CN118006718A - 一种具有抗炎功能的活性肽组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物活性肽的技术领域，公开了一种具有抗炎功能的活性肽组合物及其制备方法和应用。本发明提供的活性肽组合物的制备方法中，采用中性蛋白酶这一特定的酶分子相较于其他蛋白酶分子，能够实现对鲍鱼内脏中的蛋白质的特异性酶解，从而获得成分简单且包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1～34的小分子肽一种或多种的酶解液，接着采用特定截留分子量的滤膜对酶解液进行超滤，在处理过程中活性肽损失量小，且可获得一种具有优秀抗炎效果的活性肽组合物，该活性肽组合物可被很好地应用于制备治疗炎症的药物和/或保健性食品中。

Description

一种具有抗炎功能的活性肽组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物活性肽的技术领域，尤其涉及一种抗炎功能的鲍鱼内脏酶解物及其制备方法和应用。
背景技术
海洋生物是许多天然生物活性组分的重要来源之一，从海洋生物中提取得到的活性肽具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、降血压以及免疫调节等生物活性，可被运用于食品、饲料、生物医药等行业。
其中，鲍鱼是亚洲、非洲、澳洲和美洲大量海上养殖的重要渔业和食物工业资源之一，其富含蛋白质、矿物质和微量元素等营养物质。鲍鱼内脏是鲍鱼加工的副产品，位于鲍鱼软体背部环绕右侧壳肌的后缘，占鲍鱼总重量的15％-25％，该部分占最大面积的为消化腺和生殖腺，但大多数情况下鲍鱼内脏被当作鲍鱼加工的废弃物而丢弃，既污染环境，又限制了鲍鱼的高值化利用。近年来，科学研究也发现鲍鱼内脏中含有具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活的成分，可被应用作为生物活性肽的原料。
目前，从鲍鱼内脏中提取生物活性肽的方法主要包括物理法、化学法、酶解法等。传统的物理法需要较长时间和较高的能量消耗，成本较高；化学法操作步骤繁琐，化学试剂可能对制备产物和环境造成污染；酶解法条件温和，有较高的效率和选择性，易于控制反应进程，且具有成本较低、对环境友好等优点。但是，采用酶解法从鲍鱼内脏中提取活性肽存在着活性肽损失量较大，且所获得的活性肽纯度低，抗炎效果较差，具有较大的局限性。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种活性肽组合物的制备方法，在该制备方法中通过采用中性蛋白酶对鲍鱼内脏进行水解，所获得的活性肽组合物的制备获得的，具有优秀的抗炎效果。
本发明的第二目的在于提供一种活性肽组合物。
本发明的第三目的在于提供以上活性肽组合物的制备方法和/或活性肽组合物在制备用于治疗炎症的药物和/或保健性食品中的应用。
具体的，本发明提供的活性肽组合物的制备方法具体包括：S1、采用中性蛋白酶对鲍鱼内脏原料液进行酶解，得到酶解液；S2、采用截留分子量为3～5kDa的滤膜对所述酶解液进行超滤，获得所述活性肽组合物。
在一些具体的实施方式中，步骤S1中，所述鲍鱼内脏原料液是通过取鲍鱼内脏进行冻干、粉碎和匀浆获得的。
在一些具体的实施方式中，步骤S1中，所述匀浆中鲍鱼内脏与水的添加质量比为1:(10～20)。
在一些具体的实施方式中，步骤S1中，以所述鲍鱼内脏原料液中鲍鱼内脏的总质量为基准，所述中性蛋白酶的添加量为10～20wt％。
在一些具体的实施方式中，步骤S1中，所述酶解的溶液pH值为6～8，温度为45～60℃，时间为2～6h。
在一些具体的实施方式中，还包括对所述活性肽组合物进行纯化；所述纯化具体包括：取所述活性肽组合物进行吸附过滤、电渗析、层析、减压浓缩和干燥，得到活性肽组合物粉末。
本发明提供的活性肽组合物是通过以上的活性肽组合物的制备方法制备获得。
在一些具体的实施方式中，所述活性肽组合物包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1～34的小分子肽中的一种或多种。
在一些具体的实施方式中，所述小分子肽的重均分子量为0.5～3kDa。
本发明还提供了以上活性肽组合物的制备方法和/或活性肽组合物在制备用于治疗炎症的药物和/或保健性食品中的应用。
有益效果：
