CN118001420A - 氧化锰白蛋白纳米重组颗粒、其构建及在肝癌诊疗中的应用 - Google Patents
氧化锰白蛋白纳米重组颗粒、其构建及在肝癌诊疗中的应用 Download PDFInfo
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种氧化锰白蛋白纳米重组颗粒、其构建及在肝癌诊疗中的应用。该氧化锰白蛋白纳米重组颗粒属于抗肿瘤重组纳米颗粒，包括二维材料基底以及负载在其上的功能化血清白蛋白，该功能化血清白蛋白共价偶联有防清除的多肽分子，非共价连接靶向多肽，疏水空腔内负载有小分子药物。具体到肝癌，上述抗肿瘤重组纳米颗粒优选为氧化锰白蛋白纳米重组颗粒，包括可降解的氧化锰基底和功能化的人血清白蛋白。功能化的人血清白蛋白通过共价偶联防清除的多肽分子SP1，后利用其疏水空腔进一步负载靶向GPC‑3的多肽LH1和光敏治疗剂二氢卟吩e6和吲哚菁绿；然后将功能化的人血清白蛋白自组装于氧化锰基底表面，形成纳米颗粒。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，涉及抗肿瘤重组纳米颗粒及构建方法，具体涉及一种氧化锰白蛋白纳米重组颗粒、其构建方法及在肝癌诊疗中的应用。
背景技术
肝癌(HCC)是当今世界上六大癌症之一，也是导致人类死亡的第二大原因。众多癌症中，肝癌的生存率相对于其他癌症来说是较低的，它的5年相对生存率仅为10.1％，尽管通过手术切除等方式能够延长肝癌患者的存活时间，但是仅限于早期治疗效果较好的肝癌患者，而对于晚期肝癌患者来说手术治疗结果并不理想。
目前治疗肝癌普遍通过手术物理切割或化学疗法，然而手术物理切割及化学疗法存在不能完全根除和靶向治疗差等缺陷，从而导致了肝癌患者的存活率低。目前研究中主要通过肝癌标志物进行肝癌早期的检测，研究表明GPC3蛋白在肝癌细胞中高度表达，GPC3蛋白作为肝癌标志物具有灵敏度高以及特异性好的优势。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC-3)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员之一，由蛋白质、糖和脂质共价连接形成复合物，主要通过糖磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidyl inositol,GPI)锚定在细胞膜外表面。Glypican-3(GPC-3)蛋白是一种肝癌细胞的特异性靶点，它的分子量为70kDa左右，核心蛋白含有580个氨基酸，在细胞内参与多种与HCC相关的途径，例如Wnt信号转导通路、Yap信号转导通路、以及纤维细胞生长因子(FGF蛋白)。通过和上述这些信号传导途径的相互作用，GPC3可以调节HCC的扩展，肝癌转移以及相关血管的生长。
目前GPC-3在肝癌中的诊断存在一定研究，如专利号为CN111593024A的中国发明专利采用GPC3抗体结合免疫磁珠捕获GPC3阳性的CTC，提高肝癌分选效率；专利号为CN114813266A的中国发明专利提供了一种血液样本中GPC-3复合物的富集及检测方法，通过红细胞裂解、细胞沉淀重悬、细胞裂解提取GPC-3复合物等步骤实现GPC-3富集，富集后能够通过临床常用的化学发光检测模式或酶联免检测模式实现GPC-3含量的有效检测，进而实现通过血液检测完成肝癌诊断。但这些研究仅基于肝癌的诊断或治疗等单一功能进行，肝癌诊疗一体化的研究较少。
发明内容
本发明以肝癌诊疗一体化为目的，以二维氧化锰(MnO2)构建作为基底，通过对人血清白蛋白进行修饰，负载具有光热和光动力的光敏剂和功能多肽，形成复合纳米体系。复合纳米体系中的功能型多肽能够结合肿瘤标志物GPC-3和SIRPα抑制巨噬细胞的吞噬，复合纳米体系在光驱动条件下分别能够释放热和自由基性能，实现对肝癌细胞的荧光标记和光驱动治疗效果。
