CN118005719A - 一种SIRPα阻断剂多肽、其构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种SIRPα阻断剂多肽、其构建方法及应用。本发明从CD47和SIRPα的结合位点出发，通过多肽库筛选出可以特异性阻断CD47和SIRPα结合的多肽，其结合位点明确，不会影响SIRPα的其他生物活性。多肽可与常规药物载体聚乙二醇、脂质体、聚合物和蛋白质共价修饰，在原有载药体系中引入防清除基团，可与现有技术相结合，在药物载送方面具有广阔的应用前景。该阻断剂多肽为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，或包含该氨基酸序列的可溶肽或者其功能保守性变体，结构通式如下：
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，涉及SIRPα阻断剂多肽、其构建方法及在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，可以吞噬和清除入侵的微生物，但同样可以清除注射的药物，纳米粒子和病毒载体，这便会极大缩短治疗剂和显像剂在体内的滞留时间从而降低病灶位点的富集。目前通过聚乙二醇、脂质体、聚合物和蛋白质包覆药物形成纳米颗来延缓免疫系统的清除，但形成的包封结构则会阻碍病灶位点细胞的吞噬显著降低药效。
整合素相关蛋白(Cluster ofDifferentiation 47，CD47)是一种跨膜免疫球蛋白，在多种癌细胞表面过度表达，通过与巨噬细胞表面表达信号调节蛋白(signalregulatory proteinα，SIRPα)的N末端结合，活酪氨酸磷酸化酶抑制肌球蛋白在巨噬细胞突触膜下装配位点的聚集，发出“别吃我”的信号，抑制巨噬细胞的吞噬作用，从而保护健康细胞不被免疫系统破坏，也使得癌细胞能够逃避巨噬细胞介导的吞噬作用。CD47蛋白与凋亡、增殖、黏附、迁移等细胞学过程密切相关，在免疫及心血管反应中扮演关键角色，同时参与了肿瘤免疫逃逸，对肿瘤细胞的微环境有重要影响。
基于CD47和SIRPα免疫检查点抑制剂的研究已经成为目前免疫治疗的热点，通过开发CD47或SIRPα的抗体或小分子药物阻断CD47和SIRPα的信号传导，从而激活巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬达到癌症治疗的目的。研究表明，CD47和SIRPα通过1:1的形式发生相互交叉高度卷曲的结合，结合位点均发生在CD47和SIRPα这两个分子的N端，其核心的结合位点位于CD47上的E29,E35，K39，E97，E100，E104，L101，T102，R103。基于以上基础，通过截取CD47上的核心区域构建阻断SIRPα的多肽片段，以此阻断CD47和SIRPα的结合，从而降低小分子药物或者抗体的巨噬细胞吞噬，提高药效。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种SIRPα阻断剂多肽及构建方法；第二目的在于提供上述SIRPα阻断剂多肽白蛋白修饰中的作用，提供了一种血清白蛋白载体，通过抑制巨噬细胞吞噬增加稳定性。所述多肽在药物载体的研发中具有广阔的应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种SIRPα阻断剂多肽，用于阻断CD47和SIRPα间免疫结合，为氨基酸序列EVTELTREGE(SEQ ID NO.1)，或包含该氨基酸序列的可溶肽或者其功能保守性变体。
上述所述的SIRPα阻断剂多肽的结构通式如下式I所示：
其中，X选自C、O、N中的任意一种，
Y选自OH、间隔基、小分子药物、荧光染料、多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成盐，酯，酰胺或酰肼，
A选自H或C＝O，
B选自H、间隔基、小分子药物、荧光染料、多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成胺盐酸盐、对甲苯磺基、苄氧羰基、叔丁羰基、氯乙酰或甲酰基盐。
C选自H，间隔基、小分子药物、荧光染料，多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成O-酰基或O-烷基衍生物。
优选的，所述间隔基选自饱和烷基链(碳个数为4-10)，聚乙二醇(聚合度为2-6)中的任意一种或多种；小分子药物选自紫杉醇、喜树碱、二氢卟吩e6中的任意一种或多种；荧光染料选自吲哚菁绿、二氢卟吩e6、新吲哚菁绿IR800中的任意一种或多种；所述多肽为靶向多肽，用于抗肿瘤治疗，如靶向CPC-3的多肽；所述蛋白质为血清白蛋白，选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、驴血清白蛋白中的任意一种。
