30ng/ml SDF-1α。从培养开始的第7天和第14天，将细胞传代至类似包被的48孔板。在培养开始后的第21天(第35天)收集所有细胞，并通过流式细胞仪(BD FACSAria^TM Fusion，由BDBiosciences制造)确认CD45(+)、CD3(+)级分的存在。将获得的细胞接种在48孔板中，并在5％CO₂、37℃条件下培养。αMEM培养基含有15％FBS、2mμL-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素、50μg/ml2-磷酸抗坏血酸、10μg/ml人胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠、500ng/mL抗CD3抗体(OKT3)和10ng/mL IL-7。从培养开始的第27天(第41天)收集所有细胞，通过血细胞计数器对细胞进行计数，并使用表3所示的抗体集进行染色。

表3

Vδ1 Miltenyi FITC
	Vδ2 Miltenyi APC
γδTCR BD BV510
	CD3 BioLegend APC/Cy7
αβTCR eBioscience FITC

由于染色，证实表达γδTCR的细胞(γδTCR阳性细胞)可以从源自iPS细胞(Ff-I01s04株系)的造血祖细胞制备(图2)。

此外，由于γδTCR阳性细胞包含Vδ1阳性γδT细胞和Vδ2阳性γδT细胞，证实可以制备Vδ1型和Vδ2型γδT细胞(图3)。(注意没有γδTCR基因的KI的iPS细胞来源的γδTCR阳性细胞在本文中也称为“iγδT细胞”)

实施例2

iγδT细胞的扩增培养及功能评价

除了使用UCHT1(由GeneTex制造)作为抗CD3抗体之外，使用与实施例1中相同的方法进行iγδT细胞的产生，产生源自iPS细胞(Ff-I01s04株系)的γδT细胞(iγδT细胞)。

将获得的后续iγδT细胞以2,000,000个细胞/mL悬浮在含有15％FBS和含有表4所示细胞因子的添加剂的α-MEM培养基中，接种在用抗CD3抗体(UCHT1)和RetroNectin固相化的板上，并在5％CO₂/37℃下培养3天。在培养的第3天，从板中收集细胞，使用NucleoCounter(注册商标)NC-200(ChemoMetec)对细胞数目进行计数，并将细胞以适当的量悬浮在含有15％FBS和含有表5所示细胞因子的添加剂的α-MEM培养基中，添加到非固定化的G-Rex(注册商标)6孔板(WILSONWOLF)中，并在5％CO₂/37℃下培养。在第5、6、7、8、9、10、11、14和17天，从板收集部分细胞4-6次，并使用血细胞计数器对细胞数目进行计数。

通过以下方法将抗CD3抗体和RetroNectin固定在培养板上。将抗CD3抗体(UCHT1最终浓度3000ng/mL)和以必要浓度溶解在PBS中的RetroNectin(最终浓度150μg/mL)添加到板中，然后使其在4℃下静置过夜。用PBS洗涤之后，将板进行测试。

表4

产品名称	制造商	最终浓度
			胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂	Invitrogen	1x
2-磷酸抗坏血酸	sigma	50μg/ml
			IL-2	Peprotech	15ng/ml
IL-7	Peprotech	10ng/ml
			IL-15	Peprotech	10ng/ml
IL-21	Peprotech	20ng/ml
			IL-12	Merck	50ng/ml
IL-18	MBL	50ng/ml
			TL-1A	Peprotech	50ng/ml
Z-VAD-FMK	R&D	10μM
			人CD30抗体	R&D	300ng/ml

表5

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通过用抗CD3抗体(UCHT1)和抗CD30抗体刺激，观察到iγδT细胞的增殖(图4)。

实施例3

iPS细胞来源的Vγ9Vδ2T细胞的产生

1.iPS细胞的制备

与实施例1中公开的类似地制备iPS细胞。具体而言，使用由京都大学iPS细胞研究和应用中心(CiRA)提供的Ff-I01s04株系。iPS细胞根据CiRA发布的“人iPS细胞的无饲养层培养”方案进行培养。

2.iPS细胞向HPC的分化

根据WO 2017/221975中公开的方法进行iPS细胞向造血祖细胞(HPC)的分化。

3.Vγ9Vδ2基因

使用G115γδT细胞克隆来源的Vγ9Vδ2T细胞受体(Vγ9Vδ2TCR G115)。包含编码Vγ9Vδ2TCR G115的基因(编码SEQ ID NO:44)的核酸含有表6所示的基因。核酸是人工合成的。

