CN117987471A - 一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途。所述重组病毒载体包含编码肿瘤抗原的多核苷酸，所述肿瘤抗原选自LAGE抗原、MAGE抗原或NY‑ESO‑1抗原中的一种或多种。本发明提供的重组病毒载体疫苗能够激发肿瘤特异性免疫应答，有效抑制肿瘤细胞生长，延长肿瘤患者的生存时间。

Description

一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途
本申请为申请号为201910505212.8、申请日为2019年6月12日、发明名称为“一种重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种包含编码CD4辅助性T细胞表位融合肽的多核苷酸的重组病毒载体、包含其的免疫组合物以及用途。
背景技术
T辅助细胞(Th细胞)是一种在免疫系统中起重要作用的T细胞，特别是在适应性免疫系统中。它们通过释放T细胞细胞因子来帮助其他免疫细胞的活性。这些细胞有助于抑制或调节免疫反应。它们在B细胞抗体类别的转换、细胞毒性T细胞的活化和生长以及吞噬细胞如巨噬细胞的杀菌活性最大化中是必需的。
成熟Th细胞表达蛋白CD4，称为CD4+T细胞。通常将这样的CD4+T细胞作为免疫系统内的辅助T细胞进行预定义的处理。例如，当抗原呈递细胞在II类MHC上表达抗原时，CD4+细胞将通过细胞与细胞相互作用的组合(例如CD40(蛋白质)和CD40L)和细胞因子来帮助这些细胞。
可以从HIV(一种主要感染CD4+T细胞的病毒)中看到辅助T细胞的重要性。在艾滋病毒感染的晚期阶段，功能性CD4+T细胞的丧失导致被称为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的感染症状阶段。当血液或其他体液早期发现HIV病毒时，连续治疗可能会延迟发生这种情况的时间。如果发生艾滋病，治疗也可以更好地管理艾滋病的过程。还有其他罕见的疾病，如淋巴细胞减少症，导致CD4+T细胞的缺失或功能障碍。这些疾病产生类似的症状，其中许多是致命的。
抗原表位(antigenic epitope)，简称“表位”(epitope)，也称为“抗原决定簇”(antigenic determinant)，是指抗原表面上决定抗原特异性的化学基团。抗原表位可被免疫系统(尤其是抗体、B细胞或者T细胞)所识别。抗体中能识别抗原表位的区域叫做“互补位”或“抗体决定簇”。尽管通常抗原表位是指外来蛋白质等物质的其中一部分，但只要能被自身免疫系统所识别的表位，也被归为抗原表位。
蛋白质抗原的表位根据它们的结构以及与互补位的交互作用，被分为构象表位和线性表位这两种类型。其中构象表位由抗原氨基酸序列中的不连续部分组成，因此互补位和抗原表位的交互作用是基于表面的三维特征和形状，或者是抗原的三级结构。大部分的抗原表位都属于构象表位。与此相反，线性表位是由一段连续的抗原氨基酸序列构成，与抗原的交互作用的基础是其一级结构。
T细胞表位(T cell epitope)主要是由8-17氨基酸组成的短肽构成，出现在抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)上，这种抗原表位将会和主要组织相容性复合体(MHC)相结合形成复合体，并与相应的T细胞表位受体结合，从而活化T细胞，产生相应细胞免疫应答(Shimonkevitz et al.,1984；Babbitt et al.,1985；Buus et al.,1986；Townsend and Bodmer,1989)。与表位结合的MHC主要有两类分子，其中，I类主要组织相容性复合体所呈现的T细胞抗原表位通常是由8至11个氨基酸长度的多肽，而II类主要组织相容性复合体所呈现的T细胞抗原表位相对更长，由13-17个氨基酸组成。
辅助T细胞表位(Th epitope，即Th表位)是指T细胞表位中的，与MHC分子结合形成的复合体能被CD4辅助性T细胞受体识别的一类T细胞表位。Th表位主要与存在于由主要组织相容性复合体(MHC)的II类基因编码的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)表面上的分子结合。然后，II类分子和肽表位的复合物被T辅助淋巴细胞表面上的特异性T细胞受体(TCR)识别。以这种方式，在MHC分子的环境中呈现抗原表位的T细胞可以被激活，并为B淋巴细胞分化提供必要的信号。传统上，肽免疫原的辅助T细胞表位的来源是肽共价偶联的载体蛋白，但是该偶联过程可引入其他问题，例如在偶联过程中抗原决定簇的修饰和以针对肽的抗体为代价的针对载体的抗体的诱导(Schutze,M.P.,Leclerc,C.Jolivet,M.Audibert,F.Chedid,L.Carrier-induced epitopic suppression,a major issue forfuture synthetic vaccines.J Immunol.1985,135,2319-2322；DiJohn,D.,Torrese,J.R.Murillo,J.Herrington,D.A.et al.Effect of priming with carrier on responseto conjugate vaccine.The Lancet.1989,2,1415-1416)。