CN118001333A - 一种刺芋中有效成分的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物药学技术领域，尤其涉及一种刺芋中有效成分的提取方法及其应用。所述提取方法包括：将刺芋根部预处理至粉末状后进行石油醚脱脂、浸泡提取、减压蒸发浓缩和干燥；所述浸泡提取包括：将经过石油醚脱脂之后得到的脱脂刺芋粉末置于水中浸泡后在沸腾状态下提取2.5～3.5小时，收集第一提取液之后重新加入水，在沸腾状态下提取2.5～3.5小时，收集第二提取液并且与所述第一提取液合并后过筛灭菌。本发明提供了一种刺芋中有效成分的提取方法，通过脱脂、浸泡提取和浓缩的多步骤操作可以有效提取出刺芋中的刺芋多糖和黄酮等有效成分，得率较高，这在少精弱精症和生精功能障碍的治疗领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物药学技术领域，尤其涉及一种刺芋中有效成分的提取方法及其应用。
背景技术
在养殖业中，种畜是重要遗传资源，其肉质和繁殖能力等相关性状指标对于蛋肉奶的生产性能有着直接的影响，可以直接影响到养殖业的产出和效益。然而培育一个新的优良品种和筛选保存优良品种周期较长，成本较高，所以延长种畜使用年限是一种能够提高养殖企业的生产效率和经济效益的有效方式。
在养殖过程中，少精弱精症是一种严重影响雄性动物繁殖性能的症状，在养殖场中，主要导致这个疾病的因素除了年龄，疾病和相关激素之外，还包括品种和配种频率等。目前现有技术有采用合理的生产管理和相关营养物质添加剂的添加等方式来促进动物繁殖性能，例如在饲料中添加促进和改善种公畜禽繁殖性能的保健药。常见的治疗和促进动物繁殖性能的添加剂有抗生素、复方中草药配方和生殖激素等。但是目前，抗生素被禁止在饲料中添加，而且过度使用抗生素容易导致“耐药菌”的产生，影响生态环境健康。复方中草药配方是一个较好的方法，但其各种药材搭配成本较高且作用机制不明确。而生殖激素的长期使用会有一定的依赖性并且产生多种副作用，因此亟待研究新型促进种公畜禽健康繁殖替代品。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种刺芋中有效成分的提取方法及其应用。
刺芋是天南星科刺芋属的多年生有刺常绿草本植物，刺芋(学名：Lasia spinosa(L.)Thwait.)刺芋切碎晒干后的根茎可以入药，其味苦、辛、性寒。用水煎服后可以解毒、利尿、消炎、清热利湿、解毒消肿、健胃消食、还可用于治疗肺热咳嗽、胃胀厌食、小便黄赤、风湿痹痛、跌打肿痛、头疮、痄腮等症状。食用：刺芋的嫩茎叶洗净切碎，配以辣椒、大蒜等佐料素炒或配以适量腊肉、豆豉炒熟还可食用。《岭南采药录》、《中药大辞典》、《中华本草》有所记载，具有非常长的药用和食用历史，但是其化学成分、药理作用和分子机制等方面确少有研究。
目前虽有刺芋在家禽生产上的相关报道，但大都是取新鲜刺芋粉进行直接添加，没有对刺芋所含有效成分进行研究，实际使用效果也较差。而本发明通过特定的方法提取出刺芋中所含的多种和抗氧化以及提高动物繁殖性能的有效成分，可以更加明确、有效地应用于动物养殖领域。
第一方面，本发明提供一种刺芋中有效成分的提取方法，包括：
将刺芋根部预处理至粉末状后进行石油醚脱脂、浸泡提取、减压蒸发浓缩和干燥；
所述浸泡提取包括：
将经过石油醚脱脂之后得到的脱脂刺芋粉末置于水中浸泡后在沸腾状态下提取2.5～3.5小时，收集第一提取液之后重新加入水，在沸腾状态下提取2.5～3.5小时，收集第二提取液并且与所述第一提取液合并后过筛灭菌。
本发明提供的提取方法可以有效去除刺芋中色素、纤维和木质素等无效成分，去除生物碱等有害物质，提取出刺芋中的活性成分，例如刺芋多糖、黄酮等具有抗氧化活性的成分，以及其他多种具备促进动物繁殖能力的活性成分。通过本发明提供的提取方法提取得到的刺芋提取物具备抗氧化和促进公畜禽繁殖性能的作用，例如提高采精量、精子密度、活力等，同时也能够提高睾丸曲细精管和睾丸大小。
同时，本发明提供的提取方法提取得到的刺芋提取物可以溶于水，长期不会产生沉淀，应用范围较广。
进一步地，所述浸泡提取包括：
将经过石油醚脱脂之后得到的脱脂刺芋粉末以1：(8～12)的质量比置于水中，浸泡0.5～1小时后开始加热，加热至沸腾后保持沸腾状态提取2.5～3.5小时，收集第一提取液；
重新以1：(7～11)的质量比加入水，加热至沸腾后保持沸腾状态提取2.5～3.5小时，收集第二提取液；
合并所述第一提取液和所述第二提取液，降温至60～70℃之后在0.3～0.6μm的孔径条件下过滤得到刺芋提取液。