表6

MVSLLHASTLAVLGALCVYGAGHLEQPQISSTKTLSKTARLECVVSGITISATSVYWYRERPGEVIQFLVSISYDGTVRKESGIPSGKFEVDRIPETSTSTLTIHNVEKQDIATYYCALWEAQQELGKKIKVFGPGTKLIITDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKAGTYLCLLEKFFPDVIKIHWEEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDKEHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMYLLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMERISSLIHLSLFWAGVMSAIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDTLGMGGEYTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKTVHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRMLFAKTVAVNFLLTAKLFFL(SEQID NO:44)。

4.携带Vγ9Vδ2基因的逆转录病毒载体的产生

使用慢病毒载体pLVSIN-Ub，通过从pLVSIN-CMV Neo载体(ClontechLaboratories,Inc.)中去除编码新霉素抗性基因的序列来生成载体，并用人泛素启动子置换CMV启动子。根据表6合成人工寡聚DNA。将Vγ9Vδ2基因并入到pLVSIN-Ub逆转录病毒载体的多克隆位点中。使用该质粒及Clontech Laboratories,Inc.的Lenti-X^TM 293T细胞系和Lenti-X^TM Packaging Single Shot(VSV-G)，产生慢病毒载体pLVSIN-Ub。

5.iPS细胞来源的Vγ9Vδ2T细胞的产生

在1.iPS细胞的制备中制备的iPS细胞用在4.携带Vγ9Vδ2基因的逆转录病毒载体的产生中制备的携带Vγ9Vδ2基因的逆转录病毒载体感染。以与实施例1中相同的方式，根据已知方法(如WO2017/221975中公开的)将这些细胞分化为T细胞，以制备iPS细胞来源的Vγ9Vδ2T细胞。500ng/mL OKT3(TakaraBio)用作分化步骤中的抗CD3抗体。(注意从iPS细胞制备的iPS细胞来源的Vγ9Vδ2T细胞在本文中也称为“iγ9δ2T细胞”。)用流式细胞仪(BDFACSAria^TM Fusion，由BD Biosciences制造)测量获得的iγ9δ2T细胞在细胞膜表面上的CD3、γδTCR、Vγ9和Vδ2的表达(图5)。

实施例4

iPS细胞来源的抗间皮素-CAR/IL-15γδT细胞的产生

1.抗间皮素-CAR基因

包含编码抗间皮素-CAR的基因的核酸是人工合成的。使用表7中列出的基因，合成11种人工核酸模式，用于转染到iγδT细胞或iγ9δ2T细胞中。

表7

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2.IL-15基因

人工核酸包含编码各种IL-15型式的基因。IL-15型式的基因如表8所示。

表8

人工核酸的第1模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-41BB-CD3z-P2A-IL2sp-mIL15/Ra。

人工核酸的第2模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-41BB-CD3z-P2A-mIL15/Ra-LSP。

人工核酸的第3模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-41BB-CD3z-P2A-IL15Rasp-sushi15。

人工核酸的第4模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-41BB-CD3z-P2A-sIL15-LSP。

人工核酸的第5模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-41BB-CD3z-P2A-IL2sp-mIL15/Ra-P2A-endosp-CCL19。

人工核酸的第6模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-41BB-CD3z-P2A-mIL15/Ra-LSP-P2A-endosp-CCL19。

人工核酸的第7模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-41BB-CD3z-P2A-IL15Rasp-sushi15-P2A-endosp-CCL19。

人工核酸的第8模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-41BB-CD3z-P2A-sIL15-LSP-P2A-endosp-CCL19。

人工核酸的第9模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-CD28-CD3z-P2A-IL15sp-sushi15-P2A-endosp-CCL19。

另外，分别使用DAP10和TNFR2作为CD8铰链/TM和CD3z之间的胞内结构域，制备另外2种模式。

人工核酸的第10模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-DAP10-CD3z-P2A-IL2sp-mIL15/Ra。

人工核酸的第11模式从N末端开始按该顺序包含ssVH-P4-CD8铰链/TM-TNFR2-CD3z-P2A-IL2sp-mIL15/Ra。

2.携带抗间皮素-CAR基因的逆转录病毒载体的产生

Phoenix A细胞，一种逆转录病毒包装细胞系(ATCC)，在DMEM20％FBS和Pen/Strep中生长至50％-70％汇合。根据制造商的方案，使用含有包含编码上述CAR构建体的基因的核酸模式的相应质粒，辅助质粒gag-pol和pVSVG以及转导试剂Fugene HD(Promega)制备DNA复合物。转染后16-24小时收获病毒，等分试样并冷冻供进一步使用。

