CN118005746B - Actin 5C重组蛋白、编码其的核酸分子及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开Actin 5C重组蛋白、编码其的核酸分子及应用。本发明的Actin 5C重组蛋白具有选自以下的任意一种氨基酸序列：(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列；(II)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列。本发明的重组蛋白Actin 5C或其片段在表达后具有较高活性，且具有促进胃上皮细胞增殖的作用，能够恢复胃器官指数，对胃溃疡造成的损伤有明显的改善作用。

Description

Actin 5C重组蛋白、编码其的核酸分子及应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地涉及Actin 5C重组蛋白、编码其的核酸分子及应用。
背景技术
近年来，胃病发病率逐年升高，而许多胃病都与胃溃疡有关。由于快速的生活节奏、巨大的生活和工作压力以及饮食结构发生了很大的变化，以致胃溃疡的发病率呈逐年上升的趋势。
胃溃疡的发病机制复杂，是损害因素和防御因素失衡的结果，根本原因是胃黏膜屏障的损害。胃的损害因素有胃酸和胃蛋白酶、非甾体类药物、胆盐、病原菌等；防御因素有黏液屏障(包括碳酸氢盐)、细胞再生、黏膜血流、前列腺素等。胃溃疡多发生于胃窦小弯和胃角，临床主要表现为规律性的上腹疼痛、烧心、反酸、恶心、呕吐、腹胀、黑便等，给患者带来极大的痛苦。
目前针对胃溃疡防治的药物主要分为3类，即抑制损害因素的药物，主要是使用质子泵抑制剂和组胺H2受体拮抗剂来抑制胃酸分泌；增加防御因素的药物，即保护胃膜药物；抗生素。这些药物在临床上出现了很多的不良反应报告。因此，目前亟需一种新的安全有效的防治胃溃疡的药物。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分问题，本发明提供重组蛋白Actin 5C、编码其的核酸分子及应用。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种Actin 5C蛋白或其片段，其具有(I)-(III)所示的任意一种氨基酸序列：
(I)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性，且具有与Actin 5C蛋白相同功能的氨基酸序列；
(II)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的且具有与Actin 5C蛋白相同功能的氨基酸序列。
(III)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的且具有与Actin 5C蛋白相同功能的氨基酸序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的Actin 5C蛋白或其片段，其中，所述的Actin 5C蛋白或其片段具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供一种核酸分子，其编码上述的Actin 5C蛋白或其片段。
在某些实施方案中，根据本发明所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括经密码子优化得到的编码序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的核酸分子，其中，所述核酸分子具有以下所示的任意一种核酸序列：
(a)包含SEQ ID NO.2所示的核酸序列；
(b)与SEQ ID NO.2所示的核酸序列具有至少90％同源性，且具有相同功能的核酸序列；
(c)SEQ ID NO.2所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个核苷酸获得的且具有相同功能的核酸序列。
本发明的第三方面，提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。
本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其包含本发明所述的载体。
本发明的第五方面，提供一种Actin 5C蛋白或其片段的制备方法，其包括以下步骤：
(1)在适于所述Actin 5C表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞，得到培养物；和
(2)从所述培养物中分离所表达的蛋白。