进一步地，所述预处理包括：
将所述刺芋根部干燥之后进行10～20目粉碎处理，之后在水中超声震动清洗5～15分钟；所述超声的条件为频率40～60kHz，功率350～450W。
进一步地，所述石油醚脱脂包括：
采用4～8倍质量比的石油醚进行回流脱脂1.5～2小时。
进一步地，所述减压蒸发浓缩的条件为：
水浴温度36～40℃，上盖温度50～60℃，转速250～350r/min，真空度0.06～0.1Mpa，冷却温度-8～-12℃。
进一步地，所述干燥为喷雾干燥，条件包括：
原料初始温度为60～70℃，进风温度为110～130℃，泵速25～35Hz，雾化压力为0.03～0.07Mpa，进料速度为7～10ml/min。
进一步地，所述过筛灭菌包括：
过100～140目筛后在搅拌状态下灭菌。
进一步地，所述刺芋根部为生长不少于2年的刺芋根部。
第二方面，本发明提供一种刺芋提取物，所述刺芋提取物为通过所述的提取方法提取得到。
第三方面，本发明提供任一项所述的提取方法在制备用于促进动物的繁殖性能的饲料添加剂或药物中的应用。
第三方面，本发明提供一种用于少精弱精症和生精功能障碍的药物，包括所述的刺芋提取物。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种特定的提取刺芋中有效成分的方法，并对提取得到的有效成分进行了分析。本发明提供的方法提取得到的刺芋提取物中含有多种有益活性物质，例如刺芋多糖、黄酮等具有抗氧化能力的活性物质。本发明提供的提取方法得率在20～30％，得到的提取物中有效成分含量更高，可以更有效促进动物的繁殖性能，可以具体用于动物的繁殖性能低下的治疗和预防，包括由疾病年龄疾病引起的精液量少、少精症、弱精症和生精功能障碍等，这在动物养殖领域具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的正离子模式总离子色谱图。
图2是本发明实施例1提供的负离子模式总离子色谱图。
图3是本发明实施例2提供的不同刺芋粉用量的采精量示意图。
图4是本发明实施例2提供的不同刺芋粉用量的采精量统计图。
图5是本发明实施例3提供的刺芋粉对精子密度的影响示意图。
图6是本发明实施例3提供的刺芋粉对精子活力的影响示意图。
图7是本发明实施例3提供的刺芋粉对睾丸大小的影响示意图。
图8是本发明实施例3提供的刺芋对睾丸曲细精管直径和上皮细胞高度的影响示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种提取刺芋中有效成分的方法，具体包括如下流程：
1、选取自然界生长或人工栽培生长不少于两年新鲜刺芋根部，切断长3-5cm，厚0.5cm，自然黑暗干燥，干燥后的刺芋经过粉碎处理至10-20目，加入没过刺芋表面的自来水进行超声波振动振动清洗10分钟，超声处理的频率为40-60kHz，功率400W。
2、清洗干净后进行石油醚脱脂，采用4-8倍的石油醚进行回流脱脂1.5小时。
3、将石油醚脱脂后的刺芋粉末放入Y-TQ多功能提取罐中加入1:10的纯净水，浸泡0.5 -1小时，刺芋浸泡好后开始蒸汽加热，加热至提取罐内混合液体沸腾后开始计提取时间，提取3小时。在提取整个过程都要保证提取罐内液面有波浪式沸腾。提取3小时到后，关闭蒸汽加热，打开放液开关放出第一提取液入储液罐，进行第二遍提取。第二遍提取无需浸泡，加入原料的1:9的纯净水同样方式提取3小时得到第二提取液。两遍提取后，去掉滤渣，混合第一提取液和第二提取液。使液体降温65±5℃，采用过滤网(0.45μm孔径)进行过滤得到刺芋提取液，防止异物，灰尘影响下一步浓缩。
4、减压蒸发浓缩，将刺芋提取液放入浓缩装置HPE-6B真空平行浓缩仪，进行浓缩，水浴温度为38℃,上盖温度为55℃，转速为300r/min，真空度为0.08MPa，冷却温度为-10℃。
5、喷雾干燥，采用B-290小型喷雾干燥机，喷雾干燥仪器设备条件:原料初始温度为65±5℃，进风温度为120℃,泵速30Hz，雾化压力0.05Mpa，进料速度为7.5mL/min。
6、粉碎过筛，将经过喷雾干燥后的刺芋提取物粉末进行粉碎过筛高温灭菌的处理，规粉碎过筛的目数120目，振动筛过滤杂质。全部粉碎过筛后还需要投入搅拌机搅拌60min，搅拌同时进行辐照灭菌得到所述刺芋提取物。
本发明通过如上的提取方法得到刺芋提取物，得率在20-30％之间(得率计算方式为产物质量/原料质量)。
实施例2
本发明进一步对实施例1所示方法提取得到的刺芋提取物进行成分检测，包括如下流程：
1、实验材料
实施例1所示方法得到的刺芋提取物。
2、检测方法
2.1色谱检测
色谱检测条件如下：
采用Thermo Vanquish(Thermo Fisher Scientific,USA)超高效液相系统，使用ACQUITY HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)(Waters,Milford,MA,USA)色谱柱，0.3mL/min的流速，40℃的柱温，进样量2μL。
正离子模式，流动相为0.1％甲酸乙腈(B2)和0.1％甲酸水(A2)，梯度洗脱程序为：0～1min，8％ B2；1～8min，8％～98％ B2；8～10min，98％ B2；10～10.1min，98％～8％B2；10.1～12min，8％ B2。
负离子模式，流动相为乙腈(B3)和5mM甲酸铵水(A3)，梯度洗脱程序为：0～1min，8％ B3；1～8min，8％～98％ B3；8～10min，98％ B3；10～10.1min，98％～8％ B3；10.1～12min，8％ B3。
2.2质谱检测
质谱检测条件如下：
Thermo Q Exactive质谱检测器(Thermo Fisher Scientific,USA)，电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式分别采集数据。正离子喷雾电压为3.50kV，负离子喷雾电压为-2.50kV，鞘气40arb，辅助气10arb。毛细管温度325℃，以分辨率70000进行一级全扫描，一级离子扫描范围m/z 100～1000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞能量为30eV，二级分辨率为17500，采集信号前10离子进行碎裂，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息。
3、检测结果
通过色谱检测和质谱检测，得到如图1和图2所示的结果。结果显示刺芋含有如下活性成分：没食子酸(Gallic acid保留时间1.9min)、L-谷氨酰胺(L-Glutamine保留时间5.9min)、蒲公英甾醇(Taraxasterol保留时间8.5min)、N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid保留时间1.8min)、吡哆醇(Pyridoxine保留时间0.92min)、左旋多巴(L-Dopa保留时间3.9min)、维生素K1(Vitamin K1保留时间8.7min)、吲哚(Indole保留时间2.5min)、葡萄糖(D-Glucose保留时间1.2min)、雅姆皂甙元(Yamogenin保留时间9.5min)、吲哚洛尔(Pindolol保留时间6.7min)、积雪草酸(Asiatic acid保留时间7.7min)、异绿原酸B(Isochlorogenic acid b保留时间5min)等。
具体的定量结果显示，刺芋中按质量百分含量计，多糖9.84％，多酚2.05％，黄酮0.03％，总皂苷0.03％。此外睾酮8.32μg/kg，豆甾醇19.47mg/100g等。其中多糖、多酚、黄酮、睾酮豆甾醇文献报道能够促进动物繁殖，促进生精功能影响精子活力等雄性性状。多酚、黄酮甾醇具有良好的抗氧化也是直接证明促进繁殖性能的证据。
实施例3
本实施例进一步验证实施例1中刺芋粉进行抗氧化能力检测，具体包括如下流程：
1、实验材料
以广西麻鸡为实验对象，可以市售购得。
(1)血清采样
1日龄肉鸡在试验第42天，空腹10小时后随机选取每组10只翅静脉采血，使用5mL真空采血管采血3mL放置1小时3000r/min离心分离10min，上清液进行检测。
(2)肝脏和胸肌样本采集：屠宰后立即解剖取相同位置的肝脏与胸肌先放入干冰中临时保存，然后返回实验室，在-80℃下保存以备后用。
2、实验流程
本发明选择未性成熟前肉鸡，共400只，随机分成4个处理组，分别为0％、1％、2％、4％组，每组100只，0％为对照组-LST0，饲喂公鸡饲料；2％-LST2、4％-LST4为试验组，分别饲喂在公鸡饲料中添加质量比为1％、2％、4％刺芋粉(实施例1得到)，饲喂周期42天之后每组随机选择10只肉鸡进行取材，验证血清、肝脏和鸡胸肉的活性氧(ROS)丙二醛(MDA)超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，检测方法如下：
根据制造商试剂盒的说明(上海酶联免疫吸附测定技术有限公司)检测血清和组织样品中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的浓度，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒和酶标仪测定。
3、检测结果
结果如下表所示：
表1血清中抗氧化性能相关成分的活性检测
| 项目 | 对照组 | 1％试验组 | 2％试验组 | 4％试验组 | P-value |
| ROS，IU/mL | 468.28±67.05a | 449.93±67a | 347.53±68.24b | 363.49±68.51b | 0.0111 |
| MDA，nmol/mL | 8.13±1.01a | 7.52±0.96ab | 6.42±0.84b | 6.95±0.89b | 0.0271 |
| SOD，ng/mL | 3.52±1.15b | 4.52±0.88a | 4.60±0.62a | 5.35±0.51a | 0.0097 |
| CAT，pg/mL | 354.02±33.17c | 448.06±56.85b | 511.58±42.17a | 495.54±29.72ab | ＜0.0001 |
| GSH-Px，ng/mL | 149.52±16.6b | 167.36±14.77ab | 183.40±17.76a | 185.50±14.17a | 0.0027 |
注：同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。ROS:活性氧；MDA:丙二醛；SOD:超氧化物歧化酶；CAT:过氧化氢酶；GSH-Px:谷胱甘肽过氧化物酶，下同。
表2肝脏中抗氧化性能相关成分的活性检测
| 项目 | 对照组 | 1％试验组 | 2％试验组 | 4％试验组 | P-value |
| ROS，IU/mL | 787.18±83.23a | 618.71±193.1b | 601.94±90.41b | 440.50±56.36c | 0.0007 |
| MDA，nmol/mL | 14.47±1.47a | 11.71±1.47b | 10.96±2.35bc | 9.17±0.92c | 0.0002 |
| SOD，ng/mL | 14.71±2.34 | 14.37±4.49 | 13.46±2.44 | 14.36±3.57 | 0.9245 |
| CAT，pg/mL | 844.19±241.2b | 1214.18±199.2a | 1275.68±123.2a | 1351.24±84.46a | 0.0003 |
| GSH-Px，ng/mL | 361.38±49.59 | 387.06±67.97 | 417.96±36.73 | 425.84±57.42 | 0.1801 |
表3鸡胸肉中抗氧化性能相关成分的活性检测
从结果中可以看出，在鸡饲料中添加本发明实施例1提供的刺芋粉可以显著提升血清、肝脏和鸡胸肉中的相关抗氧化成分的活性，降低ROS和MDA的活性。
实施例4
本实施例进一步验证实施例1中刺芋粉进行促进动物繁殖性能中的检测，包括如下流程：
1、实验材料
实验材料为广西麻鸡，可市售购得。
2、实验方法
本发明选择未性成熟前60天(未第一次采精)公鸡，共36只，随机分成3个处理组，分别为0％、2％、4％组，每组12只，0％为对照组-LST0，饲喂公鸡饲料；2％-LST2、4％-LST4为试验组，分别饲喂在公鸡饲料中添加质量百分比为2％、4％的刺芋粉(实施例1提供)，饲喂周期60天。
每组选择12只公鸡请补充数量，比较采精量、精子密度、精子活力、睾丸曲细精管直径等能够反映动物繁殖性能指标。
3、实验结果
3.1本发明用人工采精的方法进行公鸡的采精装与2ml的EP管中，用精密刻度尺测量计算采精量如图3和图4所示，结果可以看出本发明实施例1提供的刺芋粉具有较高的提高采精量。
3.2本发明采用HamiltonThorne全自动精子分析仪和imv TECHNOLOGIES的精子分析软件在实验结束检测，采集精液后，用37℃的生理盐水对其进行200倍稀释后，用10μL移液枪抽取3μL的稀释精液，注入温度为38℃的Leja精子检测专用涂片的腔室内检测采取8个视野，对精液的精子活力和密度进行检测，全自动精子分析仪参数设置：缓慢VAP(μm/s)：10、缓慢VSL：3、渐进STR：35、渐进VAP(μm/s)：15、静态VSL：0、静态VAP(μm/s)：1、静态宽度乘法器：0.5、静态算法：Width-Multiplier、能动需含尾巴：False、细胞最长游行距离(μm)：50，注：VAP表示平均运动速率。VSL表示直线运动速率。STR表示直线运动比例。得到如图5所示的结果，从图中可以看出本发明实施例1中提供的刺芋粉提可以显著提高精子密度。
3.3本发明采用全自动精子分析仪检测精子活力和自密度，得到如图6所示的结果，结果显示本发明实施例1中提供的刺芋粉可以显著提高精子活力。
3.4本发明采用电子称称量睾丸重量，采用刻度尺比较睾丸大小，得到如图7所示的结果，结果显示本发明实施例1中提供的刺芋粉可以促进睾丸大小，延缓睾丸萎缩。
3.5本发明进一步制作了睾丸石蜡切片和HE染色，具体步骤如下：
将睾丸置于Bouin’s固定液中固定72h、流水冲洗2h、组织脱水机脱水、透明、浸蜡后进行HE染色。
HE染色包括：
二甲苯①脱蜡10min→二甲苯②脱蜡10min→无水乙醇①，5min→无水乙醇②，2min→90％酒精，2min→80％酒精，2min→70％酒精，2min→蒸馏水，2min→苏木素染液染色5min→酸酒精中浸2s→快速用清水洗去酸酒精→流水冲洗10min→蒸馏水中浸2s→伊红染液染色30s→70％酒精，10s→80％酒精，10s→90％酒精，10s→无水乙醇，10s→二甲苯③透明5min→二甲苯④透明5min→中性树脂封片。
切片观察和睾丸曲细精管直径测量用EVOSTM M5000细胞成像系统(ThermoFisher Scientific，America)对睾丸曲细精管直径测量得到如图8所示的结果。结果显示本发明实施例1中提供的刺芋粉可以显著提高睾丸曲细精管直径、上皮细胞高度。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种刺芋中有效成分的提取方法，其特征在于，包括：
将刺芋根部预处理至粉末状后进行石油醚脱脂、浸泡提取、减压蒸发浓缩和干燥；
所述浸泡提取包括：
将经过石油醚脱脂之后得到的脱脂刺芋粉末置于水中浸泡后在沸腾状态下提取2.5～3.5小时，收集第一提取液之后重新加入水，在沸腾状态下提取2.5～3.5小时，收集第二提取液并且与所述第一提取液合并后过筛灭菌。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述浸泡提取包括：
将经过石油醚脱脂之后得到的脱脂刺芋粉末以1：(8～12)的质量比置于水中，浸泡0.5～1小时后开始加热，加热至沸腾后保持沸腾状态提取2.5～3.5小时，收集第一提取液；
重新以1：(7～11)的质量比加入水，加热至沸腾后保持沸腾状态提取2.5～3.5小时，收集第二提取液；
合并所述第一提取液和所述第二提取液，降温至60～70℃之后在0.3～0.6μm的孔径条件下过滤得到刺芋提取液。
3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述预处理包括：
将所述刺芋根部干燥之后进行10～20目粉碎处理，之后在水中超声震动清洗5～15分钟；所述超声的条件为频率40～60kHz，功率350～450W。
4.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述石油醚脱脂包括：
采用4～8倍质量比的石油醚进行回流脱脂1.5～2小时。
5.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述减压蒸发浓缩的条件为：
水浴温度36～40℃，上盖温度50～60℃，转速250～350r/min，真空度0.06～0.1Mpa，冷却温度-8～-12℃。
6.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述干燥为喷雾干燥，条件包括：
原料初始温度为60～70℃，进风温度为110～130℃，泵速25～35Hz，雾化压力为0.03～0.07Mpa，进料速度为7～10ml/min。
7.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，所述过筛灭菌包括：
过100～140目筛后在搅拌状态下灭菌。
8.根据权利要求1-7任一项所述的提取方法，其特征在于，所述刺芋根部为生长不少于2年的刺芋根部。
9.一种刺芋提取物，其特征在于，所述刺芋提取物为通过权利要求1-8任一项所述的提取方法提取得到。
10.权利要求1-8任一项所述的提取方法，或权利要求9所述的刺芋提取物在制备用于促进动物的繁殖性能的饲料添加剂或药物中的应用。
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