CN118005778A - 一株阻断性非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用 - Google Patents
一株阻断性非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118005778A CN118005778A CN202410208793.XA CN202410208793A CN118005778A CN 118005778 A CN118005778 A CN 118005778A CN 202410208793 A CN202410208793 A CN 202410208793A CN 118005778 A CN118005778 A CN 118005778A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- protein
- antibody
- seq
- asfv
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 101900228950 African swine fever virus Phosphoprotein p30 Proteins 0.000 title claims abstract description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title abstract description 28
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 claims abstract description 45
- 101710120319 Photosystem I reaction center subunit IV Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 101710189818 Non-structural protein 2a Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 101710151911 Phosphoprotein p30 Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 3
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 17
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 abstract description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 abstract description 3
- 101000605534 Homo sapiens Prostate-specific antigen Proteins 0.000 abstract description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 abstract description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000011258 core-shell material Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 101001105440 Chlamydomonas reinhardtii Photosystem I reaction center subunit IV, chloroplastic Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 206010040893 Skin necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一株阻断性非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用。所述杂交瘤细胞株分泌的抗体，能识别真核细胞中的p30蛋白和用于western blotting检测p30蛋白，ASFV阳性猪血清对该单克隆抗体与p30抗原结合具有抑制作用，能用于建立ASFV抗体竞争ELISA检测方法。本发明涉及的p30单克隆抗体细胞株及应用，为我国ASFV检测技术开发提供坚实的物质和技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及其在建立p30抗体阻断ELISA检测方法中的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)感染猪引起的一种烈性、高度接触性传染病，病死率可高达100％，是危害世界养猪业的一种重要传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病。ASFV低毒力株感染严重迟缓育肥猪生长，引致种猪繁殖障碍，且感染潜伏期长，临床症状早期不易觉察，可在猪群中悄无声息传播，晚期可出现关节炎、皮肤坏死等典型症状，危害严重，防控难度大。ASF已成为猪场全力防控的首要疫病，亟需有效的技术方法和防控措施来控制ASFV流行。
ASFV是一种有囊膜、线性双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员。其病毒粒子结构较为复杂，由内至外分五层组成：含病毒基因组的类核(nucleoid)、内核心壳(core shell)、内膜(inner envelope)、衣壳(capsid)和外囊膜(outerenvelope)。ASFV基因组全长为170-194kbp，由中央保守区和两端可变区组成，编码151-167个开放阅读框(Open reading frame,ORF)。通过质谱分析，在体外培养的细胞中，可以检测到94种病毒蛋白的表达。而成熟的病毒粒子，则发现多达68种病毒蛋白，其中未知功能蛋白达20多种。在众多ASFV蛋白中，p30是ASFV编码的一种早期蛋白。在ASFV感染猪只中，p30抗体生成时间早，形成水平高，是检测ASFV感染的重要靶标。