在某些实施方案中，根据本发明所述的Actin 5C蛋白或其片段的制备方法，其中，所述方法包括：
(1)构建Actin 5C重组蛋白表达载体，所述载体包含本发明所述的核酸分子；
(2)将所述载体转入细胞，诱导Actin 5C重组蛋白的表达；
(3)纯化Actin 5C重组蛋白。
本发明的第六方面，提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的所述Actin 5C蛋白或其片段、所述核酸分子、所述载体、或所述宿主细胞。
本发明的第七方面，提供所述Actin 5C蛋白或其片段、所述核酸分子、所述载体、或所述宿主细胞在用于制备预防、改善或治疗胃溃疡或其相关病症的药物中的用途。
本发明的Actin 5C重组蛋白或其片段在表达后具有很好的活性，具有促进胃上皮细胞增殖的作用，同时能够恢复胃器官指数，对胃溃疡造成的损伤具有明显的改善作用。
附图说明
图1示出了pet22b-Actin 5C-His载体图谱。
图2示出了重组质粒PCR扩增后电泳图，其中，中间条带为Actin 5C，两侧条带为Marker。
图3示出了菌体裂解液上清和沉淀的SDS-PAGE电泳图，其中，M为Marker；Lane 1为诱导前；Lane 2为诱导后总蛋白(18℃)；Lane 3为上清(18℃)；Lane 4为沉淀(18℃)；Lane5为诱导后总蛋白(37℃)；Lane 6为上清(37℃)；Lane 7为沉淀(37℃)。
图4示出了不同洗脱体积下重组蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中，Lane1为重组蛋白纯化前；Lane 2为50mM咪唑洗脱120μL；Lane 3为50mM咪唑洗脱220μL；Lane 4为50mM咪唑洗脱320μL；M为Marker；Lane 6为500mM咪唑洗脱120μL；Lane 7为500mM咪唑洗脱219μL；Lane8为500mM咪唑洗脱314μL；Lane 9为500mM咪唑洗脱410μL；Lane 10为500mM咪唑洗脱514μL。
图5示出了pet22b-Actin 5C-HIs重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图6示出了原代大鼠胃上皮细胞免疫荧光鉴定结果，其中，1为DAPI细胞核染色；2为EPCAM上皮细胞蛋白染色；3为DAPI细胞核、EPCAM上皮细胞蛋白合并染色；4为DAPI细胞核染色；5为VIM成纤维细胞蛋白染色；6为DAPI细胞核、VIM成纤维细胞蛋白合并染色，比例尺为400μm。
图7示出了Actin 5C重组蛋白对原代大鼠胃膜上皮细胞活力的影响，其中，与空白对照组相比，###P＜0.001，与模型组相比，***P＜0.001。
图8示出了Actin 5C重组蛋白对大鼠胃溃疡相关的黏膜损伤情况的影响。
图9示出了Actin 5C重组蛋白对大鼠血清中炎症因子的影响，其中，与空白组相比，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
图10示出了Actin 5C重组蛋白对大鼠血清中氧化应激相关酶的影响，其中，与空白组相比，##P＜0.01，###P＜0.001，与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
Actin 5C蛋白
本发明的一个方面，提供一种Actin 5C蛋白或其片段。本文所用术语“蛋白”、“肽”和“多肽”可以互换使用，其是指通过酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。“蛋白”还包括通过化学或酶催化的反应引入的翻译后修饰，可以理解，该术语可以包含蛋白的变体或片段。
任何适合的Actin 5C蛋白均可用于本发明，所述的Actin 5C蛋白包括全长的Actin 5C蛋白或其生物活性片段(或称为活性片段)。本文中，Actin 5C蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持Actin 5C蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持Actin 5C蛋白的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持Actin 5C蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
在本发明中，所述的Actin 5C蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自植物或哺乳动物。此外，所述的Actin 5C蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组Actin 5C蛋白。较佳地，可采用重组的Actin 5C蛋白。