本发明提供的活性肽组合物的制备方法中，采用中性蛋白酶这一特定的酶分子相较于其他蛋白酶分子，能够实现对鲍鱼内脏中的蛋白质的特异性酶解，从而获得成分简单且包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1～34的小分子肽一种或多种的酶解液，接着采用特定截留分子量的滤膜对酶解液进行超滤，在处理过程中活性肽损失量小，且可获得一种具有优秀抗炎效果的活性肽组合物，该活性肽组合物可被很好地应用于制备治疗炎症的药物和/或保健性食品中。
附图说明
图1为本发明测试例中提供的蛋白印迹分析的实验结果图之一；
图2为本发明测试例中提供的蛋白印迹分析的实验结果图之二；
图3为本发明测试例中提供的蛋白印迹分析的实验结果图之三。
具体实施方式
本发明提供的活性肽组合物的制备方法具体包括：S1、采用中性蛋白酶对鲍鱼内脏原料液进行酶解，得到酶解液；S2、对所述酶解液进行超滤，获得所述活性肽组合物。
在本发明中，步骤S1中所述中性蛋白酶为由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的一类酶分子，可以是自行制备得到也可以是通过购买获得，以能够实现对鲍鱼内脏中的蛋白质的特异性酶解并获得氨基酸序列如SEQ ID NO:1～34的小分子肽一种或多种为限，并不对其加以特别的限定。
在本发明中，步骤S1中所述鲍鱼内脏原料液是通过对鲍鱼内脏进行加工处理获得的，加工处理的方法为现有样品处理中常使用的，以使鲍鱼内脏转变成利于中性蛋白酶酶解的状态为限，并不对其加以特别的限定。
在一些具体的实施方式中，所述鲍鱼内脏原料液优选的是通过取鲍鱼内脏进行冻干、粉碎和匀浆获得的。其中，所述冻干具体包括：取鲍鱼内脏于-45～-40℃下进行冷冻干燥24～48h。所述粉碎具体包括：通过挤压粉碎、冲击粉碎和/或研磨粉碎将经过冻干的鲍鱼内脏分解成粒径为100目以下的颗粒。所述匀浆具体包括：按照取经过粉碎的鲍鱼内脏颗粒与水混合，如1:10、1:12.5、1:15、1:18.3、1:20或它们之间的任意值，并通过玻璃匀浆法、研钵匀浆法、机器匀浆法和/或超声破碎法使鲍鱼内脏中的蛋白质充分释放，以便于酶解的进行。在一些优选的实施方式中，所述匀浆中鲍鱼内脏与水的添加质量比为1:(10～20)，如1:10、1:12.5、1:15、1:18.3、1:20或它们之间的任意值。此时，蛋白质从细胞中充分释放，溶液中蛋白质底物的浓度适宜，中性蛋白酶与蛋白质的结合机会大，有利于实现更佳的酶解效果。
在本发明中，步骤S1中以所述鲍鱼内脏原料液中鲍鱼内脏的总质量为基准，所述中性蛋白酶的添加量优选为10～20wt％，如10wt％、10.3wt％、11wt％、12.4wt％、13wt％、13.5wt％、14wt％、15wt％或它们之间的任意值。此时，溶液中蛋白质底物和中性蛋白酶的比例适宜，有利于中性蛋白酶与蛋白质的结合，进而实现更佳的酶解效果。
在本发明中，步骤S1中所述酶解的条件包括溶液pH值优选为6～8，如6、6.2、6.3、6.5、6.8、7、7.1、7.5、8或它们之间的任意值；温度优选为45～60℃，如45℃、48℃、50℃、51℃、53℃、56℃、59℃、60℃或它们之间的任意值；时间优选为2～6h，如2h、2.1h、2.3h、2.5h、2.8h、3h、3.4h、3.8h、4h、4.5h、5h、5.7h、6h或它们之间的任意值。此时，中性蛋白酶就有较高的酶活，能够实现更佳的酶解效果。
在本发明中，步骤S1中优选还包括对酶解液进行离心、过滤吸附以及过滤处理。其中，所述离心具体包括：于5000r/min的转速下对酶解液进行处理10～15min，取上清。所述过滤吸附具体包括：采用活性炭与离心获得的上清液混合30～120min，以除去其中的腥味物质；且以上清液的重质量为基准，活性炭的添加量优选为0.5～0.8wt％，如0.5wt％、0.53wt％、0.57wt％、0.6wt％、0.65wt％、0.68wt％、0.7wt％、0.75wt％、0.8wt％或它们之间的任意值。
在本发明中，步骤S2中所述超滤中使用的滤膜截留分子量为3～5kDa，如3kDa、3.2kDa、3.5kDa、4kDa、4.3kDa、4.4kDa、4.8kDa、5kDa或它们之间的任意值。此时，采用特定截留分子量的滤膜对酶解液进行超滤，能够实现活性肽组合物与其他杂质分子的有效分离，从而能够在活性肽损失量小的前提下，分离得到纯度高且抗炎效果优秀的活性肽组合物。