3.iPS细胞来源的抗间皮素-CAR/IL-15γδT细胞的产生

将iγδT细胞或iγ9δ2T细胞解冻，并在培养基(DMEM 10％FCS和表10中列出的添加剂)中静置3天。将烧瓶在4’C用retronectin(Takara)和CD3抗体(UCHT1)包被过夜。将iγδT细胞或iγ9δ2T细胞洗涤，重悬于DMEM 10％FCS和表9中指定的补充剂中，并转移至包被有retronectin和抗CD3抗体的烧瓶中72小时以进行激活。

使用旋转接种(spinocculation)，用包含编码上述CAR构建体的基因的每种模式的核酸转导iγδT细胞或iγ9δ2T细胞。简言之，将iγδT细胞或iγ9δ2T细胞转移到retronectin包被的板上(根据制造商的说明制备)并用编码上述pVSVG假型病毒的CAR进行旋转接种(2,000g；32’C)。在37’C 5％CO2下，将细胞在DMEM 10％FCS和表10中描述的添加剂中孵育过夜，第二天重复转导，并将细胞在DMEM 10％FCS和表10中描述的添加剂中扩增。

如上所述，在DMEM 10％FCS和表10中列出的添加剂中使用retronectin/抗CD3抗体激活进一步扩增转导的细胞，并在激活后第3天转移至G-REX。激活后第7天收获细胞并冷冻进一步使用。(注意从iγδT细胞制备的iPS细胞来源的抗间皮素-CAR/IL-15γδT细胞在本文中也称为“iMeso-CAR/IL-15γδT细胞”，并且从iγ9δ2T细胞制备的iPS细胞来源的抗-Meso-CAR/IL-15γδT细胞在本文中也称为“iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T”细胞)。

实施例5

iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞的扩增培养

使用类似于实施例3中描述的方法，进行实施例5中获得的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞(P4-41BB-mIL15/Ra-CCL19)的扩增培养。使用包含含有表9中的细胞因子的添加剂而不是含有表4中的细胞因子的添加剂，以及含有表10中的细胞因子的添加剂而不是含有表5中的细胞因子的添加剂的培养基。

表9

产品名称	制造商	最终浓度
			胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂	Invitrogen	1x
2-磷酸抗坏血酸	Sigma	50μg/ml
			IL-7	Peprotech	10ng/ml
IL-15	Peprotech	10ng/ml
			IL-21	Peprotech	20ng/ml
IL-18	MBL	50ng/ml
			Z-VAD-FMK	R&D	10μM

表10

产品名称	制造商	最终浓度
			胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂	Invitrogen	1x
2-磷酸抗坏血酸	Sigma	50μg/ml
			IL-7	Peprotech	10ng/ml
IL-15	Peprotech	10ng/ml

对实施例4中获得的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞进行扩增培养。

通过用抗CD3抗体(OKT3)刺激，观察到iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞的增殖(图6)。

实施例6

1.人细胞系MiaPaCa-2、MiaPaCa-2 Msln+、Capan-2和GSU的间皮素表达。

人细胞系MiaPaCa-2(ATCC；CRL-1420)、MiaPaCa-2 Msln+(通过使用病毒载体过表达间皮素从MiaPaca-2产生)、Capan-2(ATCC,HTB-80)和GSU(RIKEN,RBC2278)按照提供者的建议进行培养。对于流式细胞术，使用TrypLE Express酶(Gibco；#12605010)收获细胞，洗涤并用未标记的抗间皮素一抗(Rockland；#MN1200301A88)和APC缀合的抗小鼠IgG二抗(Biolegend；#405308)染色。使用可固定的活性染料(eBiosciences；#65-0866-14)对死细胞进行染色，并且在获取之前在FACS Fortessa(BD Biosciences)上固定细胞。使用FlowJo进行分析。MiaPaca-2的间皮素表达非常低或为阴性，而Capan-2、GSU和MiaPaca-2 Msln+显示高间皮素表达(图7A)。

2.iPS细胞来源的抗间皮素-CAR/IL-15γδT细胞对人细胞系MiaPaCa-2、MiaPaCa-2 Msln+、Capan-2和GSU的体外细胞毒性。

将所有靶细胞系(MiaPaCa-2、MiaPaCa-2 Msln+、Capan-2和GSU)分离、洗涤、重悬于测定培养基中并计数，然后一式三份铺板在胶原包被的平底板上。将细胞在37’C 5％CO2下孵育至少2小时，以完全粘附。