本发明所涉及的光诊疗纳米材料具有良好的光学性能、生物降解性能及特异靶向性，结合光动力治疗(PDT)协同光热治疗(PTT)构成双模式疗法，实现肝癌细胞的诊疗一体化，在肝癌细胞的治疗研究领域具有巨大的应用潜力。同时本发明的复合纳米体系的结构形式及构建方法也适用于其他肿瘤的诊疗一体化，只需根据具体肿瘤选择相应的功能多肽即可。
本发明的第一目的在于提供抗肿瘤重组纳米颗粒及构建方法，重点提供用于肝癌诊疗一体化的氧化锰白蛋白纳米重组颗粒及构建方法；第二目的在于提供上述纳米重组颗粒在肿瘤诊疗一体化中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的具体技术方案如下：
本发明的第一方面提供了一种抗肿瘤重组纳米颗粒，包括二维材料基底以及负载在其上的功能化血清白蛋白，该功能化血清白蛋白共价偶联有防清除的多肽分子，非共价连接靶向多肽，疏水空腔内负载有小分子药物。
优选的，二维材料选自氧化锰、二硫化钼(MoS2)、硫化镉(CdS)、二硫化铬(CrS2)、CoS2(二硫化钴)、NiS(硫化镍)、PtS2(二硫化铂)、石墨烯，氧化石墨烯，氧化还原石墨烯中的任意一种；血清白蛋白选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、驴血清白蛋白中的任意一种；小分子药物选自紫杉醇、喜树碱、吲哚菁绿、二氢卟吩e6、新吲哚菁绿IR800中的任意一种或多种组合。根据不同肿瘤类型及治疗目的，选择相应的二维基底材料、靶向多肽及小分子药物。
该抗肿瘤重组纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：利用化学共价偶联的手段，将防清除多肽分子与血清白蛋白进行共价连接；再将靶向多肽与小分子药物分别与结合位点和疏水空腔选择性结合，进行超分子组装，得到功能化血清白蛋白；进一步将该功能化血清白蛋白装载到二维材料基底上。
具体到肝癌，上述抗肿瘤重组纳米颗粒优选为氧化锰白蛋白纳米重组颗粒。因此，本发明的第二方面，提供了一种针对肝癌的氧化锰白蛋白纳米重组颗粒，包括可降解的氧化锰基底和功能化的人血清白蛋白。所述功能化的人血清白蛋白通过共价偶联防清除的多肽分子SP1，后利用其疏水空腔进一步负载靶向GPC-3的多肽LH1，和光敏治疗剂二氢卟吩e6和吲哚菁绿；然后将功能化的人血清白蛋白自组装于氧化锰基底表面，形成纳米颗粒。
其中，SP1多肽序列如下：EVTELTREGE(SEQ ID NO.1)；LH1多肽序列如下：RLNVGGTYFLTTRQ(SEQ ID NO.2)。
该氧化锰白蛋白纳米重组颗粒制备流程参考图1，具体步骤如下：
(1)利用化学共价偶联的手段，将防清除多肽分子SP1与人血清白蛋白进行共价连接；将多肽LH1通过非共价作用负载在HSASiteⅠ位点上；将光敏治疗剂二氢卟吩e6和荧光染料吲哚菁绿加入至人血清白蛋白-SP1-LH1组合物的磷酸盐溶液中，充分震荡搅拌后，透析去除过量的二氢卟吩e6和吲哚菁绿；
(2)透析结束后，加入二氧化锰溶液，超声震荡后，得到复合材料氧化锰白蛋白纳米重组颗粒。
优选的，步骤(1)中，多肽分子SP1共价偶联前采用马来酰亚胺修饰；血清白蛋白-SP1-LH1组合物、二氢卟吩e6、吲哚菁绿间的质量比为1:5:5；
将光敏治疗剂二氢卟吩e6和荧光染料吲哚菁绿加入至人血清白蛋白-SP1-LH1组合物的磷酸盐溶液中，37℃充分震荡搅拌5h后，使用分子量小于3500的透析袋透析24h，中途换水3次，去除过量的二氢卟吩e6和吲哚菁绿。
步骤(2)中，二氧化锰溶液的浓度为1mg/mL，超声震荡2h后，得到复合材料氧化锰白蛋白纳米重组颗粒。
本发明的第三方面，提供了氧化锰白蛋白纳米重组颗粒在制备肝癌诊断或治疗试剂中的应用。利用SP1对于巨噬细胞表面SIRPa的识别，增加材料稳定性和血清滞留时间。基于LH1对GPC-3的特异性识别，实现了肝癌细胞和移植瘤模型小鼠的近红外成像和光驱动治疗。