本发明的蛋白或多肽在C-末端和/或N-末端可以具有共价修饰。它们也可以采取各种形式(例如天然，融合体，糖基化，非糖基化，脂质化，非脂质化，磷酸化，非磷酸化，肉豆蔻酰基化，非肉豆蔻酰基化，单体，多聚，颗粒等)而存在。
来源于其它物种的Actin 5C蛋白均包含于本发明中，特别是那些与Actin5C蛋白具有同源性的蛋白。如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子，例如，在核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或在多肽分子之间的总体相关性。通常，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本发明的背景下，术语同源性包括同一性和相似性。
“同源性”可使用本领域已知的方法(诸如，序列比较算法)确定，当在比较窗口上以最大一致性比较和对齐时，两个或多个序列具有指定百分比的在指定区域上相同的核苷酸。两个序列之间的“同源性”百分比可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul,StephenF.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,和DavidJ.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs”,Nucleic Acids Res.)使用默认参数来确定。
在一些实施方案中，如果分子中至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的单体是相同的(完全相同的单体)或相似(保守置换)，聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
在某些实施方案中，Actin 5C蛋白或其片段具有与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少95％、优选至少96％、还优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％，更优选至少99.9％同源性的氨基酸序列，并且具有上述同源性氨基酸序列的蛋白与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能。
在某些实施方案中，Actin 5C蛋白或其片段具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个氨基酸获得的氨基酸序列，并且具有上述氨基酸序列的蛋白与SEQ ID NO.1所示的蛋白具有相同功能。可以理解的是，Actin 5C蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性，参见例如Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
在某些实施方案中，Actin 5C蛋白或其片段具有在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到氨基酸序列，并且具有上述氨基酸序列的蛋白与SEQ IDNO.1所示的蛋白具有相同功能。在所述Actin 5C蛋白或其片段的C端连接的标签包括但不限于His标签、S-tag标签、TrxA标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签中的至少一种；在所述Actin 5C蛋白或其片段的N端连接的标签包括但不限于S-tag标签、TrxA标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签中的至少一种；或者，在所述Actin 5C蛋白或其片段的N端连接的标签包括His标签，以及S-tag标签、TrxA标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签或NusA标签中的至少一种。
在一个优选的实施方案中，Actin 5C蛋白或其片段具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
核酸分子
本发明的第二方面，提供一种核酸(或核苷酸)分子。本发明中，核酸分子编码Actin 5C重组蛋白、Actin 5C蛋白的变体或片段。