将Meso iCAR-T解冻、洗涤、重悬于测定培养基中并进行计数，之后与靶细胞以指定的效应物与靶细胞(E:T)比率(即3:1、1:1、0.3:1、0.1:1)在37’C 5％CO2下共培养48小时之前。根据制造商的说明，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定法(Promega)评估iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞对靶细胞的杀伤。根据以下等式计算杀伤率％：

杀伤率％＝(共培养物的平均发光-单独效应细胞的平均发光)

单独靶细胞的平均发光

结果显示，具有所有IL-15型式的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞在体外有效地杀伤天然表达间皮素的细胞系(GSU，Capan-2)或经工程改造以表达间皮素的细胞系(MiaPaCa-2Msln+)，但不杀伤间皮素阴性MiaPaCa-2细胞，并且与未诱导的对照细胞(UTD)(iγ9δ2T细胞)相比，杀伤作用大大增加(图7B)。

实施例7

1.在Capan-2皮下异种移植物模型中评估携带不同共刺激结构域的iPS细胞来源的抗间皮素-CAR/IL-15γδT细胞的体内抗肿瘤功效

向6-16周龄的雌性NSG小鼠(Jackson Labs)皮下接种4x10⁶个在100ul McCoys 5A+matrigel中的活Capan-2肿瘤细胞。植入后三周，肿瘤大小达到约50mm3，并将小鼠随机分成平均肿瘤大小相似的治疗组(平均～100mm3；n＝6只/组)。第二天，肿瘤内注射1x10⁶个新鲜产生的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞。每周测量两次体重以监测毒性。每周测量两次肿瘤大小，并使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝长×宽×高×0.5236。参见下表11。

表11

用携带4-1BB或CD28共刺激结构域的iMeso-CAR/IL-15γδT细胞观察到最佳抗肿瘤功效(图8)。

实施例8

1.在Capan-2皮下异种移植物模型中评估携带不同IL-15型式的iPS细胞来源的抗间皮素-CAR/IL-15γδT细胞的体内抗肿瘤功效及4-1BB和CD28共刺激结构域的比较

向6-16周龄雌性NSG小鼠(Jackson Labs；n＝6/组)皮下接种4x10⁶个在100ulMcCoys 5A+matrigel中的活Capan-2肿瘤细胞。植入后三周，肿瘤大小达到约100mm3时，将小鼠随机分成平均肿瘤大小相似的治疗组(平均～100mm3；n＝6只/组)。第二天，肿瘤内注5x10⁶个(组臂1)或1.5x10⁶个(组臂2)冷冻保存的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞。每周测量两次体重以监测毒性。每周测量两次肿瘤大小，并使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝长×宽×高×0.5236。参见表12-14。

表12：组臂1。也参见图9A和图9B。

表13：组臂2。也参见图9C和图9D。

表14.也参见图9E

携带IL-15型式sushi15或mIL15/Ra的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞显示出总体最佳的抗肿瘤功效，与所用的细胞数目无关(即5x10⁶或1.5x10⁶个；图9E)。与使用CD28共刺激结构域的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞相比，携带共刺激结构域4-1BB的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞显示出更佳的肿瘤控制(图9E)。

实施例9

1.在GSU皮下异种移植物模型中评估用不同IL-15型式和CCL19装甲的iPS细胞来源的抗间皮素-CAR/IL-15γ9δ2T细胞的体内抗肿瘤功效

向6-16周龄雌性NSG小鼠(Jackson Labs；n＝6只/组)皮下接种2x10⁶个在Matrigel:PBS1:1中的活GSU肿瘤细胞。植入后7天，肿瘤大小达到约100mm3，并将小鼠随机分成平均肿瘤大小相似的治疗组(平均～100mm3；n＝6只/组)。第二天，肿瘤内注射10x10⁶个冷冻保存的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞。每周测量两次体重以监测毒性。每周测量两次肿瘤大小，并使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝长×宽×高×0.5236。参见下表15和图10。

表15

腹膜内施用10x10⁶个iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞清除肿瘤，而静脉内施用10x10⁶个Meso iCAR-T显示出肿瘤控制，但没有完全反应。用sushi15-CCL19或mIL15/Ra-CCL19装甲的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞表现相当好。

实施例10

1.在GSU腹膜内异种移植物模型中评估用不同IL-15型式和CCL19装甲的iPS细胞来源的抗间皮素-CAR/IL-15γ9δ2T细胞的体内抗肿瘤功效

使用来自Perkin Elmer(CLS960002)的RediFect Red-FLuc-嘌呤霉素病毒产生荧光化的GSU细胞系。在1.6ug/ml聚凝胺(Millipore)的存在下进行过夜转导，用携带编码人CD19的质粒的病毒在EF1a启动子的控制和嘌呤霉素抗性下转导细胞。使用嘌呤霉素阳性选择GSU-RedLuc细胞。