在本发明中，基于适用所述活性肽组合物在实际应用中更高的纯度要求，该制备方法进一步还包括对所述活性肽组合物进行纯化；所述纯化具体包括：取所述活性肽组合物进行电渗析、层析、减压浓缩和干燥，得到活性肽组合物粉末。其中，所述电渗析具体包括：在电场的作用下利用半透膜的选择透过性来实现活性肽组合物与其他杂质分子的有效分离；且所述电渗析的电流优选为0.1～2.5A，如0.1A、0.3A、0.8A、1A、1.2A、1.5A、2A、2.5A或它们之间的任意值。所述层析具体包括：采用DA-201C型大孔树脂对经电渗析处理的活性肽组合物进行层析。所述减压浓缩具体包括：于温度为40～60℃、压力为-0.05～-0.1bar的条件下对经过层析处理的活性肽组合物进行浓缩，以除去其中的水分子。所述干燥具体包括：采用冷冻干燥和/或低温烘干的方法对经过减压浓缩处理的活性肽组合物进行处理，以获得一种呈粉末状的活性肽组合物产品。
本发明还提供了一种活性肽组合物，所述活性肽组合物是通过以上所述的活性肽的制备方法制备获得的。
在本发明中，所述活性肽组合物具体包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1～34的小分子肽中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，所述活性肽组合物中各小分子肽的含量优选的表1所示：
表1.
在本发明中，所述活性肽组合物中小分子肽的重均分子量优选为0.5～3kDa，如0.5kDa、0.8kDa、1kDa、1.3kDa、1.8kDa、2kDa、2.4kDa、2.7kDa、3kDa或它们之间的任意值。
本发明还提供了以上活性肽组合物的制备方法和/或活性肽组合物在制备用于治疗炎症的药物和/或保健性食品中的应用。该活性肽组合物可通过MAPK、ERK和p38MAPK途径抑制细胞内NO生成以及炎症细胞因子和炎症媒介物的表达，实现优秀的抗炎效果。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例以及对比例所使用的原料及来源具体为：
中性蛋白酶(北京夏盛，货号为FDG-2230)；
菠萝蛋白酶(南宁庞博，货号为BL-2304)；
RAW264.7细胞(武汉尚恩，货号为SNL-112)；
CCK-8试剂盒(上海麦克林，货号为C917226)；
DMEM培养基(gibco，货号为C11995500)；
胎牛血清(gibco，货号为10099141)；
IL-6、IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特，货号为E-EL-M0037，E-EL-M0044和E-EL-M3063)；
一级抗体ERK(湖南艾方，货号为AF02701)；
一级抗体p-ERK(湖南艾方，货号为AF05828)；
一级抗体JNK(湖南艾方，货号为AF300488)；
一级抗体p-JNK(湖南艾方，货号为AF300539)；
一级抗体P-38(湖南艾方，货号为AF300301)；
一级抗体p-P38(湖南艾方，货号为AF00879)；
辣根过氧化物酶共轭的山羊抗小鼠IgG二级抗体(Amersham PharmaciaBiotech)；
ECL检测试剂(Amersham Biosciences)。
实施例
本实施例用以说明一种活性肽组合物的制备，具体包括：
S1、取冻干鲍鱼内脏进行磨粉并加入10倍重量的去离子水匀浆后，调节溶液pH值至7.5，加入20wt％的中性蛋白酶(以冻干鲍鱼内脏的重量计)，于55℃下酶解5h后，于100℃水浴加热灭酶，得到酶解液；
S2、取酶解液于5000r/min下离心15min，取上清液，加入0.5wt％的活性炭(以上清液的重量计)，过滤收集滤液，依次采用截留相对分子质量为30、10、3KD的中空纤维膜对滤液进行超滤，收集透过液，得到活性肽组合物，记为AVZE。
在本实施例提供的制备方法中，超滤前后的总肽量分别为1.34g和1.32g，肽损失量为1.5％。并利用HPLC对制备得到的活性肽组合物进行测定，该活性肽组合物中含有76.3wt％的相对分子质量小于3KDa的小分子肽。并采用LC-MS/MS对活性肽组合物进行分析，共检测到34种小肽，检测结果如表2所示。
其中，LC-MS/MS的测试条件包括：采用Q Exactive HF质谱仪串联UltiMate3000RSLCnano液相的液质联用系统；LC中流动相A：0.1％的甲酸和3％的DMSO，流动相B：0.1％的甲酸、3％的DMSO和80％的乙腈，流速为300nL/min；质谱仪以DDA模式采集数据，每个扫描循环中包含一个MS全扫描(R＝60K，AGC＝3e6，max IT＝25ms，scan range＝350-1500m/z)，以及随后的20个MS/MS扫描(R＝15K，AGC＝1e5，max IT＝50ms)；动态排除时间为24s。
表2.