本发明的具体实施方式中，提供了SIRPα阻断剂多肽EM-17，其氨基酸序列如下所示：Maleimide-GGGGGGEVTELTREGE(SEQ ID NO.2)所示，结构式如下式II所示：
本发明的第二方面，提供了SIRPα阻断剂多肽(SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的功能保守性变体EE-10)的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，以9-芴基甲氧基羰基-谷氨酸-氧叔丁基为原料，Cl树脂为载体，加缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐以摩尔比1:1:3进行偶联30min，形成9-芴基甲氧基羰基谷氨酸树脂；
步骤2，采用体积比为1:5的哌啶及N,N-二甲基甲酰胺脱除9-芴基甲氧基羰基保护反应15min，并采用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺洗涤后，分别加入C端第二个保护氨基酸9-芴基甲氧基羰基-甘氨酸-氧叔丁基、缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺以摩尔比1:3:1进行偶联；二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺洗涤后，用体积比为1:5的哌啶和N,N-二甲基甲酰胺脱除9-芴基甲氧基羰基保护；后续经过洗涤-偶联-再洗涤的步骤，直至最后一个氨基酸偶联结束，形成全保护多肽树脂；
步骤3，以体积比为82.5:5:5:2.5:5的三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、水混合液作为切肽试剂，将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，2h后加入4℃预冷的乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤多次后，真空抽干，得到多肽粗品。
进一步，包含EE-10的功能保守性变体多肽EM17的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，称取9-芴基甲氧基羰基-谷氨酸-氧叔丁基树脂，经二氯甲烷溶胀并减压抽掉二氯甲烷；用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3遍，加入20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液反应20分钟，除去9-芴基甲氧基羰基保护基，减压抽掉溶液，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤6遍；
步骤2，称取第二个氨基酸9-芴基甲氧基羰基-甘氨酸-氧叔丁基加入到树脂中，N,N-二甲基甲酰胺溶解并加入N,N-二异丙基乙胺反应30分钟，反应完全后减压抽掉溶剂；重复该步骤2，直至接到最后一个原料6-马来酰亚胺己酸，然后用N,N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，甲醇各洗三遍，抽干树脂；
步骤3，以体积比为82.5:5:5:2.5:5的三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、水混合液作为切肽试剂，将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，一定时间后，加入4℃预冷的乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤多次后，真空抽干，得到多肽粗品。
实验显示，EM17能够与血清蛋白偶联形成HSA-EM17载体，其上可包载小分子光敏剂Ce6，形成的HSA-EM17-Ce6在670nm处有明显的荧光，并可抑制巨噬细胞的吞噬，具有一定的药物载体价值。
优选的，本发明的第三方面，提供了一种血清白蛋白载体，其特征在于，包括血清白蛋白以及偶联在其上的SIRPα阻断剂多肽，所述SIRPα阻断剂多肽由权利要求1或4所示。
血清白蛋白选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、驴血清白蛋白中的任意一种；所述SIRPα阻断剂多肽优选为EE-10或EM-17，均可与血清蛋白偶联。
进一步，上述血清白蛋白载体还包括小分子药物及荧光染料中的一种或两种。小分子药物如紫杉醇、喜树碱、二氢卟吩e6等，用于靶点结合或光敏作用；荧光染料选自吲哚菁绿、二氢卟吩e6、新吲哚菁绿IR800等，用于细胞成像。
除血清蛋白载体外，本发明的SIRPα阻断剂多肽也可以和药学上常用的其他载体结合，如与聚乙二醇、脂质体和聚合物等结合，同样具备抗巨噬细胞清除的作用。