在某些实施方案中，编码Actin 5C重组蛋白的核酸序列具有与SEQ ID NO.2所示的核酸序列具有至少90％同源性的核酸序列，例如与根据SEQ ID NO.2的核酸序列具有至少95％、优选至少96％、还优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％，更优选至少99.9％同源性的核酸序列，并且具有上述同源性序列的核酸分子与SEQ ID NO.2所示的核酸分子具有相同功能。
在某些实施方案中，编码Actin 5C重组蛋白的核酸序列具有与SEQ ID NO.2所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多于一个核苷酸获得的核酸序列，并且具有上述序列的核酸分子与SEQ ID NO.2所示的核酸分子具有相同功能。
在一个优选的实施方案中，编码Actin 5C重组蛋白的核酸分子具有SEQ ID NO.2所示的核酸序列。
本发明中核酸分子包括经密码子优化得到的编码序列。密码子是指信使RNA分子中每相邻的三个核苷酸为一组，在蛋白质合成时，其代表某一种氨基酸的规律。“密码子优化”旨在包括在不改变氨基酸序列的情况下对重组核酸的密码子组成进行改变。
本发明所用术语“核酸”旨在包括任何长度的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物，其包括DNA、RNA和DNA/RNA杂合物，其还包括DNA或RNA类似物，诸如含有修饰的骨架(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。因此，本发明的核酸包括DNA、cDNA、mRNA、重组核酸等。
载体
本发明提供包括包含编码所述Actin 5C蛋白的核酸分子的载体。所述的载体还可包含与所述核酸分子的序列可操作地连接的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的“可操作地连接”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连接于编码序列。载体可以是例如经设计以在宿主细胞中表达核苷酸序列的表达载体，或经设计以产生重组病毒或病毒样颗粒的病毒载体。
宿主细胞
本发明提供了一种宿主细胞，其包括上述的载体。用于克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌等，例如可以是大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主细胞包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。
制备方法
本发明的一个方面，提供Actin 5C蛋白或其片段的制备方法。一旦分离获得了本发明所述蛋白的编码序列或氨基酸序列，就可以采用重组技术来大批量地获得该蛋白。这通常是将其编码基因克隆至载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。此外，也可采用人工合成(如通过多肽合成仪合成)的方法来合成有关序列。
在一个优选的实施方案中，所述方法包括：
(1)将编码Actin 5C蛋白的碱基序列与pet22b载体连接构建重组蛋白表达载体；
(2)将所述重组载体转化至细胞并诱导Actin 5C重组蛋白的表达；
(3)纯化Actin 5C重组蛋白。
药物组合物
本发明的一个方面，提供一种药物组合物，其包括所述Actin 5C蛋白或其片段、所述核酸分子、所述载体、或所述宿主细胞。本发明的药物组合物进一步包括药物学可接受载体。
所述药物学可接受载体在领域内是熟知的，包括本身不诱导产生对接受所述组合物的受试者有害的任何载体。本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。药物学可接受载体包括但不限于稀释剂、赋形剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲物质等。稀释剂包括但不限于水、无菌无热原水、盐水、磷酸盐缓冲生理盐水、甘油等。
本发明的药物组合物可以是任何适宜的剂型。例如，注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
用途
本发明的一个方面，提供所述Actin 5C蛋白或其片段、所述核酸分子、所述载体、或所述宿主细胞在用于制备预防、改善或治疗胃溃疡或其相关病症的药物中的用途。