对比例1
该对比例提供一种活性肽组合物的制备，具体包括：
S1、取冻干鲍鱼内脏进行磨粉并加入20倍重量的去离子水匀浆后，调节溶液pH值至7.0，加入10wt％的菠萝蛋白酶(以冻干鲍鱼内脏的重量计)，于50℃下酶解4h后，于100℃水浴加热灭酶，得到酶解液；
S2、取酶解液于5000r/min下离心15min，取上清液，加入0.5wt％的活性炭(以上清液的重量计)，过滤收集滤液，依次采用截留相对分子质量为30、10、3KD的中空纤维膜对滤液进行超滤，收集透过液，得到活性肽组合物。
利用HPLC对该对比例制备得到的活性肽组合物进行测定，该活性肽组合物中含有61.2wt％的相对分子质量小于3KDa的小分子肽。并采用LC-MS/MS对活性肽组合物进行分析，共检测到20种小肽，检测结果如表3所示(与实施例的测试方法及条件相同)。
表3.
对比例2
该对比例提供一种活性肽组合物的制备方法，具体包括：
S1、取冻干鲍鱼内脏进行磨粉并加入15倍重量的去离子水匀浆后，调节溶液pH值至7.5，加入15wt％的木瓜蛋白酶(以冻干鲍鱼内脏的重量计)，于50℃下酶解4h后，于100℃水浴加热灭酶，得到酶解液；
S2、取酶解液于5000r/min下离心15min，取上清液，加入0.5wt％的活性炭(以上清液的重量计)，过滤收集滤液，依次采用截留相对分子质量为30、10、3KD的中空纤维膜对滤液进行超滤，收集透过液，得到活性肽组合。
并利用HPLC对该对比例制备得到的活性肽组合物进行测定，该活性肽组合物中含有69.5wt％的相对分子质量小于3KDa的小分子肽。并采用LC-MS/MS对活性肽组合物进行分析，共检测到26种小肽，检测结果如表4所示(与实施例的测试方法及条件相同)。
表4.
测试例
本测试例用以说明实施例和对比例1、2提供的活性肽组合物的相关生物活性，具体测试包括：
(1)细胞存活率测定：采用CCK-8试剂盒进行测试，具体包括：按照1×104个/孔的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板中，并加入2mL的生长培养基，于37℃下预温育过夜；接着采用PBS缓冲液洗涤96孔板，更换为含1％胎牛血清的DMEM培养基并加入终浓度为1μg/mL的脂多糖和300μg/mL的活性肽组合物，于37℃下进行培养24h；培养24h后除去上清液，向每孔中加入10％的CCK-8溶液，于25℃下培养2h后，使用酶标仪(Thermo Varioskan LUX，CA，USA)测定450nm处吸光度(OD450)，并以RAW264.7细胞作为空白对照组，以仅加入脂多糖进行培养的细胞作为对照组。根据下式计算细胞活力：
细胞存活率(％)＝(Aa-Ac)/(Ab-Ac)×100％
其中，Aa为实验组测得的吸光度；Ab为空白对照组测得的吸光度；Ac为加入有CCK-8的含1％血清的培养基的吸光度。测试结果如表5所示。
(2)抗炎功能：(i)NO生成量测定：采用Griess反应测试各培养液中的NO水平，具体为：按照1×104个/孔的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板中，并加入2mL的生长培养基，于37℃下预温育过夜；接着采用PBS缓冲液洗涤96孔板，更换为含1％胎牛血清的DMEM培养基并加入终浓度为1μg/mL的脂多糖和300μg/mL的活性肽组合物，于37℃下进行培养24h；培养结束后收集细胞培养液上清，取75μL上清液和等量的Griess试剂，然后用酶标仪(ThermoVarioskan LUX，CA，USA)测定548nm处的吸光度(使用磷酸-亚硝酸盐标准品绘制0-100μmol/L的标准曲线，根据标准曲线计算样品中NO的含量)。测试结果如表5所示。
(ii)细胞炎症因子表达量测定：使用酶联免疫法测定细胞炎症因子的表达，具体为：按照1×104个/孔的密度将RAW264.7细胞接种于96孔板中，于37℃下预温育过夜；接着采用PBS缓冲液洗涤96孔板，更换为含1％胎牛血清的DMEM培养基并加入终浓度为1μg/mL的脂多糖和300μg/mL的活性肽组合物，于37℃下进行培养24h；培养结束后收集细胞培养液上清，根据小鼠IL-6、IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒使用说明书，测定细胞培养液上清中促炎细胞因子的水平，每样品平行测定3次(按照说明书稀释各个标准品绘制标准曲线，根据浓度和吸光度值，使用ELISAcalc计算标准曲线的回归方程，拟合模型选用logistic曲线(四参数)，根据标准曲线计算样品中各种炎症因子的含量)。测试结果如表5所示。