优选的，肝癌诊断试剂为肝癌近红外成像试剂；肝癌治疗试剂为光驱动治疗剂。
本发明的第四方面，提供了一种肝癌诊断或治疗试剂，包括活性组分以及药学上可接受的载体。其中，该活性组分包括上述所述氧化锰白蛋白纳米重组颗粒，优选以氧化锰白蛋白纳米重组颗粒为唯一活性组分。
与现有技术对比，本发明具有如下技术效果：
本发明将纳米材料作为一种平台化技术，可功能化多种药物，显著提高药物的生物相容度和稳定性。通过抑制巨噬细胞的吞噬，增加血清滞留时间，延长半衰期，提高肿瘤的富集效率。
具体的，利用多肽对肝癌的靶向性，以及药物的光敏性能，可实现肝癌细胞和小鼠的精准成像和光敏治疗。如，利用SP1对于巨噬细胞表面SIRPa的识别，增加材料稳定性和血清滞留时间；基于LH1对GPC-3的特异性识别，实现了肝癌细胞和移植瘤模型小鼠的近红外成像和光驱动治疗。
附图说明
图1为氧化锰白蛋白纳米重组颗粒制备流程示意图。
图2为纳米颗粒制备前后的粒径和电位变化。
图3为纳米重组颗粒体外释放自由基的能力评价。
图4为纳米重组颗粒体外释放光热的能力评价。
图5为纳米重组颗粒用于不同GPC-3表达程度的细胞的成像。
图6为纳米重组颗粒用于不同GPC-3表达程度的细胞的光敏治疗。
图7为纳米重组颗粒用于肝癌移植瘤模型小鼠的肿瘤成像。
图8为纳米重组颗粒用于肝癌移植瘤模型小鼠的肿瘤光敏治疗效果评价。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按体积计算。
实施例1氧化锰白蛋白纳米重组颗粒制备
选用人血清白蛋白HSA作为示例，参见图1，将马来酰亚胺修饰的多肽SP1共价偶联在HSA上，将多肽LH1通过非共价作用负载在HSA上。取1mg HSA-SP1-LH1荧光染料溶解于1mL磷酸盐缓冲液中，称取5mg吲哚菁绿(ICG)，5mg二氢卟吩e6(Ce6)加入其中，37℃充分震荡搅拌5h。
组装结束后，使用透析袋(分子量小于3500)透析24小时，中途换水3次，去除过量的ICG和Ce6。透析结束后，加入200μL 1mg/mL二氧化锰(MnO2)片层溶液，超声震荡2小时，得到纳米重组复合材料Composites。
通过对复合前后的粒径进行分析，如图2所示，Composites与单独的HSA和MnO2相比，粒径明显增加，说明HSA被成功组装到MnO2表面。
实施例2体外自由基释放测试
二氢罗丹明123(DHR123)被广泛的应用在检测细胞内各种材料释放氧自由基的含量，DHR123本身是一种不带荧光的物质，但遇到氧自由基时，它自身很容易被氧化，形成罗丹明123，而罗丹明123具有荧光，被激发后能在530nm处检测到荧光，且荧光强度与罗丹明123的浓度成正比，因此可以使用DHR123对体系产生的氧自由基进行检测。
设置三组实验进行测试对照：空白对照组为单独的PBS缓冲液，两组实验组分别为Ce6组以及Composites组。在比色皿中加入500微升测试溶液，加入20微升DHR123溶液，在黑暗中孵育30分钟后，在荧光光谱仪下进行测试，激发波长为488nm，此处为初始荧光。之后使用660nm的光源照射，每次光照五分钟，然后进行测试荧光测试，测试时间为30分钟。
如图3所示，Ce6、Composites与PBS相比，荧光明显上升，说明氧自由基的产生。Composites与Ce6相比，自由基释放能力稍有下降，但下降不明显，说明Composites含有Ce6。
实施例3体外光热释放测试
为了验证Composites复合体系是否具有光热性能。取Composites加入到1.5mL子弹头中，使用808nm的激光灯照射，功率为2W/cm-2，在热红外成像仪上进行观察，拍照并记录数据，得到如图4结果。随着光照时间的增加，体系的温度逐渐上升，从开始的27℃上升至57℃，结果说明Composites具有一定的光热治疗的潜力。