此外，在制备中使用无关蛋白引入质量控制问题。合适的载体蛋白的选择在设计肽疫苗时非常重要，其选择受到其大规模生产的毒性和可行性等因素的限制。这种方法还有其他限制，包括可偶联的肽负载的大小和可以安全施用的载体的剂量(Audibert,F.a.C.,L.1984.Modern approaches tovaccines.Molecular and chemical basis of virus virulence and immunogenicity.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York.)。虽然载体分子允许诱导强的免疫应答，但它们也与不利影响相关，例如抑制抗肽抗体应答(Herzenberg,L.A.and Tokuhisa,T.1980.Carrier-priming leads to hapten-specific suppression.Nature 285:664；Schutze,M.P.,Leclerc,C.,Jolivet,M.,Audibert,F.,and Chedid,L.1985.Carrier-induced epitopic suppression,a major issue for future synthetic vaccines.JImmunol 135:2319；Etlinger,H.M.,Felix,A.M.,Gillessen,D.,Heimer,E.P.,Just,M.,Pink,J.R.,Sinigaglia,F.,Sturchler,D.,Takacs,B.,Trzeciak,A.,and et al.,1988.Assessment in humans of a synthetic peptide-based vaccine against thesporozoite stage of the human malaria parasite,Plasmodium falciparum.JImmunol 140:626)。
一般来说，免疫原必须包含辅助T细胞表位，除了将被表面Ig识别的表位或存在于细胞毒性T细胞上的受体之外。应该意识到，这些类型的表位可能是非常不同的。对于B细胞表位，构象是重要的，因为B细胞受体直接与天然免疫原结合。相比之下，由T细胞识别的表位不依赖于表位的构象完整性，并且由针对CTL的约9个氨基酸的短序列和针对辅助T细胞的稍长的序列(长度限制较小)组成。这些表位的唯一要求是它们可以分别容纳在I类或II类分子的结合裂口中，并且然后复合物能够与T细胞受体结合。II类分子的结合位点在两端是开放的，允许与报道的短至8个氨基酸残基(Fahrer,A.M.,Geysen,H.M.,White,D.O.,Jackson,D.C.and Brown,L.E.Analysis of the requirements for class II-restricted T-cell recognition of a single determinant revealsconsiderablediversity in the T-cell response and degeneracy of peptidebinding to HEd J.Immunol.1995.155:2849-2857)的表位结合的肽的长度变化更大(Brown,J.H.,T.S.Jardetzky,J.C.Gorga,L.J.Stern,R.G.Urban,J.L.Strominger andD.C.Wiley.1993.Three-dimensional structure of the human class IIhistocompatibility antigen HLA-DR1.Nature 364:33)。
Th表位能刺激并活化辅助T细胞，相应地，促进CD8 T细胞和B细胞活化，最终提高免疫应答。实质上，Th表位除了能活化针对自身的免疫应答外，还能有效帮助与之关联的其他抗原或表位的免疫应答。因此，可以将异源性的强Th表位与目的免疫原融合，据此可以提高目的免疫原的免疫原性。一种称之为“PADRE(pan HLA DR-binding Epitope)”的人造强Th表位已用于多个疫苗的融合构造，以提高相关免疫原的免疫应答水平(del Guercio etal.,Vaccine,1997,15:441.；Franke,E.D.et al.,Vaccine,1999,17:1201；JeffAlexander et al.,J Immunol,2000,164(3)1625-1633；Jeff Alexander et al.,Vaccine,2004,22:2362.；La Rosa,Corinna et al.,The Journal of infectiousdiseases,2012,205:1294-304)。此外，源于破伤风毒素(Tetanus toxin)的强Th表位P2也常用于与目的免疫原偶联，以提高免疫原性(Panina-Bordignon P et al.,Eur JImmunol,1989,19:2237-42；La Rosa,Corinna et al.,The Journal of infectiousdiseases,2012,205:1294-304)。