本发明的第四方面，提供了一种抗肿瘤药物组合物，包括上述血清白蛋白载体或与聚乙二醇、脂质体和聚合物载体的偶联体，与小分子药物偶联后得到。
与现有技术对比，本发明具有如下技术效果：
1)本发明从CD47和SIRPα的结合位点出发，通过多肽库筛选出可以特异性阻断CD47和SIRPα结合的多肽，其结合位点明确，不会影响SIRPα的其他生物活性。
2)与聚乙二醇、脂质体、聚合物和蛋白质包覆药物形成纳米颗粒相比，利用阻断多肽进行修饰可显著降低药物被巨噬细胞侵吞，增加药物稳定性、血清滞留时间，提高肿瘤富集的效率。
3)多肽可与常规药物载体聚乙二醇、脂质体、聚合物和蛋白质共价修饰，在原有载药体系中引入防清除基团，可与现有技术相结合，在药物载送方面具有广阔的应用前景。
术语解释：本发明所述的术语“功能保守性变体”是指在不改变肽总体结构和功能的情况下，插入、缺失和替换给定的氨基酸残基或共价修饰的化学衍生物。给定的氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸，也可以是指通过改变具有相似性质的氨基酸，包括疏水性氨基酸(异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和蛋氨酸)，亲水型氨基酸(精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、甘氨酸和丝氨酸)，碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)，酸性残基(天冬氨酸和谷氨酸)。化学衍生物是指一个或多个通过侧链官能团化学修饰的标记肽。
附图说明
图1为多肽EE-10的质谱和高效液相色谱图，其中，(a)为质谱分析图，(b)为高效液相色谱图。
图2为多肽EM-17的质谱和高效液相色谱图，其中，(a)为质谱分析图，(b)为高效液相色谱图。
图3为HSA-EM17偶联质谱图。
图4为HSA-EM17包载Ce6荧光图。
图5为HSA-EM17-Ce6抑制巨噬细胞吞噬图。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
实施例1多肽EE-10的合成
合成方向为序列的C端至N端。原料9-芴基甲氧基羰基-谷氨酸-氧叔丁基(1mmol)，Cl树脂(1mmol)为载体，加缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(3mmol)进行偶联，形成9-芴基甲氧基羰基谷氨酸树脂。用哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(1:5，体积比)脱除9-芴基甲氧基羰基保护，15分钟后，二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺洗涤后，分别加入C端第二个保护氨基酸9-芴基甲氧基羰基-甘氨酸-氧叔丁基(1mmol)、缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(3mmol)、N,N-二异丙基乙胺(1mmol)进行偶联30分钟。二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺洗涤后，用哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(1:5，体积比)脱除9-芴基甲氧基羰基保护。后续经过洗涤-偶联-再洗涤的步骤，直至最后一个氨基酸偶联结束，形成全保护多肽树脂。最后以切肽试剂三氟乙酸：苯甲硫醚：苯酚：乙二硫醇：水(82.5:5:5:2.5:5，体积比)将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，2小时后，加入4℃预冷的乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤3遍，真空抽干，得到多肽粗品。
质谱分析(图1a)显示，[M+H]+理论分子量为1162.20，实验分子量为1163.10。高效液相色谱分析(图1b)显示，保留时间11.819min，测试时间为24min，流速为1.0mLmin-1，流动相为6％乙腈和94％水,纯度为98.0％
实施例2多肽EM-17的合成
称取9-芴基甲氧基羰基-谷氨酸-氧叔丁基树脂(1mmol)，放到玻璃反应柱加二氯甲烷溶胀30分钟，减压抽掉二氯甲烷。用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3遍，加入20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液反应20分钟，除去9-芴基甲氧基羰基保护基，减压抽掉溶液，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤6遍。称取第二个氨基酸9-芴基甲氧基羰基-甘氨酸-氧叔丁基(1mmol)，加入到树脂中，N,N-二甲基甲酰胺溶解并加入N,N-二异丙基乙胺(3mmol)反应30分钟，取树脂做验色反应，观察溶液颜色和树脂颜色，溶液亮黄，树脂黄，说明反应完全。减压抽掉溶剂。重复2和3步骤，直至接到最后一个原料6-马来酰亚胺己酸，然后用N,N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，甲醇各洗三遍，抽干树脂。加入裂解液去除树脂和氨基酸侧链保护基，砂芯过滤，向滤液加入乙醚析出，离心，洗涤固体3次，抽干，纯化。