实施例4 Composites复合体系的荧光成像实验
在96孔板中分别种植7701细胞、Hep-G2细胞和GPC-3蛋白敲低的Hep-G2细胞(Sh-Hep-G2)，种植数量均为2万个每孔，放入37℃培养箱中培养过夜使细胞贴壁，然后分别将Ce6、HSA-Ce6和composites使用溶剂DMEM高糖培养基(10％FBS)进行稀释，加入到细胞中，在37℃培养箱中孵育30分钟后，使用生理盐水清洗3次后，加入Hoechst 33342(染色浓度为1μg/mL)对细胞核进行染色，固定液为4％浓度的多聚甲醛100μL，再次放入37℃培养箱中孵育10分钟(中间过程严格避光)，放入荧光显微镜下进行观察，并将荧光强度归一化处理，得到图5结果。Composites组的荧光明显高于Ce6和HSA-Ce6，说明Composites通过内吞作用进入细胞，而且Hep-G2细胞明显高于受体低表达的7701和Sh-Hep-G2细胞，进一步说明Composites具有良好的细胞选择性。
实施例5细胞光热光动力治疗
为了验证Composites复合体系既具有光动力治疗效果，还有光热治疗效果，设计如下实验。在96孔板上种植Hep-G2细胞以及Sh-Hep-G2细胞细胞2万个每孔(100μL),放入37℃培养箱中培养过夜使细胞贴壁，使用DMEM高糖培养基(10％FBS)稀释Composites复合体系，并用PBS做对照，使用808nm的光照射30min(功率为1W/cm2)，使用660nm的光照射30min(功率为1W/cm2)；放入37℃培养箱培养24小时后，使用CCK8试剂盒测得细胞存活数，得到图6结果。Sh-Hep-G2与Hep-G2相比，细胞存活率明显下降，说明Composites被吞入细胞后产生更加明显的细胞毒性，具有一定应用前景。
实施例6动物活体成像实验
使用正常的Huh-7细胞(NC-Huh-7)和过转GPC-3的Huh-7(Over-Huh-7)这两种细胞构建荷瘤小鼠，方法如下：选择北京维通利华实验动物技术有限公司的4-5周的免疫缺陷雌性小鼠，类型为NU/NU，将准备好接瘤的细胞于一小时内接入小鼠体内，注射前用酒精棉球擦拭接瘤部位，一般为小鼠前肢或后肢的大腿内侧，该部位血管丰富利于肿瘤的生长。然后用注射器按照100μL/只的量注入小鼠皮下，观察小鼠状态良好，一般大约两到三周就可以明显看到肿瘤的形成。每周都要使用天平和游标卡尺统计小鼠的体重和肿瘤大小，等到肿瘤大小得到0.5cm3，就可以进行下一步实验。
利用尾静脉注射的方式将composites注射至小鼠体内，设置观察时间为3h、6h、9h、18h、27h，结果如图7所示：尾静脉注射探针3h后，在两组小鼠的肠道位置上均看到明亮的荧光。随着时间延长，在18h时，位于肠道部位的荧光信号已经被代谢掉，观察不到荧光信号，且在肿瘤部位能够看到明显荧光，随着时间延长，Over-Huh-7组小鼠肿瘤部位的荧光看到了比NC-Huh-7组小鼠肿瘤部位更强的荧光。以上结果说明，含有靶向GPC3多肽的超分子体系能够靶向肝癌肿瘤，且效果良好。
实施例7动物治疗模型实验
与小鼠荧光成像的注射方式一致，采用尾静脉注射探针的方法将composites注射入小鼠体内，选取探针到达肿瘤的时间点24h。依次使用808nm的光照射30min(功率为1W/cm2)，使用660nm的光照射30min(功率为1W/cm2)。继续观察小鼠14天，观察并记录小鼠体重和肿瘤大小的变化，结果如图8所示。光照条件下，小鼠的体重在14天内均未出现明显的变化。如图所示，composites处理后的小鼠经光照后，随着时间增长，肿瘤大小逐渐变小，而PBS组小鼠光照后肿瘤大小随着时间增加而不断增大，且变化趋势明显。以上结果均证明了composites具有良好的靶向光治疗肿瘤的性能。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (10)