当前，ASFV尚无有效疫苗和药物可供使用，检测技术在ASFV防控中发挥着重要作用。但ASFV强、弱毒感染存在明显差异：强毒感染引起急性型ASF，症状明显，病程快，病毒血症水平及排毒量高；弱毒感染引起慢性型ASF，临床症状不明显，潜伏期长，病毒量及排毒量低，存在间歇排毒现象。我国研制了多种ASFV病原核酸检测技术，在猪场外防ASFV输入、场内感染清除中发挥了关键作用。但ASFV弱毒变异株的出现与流行，对ASFV核酸检测技术形成挑战。弱毒变异株感染，病毒量低或间歇性排毒，使病原核酸检测存在漏检风险。但弱毒变异株感染，仍然可以刺激猪体产生显著的抗体免疫反应，且抗体水平稳定、持续时间长，在无疫苗使用的背景下，检测ASFV抗体是诊断弱毒变异株感染的有效途径。
发明内容
为了解决上述问题，本发明以大肠杆菌表达纯化的p30蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体。通过筛选及亚克隆纯化，获得了一株分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞株分泌的单抗，在阻断ELISA检测中，阳性猪血清能高效阻断该单克隆抗体与p30蛋白结合，显示该单克隆抗体可应用于建立p30抗体阻断ELISA，这将为我国ASFV血清学检测技术开发提供坚实基础。此外，该株单抗可IFA检测中识别真核细胞中表达的p30蛋白，也能用于western blotting中识别p30蛋白，显示出该单抗对p30蛋白有良好的结合特性。
本发明的目的提供一株ASFV p30单克隆抗体细胞株及其应用。所述的单克隆细胞株分泌的抗体，能识别真核细胞中的p30蛋白和用于western blotting检测p30蛋白，ASFV阳性猪血清对该单克隆抗体与p30抗原结合具有抑制作用，能用于建立ASFV抗体竞争ELISA检测方法。
此外，本发明还提供了一种p30的制备方法及应用。
此外，本发明还提供了一种p30抗体阻断ELISA方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
本发明将p30蛋白免疫Balb/c小鼠，取产生高水平抗体小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合，通过p30抗体ELISA筛选阳性克隆杂交瘤，并通过稀释法获得纯化的杂交瘤细胞克隆。通过ASFV阳性猪血清的阻断ELISA检测，获得了一株能分泌与ASFV阳性血清竞争性抗体的杂交瘤细胞株。
本发明中使用的p30抗体阻断ELISA方法为：每孔p30蛋白包被量为20ng；0.05M碳酸盐缓冲液为包被液，4℃包被过夜；5％脱脂乳为封闭液，37℃封闭时间1h；ASFV阳性血清作1:20倍稀释，37℃孵育1h；杂交瘤细胞培养上清37℃孵育1h；酶标羊抗小鼠抗体稀释度为1:1×104,37℃孵育1h；TMD室温下显色10min，建立了p30抗体间接ELISA方法。
其中，所述的p30抗体重链为IgG2b亚型，轻链为Kappa亚型。
进一步的，本发明提供一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，所述抗体包含：氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11、13、15的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；和，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:27、29、31的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；
优选地，所述的单克隆抗体包括，如SEQ ID NO:9所示的重链可变区，和/或，如SEQID NO:25所示的轻链可变区。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段。
进一步的，本发明提供一种分离的核酸分子，其包含能够编码抗体重链可变区的核酸序列，其中所述抗体包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11、13、15的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；和，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:27、29、31的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
进一步的，本发明提供一种载体，其包含上述分离的核酸分子。
进一步的，本发明提供一种宿主细胞，其包含上述分离的核酸分子或的载体。
进一步的，本发明提供制备上述单克隆抗体的方法，其包括，在合适的条件下培养上述宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述单克隆抗体。
有益效果
本发明以p30蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，并通过ELISA和阻断ELISA筛选及亚克隆纯化，获得了一株分泌p30单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该杂交瘤细胞株分泌的单抗，可识别真核细胞中表达的p30蛋白，也能用于western blotting中识别p30蛋白，且与ASFV阳性猪血清中抗体具有高度竞争性，能用于建立p30抗体阻断ELISA检测方法。本发明涉及的p30单克隆抗体细胞株及应用，为我国ASFV检测技术开发提供坚实的物质和技术支撑。
附图说明
图1ASFV阳性猪血清对2-3株单抗的抑制作用；
图2单抗识别WB中的p30蛋白；
图3 1F9株单抗识别真核表达的p30蛋白。
具体实施方式
下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下:
HRP标记羊抗鼠抗体和小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒，proteintech公司；ELISA酶标板，圣菲科公司产品；HT、HAT、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，sigma公司；DMEM培养基，Thermo fisher公司。
其它试剂：质粒提取试剂盒，购自OMEGA公司；IPTG、BSA和TMB，购自碧云天生物科技公司；脱脂乳，购自美国BD公司；考马斯亮蓝R-250，购自Biosharp公司。