但一般而言，用于提高免疫原性的Th表位通常为异源性的，换言之，疫苗受试者体内不会存在针对该Th表位自身的高水平的免疫应答。因此，使用上述的强Th表位接种疫苗受试者时，很可能的情况是疫苗受试者的免疫系统是初次接触此类Th表位，受体免疫系统活化针对此类Th表位和目的免疫原的表位基本上是同步的，针对此类Th表位的T细胞的生成时间和数量与目的免疫原相似，这样的话，对于帮助目的免疫原的效果会因此受限。特别是对于弱免疫原性的肿瘤抗原，此类Th表位的辅助作用更难发挥。事实上，直接采用强Th表位虽然能活化肿瘤抗原，但其激发的细胞免疫应答水平仍较低，不能满足肿瘤疫苗的需要(Ghaffari-Nazari H etal.,PLoS ONE,2015,10(11):e0142563)。
因此，需要新的Th表位策略来提高目的免疫原免疫原性，特别是一些弱的免疫原，例如肿瘤抗原。
发明内容
本发明的目的是提供一种CD4辅助性T细胞表位融合肽，通过该表位融合肽，目的免疫原的免疫原性得以提高。
进一步地，本发明利用来源于巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)和流感病毒(Influvirus,Flu)的强Th表位获得表位融合肽来提高目的免疫原的免疫原性。
为了本发明的目的以下定义下列术语。
“表位融合肽”是指将若干表位连接在一起所形成的一个肽。
“目的免疫原”是指为实现某种免疫应答，所采用的免疫原，包括抗原等具有免疫学活性的物质，优选为蛋白。
本发明的另一目的是提供一种所述表位融合肽和所述目的免疫原的融合蛋白。
为实现上述目的，本发明提供一种CD4辅助性T细胞表位融合肽，其包含巨细胞病毒表位和/或流感病毒表位。本发明还提供一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包含编码CD4辅助性T细胞表位融合肽的多核苷酸，所述CD4辅助性T细胞表位融合肽包含巨细胞病毒表位和/或流感病毒表位。
在本发明的一个实施方案中，所述表位融合肽包含选自SEQ ID NO:1-10所示的巨细胞病毒表位中的一种或多种，和/或选自SEQ ID NO:11-23所示的流感病毒表位中的一种或多种。
在本发明的一个实施方案中，所述表位融合肽由选自SEQ ID NO：1-10所示的巨细胞病毒表位中的一种或多种，和/或选自SEQ ID NO：11-23所示的流感病毒表位中的一种或多种组成。优选地，所述表位融合肽由5个或10个巨细胞病毒表位和/或由8个或13个流感病毒表位组成，例如SEQ ID NO:34或44所示的表位融合肽。最优选地，所述表位融合肽由13个流感病毒表位组成，例如SEQ ID NO:48或60所示的表位融合肽。
优选地，所述表位融合肽诱导体液或细胞免疫应答。
优选地，重组病毒是痘苗病毒，优选为复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒天坛株，例如752-1株，或者为非复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒减毒疫苗安卡拉株(Modified Vaccinia Ankara，MVA)。
本发明还提供了所述表位融合肽和目的免疫原的融合蛋白。
本发明还提供了编码所述表位融合肽和/或所述融合蛋白的多核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，所述目的免疫原为任意一种或多种免疫原。优选的，所述目的免疫原为肽、抗原、半抗原、碳水化合物、蛋白质、核酸、过敏原、病毒或病毒的一部分、细菌、寄生虫或其它完整的微生物。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原为肿瘤抗原或感染相关抗原。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自肺癌抗原、睾丸癌抗原或黑色素瘤抗原、肝癌抗原、乳腺癌抗原或前列腺癌抗原中的一种或多种。
在本发明的一个实施方案中，所述肿瘤抗原选自LAGE抗原、MAGE抗原或NY-ESO-1抗原中的一种或多种。优选地，LAGE抗原为LAGE-1，MAGE抗原为MAGE-A3。进一步优选地，所述肿瘤抗原包含LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1。优选地，所述LAGE-1的氨基酸序列如SEQ IDNO:24所示，所述MAGE-A3的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，所述NY-ESO-1的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；还进一步优选地，所述肿瘤抗原包含LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1。