向6-16周龄雌性NSG(Jackson Labs；n＝4只/组)腹膜内接种5x10⁶个在Matrigel:PBS1:1中的活GSU-RedLuc细胞。植入后两天，使用体内成像系统(IVIS)光谱(PerkinElmer)用生物发光成像监测肿瘤生长，并使用IVIS成像软件(Perkin Elmer)进行随机化分析。值表示为光子数/秒。简言之，在成像前六分钟，动物接受150mg/kg D-荧光素钾盐(Promega)的腹膜内(IP)注射。以吸入异氟烷提供麻醉。随机化后的第二天，对小鼠腹膜内或静脉内施用10x10⁶个活的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞，每周监测两次肿瘤生长和重量，直至研究结束。参见下表16和图11。

表16

10x10⁶个iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞有效抑制腹膜内GSU-RedLuc肿瘤生长，与所用的IL-15型式(sushi15与mIL15/Ra)无关。腹膜内施用的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞导致快速和完全的肿瘤清除，而静脉内注射的iMeso-CAR/IL-15γ9δ2T细胞与PBS处理的对照相比显著抑制肿瘤生长。

实施例11

间皮素(Msln)阳性肿瘤中的重复抗原刺激。

将大约100,000个共表达针对Msln的CAR以及TGFβ调节剂(例如，TGFβR2-VH或dnTGFbR2)或针对GFP的对照VH(Msln-对照VH)的iPSC来源的抗Msln CAR-T细胞与40,000个过表达人Msln的MiaPaca-2肿瘤细胞在存在或不存在TGF-β(R&D Systems，10ng/ml)的情况下一式两份地共培养。TGFβR2-VH由CAR-T细胞分泌，而dnTGFbR2与CAR-T细胞的膜结合。每隔3-4天，在相同条件下(有或没有TGF-β10ng/ml)将每孔的一半CAR-T细胞转移到新的肿瘤细胞板上。收获上清液并冷冻用于稍后评价。通过流式细胞术对CAR-T细胞进行计数，并在选定的时间点进行FACS表型分析(图12A)。

根据制造商的方案，使用CellTiterGlo(Promega)评估肿瘤细胞的活力。使用Pherastar酶标仪对板进行分析。使用以下公式评估杀伤率百分比：

对照孔仅含有肿瘤细胞，不含效应(即CAR-T)细胞。百分比细胞毒性如图12B所示。

通过使用Sytox红染料(Thermofisher，根据制造商的方案)排除死细胞来进行细胞计数，并且使用HTS装置在Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上获取等体积的细胞悬浮液。活的CAR-T细胞通过活细胞、单细胞和尺寸门控来计数。外推结果以获得每个孔的细胞数。

观察到在用靶细胞进行几轮再刺激后，模拟慢性抗原激活，TGF-β诱导CAR-T细胞功能的抑制(即杀伤)并抑制CAR-T细胞的增殖。只有表达TGFβ调节剂(例如，分泌TGFβR2 VH二聚体或表达膜结合的dnTGFbR2)但不表达对照VH的CAR-T细胞受到保护免受TGF-β(10ng/ml)的抑制作用。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。

本文示例性描述的本技术可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被广泛地和无限制地阅读。另外，本文采用的术语和措辞已经作为描述性术语而非限制性术语使用，并且此类术语和措辞的使用无意排除所示出和描述的特征或其部分的任何等效物，但是应当认识到，在要求保护的本技术的范围内，各种修改都是可能的。

因此，应该理解的是，这里提供的材料、方法和实例代表优选方面，是示例性的，并且不旨作为对本技术范围的限制。

本文已经广泛和总体地描述了本技术。落在一般公开内容内的每个较窄的种和亚属分组也形成本技术的一部分。这包括对本技术的一般描述，带有从该属中去除任何主题的限制性条款或负面限制，无论所去除的材料是否在本文中明确叙述。

此外，在根据马库什群组描述本技术的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本技术也因此根据马库什群组的任何单个成员或成员的亚组来描述。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体明确地并入本文，其程度如同各自通过引用单独并入本文一样。在有冲突的情况下，将以本说明书，包括定义为准。

其它方面在以下权利要求中阐述。

序列表

汇总表

/>

SEQ ID NO:1/AA/P4 scFv(不含信号肽)

SEQ ID NO:2/AA/ssVH信号肽(sp)