本发明使用的术语“治疗或预防”指的是在疾病或机能紊乱发生之前或之后改善这种状况。与同等条件下未经治疗的参照组相比，按照任何标准技术来衡量，这种缓解或预防程度至少是5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％。在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱，例如胃溃疡的进展。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。“治疗”还意指与不接受治疗时预期的生存期限相比所延长的生存期限。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
在具体的实施方案中，本发明还提供所述Actin 5C蛋白或其片段在用于制备促进乙醇损伤胃粘膜上皮细胞增殖的药物中的用途。
在具体的实施方案中，本发明还提供所述Actin 5C蛋白或其片段在用于制备抑制乙醇损伤对胃粘膜炎症因子的释放的药物中的用途。
在具体的实施方案中，本发明还提供所述Actin 5C蛋白或其片段在用于制备改善乙醇对胃粘膜的氧化应激损伤的药物中的用途。所述改善包括降低氧化应激因子ROS、MDA的分泌量和/或增加抗氧化酶SOD的分泌量。
实施例
1.实验方法
1.1Actin 5C重组蛋白表达载体构建
1.1.1Actin 5C蛋白的序列
Actin 5C，由113个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MVKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHTGVMVGMGQKDAYVGDEAQS KRGILTLKYPIEHGIVSNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTEAPLN PKANREKMTQIMFETFN。
对蛋白序列进行密码子优化，并添加了His标签。优化后的碱基序列如SEQ IDNO.2所示：
ATGGTTAAGGCTGGTTTCGCTGGTGATGATGCTCCAAGAGCTGTTTTCCCATCCATCGTTGGTAGACCAAGACACACTGGTGTTATGGTTGGTATGGGTCAAAAGGACGCTTACGTTGGTGACGAAGCTCAATCCAAGAGAGGTATCTTGACCCTGAAGTACCCAATCGAGCACGGTATCGTTTCTAACTGGGACGACATGGAAAAGATCTGGCACCACACTTTCTACAACGAGTTGAGAGTTGCTCCAGAGGAACACCCAGTTTTGTTGACTGAAGCTCCATTGAACCCAAAGGCCAACAGAGAAAAGATGACCCAGATCATGTTCGAGACTTTCAACCATCACCACCACCATCACTAA。
1.1.2重组蛋白的载体图谱
将优化后的Actin 5C碱基序列与pet22b载体构建载体图谱，参见图1。
1.1.3重组质粒扩增
使用PCR法扩增目的序列，扩增体系(50μL)如表1所示，扩增程序如表2所示。
表1PCR扩增体系
表2PCR扩增程序
1.1.4载体质粒酶切
使用NdeI/BamHI对pet22b载体进行双酶酶切，酶切体系如表3所示。
表3双酶切体系
以上酶切体系混匀后置于37℃水浴锅中反应15min，然后使用DNA凝胶回收试剂盒进行切胶回收。
1.1.5重组质粒的构建
将切胶回收的载体与目的片段进行重组酶连接，即按照表4所示反应体系(20μL)，在50℃水浴中反应15-20min。
表4重组酶连接反应体系
1.1.6转化
将连接体系转化至DH5α感受态细胞，具体步骤如下：(1)从-80℃冰箱中取1管感受态细胞，立即置于冰上；(2)加入连接体系(体积不超过10μL)，轻轻混匀，冰上放置30分钟；(3)42℃水浴中准确热击90秒，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟；(4)向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后于37℃，200rpm床振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态；(5)将上述菌液离心，去除800μL上清，余下培养基吸打混匀后取涂布于含相应抗生素的筛选平板上；(6)倒置培养皿，37℃培养16-24小时；(7)转化后的平板挑菌，将克隆菌液送测序公司测序，验证重组质粒的准确性。
1.2Actin 5C重组蛋白试表达
诱导Actin 5C重组蛋白的表达步骤如下：
(1)将表达质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中，37℃倒置过夜培养；
(2)挑取单菌落于5mL的LB培养基中，37℃，250rpm条件过夜培养16-18h，作为种子液；