(iii)蛋白印迹分析：按照1x106个细胞/孔的密度将RAW264.7细胞接种于6孔板中接种，并加入2mL的生长培养基，于37℃下生长24h；更换为含1％胎牛血清的DMEM培养基并加入终浓度为1μg/mL的脂多糖于37℃下刺激培养1h，接着加入终浓度为300μg/mL的活性肽组合物，于37℃下进行培养18h；培养结束后收集细胞并提取细胞蛋白，使用10％SDS-PAGE分离所提取得到的细胞蛋白；接着采用电泳方法将细胞蛋白转移到PVDF膜，采用膜用阻断溶液于室温下预温育30min，然后用一级抗体ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、P-38和p-P38(1:1000)在室温下温育2h后进行洗涤；采用辣根过氧化物酶共轭的山羊抗小鼠IgG二级抗体(1:10000)温育1h；对PVDF膜使用ECL检测试剂盒于近红外荧光成像仪(Tanon，Shanghai，CHN)中扫描曝光并分析。测试结果如图1～3所示。
表5.
由表5所示的测试结果可知，相较于原始RAW264.7细胞(也即空白对照组)，使用1μg/mL的脂多糖刺激培养的RAW264.7细胞(也即对照组)，NO生成量以及各炎症因子的表达量显著上升，说明炎症模型构建成功。相较于对照组以及对比例1和2，采用本发明实施例提供的活性肽组合物与脂多糖共同进行培养，通过组合物各种小肽之间的相互协同作用，能够显著抑制脂多糖刺激RAW264.7细胞生成NO的能力，大大降低NO的生成量；同时，在本发明实施例提供的活性肽组合物作用下，IL-6、IL-1β和TNF-α的表达量显著下降。
由图1～3所示的测试结果可知，本发明实施例提供的活性肽组合物对RAW264.7细胞细胞内的JNK、ERK和p38磷酸化具有抑制作用，由此推测该活性肽组合物经由MAPK、ERK和p38MAPK途径衰减脂多糖诱发的炎症细胞因子表达，从而实现良好的抗炎效果，可被用于制备治疗炎性疾病的药物或功能性保健食品，应用前景良好。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种活性肽组合物的制备方法，其特征在于，该制备方法具体包括：
S1、采用中性蛋白酶对鲍鱼内脏原料液进行酶解，得到酶解液；
S2、采用截留分子量为3～5kDa的滤膜对所述酶解液进行超滤，获得所述活性肽组合物。
2.根据权利要求1所述的活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述鲍鱼内脏原料液是通过取鲍鱼内脏进行冻干、粉碎和匀浆获得的。
3.根据权利要求2所述的活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述匀浆中鲍鱼内脏与水的添加质量比为1:(10～20)。
4.根据权利要求1所述的活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，以所述鲍鱼内脏原料液中鲍鱼内脏的总质量为基准，所述中性蛋白酶的添加量为10～20wt％。
5.根据权利要求1所述的活性肽组合物的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述酶解的溶液pH值为6～8，温度为45～60℃，时间为2～6h。
6.根据权利要求1所述的活性肽组合物的制备方法，其特征在于，还包括对所述活性肽组合物进行纯化；所述纯化具体包括：取所述活性肽组合物进行电渗析、层析、减压浓缩和干燥，得到活性肽组合物粉末。
7.一种活性肽组合物，其特征在于，通过权利要求1～6任一所述的活性肽组合物的制备方法制备获得。
8.根据权利要求7所述的活性肽组合物，其特征在于，所述活性肽组合物包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1～34的小分子肽中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的活性肽组合物，其特征在于，所述小分子肽的重均分子量为0.5～3kDa。
10.权利要求1～6任一所述的活性肽组合物的制备方法和/或权利要求7～9任一所述的活性肽组合物在制备用于治疗炎症的药物和/或保健性食品中的应用。
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