质谱分析(图2a)，[M-2H]2-理论分子量为847.8，实验分子量为847.8。高效液相色谱分析(图2b)，保留时间9.370min，测试时间为24min，流速为1.0mLmin-1，流动相为15％乙腈和85％水,纯度为96.0％
实施例3 HSA-EM17合成
称取人血清白蛋白(HSA)1mg，溶解于1mL去离子水中，充分震荡，超声5分钟，直至全部溶解。称取EM17溶解于200微升二甲基亚砜/水(体积比1:5)混合溶液中，逐滴加入到HSA蛋白溶液中，37.5℃恒温摇床震荡反应5小时。反应结束后，使用透析袋(分子量小于3500)过夜搅拌除去未反应掉的EM17和溶剂二甲基亚砜，总共换水3次。溶液冷冻干燥处理得到HSA-EM17的白色粉末。
质谱分析(图3)显示，HSA蛋白理论分子量为66.6kD，实验分子量为66.6kD，HSA-EM17理论分子量为68.4kD，实验分子量为68.3kD。
实施例4 HSA-EM17包载小分子光敏剂Ce6
称取HSA-EM171 mg溶解于1mL去离子水中得到1mg/mL的溶液，涡旋分散2分钟。称取1mg二氢卟吩e6(Ce6)溶解于1mL去离子水中得到1mg/mL的溶液。取25微升1mg/mL的HSA-EM17溶液加入到500微升的磷酸缓冲盐溶液中，浓度为50μg/mL，加入50μL Ce6，充分混合，超声10分钟，然后涡旋2小时。使用透析袋(分子量小于3500)除去过量的Ce6，得到HSA-EM17-Ce6溶液。冷冻干燥处理后得到灰色粉末。
通过荧光分光光度计测量HSA-EM17和HSA-EM17-Ce6的荧光，激发波长为420nm，670nm处为Ce6的特征发射峰，可以看到HSA-EM17-Ce6在670nm处有明显的荧光，而HSA-EM17没有(图4)，说明Ce6被成功负载到HSA-EM17上。
实施例5 HSA-EM17-Ce6抑制巨噬细胞
RAW细胞接板密度是28×104个/mL，96孔板每孔加入100μL细胞悬浮液，接板的细胞放置于5％CO2温度为37℃培养箱中过夜培养。将96孔板里的细胞培养基缓慢吸走，将100μLHSA-Ce6或HSA-EM17-Ce6加入到细胞中，37℃在培养箱中避光孵育30min，再次吸去孔板内的培养基，加入100μL/孔，浓度为5μg/mLHoechst 33342试剂进行染核，用PBS洗三遍，并每孔加入80μL的PBS。最后用高内涵成像仪器Operetta进行图像采集，激发通道为405nm，发射通道为600-650nm。
如图5所示，随着HSA-Ce6浓度增加，巨噬细胞的荧光逐渐增强。而HSA-EM17-Ce6则荧光较弱且不随浓度增加而改变，原因在于EM17的加入明显降低了巨噬细胞的摄取，说明HSA-EM17-Ce6确实可抑制巨噬细胞的吞噬，具有一定的药物载体的价值。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (10)
1.一种SIRPα阻断剂多肽，其特征在于，阻断CD47和SIRPα间免疫结合，为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，或包含该氨基酸序列的可溶肽或者其功能保守性变体。
2.根据权利要求1所述的SIRPα阻断剂多肽，其特征在于，该阻断剂多肽的结构通式如下式I所示：
其中，X选自C、O、N中的任意一种，
Y选自OH、间隔基、小分子药物、荧光染料、多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成盐，酯，酰胺或酰肼，
A选自H或C＝O，
B选自H、间隔基、小分子药物、荧光染料、多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成胺盐酸盐、对甲苯磺基、苄氧羰基、叔丁羰基、氯乙酰或甲酰基盐。
C选自H，间隔基、小分子药物、荧光染料，多肽、核酸和蛋白质中的一种或多种，被衍生成O-酰基或O-烷基衍生物。
3.根据权利要求1所述的SIRPα阻断剂多肽，其特征在于：
其中，所述间隔基选自碳个数为4-10的饱和烷基链、聚合度为2-6的聚乙二醇中的任意一种或多种；
小分子药物选自紫杉醇、喜树碱、二氢卟吩e6中的任意一种或多种；
荧光染料选自吲哚菁绿、二氢卟吩e6、新吲哚菁绿IR800中的任意一种或多种；
所述多肽为靶向多肽；