SEQ ID NO:3/AA/ssVHsp-P4 scFv

SEQ ID NO:4/AA/接头(P4 scFv-CD8铰链))

SEQ ID NO:5/AA/P2A肽

SEQ ID NO:6/AA/IL2 sp

SEQ ID NO:7/AA/IL15Rasp

SEQ ID NO:8/AA/mIL15/Ra(包括26aa接头)(不含IL2sp)

SEQ ID NO:9/AA/mIL15/Ra-LSP(IL15LSP-(IL15前肽)-IL15-26aa接头-IL15Ra(FL))

SEQ ID NO:10/AA/sushi15(包括26aa接头)(不含IL15Rasp)

SEQ ID NO:11/AA/sIL15-LSP(IL15LSP-(IL15前肽)-IL15)

SEQ ID NO:47/AA/IL15LSP

SEQ ID NO:48/AA/IL15前肽

ID NO:12(endosp)

SEQ ID NO:13/AA/CCL19

SEQ ID NO:14/AA/IL2sp-mIL15/Ra-P2A-endosp-CCL19(包括26aa接头)

SEQ ID NO:24/AA/4-1BB共刺激结构域

SEQ ID NO:25/AA/CD3z(wt)胞内区

SEQ ID NO:26/AA/CD8铰链

SEQ ID NO:27/AA/CD8TM结构域

SEQ ID NO:43/AA/ssVHsp-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:42/NA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-BB-CD3z

SEQ ID NO:28/AA/IL2sp-mIL15/Ra(IL2sp-IL15-26 aa接头-IL15Ra(FL))

SEQ ID NO:29/AA/IL15Rasp-sushi15(IL15Rasp-sushi结构域-26aa接头-IL15)

P4 scFv中的SEQ ID NO:45/AA/肽接头(20个氨基酸)

SEQ ID NO:31/AA/IL15Rasp-sushi15-P2A-endosp-CCL19(IL15Rasp-sushi结构域-26aa接头-IL15-P2A-endosp-CCL19)

SEQ ID NO:32/AA/肽接头(26个氨基酸)

SEQ ID NO:33/AA/肽接头(20个氨基酸)

SEQ ID NO:34/AA/ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL2sp-mIL15/Ra(包括26aa接头)

SEQ ID NO:35/AA/ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15Rasp-sushi15-IL15(包括26aa接头)

SEQ ID NO:36/AA/ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL2sp-mIL15/Ra-P2A-endosp-CCL19(包括26aa接头)

SEQ ID NO:15/AA/ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15Rasp-sushi15-IL15-endosp-CCL19(包括26aa接头)

SEQ ID NO:37DNA P4-BB-mIL15/Ra

P4-BB-mIL15/Ra-LSP

SEQ ID NO:38DNA P4-BB-sushi15

P4-BB-sIL15-LSP

SEQ ID NO:39DNA P4-BB-mIL15/RaxCCL19

P4-BB-mIL15/Ra-LSP xCCL19

SEQ ID NO:40DNA P4-BB-sushi15xCCL19

SEQ ID NO:50/DNA/

>Seq42A_来自_37

/>

SEQ ID NO:51/DNA/

>Seq42B_来自_38(与有1个碱基差异)

SEQ ID NO:52/DNA/

>Seq42C_来自_39(与Seq42A 1154/1523的同一性(75.8％)；与来自CAR Seq ID#40的DNA序列相等)

SEQ ID NO:44/AA/Vg9-P2A-Vd2 TCR

SEQ ID NO:53AA SSVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP

(ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-mIL15/Ra(包括26aa接头)

SEQ ID NO:54AA SSVHsp-P4-BB-sIL15-LSP

(ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15)

SEQ ID NO:55AA SSVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP-CCL19

(ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19)

SEQ ID NO:56AA SSVHsp-P4-BB-sIL15-LSP-CCL19

(ssVHsp-P4-CD8h/TM-BB-CD3z-P2A-IL15LSP-IL15前肽-IL15-P2A-endospCCL19)

SEQ ID NO:57AA SSVHsp-P4-CD28-sushi15-CCL19

(ssVH-P4-CD28铰链-TM-CD28cyto-CD3z-P2A-IL15Rasp-IL15Ra(sushi)-20aa接头-IL15-P2A-endospCCL19)

SEQ ID NO:58DNA ssVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP

SEQ ID NO:59DNA ssVHsp-P4-BB-sIL15-LSP

SEQ ID NO:60DNA ssVHsp-P4-BB-mIL15/Ra-LSP-CCL19

/>

SEQ ID NO:61DNA ssVHsp-P4-BB-sIL15-LSP-CCL19

SEQ ID NO:63/AA/CD8TM结构域

SEQ ID NO:64/AA/CD8铰链

SEQ ID NO:65/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:66/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:67/AA/ssVHsp P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:68/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:69/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:70/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:71/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:72/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:73/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:74/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