(3)将种子液按1:100转接到新鲜的LB培养基中，37℃，250rpm条件培养，当菌液OD600＝0.6时，补加IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM，在18℃或37℃温度下继续诱导培养16-18h；
(4)低温离心收集菌体；
(5)将菌体用裂解buffer(50mM Tris，500mM NaCl)重悬后进行超声破碎；
(6)超声后的样品，低温离心，分别取上清和沉淀用15％的SDS-PAGE胶进行蛋白分析。
1.3Actin 5C重组蛋白的纯化
根据SDS-PAGE电泳结果，将成功诱导表达蛋白的菌体破碎分离，取沉淀部分进行进一步的蛋白纯化，具体步骤如下：
(1)将表达完的菌液进行离心，4500r/min，15min，弃上清，收集沉淀；
(2)取菌液加入裂解buffer重悬后进行超声破碎。超声条件为：work 3s，off 2s，时间15min，重复一遍；
(3)将超声破碎后的菌液于低温离心机内离心(7000rmp，25min，4℃)，保留沉淀。
(4)将上述获得的沉淀，用buffer(50mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，2mM咪唑)复溶，使用0.45μm滤膜过滤后，通过His亲和层析柱(Ni-TED柱)进行蛋白纯化。步骤如下：
1)用5倍柱体积的去离子水洗涤，去除空气和20％乙醇；
2)用5-10倍柱体积buffer(50mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，2mM咪唑)平衡柱子，并将样品以1mL/min的速度流穿层析柱；
3)上样后先用buffer(50mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，2mM咪唑)冲洗8-10倍填料体积进行洗杂，洗脱梯度为50mM咪唑×3管(洗脱体积分别为120μL，220μL和320μL)，500mM咪唑×5管(洗脱体积分别为120μL，219μL，314μL，410μL和514μL)；
(5)根据洗脱样的SDS-PAGE图含目的蛋白的样品进行透析，透析到PBS pH7.4中。
1.4Actin 5C重组蛋白活性验证
1.4.1实验细胞与动物
原代大鼠胃上皮细胞：分离自SD大鼠乳鼠的胃膜，培养条件为原代胃上皮细胞专用完全培养基，37℃、5％CO2培养箱。
SD大鼠：购自亿斯实验动物技术有限公司，SPF级，180-200g，合格证编号：SCXK(JI)-2020-0002。
1.4.2原代大鼠胃上皮细胞的分离与培养
取大鼠乳鼠的胃，将胃剪开，用含有青链双抗的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，转移至用含有0.21％牛血清白蛋白(BSA)、0.17％分散酶2(Dispase2)和0.12％胶原酶Ⅰ的磷酸盐缓冲液(PBS)配置的消化酶中，乳鼠胃的个数与消化酶毫升数比为1:3。于37℃，160r/min的摇床中消化1h。用吹管反复吹打后置于37℃恒温培养箱中孵育15min。将胃组织取出，于4℃，1050r/min将消化液离心5min。弃上清，用培养基重悬，过0.22μm的细胞筛网，4℃，1050r/min，离心5min。弃上清，用培养基重悬，转移到T25细胞培养瓶中，及时查看情况并换液。当原代细胞铺满瓶底，细胞融合达80％以上时，可进行传代。传代前先用PBS清洗细胞1次，加入1mL 0.25％胰酶-EDTA对细胞进行消化，在倒置显微镜下观察，当细胞间隙变大，细胞变圆时，吸弃胰酶，加入2mL培养基终止消化，并充分吹打，使细胞脱落。将细胞转入1.5mLEP管中以1100r/min进行离心，吸弃上层培养基，加入新培养基将细胞重悬，按照1：3的比例接种于T25细胞培养瓶中继续培养。
1.4.3原代大鼠胃上皮细胞的鉴定
分离出的原代大鼠胃上皮细胞培养1-2d直至细胞融合达80％，吸弃培养基，用PBS清洗3次。用4％多聚甲醛于室温下固定细胞15min，再用PBS清洗3次，加入0.5％ Triton x-100，室温下孵育30min，吸弃上清，加入上皮细胞抗体(EPCAM)或成纤维细胞抗体(VIM)于4℃孵育过夜。吸弃抗体，PBS清洗3次，加入山羊抗兔抗体，37℃避光孵育1h。加入细胞核染色(DIPA)染细胞核15min。倒置显微镜下观察。
1.4.4Actin 5C对细胞增殖活性的影响