在本发明的一个实施方案中，所述感染相关抗原选自HIV抗原、流感病毒抗原或HBV抗原中的一种或多种。
优选地，所述融合蛋白如SEQ ID NO:55-58、62中之一所示。
优选地，所述融合蛋白的编码基因如SEQ ID NO:63所示。
本发明的另一目的是提供一种免疫组合物，所述免疫组合物包含治疗有效量的根据本发明的表位融合肽、融合蛋白、多核苷酸和/或重组病毒载体，以及药学上可接受的载体。优选地，该免疫组合物为疫苗。
本发明的另一目的是提供一种药盒，所述药盒包含根据本发明的表位融合肽、融合蛋白、多核苷酸、重组病毒载体和/或免疫组合物，以及其使用说明。
本发明还提供了根据本发明的表位融合肽、融合蛋白、多核苷酸、重组病毒载体和/或免疫组合物在制备提高目的免疫原的免疫原性的药物或疫苗中用途。
本发明还提供了一种使用根据本发明的表位融合肽提高目的免疫原的免疫原性的方法，包括将疫苗受试者或人群中已有较强免疫应答的CD4辅助性T细胞表位与目的免疫原融合形成的融合蛋白。其方法具体为：
(1)选择一个或多个CD4辅助性T细胞的表位，所述表位与MHC分子结合形成的复合体能被CD4辅助性T细胞受体识别，并且在疫苗接种前，疫苗受试者体内已经存在针对所述表位中至少一个表位产生了T细胞免疫应答；
(2)将上述表位融合以制成表位融合肽，将所述表位融合肽与目的免疫原融合以制成融合蛋白，表达融合蛋白并制成疫苗，其表达载体形式可以是DNA疫苗载体形式，可以是蛋白疫苗载体形式，还可以是病毒疫苗载体形式；
(3)将上述疫苗接种给疫苗受试者，接种时可以选择适当的佐剂，例如不完全弗氏佐剂，完全弗氏佐剂，氢氧化铝佐剂等。
进一步地，所述使用方法的步骤(1)还包括检查疫苗受试者MHC表型的步骤。优选地，检查疫苗受试者MHC表型包括检查疫苗受试者的MHC II类基因亚型型别。
本发明还提供了一种治疗或预防有需要的受试者的病症的方法，其包括给予治疗有效量的本发明的表位融合肽、免疫组合物、多核苷酸和/或重组病毒载体。优选地，所述病症选自恶性肿瘤、细菌和病毒性感染中的一种或多种。优选地，所述恶性肿瘤为乳腺癌或结肠癌。优选地，所述感染是慢性感染。优选地，该方法中，初免使用DNA疫苗载体，加强免疫使用蛋白疫苗载体，更优选地，初免使用pVKD1.0-CI-LMNB DNA疫苗，加强免疫使用LMNB-I13蛋白。
本发明提供的表位融合肽能大幅度提高目的免疫原，尤其是弱免疫原的细胞免疫应答水平，是克服免疫系统对抗原免疫耐受性，尤其是对肿瘤抗原或感染相关抗原免疫耐受性的有效手段，适用于高效增强疫苗的效力。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1和图2分别是带有LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原编码序列的DNA疫苗载体pVKD1.0-hLMN的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图3和图4分别是带有LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原以及霍乱毒素B亚单位编码序列的DNA疫苗载体pVKD1.0-hLMN-CTB的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图5和图6分别是带有源于CMV和流感病毒CD4表位编码序列的DNA疫苗载体pVKD1.0-CI的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图7和图8分别是带有LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原以及霍乱毒素B亚单位，和源于CMV和流感病毒CD4表位编码序列的DNA疫苗载体pVKD1.0-CI-LMNB的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图9和图10分别是带有LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原编码序列的原核载体pET-30a(+)-LMN的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图11和图12分别是带有LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原以及霍乱毒素B亚单位编码序列的原核载体pET-30a(+)-LMN-CTB的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图13和图14分别是带有源于CMV表位编码序列的原核载体pET-30a(+)-CMV