SEQ ID NO:75/AA/ssVHsp-P4-CD8铰链-TM-41BB-CD3z

/>

Claims

1.一种分离的核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的第一多核苷酸和编码白细胞介素15(IL-15)的第二多核苷酸，所述嵌合抗原受体包含特异性识别人间皮素的抗体和4-1BB胞内区。

2.如权利要求1所述的分离的核酸分子，其中所述CAR还包含CD8铰链区、CD8跨膜区和CD3ζ胞内区。

3.如权利要求1或2所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子包含编码CAR的所述第一多核苷酸和编码IL-15的所述第二多核苷酸。

4.如权利要求1-3中任一项所述的分离的核酸分子，其还包含编码CCL19的第三多核苷酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述IL-15是人IL-15。

6.如权利要求1-5中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述CCL19是人CCL19。

7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含三个包含SEQ ID NO:16-18的互补决定区(CDR)，并且其中所述VL包含三个包含SEQ ID NO:19-21的CDR。

8.如权利要求1-7中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述VH包含SEQ ID NO:22，并且所述VL包含SEQ ID NO:23。

9.如权利要求1-8中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述抗体包含单链可变片段(scFv)形式。

10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述抗体包含SEQ ID NO:1。

11.如权利要求1-10所述的分离的核酸分子，其中所述4-1BB胞内区包含SEQ ID NO:24。

12.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述CD3ζ胞内区包含SEQ ID NO:25。

13.如权利要求2或12所述的分离的核酸分子，其中所述4-1BB胞内区位于所述分离的核酸分子中所述CD3ζ胞内区的上游。

14.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述CD8铰链区包含SEQ ID NO:26。

15.如权利要求2所述的分离的核酸分子，其中所述CD8跨膜区包含SEQ ID NO:27。

16.如权利要求2或14所述的分离的核酸分子，其中所述CAR还包含长度为3至10个氨基酸残基的连接所述抗体和所述CD8铰链区的肽接头。

17.如权利要求16所述的分离的核酸分子，其中所述肽接头包含SEQ ID NO:4。

18.如权利要求1-17中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述CAR还包含信号肽。

19.如权利要求18所述的分离的核酸分子，其中所述信号肽位于所述分离的核酸分子中特异性识别人间皮素的所述抗体的上游。

20.如权利要求18或19所述的分离的核酸分子，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:2。

21.如权利要求1-20中任一项所述的分离的核酸分子，其中编码IL-15的所述第二多核苷酸和任选地编码CCL19的所述第三多核苷酸各自独立地在启动子下转录，所述启动子包含编码自裂解2A肽(2A肽)的多核苷酸。

22.如权利要求21所述的分离的核酸分子，其中所述2A肽包含SEQ ID NO:5。

23.如权利要求1-22中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述IL-15包含选自SEQ IDNO:8-11的序列。

24.如权利要求1-22中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述IL-15包含选自SEQ IDNO:28或29的序列。

25.如权利要求1-24中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述CCL19包含SEQ ID NO:13。

26.如权利要求1-25中任一项所述的分离的核酸分子，其中编码所述CAR的所述第一多核苷酸和编码IL-15的所述第二多核苷酸在所述核酸分子中从5’末端到3’末端排列为编码所述CAR的所述第一多核苷酸-编码IL-15的所述第二多核苷酸。

27.如权利要求1-25中任一项所述的分离的核酸分子，其中编码所述CAR的所述第一多核苷酸、编码IL-15的所述第二多核苷酸和编码CCL19的所述第三多核苷酸在所述核酸分子中从5’末端到3’末端排列为编码所述CAR的所述第一多核苷酸-编码IL-15的所述第二多核苷酸-编码CCL19的所述第三多核苷酸。

28.如权利要求1-27中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:14或31的多肽。

29.如权利要求1-27中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码包含SEQ ID NO:34、35、36或15的多肽。

30.如权利要求1-27中任一项所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子包含SEQ ID NO:37、38、39或40。