将稳定生长的原代大鼠胃上皮细胞以每孔5×104的细胞密度均匀地铺在96孔板中，并在37℃和5％二氧化碳的培养箱中培养24小时。然后将培养基更换为含有5％无水乙醇的培养基，继续孵育3h以损伤细胞，造乙醇损伤模型。造模后更换新鲜的培养基，同时给药组分别给予1、3、5μg/mL Actin5C重组蛋白，并继续培养24小时。使用CCK-8法检测各组细胞的增殖和损伤情况，即每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃培养箱内孵育2h后，于450nm波长处测定每孔的吸光度。
1.4.5动物分组与给药
将SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、低、中、高剂量组及阳性对照组，每组10只，于恒温(25±1)℃、恒湿(70％)的SPF级洁净环境中适应性饲养1周。空白组大鼠灌胃生理盐水，其余各组大鼠灌胃1mL无水乙醇，造乙醇致大鼠胃溃疡模型。造模后，低、中、高剂量组大鼠分别灌胃0.03、0.1、0.3mg/kg的Actin 5C重组蛋白，阳性对照组大鼠灌胃0.3mg/kg的其它蛋白PDOP，空白组与模型组大鼠灌胃等体积的蒸馏水，连续给药7天。
1.4.6胃器官指数
药物干预7天后，各组大鼠禁食禁水24h，腹腔注射麻醉。称量大鼠体质量，分离大鼠胃组织，于生理盐水中轻轻清洗胃表面的食物残渣，称取重量。通过以下公式计算胃器官指数：胃器官指数(g/kg)＝胃重量(g)/体重(kg)。
1.4.7大鼠胃溃疡情况
各组大鼠的胃组织，沿胃大弯剪开，用冰生理盐水轻轻冲洗胃表面的污物，用滤纸吸干、除净胃表面的黏液、血凝块等，用针头固定后，拍照。图像使用Image J软件分析胃损伤程度，计算胃溃疡面积占整个胃黏膜面积的百分比。
1.4.8大鼠血清生化指标的检测
各组大鼠腹腔注射麻醉，使用真空采血管和采血针，于大鼠腹主动脉取血，室温中静置30min凝固分层，然后3000rpm离心5min，收集上层血清转至干净的离心管中，再于4℃环境中12000rpm离心10min，取上清转移至离心管中，分装后做好标记。采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6，以及氧化应激相关酶ROS、MDA、SOD的含量。按照试剂盒说明书的要求，具体实验流程如下：
(1)加样：试剂盒置于室温中平衡20min，包被微孔板中标准品孔每孔中加入50μL不同浓度的标准品溶液；样品孔加入10μL待测血清，再加入40μL稀释液；空白孔不加液；
(2)加抗体反应液：标准孔和样品孔中分别加入100μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，空白孔不加液；
(3)孵育：将封板膜封住包被微孔板反应孔，于37℃恒温箱孵育1h；
(4)洗板：移除所有液体，在滤纸上将液体拍打至干，将洗涤液加满每孔(注意不要溢出)，放置1min，移除洗涤液，在滤纸上将拍打至干。重复洗板5次。
(5)加底物：每孔依次加入50μL反应液A、50μL反应液B，37℃避光条件下孵育15min；
(6)终止：每孔立刻加入50μL终止液使反应停止；
(7)检测：在15min以内，于450nm波长处使用酶标仪检测各孔的吸光度值。
2.实验结果
2.1目的基因片段的扩增
PCR扩增后的电泳结果如图2所示。
2.2重组蛋白试表达
将Actin 5C重组蛋白成功转化的菌体裂解后，上清和沉淀的SDS-PAGE结果如图3所示。目的蛋白分子量约为13.6kD，由电泳图结果可知，该重组蛋白在37℃的诱导条件下，沉淀部分都有表达。
2.3重组蛋白纯化结果
重组蛋白按照不同程序洗脱后的蛋白电泳结果见图4，可见在50mM和500mM咪唑的洗脱条件下，重组蛋白均成功纯化。
根据纯化后跑胶结果，对50mM咪唑洗脱的蛋白3管和500mM咪唑洗脱的蛋白5管合样，并进行SDS-PAGE电泳检测，结果见图5。即将200mL发酵液纯化后得到蛋白1mg，浓度为0.25mg/mL，体积4mL。
2.4大鼠原代胃上皮细胞免疫荧光鉴定
选取稳定生长的原代大鼠胃上皮细胞进行染色鉴定。根据上皮细胞表达上皮细胞粘附分子蛋白EPCAM，成纤维细胞表达波形蛋白Vim的特性，采用免疫荧光染色法对分离到的大鼠原代胃上皮细胞进行鉴定。鉴定结果见图6，由图可见，免疫荧光染色后，分离的原代细胞呈EPCAM阳性表达，细胞膜呈绿色荧光，而Vim呈阴性表达，由此可以判定，分离的原代细胞为胃上皮细胞。
2.5Actin 5C重组蛋白对原代大鼠胃上皮细胞活力的影响
根据不同浓度Actin 5C重组蛋白对5％无水乙醇诱导的胃上皮细胞损伤后细胞活力的影响，通过与模型组和对照组比较，来验证Actin5C重组蛋白的活性。结果如图7所示，与空白对照组相比，模型组细胞的活力显著下降(P＜0.001)。与模型组相比，1、3、5μg/mL的Actin 5C重组蛋白能够显著增加被乙醇损伤后细胞的细胞活力，且对细胞的增殖活性与蛋白浓度呈正相关。由此可见，Actin 5C重组蛋白具有促进乙醇损伤原代大鼠胃上皮细胞增殖的作用。