Th的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图15和图16分别是带有源于CMV表位和LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原以及霍乱毒素B亚单位编码序列的原核载体pET-30a(+)-CMV10-LMNB的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图17和图18分别是带有源于流感病毒表位编码序列的原核载体pET-30a(+)-CMVTh的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图19和图20分别是带有源于流感病毒表位和LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原以及霍乱毒素B亚单位编码序列的原核载体pET-30a(+)-Influ8-LMNB的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图21和图22分别是带有源于流感病毒表位和LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原以及霍乱毒素B亚单位编码序列的原核载体pET-30a(+)-Influ13-LMNB的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图23为动物免疫实验中的细胞免疫应答检测结果。
图24和图25分别是带有源于CMV表位和LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原以及霍乱毒素B亚单位编码序列的原核载体pET-30a(+)-CMV5-LMNB的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图26为实施例12中的动物免疫实验中的细胞免疫应答检测结果。
图27为实施例13中的小鼠肿瘤生长情况。
图28和图29分别是实施例13中的小鼠无瘤存活状况和总体存活状况。
图30为4T1-hNY-ESO-1小鼠肿瘤模型中，各治疗小组小鼠肿瘤生长情况。
图31为CT26-hLAGE-1小鼠肿瘤模型中，各治疗小组小鼠肿瘤生长情况。
图32和图33分别是带有LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1抗原编码序列和13个流感表位编码序列(I13)的穿梭载体载体pSC65-LMNB-I13的质粒图谱和双酶切鉴定图。
图34为实施例19中的CT26-MAGE-A3小鼠肿瘤模型中，各组小鼠肿瘤生长情况。
图35为实施例19中的CT26-MAGE-A3小鼠肿瘤模型中，各组小鼠总体存活状况。
图36为实施例20中的CT26-LAGE-1小鼠肿瘤模型中，各组小鼠肿瘤生长情况。
图37为实施例20中的CT26-LAGE-1小鼠肿瘤模型中，各组小鼠总体存活状况。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1DNA疫苗pVKD1.0-hLMN构建
LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1氨基酸序列分别如SEQ ID NO:24-26所示。通过在线密码子优化软件(http://www.jcat.de/)将上述抗原氨基酸序列优化成哺乳动物密码子使用偏好的核苷酸序列，分别如SEQ ID NO:27-29所示。经上海捷瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的方法克隆至DNA疫苗载体pVKD1.0(苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)上的多克隆位点Sal I与BamH I之间，构建成可表达融合蛋白抗原的DNA疫苗载体pVKD1.0-hLMN(质粒图谱如图1)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Sal I与BamHI鉴定载体pVKD1.0-hLMN(酶切体系如表1)，其酶切验证图谱如图2所示。
表1：质粒pVKD1.0-hLMN的酶切鉴定体系(37℃酶切2小时)
酶切体系 体积
质粒pVKD1.0-hLMN 3μL，约1μg
Sal I(宝生物，货号1080A) 1μL
BamH I(宝生物，货号1010A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
实施例2DNA疫苗pVKD1.0-hLMN-CTB构建
霍乱毒素B亚单位(Cholera toxin subunit B，简称CTB)的氨基酸序列(SEQ IDNO:30)的哺乳动物密码子优化序列(SEQ ID NO:31)及其真核表达载体pVKD1.0-CTB由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。以pVKD1.0-CTB为模板，设计引物(表2)，通过PCR扩增CTB基因片段，然后凝胶回收相应片段，通过同源重组法将CTB片段插入线性化载体pVKD1.0-hLMN相应位置上，构建成DNA疫苗载体pVKD1.0-hLMN-CTB(质粒图谱如图3)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Sal I与BamH I鉴定载体pVKD1.0-hLMN-CTB(酶切体系如表3)，其酶切验证图谱如图4所示。
表2：实施例2中的引物
表3：质粒pVKD1.0-hLMN-CTB的酶切鉴定体系(37℃酶切2小时)
酶切体系 体积
质粒pVKD1.0-hLMN-CTB 3μL，约1μg
Sal I(宝生物，货号1080A) 1μL
BamH I(宝生物，货号1010A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
实施例3DNA疫苗pVKD1.0-CI-LMNB构建
在免疫表位数据库(IEDB，http://www.iedb.org)上获取来源于巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)和流感病毒(Influvirus,Flu)的强Th表位(见表4)，其中，CMV的强Th表位包括pp65-11、pp65-71、pp65-92、pp65-123、pp65-128、pp65-57、pp65-62、pp65-30、pp65-112和pp65-104；流感病毒的强Th表位包括HA203、NP438、NS1-84、M1-181、HA375、NP24、NP95、NP221、HA434、HA440、NP324、M1-127和M1-210。表4中选择的表位覆盖人群中MHCII类分子多数亚型，而且也覆盖小鼠MHC II亚型分子。然后将所选的表位pp65-11、pp65-71、pp65-92、pp65-123、pp65-128、HA203、NP438、NS1-84、M1-181、HA375、NP24、NP95、NP221串联在一起，形成一段CMV病毒和流感病毒的表位融合肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，该表位融合肽经哺乳动物密码子优化后，核酸序列如SEQ ID NO:35所示。送苏州泓迅生物科技有限公司合成该核酸序列，然后通过本领域熟知的分子生物学方法将该核酸序列插入至DNA疫苗载体pVKD1.0(苏州工业园区唯可达生物科技有限公司)上，形成载体pVKD1.0-CI(质粒图谱如图5)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Pst I与Bgl II鉴定载体pVKD1.0-CI(酶切体系如表5)，其酶切验证谱如图6所示。
表4：实施例3中的Th表位
表5：质粒pVKD1.0-CI的酶切鉴定体系(37℃酶切2小时)
酶切体系 体积
质粒pVKD1.0-CI 3μL，约1μg
Pst I(宝生物，货号1073A) 1μL
Bgl II(宝生物，货号1021A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
最后以实施例2中的载体pVKD1.0-hLMN-CTB为模板，设计引物(表6)，通过PCR扩增hLMN-CTB目的基因片段，然后通过本领域熟知的分子生物学方法将该基因片段插入该pVKD1.0-CI载体上Not I和Bam HI酶切位点之间，构建成DNA疫苗载体pVKD1.0-CI-LMNB(质粒图谱如图7)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Bam HI与EcoR V鉴定载体pVKD1.0-CI-LMNB(酶切体系如表7)，其酶切验证图谱如图8所示。
表6：实施例3中的引物
表7：质粒pVKD1.0-CI-LMNB的酶切鉴定体系(37℃酶切2小时)
实施例4LMN原核表达载体构建
LAGE-1、MAGE-A3和NY-ESO-1氨基酸序列分别如SEQ ID NO:24-26所示。通过在线密码子优化软件(http://www.jcat.de/)将所述抗原氨基酸序列优化成大肠杆菌密码子使用偏好的核苷酸序列，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:38-40所示。经苏州泓迅生物科技有限公司合成后，通过本领域熟知的分子生物学方法插入至原核表达载体pET-30a(+)(Novagen，货号69909)上的多克隆位点Nco I与Xho I之间，构建成原核表达构建体pET-30a(+)-LMN(质粒图谱如图9)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Nco I和Xho I鉴定载体pET-30a(+)-LMN(酶切体系如表8)，其酶切验证图谱如图10所示。
表8：质粒pET-30a(+)-LMN的酶切鉴定体系(37℃酶切过夜)
酶切体系 体积
质粒pET-30a(+)-LMN 3μL，约1μg
Nco I(宝生物，货号1160A) 1μL
Xho I(宝生物，货号1094A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