实施例1.p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备
1.1小鼠免疫
利用本实验室以大肠杆菌表达纯化的ASFV p30蛋白免疫小鼠。5只6-8周龄的Balb/c小鼠，初免以弗氏完全佐剂乳化的p30蛋白皮下免疫接种。初免后21天，以弗氏不完全佐剂乳化的p30蛋白皮下接种再次免疫。二免10天后，通过尾静脉采血，制备血清，以本实验室建立的p30抗体间接ELISA进行抗体水平检测。ELISA结果显示，5只免疫小鼠血清中的抗体达到1:32000稀释倍以上。二免后21天，选择2只p30抗体水平高的小鼠，通过尾静脉注射p30蛋白加强免疫。
1.2杂交瘤细胞融合与筛选
第三次加强免疫后3天，取小鼠脾脏，制备脾细胞。按照常规程序，将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。融合后的细胞，分种入含有饲养细胞的96孔板。融合后15天，取生长有杂交瘤细胞的孔的上清进行ELISA检测，阳性孔杂交瘤细胞进行有限稀释法进行亚隆纯化。经过3轮单克隆纯化，同一杂交瘤细胞株在96孔板上检测孔阳性率达到100％，将杂交瘤细胞扩大培养保存。
1.3分泌阻断性单克隆抗体的杂交瘤细胞株筛选
在本实验室建立的p30抗体间接ELISA基础上稍加修改，建立p30抗体间接阻断ELISA，即：p30蛋白20ng/孔包被的酶标板，1:20稀释的灭活ASFV阳性猪血清和阴性猪血清以100μL/孔分别加入不同孔中，一列阳性血清间隔一列阴性血清，37℃孵育1h。经PBST洗涤后，加入杂交瘤细胞上清，37℃孵育1h。经PBST洗涤后，加入hrp标记的羊抗鼠抗体，37℃孵育1h。PBST洗涤后，加入TMD室温作用15min，2M的浓硫酸终止反应，酶标仪测定OD450值。阻断ELISA检测结果显示：一株杂交瘤细胞1F9抗体的阴性猪血清/阳性猪血清(N/P)的值为4.25，显示出该株杂交瘤细胞分泌单抗与猪血清中的ASFV抗体有较好的竞争抑制作用。
实施例2.1F9株单克隆抗体的生物学特性
2.1不同猪血清对1F9株单克隆抗体抑制效果检测
将6份灭活ASFV阳性猪血清和6份阴性猪血清均作1:20稀释，应用实施实例1.3中的竞争ELISA方法进行检测，结果如图1所示，阳性样品与阴性样品OD值存在极显著差异，平均OD值N/P为4.03。这表明所测不同阳性血清对1F9株单抗均具有良好的抑制作用。
2.2 1F9株单克隆抗体对p30蛋白的识别
将制备的p30蛋白进行SDS-PAGE，随后转膜，以1F9株单抗作为一抗，进行westernblotting分析。如图2所示，1F9株单抗识别变性电泳后的p30蛋白。
将p30蛋白基因序列克隆入真核表达载体p3×Flag-CMV-7.1中，构建了重组表达质粒pFlag-P30。将pFlag-P30及p3×Flag-CMV-7.1转染293T细胞。转染后24h，固定细胞，以1F9株单抗作为一抗进行间接免疫荧光(IFA)分析。结果如图3所示，1F9株单抗特异性识别真核细胞中表达的p30蛋白。
2.3 1F9株单克隆杂交瘤的稳定性
将1F9株单克隆杂交瘤细胞株连续传代10代，计数第10代细胞数量，取150个细胞分种至96孔板。培养10天后，随机取20孔细胞上清，进行间接ELISA检测。各孔上清OD450值如表，所有孔均为阳性。这表明，1F9株杂交瘤细胞能稳定分泌p30抗体。
表1.二十孔杂交瘤细胞的OD450值
2.4 1F9株单克隆抗体亚型鉴定
应用proteintech公司的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分析1F9株单克隆抗体的亚型。按照试剂盒说明书，将1F9株培养上清进行鉴定。试剂盒测定的值(表2)显示，该株单抗重链为IgG2b亚型，轻链为Kappa亚型。
表2.2-3株单抗亚型鉴定
2.5 1F9株单克隆抗体高变区基因序列
培养于6孔板中的1F9株杂交瘤细胞，移出上清后，每孔加入1mL Trizol裂解细胞，将裂解样品收集于1.5mL离心管，暂存于-80℃，将样品提交生物技术公司进行小鼠杂交瘤细胞单克隆抗体可变区测序。测序结果如下：
重链可变区(VH)核苷酸序列如下:
5’-GAAGTGATTCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTGTGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTGGTAGTGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCATCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGACATTATGGGGATTACGACCGAGGAGACTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3’(SEQ ID NO.1)。其中，
骨架区1(FR1):5’-GAAGTGATTCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAAC TCTCCTGTGCAGCCTCT-3’(SEQ ID NO.2)；
互补决定区1(CDR1)：5’-GGATTCACTTTCAGTAGCTGTGCC-3’(SEQ ID NO.3)；
FR2:5’-ATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACC-3’(SEQ IDNO.4)；
CDR2：5’-ATTGGTAGTGGTGGTAGTTACACC-3’(SEQ ID NO.5)；
FR3:5’-TACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCATCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAC CCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGT-3’
(SEQ ID NO.6)；
CDR3：5’-GCAAGACATTATGGGGATTACGACCGAGGAGACTTTGCTATGGACTAC-3’(SEQ IDNO.7)；
FR4:5’-TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA-3’(SEQ ID NO.8)。
对应的氨基酸序列如下：
VH:
EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSCAMSWVRQTPEKRLEWVATIGSGGSYTYYP
DSVKGRFIISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARHYGDYDRGDFAMDYWGQGTSVT VSS(SEQID NO.9)；
FR1:EVILVESGGGLVKPGGSLKLSCAAS(SEQ ID NO.10)；
CDR1:GFTFSSCA(SEQ ID NO.11)；
FR2:MSWVRQTPEKRLEWVAT(SEQ ID NO.12)；
CDR2:IGSGGSYT(SEQ ID NO.13)；
FR3:YYPDSVKGRFIISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYC(SEQ ID NO.14)；
CDR3:ARHYGDYDRGDFAMDY(SEQ ID NO.15)；
FR4:WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.16)。
轻链可变区(VL)核苷酸序列如下:
5’-CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAGTCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGCGGGTCACCATGACCTGCACTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTATTTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCAACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCACCAGTATCATCGTTCCCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA-3’(SEQ ID NO.17)。其中：FR1:5’-CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAGTCATGTCTGCATCTCTAGGGGAGCGGGTCAC CATGACCTGCACTGCCAGC-3’(SEQ IDNO.18)；
CDR1:5’-TCAAGTGTAAGTTCCAGTTAT-3’(SEQ ID NO.19)；
FR2:5’-TTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAAACTCTGGATTTAT-3’(SEQ IDNO.20)
CDR2:5’-AGCACATCC-3’(SEQ ID NO.21)；
FR3:5’-AACCTGGCTTCTGGAGTCCCAACTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTC TCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGC(SEQ ID NO.22)-3’
CDR3:5’-CACCAGTATCATCGTTCCCCATTCACG-3’(SEQ ID NO.23)；
FR4:5’-TTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA-3’(SEQ ID NO.24)。
对应的氨基酸序列如下：
VL：QIVLTQSPAVMSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPTR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO.25)；
FR1：QIVLTQSPAVMSASLGERVTMTCTAS(SEQ ID NO.26)；
CDR1:SSVSSSY(SEQ ID NO.27)；
FR2：LHWYQQKPGSSPKLWIY(SEQ ID NO.28)；
CDR2:STS(SEQ ID NO.29)；
FR3：NLASGVPTRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYC(SEQ ID NO.30)；
CDR3:HQYHRSPFT(SEQ ID NO.31)；
FR4：FGSGTKLEIK(SEQ ID NO.32)。
通过上述实施实例，本发明制备了一株ASFV p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株1F9，确定了该株单抗的可变区序列。该株单抗，ASFV抗体阳性猪血清能抑制其与p30蛋白结合，显示其可用于建立p30抗体阻断ELISA检测方法。此外，该株单抗可用于IFA，识别真核细胞中表达的p30蛋白；也可用于western blotting，识别变性的p30蛋白，显示该单抗可广泛应用于对p30蛋白的分子检测中。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，其特征在于所述抗体包含：氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11、13、15的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；和，氨基酸序列分别为SEQ IDNO:27、29、31的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体包括，如SEQID NO:9所示的重链可变区，和/或，如SEQ ID NO:25所示的轻链可变区。
3.一种分离的核酸分子，其包含能够编码如权利要求1所述的一株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的核酸序列，其中所述抗体包含氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11、13、15的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；和，氨基酸序列分别为SEQ ID NO:27、29、31的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。
4.一种载体，其包含权利要求3所述的分离的核酸分子。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求3所述的分离的核酸分子或权利要求4所述的载体。