2.6Actin 5C重组蛋白对大鼠胃器官指数的影响
各组大鼠的胃器官指数见表5，结果可知，模型组大鼠的胃器官指数显著降低，低剂量和中剂量组大鼠的胃器官指数略有升高，阳性对照组大鼠指数明显升高，但与模型组相比均无显著性差异，高剂量组大鼠的胃器官指数显著升高，基本恢复至正常水平。结果表明，乙醇能够显著降低大鼠胃器官指数，而Actin 5C重组蛋白能够恢复大鼠的胃器官指数。
表5Actin 5C重组蛋白对大鼠胃器官指数的影响(x±s，n＝10)
注：与空白对照组相比，#P＜0.05；与模型组相比，*P＜0.05。
2.7Actin 5C重组蛋白对大鼠胃溃疡情况的影响
各组大鼠的胃溃疡情况见图8。由图可见，空白组大鼠胃内壁表面光滑，呈浅粉色，无明显血色，无异味；模型组大鼠胃内壁可见多处损伤部位，胃体呈鲜红色，有明显胃膜脱落并伴有出血情况，有腐败异味；与模型组相比，低剂量组和中剂量组大鼠胃内壁明显恢复，胃体颜色稍转浅，胃膜脱落情况明显减轻，但依然有少量血丝及腐败异味；高剂量组大鼠胃体颜色基本恢复至正常颜色，无胃膜脱落情况，基本无血丝及异味，胃膜状态与阳性对照组相当。对胃溃疡情况的评估结果见表6，与空白组相比，模型组大鼠胃溃疡损伤面积显著增加，与模型组相比，各给药组大鼠的胃溃疡损伤面积均显著减小，且Actin 5C重组蛋白与胃溃疡的恢复作用呈剂量依赖关系。结果表明，Actin 5C重组蛋白对乙醇导致的大鼠胃溃疡损伤有明显的改善作用。
表6各组大鼠给药剂量及胃损伤程度(x±s，n＝10)
2.8Actin 5C重组蛋白对胃溃疡大鼠血清中炎症因子的影响
通过Elisa法检测了乙醇致大鼠胃溃疡后，各组大鼠血清中炎症因子NF-α、IL-6、IL-1β的分泌情况，见图9。结果显示，与空白组相比，乙醇损伤大鼠胃溃疡后血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌量显著增加，而给予低、中、高不同剂量的Actin 5C重组蛋白后，与模型组相比，上述炎症因子的分泌量显著降低，且高剂量组对炎症因子分泌的干预作用强于阳性对照组。因此，Actin 5C重组蛋白能够显著抑制乙醇损伤对大鼠胃溃疡炎症因子的释放。
2.9Actin 5C重组蛋白对胃溃疡大鼠血清中氧化应激相关酶的影响
通过Elisa法检测乙醇致大鼠胃溃疡后，各组大鼠血清中氧化应激相关酶ROS、MDA、SOD的分泌情况，如图10。结果显示，与空白组相比，乙醇损伤大鼠胃溃疡后血清中氧化应激因子ROS、MDA的分泌量显著增加，抗氧化因子SOD的分泌量显著降低，表明乙醇能够刺激大鼠胃膜脂质过氧化损伤；分别给予低、中、高不同剂量的Actin 5C重组蛋白后，与模型组相比，氧化应激因子ROS、MDA的分泌量显著降低，抗氧化酶SOD的分泌显著增加，表明Actin 5C重组蛋白能够显著改善乙醇对大鼠胃膜的氧化应激损伤。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应对理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.Actin 5C蛋白在制备改善或治疗胃溃疡的药物中的用途，其特征在于，所述Actin5C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.核酸分子在制备改善或治疗胃溃疡的药物中的用途，其特征在于，所述核酸分子编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的Actin 5C蛋白。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述核酸分子包括经密码子优化得到的编码序列。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
5.载体在制备改善或治疗胃溃疡的药物中的用途，其特征在于，所述载体包含编码Actin 5C蛋白的核酸分子，所述Actin 5C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.宿主细胞在制备改善或治疗胃溃疡的药物中的用途，其特征在于，所述宿主细胞包含载体，所述载体包含编码Actin 5C蛋白的核酸分子，所述Actin 5C蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述Actin 5C蛋白由包括以下步骤的方法制备得到：
(1)在适于所述Actin 5C表达的条件下培养宿主细胞，得到培养物；和
(2)从所述培养物中分离所表达的蛋白。
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