所述蛋白质为血清白蛋白，选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、驴血清白蛋白中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的SIRPα阻断剂多肽，其特征在于，该阻断剂多肽为多肽EM-17，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，结构式如下式II所示：
5.权利要求1所述的SIRPα阻断剂多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，以9-芴基甲氧基羰基-谷氨酸-氧叔丁基为原料，Cl树脂为载体，加缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐以摩尔比1:1:3进行偶联，形成9-芴基甲氧基羰基谷氨酸树脂；
步骤2，采用体积比为1:5的哌啶及N,N-二甲基甲酰胺脱除9-芴基甲氧基羰基保护，并采用二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺洗涤后，分别加入C端第二个保护氨基酸9-芴基甲氧基羰基-甘氨酸-氧叔丁基、缩合剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺以摩尔比1:3:1进行偶联；二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺洗涤后，用体积比为1:5的哌啶和N,N-二甲基甲酰胺脱除9-芴基甲氧基羰基保护；后续经过洗涤-偶联-再洗涤的步骤，直至最后一个氨基酸偶联结束，形成全保护多肽树脂；
步骤3，以体积比为82.5:5:5:2.5:5的三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、水混合液作为切肽试剂，将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，一定时间后，加入4℃预冷的乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤多次后，真空抽干，得到多肽粗品。
6.权利要求5所述的SIRPα阻断剂多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
其中，进行偶联时，偶联时间为30min；脱除9-芴基甲氧基羰基保护的反应时间为15min；切肽试剂将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂的反应时间为2h。
7.权利要求4所述的SIRPα阻断剂多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，称取9-芴基甲氧基羰基-谷氨酸-氧叔丁基树脂，经二氯甲烷溶胀并减压抽掉二氯甲烷；用N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3遍，加入20％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺溶液反应20分钟，除去9-芴基甲氧基羰基保护基，减压抽掉溶液，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤6遍；
步骤2，称取第二个氨基酸9-芴基甲氧基羰基-甘氨酸-氧叔丁基加入到树脂中，N,N-二甲基甲酰胺溶解并加入N,N-二异丙基乙胺反应30分钟，反应完全后减压抽掉溶剂；重复该步骤2，直至接到最后一个原料6-马来酰亚胺己酸，然后用N,N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，甲醇各洗三遍，抽干树脂；
步骤3，以体积比为82.5:5:5:2.5:5的三氟乙酸、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、水混合液作为切肽试剂，将多肽从载体树脂上裂解下来，并同时脱去所有保护剂，一定时间后，加入4℃预冷的乙醚使多肽沉淀，离心收集沉淀物，并用乙醚洗涤多次后，真空抽干，得到多肽粗品。
8.一种药物载体，其特征在于，包括载体以及偶联在其上的SIRPα阻断剂多肽，所述SIRPα阻断剂多肽由权利要求1或4所示，所述载体选自血清白蛋白、聚乙二醇、脂质体及聚合物中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的药物载体，其特征在于，还包括小分子药物及荧光染料中的一种或两种。
10.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括权利要求8或9所述的药物载体。
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