6.一种制备权利要求1所述的单克隆抗体的方法，其包括，在合适的条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述单克隆抗体。
7.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体在制备ASFV抗体竞争ELISA检测试剂盒中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其中使用的p30抗体阻断ELISA方法为：每孔p30蛋白包被量为20ng；0.05M碳酸盐缓冲液为包被液，4℃包被过夜；5％脱脂乳为封闭液，37℃封闭时间1h；ASFV阳性血清作1:20倍稀释，37℃孵育1h；p30蛋白单克隆抗体37℃孵育1h；酶标羊抗小鼠抗体稀释度为1:1×104,37℃孵育1h；TMD室温下显色10min，建立了p30抗体间接ELISA方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410208793.XA CN118005778A (zh) | 2024-02-26 | 2024-02-26 | 一株阻断性非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410208793.XA CN118005778A (zh) | 2024-02-26 | 2024-02-26 | 一株阻断性非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118005778A true CN118005778A (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90948236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410208793.XA Pending CN118005778A (zh) | 2024-02-26 | 2024-02-26 | 一株阻断性非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118005778A (zh) |
-
2024
- 2024-02-26 CN CN202410208793.XA patent/CN118005778A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113336844B (zh) | 一种靶向新冠病毒n蛋白的鲨鱼单域抗体及其制备方法和应用 | |
| CN112812178B (zh) | PCV3 Cap蛋白抗原表位肽、抗PCV3 Cap蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN109180810B (zh) | 特异性结合诺如病毒gi.1基因型vp1蛋白或vlp的抗体及其制备方法和应用 | |
| CN109265542B (zh) | 特异性结合诺如病毒gii.4基因型vp1蛋白或vlp的抗体及其制备方法和应用 | |
| Li et al. | Identification and characterization of monoclonal antibodies against the ORFV059 protein encoded by Orf virus | |
| CN115724952A (zh) | 一种靶向甲型流感病毒保守线性b细胞表位的广谱单克隆抗体及其应用 | |
| CN116836270B (zh) | 一种抗蓝舌病毒vp7蛋白的单克隆抗体及制备方法与用途 | |
| CN109295002B (zh) | 杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN108752471B (zh) | 抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用 | |
| CN106701687B (zh) | 一种杂交瘤细胞株及其产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体 | |
| CN116217716A (zh) | 一种识别柯萨奇病毒a2、a4和a5的单克隆抗体及其应用 | |
| CN118005778A (zh) | 一株阻断性非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用 | |
| CN113929772B (zh) | SARS-CoV-2中和抗体及其制备方法与应用 | |
| CN116444653B (zh) | 一株阻断性非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备与应用 | |
| CN109097337B (zh) | 可分泌抗Ad3FK单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN115698058A (zh) | 抗SARS-CoV-2刺突蛋白单克隆抗体 | |
| CN116496414A (zh) | 一种检测马精液质量的联合检测抗体及其应用 | |
| CN116769021B (zh) | 一种针对非洲马瘟病毒vp7蛋白的单克隆抗体及用途 | |
| CN113831408B (zh) | 一种猪伪狂犬病毒ep0蛋白的单克隆抗体、制备方法和应用 | |
| CN115960220B (zh) | 特异性结合柯萨奇病毒a6的单克隆抗体及其用途 | |
| CN110551211B (zh) | 含抗肠病毒71型vp1蛋白单克隆抗体的检测试剂盒 | |
| CN118085070A (zh) | 识别cva6空心颗粒和实心颗粒且具有中和活性的单克隆抗体及其应用 | |
| CN108913665B (zh) | 一种分泌抗CpHV-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN117659173A (zh) | 抗PRV gC蛋白单克隆抗体、其制备方法及应用 | |
| CN116284360A (zh) | 识别cv-a4 vp1蛋白n末端的单克隆抗体及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |