CN118001306A - 罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用 - Google Patents

罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用，涉及微生物制剂技术领域。罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用。肠道菌群紊乱是由缺硒导致的。治疗的机理包括：a、炎症因子表达水平降低；b、细胞自噬程度降低；c、内质网应激减轻；d、细胞凋亡水平降低；e、紧密连接恢复；f、平滑肌收缩改善。本发明采用上述的罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用，罗伊氏乳杆菌可改善硒缺乏引起的肠道组织炎症、自噬、内质网应激、细胞凋亡、紧密连接及平滑肌异常收缩，为细菌治疗肠道疾病提供一种新的思路。

Description

罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用
技术领域
本发明涉及微生物制剂技术领域，尤其是涉及罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用。
背景技术
人和动物的肠道中存在数以百亿计的活细菌，人们将这些细菌分为有益菌，有害菌和条件致病菌。在健康的宿主体内，各菌群之间维持着动态平衡，有益细菌占主导地位。它们产生必需的营养物质，如维生素和有机酸，这些营养物质被肠道吸收，并被肠道上皮细胞和肝脏等重要器官利用。有机酸还能抑制肠道内病原体的生长。其他肠道细菌产生对宿主有害的物质，如腐烂产物、毒素和致癌物质。当有害细菌在肠道中占主导地位时，必需营养物质的产生减少，有害物质的产生增加。肠道是包容这些细菌的场所，有害物质则会直接威胁肠道健康，对肠粘膜产生损害，引起肠上皮细胞发生炎症、凋亡、自噬、坏死。甚至通过消化系统进入血液引起其他系统疾病，如肥胖、心血管疾病、代谢性疾病、炎症性肠病和结直肠癌等，它也在调节胰岛素敏感性、脂肪储存和体重方面发挥关键作用。许多因素可以改变肠道菌群的平衡，使之有利于有害细菌的生长繁殖。这些因素包括蠕动障碍、胃或小肠手术、肝脏或肾脏疾病、恶性贫血、癌症、放射或抗生素治疗、免疫障碍、情绪紧张、不良饮食和衰老。采用乳酸菌、双歧杆菌等肠道乳酸菌株进行口服细菌治疗，可恢复正常肠道平衡，产生有益效果。在动物体中,肠道菌群具有可塑性,其组成随年龄、饮食、环境等因素的调节。通过调节肠道菌群的组成来预防和治疗疾病已成为新的研究热点,研究肠道菌群对维护人和动物的健康具有重要意义。
硒是一种微量营养元素，在人和动物的各种生理过程中发挥着重要作用。已有学者用75Se组织定位法预言哺乳动物体内存在20-30种硒蛋白。截至2023年3月为止，已经发现25种人类硒蛋白，24种鼠硒蛋白。硒的摄入与硒及硒蛋白在生物体内的含量密切相关。但是由于硒在世界各地的分布情况不同，导致一些地区的人和动物长期处于缺硒状态。世界卫生组织在2015年发布的数据表明，全球有40多个国家或地区分布于缺硒过低硒地区。缺硒会影响器官和组织中的硒蛋白水平，导致机体发生多种组织损伤,如炎症、凋亡、自噬，甚至可导致器官衰竭和死亡。有文献报道，日粮中硒含量低于0.05mg/kg时，动物就会出现明显的缺硒症状。急性型缺硒的仔畜通常会突然发病，由于心力衰竭而在短期内死亡。而慢性型缺硒则表现生长发育停滞，腹泻，营养不良。He,Yujiao等人的研究发现硒缺乏可降低抗氧化硒蛋白水平，诱导氧化应激，降低肠道抗菌肽水平，导致空肠炎症损伤和肠屏障破坏。Zheng,Yingying等人的研究证明硒缺乏引起猪小肠内质网应激，增加了猪小肠和IPEC-J2细胞的凋亡，从而引起猪小肠组织的损伤。这些研究均证实了缺硒与肠道损伤之间存在密切联系。
罗伊氏乳杆菌是(Lactobacillus_reuteri)一种乳酸菌，据报道，几乎所有脊椎动物和哺乳动物的肠道中都存在这种乳酸菌。罗伊氏乳杆菌对肠道黏膜具有较强的粘附能力，可改善肠道菌群分布，抵抗有害菌定植，避免肠道疾病。罗伊氏乳杆菌可以产生广谱的非蛋白抗菌物质“罗伊特蛋白”，广泛抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原体的生长。Lactobacillus_reuteri可以改善人体功能，增强免疫力，从而促进人体健康。Lactobacillus_reuteri主要具有乳酸菌的有益作用，并具有产生广谱抗菌物质的显著作用。健康畜禽肠道在生长发育过程中会形成一个相对稳定的动态平衡系统。Lactobacillus_reuteri及其代谢产物具有许多良好的生理功能，对维持动物健康和促进动物生长发育具有重要意义。本发明将罗伊氏乳杆菌给予缺硒小鼠，验证其是否能通过调节肠道菌群的种类组成来促进肠道损伤的修复或减轻肠道损伤，为细菌治疗肠道疾病提供一种新的思路。
发明内容
本发明的目的是提供罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用，罗伊氏乳杆菌可改善硒缺乏引起的肠道组织炎症、自噬、内质网应激、细胞凋亡、紧密连接及平滑肌异常收缩，为细菌治疗肠道疾病提供一种新的思路。
为实现上述目的，本发明提供了罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用。
进一步的，肠道菌群紊乱是由缺硒导致的。
进一步的，治疗的机理包括：
a、炎症因子表达水平降低；
b、细胞自噬程度降低；
c、内质网应激减轻；
d、细胞凋亡水平降低；
e、紧密连接恢复；
f、平滑肌收缩改善。
进一步的，应用于制备含有罗伊氏乳杆菌的药物。
进一步的，药物包括冻干粉。
本发明所述的罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用的优点和积极效果是：
1、本发明中补充罗伊氏乳杆菌后，可调节缺硒小鼠肠道菌群结构，肠道损伤得到改善。组织学分析结果显示，摄入罗伊氏乳杆菌后，LSeJ组肠道结构发生改变。虽然LSeJ组的肠绒毛较短甚至断裂，但与LSeN组相比，LSeJ组的肠隐窝数量更多，肌层更厚，肠绒毛排列更致密。
2、本发明中经罗伊氏乳杆菌处理后，硒缺乏小鼠炎症因子表达水平下降。细胞自噬程度降低，内质网应激减轻，细胞凋亡水平降低，紧密连接恢复，平滑肌收缩改善，为细菌治疗肠道疾病提供一种新的思路。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为本发明实施例中罗伊氏乳杆菌摄入后，样本物种相对丰度直方图；
图2为本发明实施例中物种相对丰度热类聚图；
图3为本发明实施例中小鼠肠道组织病理组织学分析，其中A为CG组，B为LSeJ组，C为LSeN组，a为A的局部放大图，b为b的局部放大图，c为C的局部放大图；
图4为本发明实施例中小肠组织炎症相关分子蛋白水平及比率分析；其中A为小肠组织炎症相关分子蛋白水平，B为p65/GAPDH比率分析；C为p-p65/GAPDH比率分析；D为IκBα/GAPDH比率分析；E为p-IκBα/GAPDH比率分析；
图5为本发明实施例中小肠组织炎症相关分子的含量，其中A为小肠组织IL-1β含量；B为小肠组织IL-6含量；C为小肠组织TNF-α含量；
图6为本发明实施例中TENUL分析结果，其中A为CG组；B为LSeJ组；C为LSeN组；
图7为本发明实施例中小肠组织凋亡相关分子蛋白水平及其比率分析，其中A为Caspase-3和RIP1蛋白水平，B为Caspase-3/GAPDH比率分析，C为RIP1/GAPDH比率分析；
图8为本发明实施例中小肠组织自噬相关分子蛋白水平及其比率分析，其中A为ATG5和p62蛋白水平，B为ATG5/GAPDH比率分析，C为p62/GAPDH比率分析；
图9为本发明实施例中小肠组织内质网应激相关分子蛋白水平及其比率分析，其中A为IRE1、elF2α、p-elF2α蛋白水平，B为IRE1/GAPDH比率分析，C为elF2α/GAPDH比率分析，D为p-elF2α/GAPDH比率分析；
图10为本发明实施例中小肠组织紧密连接蛋白水平及其比率分析，其中A为ZO-2和E-cadherin蛋白水平，B为ZO-2/GAPDH比率分析，C为E-cadherin/GAPDH比率分析；
图11为本发明实施例中小肠组织平滑肌收缩蛋白相关分子蛋白水平及其比率分析，其中A为MLCK和RhoA蛋白水平，B为MLCK/GAPDH比率分析，C为RhoA/GAPDH比率分析；
图12为本发明实施例中小鼠小肠组织的mRNA水平。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明中使用的罗伊氏乳杆菌为购买得到，其在美国菌种保藏中心的保藏编号为ATCC23272。
实施例1材料方法
1.1动物模型建立方法。
使用4周龄雌性C57BL/6小鼠(n＝60，18-20g体重)。将小鼠随机分成3组。低硒组(LSeN)：用Se缺乏谷物喂养的20只小鼠(0.01mg Se/kg)。低硒补菌组(LSeJ)：用Se缺乏谷物喂养的20只小鼠(0.01mg Se/kg)。正常硒组(CG)：用Se含量正常谷物喂养的20只小鼠(0.15mg Se/kg)。小鼠可以自由进食和饮水。在室温下喂养50天后，对各组进行如下处理。LSeN：灌服生理盐水(0.1ml/10g体重),每日一次，持续15天；LSeL：灌服用生理盐水重悬的Lactobacillus_reuteri溶液(0.1ml/10g体重，Lactobacillus_reuteri溶液浓度为4.0*107CFU/L)，每日一次，持续15天；CG：灌服生理盐水(0.1ml/10g体重)，每日一次，持续15天。
小鼠饲养于干净、通风的环境中，所使用的鼠笼、水瓶、垫料均高温灭菌并进行烘干处理。饲喂充足的、清洁的水和饲料。鼠粮是由中国南通特洛菲公司定制的缺硒鼠粮(0.01mg Se/kg)和硒正常鼠粮(0.15mg Se/kg)。各处理组的温度、相对湿度、风速、光照等环境参数均得到控制并保持一致。每日观察小鼠的生长状况。对小鼠进行安乐死处理，并迅速取样。样品一部分置于4％多聚甲醛溶液中固定，一部分保存在-80℃冰箱中。
1.2罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)的培养。
将储存在4℃冰箱内的冻干菌种(Lactobacillus_reuteri)取出放入已灭菌的超净台内，吸取0.5mL液体培养基加入冻干管内，充分溶解。吸取0.4mL罗伊氏乳杆菌菌悬液均匀打入两个已加入琼脂MRS培养基的平板中，用涂布棒涂开菌液，放入37℃培养箱中培养48小时后取出平板，用接种环挑取菌落转接至液体培养基中，置于37℃摇床中继续培养。
1.3病理组织学分析。
小鼠小肠组织在4％多聚甲醛中固定过夜，石蜡包埋。将包埋后小肠组织切成2μm厚度的切片，将小肠切片在ZGSJ(Masson A)中浸泡过夜，在Weigert’s铁苏木精(混合等量的Masson A和Masson B)工作液中染色1分钟，用1％酸性乙醇分化，在猩红品红溶液(Masson D)中染色6分钟，在磷钼磷钨酸溶液(Masson E)中分化1分钟，直接转移(不漂洗)到苯胺蓝溶液(Masson F)，染色2-30秒。随后,在蒸馏水简要冲洗2-5分钟。最后，通过无水乙醇脱水，二甲苯透明和中性密封胶。切片用Pannoramic 250载玻片扫描仪(3D HISTECH)进行显微照片扫描。用盲法分析显微照片。胶原体积分数(CVF)采用图像分析系统软件(HALO,Indica Labs,American)进行观察。CVF的评估采用以下公式：CVF＝胶原面积/总面积(总面积不包括血管周围胶原面积和管腔面积)。技术支持由Servicebio有限公司(武汉，中国)提供。
1.4晚期凋亡细胞凋亡程度的评价。
该方法的原理是染色体DNA双链或单链断裂产生粘性3'-OH末端。在脱氧核糖核酸末端转移酶(DTT)的催化下，带有荧光素分子的dUTP被标记到DNA的3'端。在荧光显微镜下观察染色后的凋亡细胞。石蜡切片脱蜡至水，破膜，Tunel反应液孵育，微波修复，一抗4℃孵育过夜，加入二抗，DAPI染色细胞核，抗荧光猝灭挂载，镜检拍照，观察结果。
1.5ELISA法检测炎症因子。
采用双夹心抗体法检测小鼠小肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。称量组织0.1g，用预冷的PBS冲洗。组织(组织：PBS＝1：9)用玻璃匀浆器彻底研磨。在5000rpm离心10min后取上清液。细胞培养上清液2000rpm离心20min，以去除杂质和细胞碎片。检测上清液。将抗小鼠抗体包被在ELISA板上。此时样本中的细胞因子与抗小鼠抗体结合。然后加入辣根过氧化物酶标记抗体，加入显色底物TMB。停止反应后加入溶液。在450nm波长段测量OD值。通过绘制标准曲线计算样品中细胞因子的浓度。
1.6聚合酶链式反应(qPCR)。
从冷冻小肠组织中提取总RNA.使用BioRT HiSensi cDNAFirst StrandSynthesis Kit对提取小鼠小肠组织的总RNA进行反转录。在37℃水浴下反应20min，后置于98℃水浴下反应5min，将合成的cDNA放入-80℃冰箱中保存。基于已知序列的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)分别通过逆转录设计合成靶向特异性引物，引物由上海生工生物有限公司设计合成。使用ABI PRISM7700处理系统进行实时定量PCR。对于需要测量的每个基因，选择确定表达基因的cDNA模板和样品cDNA用于PCR反应。有40个循环，分别是94℃30秒，94℃5秒和60℃30秒。每个实验重复三次，每个样品重复三次。GAPDH用作内源性内标对照，根据2-ΔΔCt公式进行数据处理。
1.7蛋白免疫印迹(Western Blotting)分析。
对小肠组织进行蛋白质印迹分析。从小肠组织样品中分离提取总蛋白质。根据靶蛋白的分子量选择10％浓度的SDS-PAGE凝胶进行电泳。电泳时间约为120min，并在电泳终止后转移到硝酸纤维素膜上。转膜时间15-60分钟。在脱脂乳溶液中封闭2-3小时后，使用TBST洗膜3次，每次10min。孵育一抗，并在4℃下过夜。将未结合的抗体洗去，洗膜3次，每次10min。将膜在二抗溶液中孵育1-2小时。孵育结束后使用TBST洗膜3次，每次10min。在化学发光检测系统检测蛋白质表达。GAPDH用作内部参考相对定量。
1.8小鼠肠道菌群测序分析。
1.8.1小鼠小肠内容物的DNA的提取及扩增。
取0.2g小肠内容物提取其中的总DNA，采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，之后使用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的总DNA的纯度和浓度，取适量的样本DNA于离心管中，使用无酶灭菌水稀释样本至1ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，根据选择的测序区域，使用带Barcode的特异引物，New England Biolabs公司的High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶进行PCR，确保扩增的效率和扩增的准确性。PCR产物使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；对检测合格的PCR产物进行磁珠纯化，采用酶标法对其进行定量检测，根据PCR产物的浓度进行混样，调整各组PCR产物的浓度一致。充分混匀后使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物。使用/>DNA PCR-Free SamplePreparation Kit建库试剂盒构建文库，构建好的文库经过Qubit和Q-PCR定量，测试合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。
1.8.2分析流程。
测序得到的原始数据(Raw Data)会存在一定比例的干扰数据(Dirty Data)，为了后续分析的结果更加准确可靠，需要对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据(CleanData)。然后基于得到的有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析。根据OTUs聚类得到的结果对每个OTU的代表序列进行物种注释，得到每个OTUs相对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。同时对OTUs进行物种丰度、Alpha多样性、Venn图和花瓣图等分析，以得到样本内物种丰富度和均匀度信息等。其次还可以对OTUs进行多序列比对并构建系统发育树，通过PCoA、PCA、NMDS等降维分析和样本聚类树分析，探究不同样本或组别间群落结构的差异。若想了解分组样本间的群落结构差异，还可以选用T-test、Simper、MetaStat、LEfSe、Anosim和MRPP等统计分析方法对分组样本的物种组成和群落结构进行差异显著性检验。同时，扩增子的注释结果还可以和相应的功能数据库相关联，可以选用Tax4Fun软件对提取的生态样本中的微生物群落进行功能预测分析。本实验委托Novogene Tianjin公司完成。
1.9试验数据的统计分析。
所有试验至少重复进行3次，使用GraphPad Prism Version 9.0软件(GraphPad软件，SanDiego，CA)进行数据统计学分析对试验数据进行分析作图。所有的数据分析均采用t检验(T text)或单因素方差分析(one-way ANOVA)，统计数据结果呈正态分布，所有数值均表示为“mean±SD”的形式，结果图中标记有“*”符号表示差异显著(P＜0.05)，“**”符号表示差异极显著(P＜0.01)，否则为差异不显著(P＞0.05)。
实施例2实验结果
2.1罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)促进硒缺乏小鼠肠道菌群恢复平衡。
2.1.1物种相对丰度展示。
根据物种注释的结果，选取每个样本及分组在种水平上物种最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形累加图。如图1所示，LSeN组Lactobacillus_johnsonii和Ileibacterium_valens的丰度明显较CG组下降，而Firmicutes_bacterium_M10-2和Lactobacillus_reuteri的丰度则明显升高。而摄入Lactobacillus_reuteri后，肠道菌群的组成明显发生了改变。LSeJ组中Lactobacillus_johnsonii、Ileibacterium_valens和Faecalibaculum_rodentium的丰度与CG组和LSeN组相比较显著增高，而Firmicutes_bacterium_M10-2的丰度则显著下降。
2.1.2物种丰度聚类热图。
根据测序的所有样本在种水平下的物种注释及物种丰度信息，选取物种丰度排名前35的物种，根据其在每个样本中的丰度信息进行聚类，绘制成热图。结果见图2。图中CG组、LSeN组和LSeJ组颜色差别很大，说明两组丰度排名较高的物种存在较大差异，颜色偏暖色的物种为该样本中丰度排名较高的物种。
2.2罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)改善硒缺乏小鼠小肠组织的炎症损伤。
本试验应用HE染色方法对试验小鼠进行了病理组织学分析，如图3所示。与CG组相比，LSeN组绒毛变短，肠绒毛断裂，肠绒毛排列疏松，肠绒毛杯状细胞减少，肠隐窝减少，肌层变薄。LSeJ组虽然肠绒毛变短甚至断裂，但与LSeN组相比，肠隐窝数量变多，肌层变厚。
检测了小肠组织有关炎症的基因水平。与CG组相比较，LSeN组小肠NF-κB、IκBα、p38、IL-1β和TNF-α的mRNA水平明显升高，IL-10的mRNA水平明显下降。与CG组相比较，LSeJ组小肠NF-κB、IκBα、p38、IL-1β和TNF-α的mRNA水平明显升高，IL-10的mRNA水平明显下降，但NF-κB、IκBα、p38、IL-1β和TNF-α的mRNA水平明显低于LSeN组，IL-10的mRNA水平明显高于LSeN组。图4中A展示了IκBα、p-IκBα、p65和p-p65的蛋白水平。与CG组相比，LSeN组的蛋白磷酸化水平明显增加，LSeJ组的蛋白磷酸化水平则低于LSeN组。图4中B、C、D、E展示了蛋白灰度的比率分析。图5中A、B、C分别展示了小肠组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，与CG组相比，LSeN组IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明显增多，LSeJ组中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量则明显低于LSeN组。以上结果表明，缺硒导致小鼠小肠组织出现损伤及炎症反应，而灌服罗伊氏乳杆菌后，这种情况得到了改善。
2.3罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)减轻硒缺乏小鼠小肠组织的发生细胞凋亡。
本试验对小肠组织切片进行了免疫荧光分析，TUNEL荧光染色结果如图6所示，LSeN组(图6中C)的绿色荧光强度明显高于CG组(图6中A)。LSeJ(图6中B)的绿色荧光强度低于LSeN组(图6中C)，但高于CG组。提示缺硒促进小肠细胞凋亡。凋亡相关基因的mRNA表达水平如图12所示，与CG组相比，LSeN组小肠BaK、Pum、Caspase-3、RIP1和RIPK3的mRNA水平明显上升，p53、BcL-2以及BcL-w的mRNA水平明显下降。LSeJ组中BaK、Pum、Caspase-3、RIP1和RIPK3的mRNA水平较LSeN组有所下降，p53、BcL-2以及BcL-w的mRNA水平则有所升高。图7展示了小鼠小肠组织凋亡相关蛋白Caspase-3和RIP1的蛋白水平，LSeN组中Caspase-3和RIP1的表达水平较CG组增加，LSeJ组中Caspase-3和RIP1的表达水平较LSeN组减少。这说明罗伊氏乳杆菌改善了缺硒引起的小肠组织细胞凋亡。
2.4罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)减少硒缺乏小鼠小肠组织的自噬发生。
本试验检测了小肠组织有关自噬的基因和蛋白水平。结果如图12所示，与CG相比，LSeN组小肠Beclin，ATG7，ATG5，LC3α的mRNA水平明显上升，p62的mRNA水平略下降。LSeJ组中Beclin，ATG7，ATG5，LC3α的mRNA水平较LSeN组相比有所下降，p62的mRNA水平升高。如图8所示，与CG组相比，LSeN组中ATG5和p62的蛋白水平显著升高，LSeJ组ATG5和p62的蛋白水平低于LSeN组。这说明罗伊氏乳杆菌改善了缺硒引起的小肠组织细胞自噬。
2.5罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)减轻硒缺乏小鼠小肠组织发生内质网应激。
本试验检测了小鼠小肠组织内质网相关基因和蛋白的水平。结果如图12所示，与CG组相比，PERK、IRE1、elF2α、GRP78和CHOP2的mRNA水平明显上升。图9展示了小肠组织内质网相关蛋白的表达水平，结果显示，与CG组相比，LSeN组IRE1和p-elF2α的表达明显增多，elF2α的表达减少。LSeJ组中IRE1的表达比LSeN组增加，elF2α的磷酸化水平与LSeN组相比却减少了。这说明罗伊氏乳杆菌可能通过降低elF2α的磷酸化水平改善缺硒引起的小肠组织内质网应激。
2.6罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)促进硒缺乏小鼠小肠组织的细胞紧密连接恢复。
本研究通过qPCR法和Western Bloting法检测了小鼠小肠组织紧密连接相关的mRNA和蛋白水平。mRNA检测结果图12所示，与CG组相比，LSeN组紧密连接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin和E-cadherin的mRNA水平明显上升。LSeJ组中ZO-1、ZO-2、Occludin和E-cadherin的mRNA水平较LSeN组有所下降，蛋白检测结果如图10所示，与CSe组相比较，LSeN组ZO-2的表达水平显著增加，而E-cadherin的表达水平却减少了。与LSeN组相比较，LSeJ组ZO-2的表达水平有所下降，而E-cadherin的表达水平略有升高。这说明罗伊氏乳杆菌可能通过降低ZO-2的表达水平改善缺硒引起的小肠组织细胞紧密连接破坏。
2.7罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)减轻硒缺乏小鼠小肠组织的平滑肌收缩异常。
本研究通过qPCR法和Western Bloting法检测了小鼠小肠组织平滑肌收缩相关基因如CaM、MLC、MLCK、Rho和RhoA的mRNA水平以及MLCK和RhoA的蛋白水平。mRNA检测结果图12所示，与CG组相比，LSeN组平滑肌收缩相关基因如CaM，MLC，MLCK，Rho，RhoA的表达均上升，LSeJ组则显著低于LSeN。蛋白检测结果如图11所示，与CG组相比较，LSeN组RhoA的蛋白表达水平显著增加，LSeJ组则显著低于LSeN。这说明小肠平滑肌收缩状态已不同于CG组。
因此，硒缺乏引起小鼠肠道菌群物种组成结构发生变化，在试验中LSeN组Lactobacillus_johnsonii、Ileibacterium_valens、Firmicutes_bacterium_M10-2以及罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)的物种相对丰度较CG组变化最大，而摄入罗伊氏乳杆菌后Lactobacillus_johnsonii、Ileibacterium_valens和Faecalibaculum_rodentium的物种相对丰度升高。罗伊氏乳杆菌对缺硒小鼠的肠道菌群紊乱起到了调节作用，并且改善了硒缺乏导致的小肠组织损伤及炎症，自噬，内质网应激，凋亡，紧密连接和平滑肌收缩异常。
因此，本发明采用上述的罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用，罗伊氏乳杆菌可改善硒缺乏引起的肠道组织炎症、自噬、内质网应激、细胞凋亡、紧密连接及平滑肌异常收缩，为细菌治疗肠道疾病提供一种新的思路。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.罗伊氏乳杆菌在制备治疗肠道菌群紊乱药物中的应用，所述罗伊氏乳杆菌为罗伊氏乳杆菌ATCC23272。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：应用于制备含有罗伊氏乳杆菌的药物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：药物包括冻干粉。
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