1.一种抗肿瘤重组纳米颗粒，其特征在于，包括二维材料基底以及负载在其上的功能化血清白蛋白，该功能化血清白蛋白共价偶联有防清除的多肽分子，非共价连接靶向多肽，疏水空腔内负载有小分子药物。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤重组纳米颗粒，其特征在于：
其中，二维材料选自氧化锰、二硫化钼、硫化镉、二硫化铬、二硫化钴、硫化镍、二硫化铂、石墨烯、氧化石墨烯、氧化还原石墨烯中的任意一种；
血清白蛋白选自人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、驴血清白蛋白中的任意一种；
小分子药物选自紫杉醇、喜树碱、吲哚菁绿、二氢卟吩e6、新吲哚菁绿IR800中的任意一种或多种组合。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤重组纳米颗粒，其特征在于：
其中，所述肿瘤为肝癌；所述抗肿瘤重组纳米颗粒为氧化锰白蛋白纳米重组颗粒；
二维材料选自氧化锰；血清白蛋白选自人血清白蛋白；防清除的多肽分子为SP1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；靶向多肽为靶向GPC-3的多肽LH1，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；小分子药物选自吲哚菁绿和二氢卟吩e6。
4.权利要求1或2所述的抗肿瘤重组纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用化学共价偶联的手段，将防清除多肽分子与血清白蛋白进行共价连接；再将靶向多肽与小分子药物分别与结合位点和疏水空腔选择性结合，进行超分子组装，得到功能化血清白蛋白；进一步将该功能化血清白蛋白装载到二维材料基底上。
5.权利要求3所述的氧化锰白蛋白纳米重组颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用化学共价偶联的手段，将防清除多肽分子SP1与人血清白蛋白进行共价连接；将多肽LH1通过非共价作用负载在HSA SiteⅠ位点上，得到血清白蛋白-SP1-LH1组合物；将光敏治疗剂二氢卟吩e6和荧光染料吲哚菁绿加入至人血清白蛋白-SP1-LH1组合物的磷酸盐溶液中，充分震荡搅拌后，透析去除过量的二氢卟吩e6和吲哚菁绿；
(2)透析结束后，加入二氧化锰溶液，超声震荡后，得到复合材料氧化锰白蛋白纳米重组颗粒。
6.根据权利要求5所述的氧化锰白蛋白纳米重组颗粒的制备方法，其特征在于：
其中，步骤(1)中，多肽分子SP1共价偶联前采用马来酰亚胺修饰；
血清白蛋白-SP1-LH1组合物、二氢卟吩e6、吲哚菁绿间的质量比为1:5:5；
将光敏治疗剂二氢卟吩e6和荧光染料吲哚菁绿加入至人血清白蛋白-SP1-LH1组合物的磷酸盐溶液中，37℃充分震荡搅拌5h后，使用分子量小于3500的透析袋透析24h，中途换水3次，去除过量的二氢卟吩e6和吲哚菁绿；
步骤(2)中，二氧化锰溶液的浓度为1mg/mL，超声震荡2h后，得到复合材料氧化锰白蛋白纳米重组颗粒。
7.权利要求3所述的氧化锰白蛋白纳米重组颗粒在制备肝癌诊断或治疗试剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在：
其中，所述肝癌诊断试剂为肝癌近红外成像试剂；
所述肝癌治疗试剂为光驱动治疗剂。
9.一种肝癌诊断或治疗试剂，其特征在于，包括活性组分以及药学上可接受的载体，所述活性组分包括权利要求3所述的氧化锰白蛋白纳米重组颗粒。
10.根据权利要求9所述的肝癌诊断或治疗试剂，其特征在于，所述活性组分以氧化锰白蛋白纳米重组颗粒为唯一活性组分。
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