31.一种载体，其包含如权利要求1-30中任一项所述的核酸分子。

32.如权利要求31所述的载体，其中所述载体是病毒载体，任选地是表达载体。

33.如权利要求32所述的载体，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒(AAV)载体。

34.如权利要求31或32所述的载体，其中所述病毒载体是pSFG载体、pMSGV载体或pMSCV载体。

35.如权利要求31所述的载体，其中所述载体是质粒。

36.一种免疫细胞，其包含如权利要求1-30中任一项所述的核酸分子或如权利要求31-35中任一项所述的载体。

37.如权利要求36所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞还包含编码gamma-TCR(γTCR)的多核苷酸和编码delta-TCR(δTCR)的多核苷酸。

38.如权利要求36所述的免疫细胞，其中所述γTCR是V gamma9TCR(Vγ9TCR)，并且所述δTCR是V delta 2TCR(Vδ2TCR)。

39.一种免疫细胞，其表达：

a)嵌合抗原受体(CAR)，其包含特异性识别人间皮素的抗体和4-1BB胞内区；和

b)IL-15；和

c)任选地CCL19。

40.如权利要求39所述的免疫细胞，其中所述CAR还包含CD8铰链区、CD8跨膜区和CD3ζ胞内区。

41.如权利要求36-40中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、抗原呈递细胞或粒细胞，任选地是T细胞或NK细胞。

42.如权利要求36-41中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞源自诱导多能干细胞(iPSC)。

43.如权利要求36-42中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞不表达alpha TCR(αTCR)和/或beta TCR(βTCR)，任选地不表达αβTCR。

44.如权利要求36-43中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞表达γδTCR。

45.如权利要求44所述的免疫细胞，其中所述γδTCR包括Vγ9TCR和Vδ2TCR。

46.一种药物组合物，其包含如权利要求35-44中任一项所述的免疫细胞和药学上可接受的添加剂。

47.一种治疗表达间皮素的癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用如权利要求35-44中任一项所述的免疫细胞或如权利要求46所述的药物组合物。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述表达间皮素的癌症是实体瘤，任选地选自间皮瘤、结直肠癌、胰腺癌、胸腺癌、胆管癌、肺癌、皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈癌、子宫癌、肝癌、肾癌、脾癌、气管癌、支气管癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、睾丸癌、卵巢癌和骨癌。

49.如权利要求47所述的方法，其中所述表达间皮素的癌症是造血系统癌症。

50.如权利要求47所述的方法，其中所述表达间皮素的癌症是肉瘤，任选地选自软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤。

51.如权利要求47-50中任一项所述的方法，其中所述表达间皮素的癌症是转移性癌症。

52.如权利要求47-50中任一项所述的方法，其中所述表达间皮素的癌症是复发性癌症或难治性癌症。

53.如权利要求47-52中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用附加治疗剂或附加治疗方案。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述附加治疗剂包括化学治疗剂、免疫治疗剂、靶向疗法、放射疗法或它们的组合。

55.如权利要求53所述的方法，其中所述附加治疗方案包括一线疗法。

56.如权利要求53所述的方法，其中所述附加治疗方案包括手术。

57.如权利要求53-56中任一项所述的方法，其中同时施用如权利要求36-44中任一项所述的免疫细胞或如权利要求45所述的药物组合物和所述附加治疗剂。

58.如权利要求52-55中任一项所述的方法，其中依序施用如权利要求36-44中任一项所述的免疫细胞或如权利要求45所述的药物组合物和所述附加治疗剂。

59.如权利要求57所述的方法，其中在施用所述附加治疗剂之前，向所述受试者施用如权利要求36-44中任一项所述的免疫细胞或如权利要求5所述的药物组合物。

60.如权利要求57所述的方法，其中在施用所述附加治疗剂之后，向所述受试者施用如权利要求35-43中任一项所述的免疫细胞或如权利要求45所述的药物组合物。

61.如权利要求46-59中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

62.一种降低肿瘤细胞增殖的方法，其包括使所述肿瘤细胞与如权利要求36-45中任一项所述的免疫细胞接触，从而降低所述肿瘤细胞增殖。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述方法是体外方法。

64.如权利要求62所述的方法，其中所述方法是体内方法。

65.一种产生表达特异性识别人间皮素的细胞表面分子、IL-15和任选CCL19的免疫细胞的方法，所述方法包括：

将如权利要求1-30中任一项所述的核酸分子或如权利要求31-35中任一项所述的载体引入免疫细胞，以诱导所述免疫细胞表达特异性识别人间皮素的细胞表面分子、IL-15和任选CCL19。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、抗原呈递细胞或粒细胞，任选地是T细胞或NK细胞。

67.一种试剂盒，其包含如权利要求1-30中任一项所述的核酸分子；如权利要求31-35中任一项所述的载体，如权利要求36-45中任一项所述的免疫细胞，或如权利要求46所述的药物组合物，以及使用说明。