实施例5LMN-CTB原核表达载体构建
霍乱毒素B亚单位CTB氨基酸序列(SEQ ID NO:30)及其原核密码子优化核酸序列(SEQ ID NO:41)均由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。设计引物(表9)，以pET-30a(+)-CTB(苏州工业园区唯可达生物科技有限公司)为模板，用PCR方法扩增含有CTB编码序列的核酸片段，具体方法参看Ex Taq酶(宝生物，货号RR001B)试剂说明书。然后通过同源重组的方式将该核酸片段插入pET-30a(+)-LMN载体上，构建成pET-30a(+)-LMN-CTB载体(质粒图谱如图11)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Nco I和Xho I鉴定载体pET-30a(+)-LMN-CTB(酶切体系如表10)，其酶切验证图谱如图12所示。
表9：实施例5中的引物
表10：实施例5中的酶切鉴定体系(37℃酶切过夜)
酶切体系 体积
质粒pET-30a(+)-LMN-CTB 3μL，约1μg
Nco I(宝生物，货号1160A) 1μL
Xho I(宝生物，货号1094A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
实施例6含有LMN-CTB与CMV Th表位融合蛋白的原核表达载体构建
从表4中选取10个来源于CMV的Th表位pp65-11、pp65-71、pp65-92、pp65-123、pp65-128、pp65-57、pp65-62、pp65-30、pp65-112和pp65-104，将其串联在一起，所组成的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示，其中，该SEQ ID NO:44中的一段序列“EFELRRQ”是因为引入了酶切位点导致的，属于融合构建常用的技术。通过在线密码子优化软件(http://www.jcat.de/)将所述Th表位氨基酸序列优化成大肠杆菌密码子使用偏好的核苷酸序列(SEQ ID NO:45)，经上海捷瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的分子生物学方法插入至原核表达载体pET-30a(+)(Novagen，货号69909)上的多克隆位点Nco I与Xho I之间，构建成可表达融合蛋白抗原的原核表达构建体pET-30a(+)-CMV Th(质粒图谱如图13)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Mlu I和Xho I鉴定载体pET-30a(+)-CMV Th(酶切体系如表11)，其酶切验证图谱如图14所示。
其中，如图13所示，CMV Th1含有5个CMV的Th表位，由pp65-11、pp65-71、pp65-92、pp65-123和pp65-128串联而成，CMV Th2含有5个CMV的Th表位，由pp65-57、pp65-62、pp65-30、pp65-112和pp65-104组成，CMV Th1和CMV Th2之间引入了EcoR I、Sac I和Sal I等3个限制酶酶切位点。
表11：质粒pET-30a(+)-CMV Th的酶切鉴定体系(37℃酶切过夜)
酶切体系 体积
质粒pET-30a(+)-CMV Th 3μL，约1μg
Mlu I(宝生物，货号1071A) 1μL
Xho I(宝生物，货号1094A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
设计引物(表12)，以实施例5中的pET-30a(+)-LMN-CTB为模板，用PCR方法扩增含有LMN-CTB编码序列的核酸片段，具体方法参看Ex Taq酶(宝生物，货号RR001B)试剂说明书。然后通过本领域熟知的分子生物学方法将该核酸片段插入实施例6中的pET-30a(+)-CMV Th载体上的Not I和Xho I之间，构建成pET-30a(+)-CMV10-LMNB载体(质粒图谱如图15，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶BamH I和Xho I鉴定载体pET-30a(+)-CMV10-LMNB(酶切体系如表13)，其酶切验证图谱如图16所示。如图15所示，pET-30a(+)-CMV10-LMNB含有CMV Th1和CMV Th2片段，即该载体含有表4中所有10个CMV Th表位。这些表位是pp65-11、pp65-71、pp65-92、pp65-123、pp65-128、pp65-57、pp65-62、pp65-30、pp65-112和pp65-104。
表12：实施例6中的引物设计
引物 序列
6F(SEQ ID NO:46) GCGCGGCCGCGACGACAAGGCCATGGCT
6R(SEQ ID NO:47) GCCTCGAGGTTAGCCATAGAGATAGC
表13：pET-30a(+)-CMV10-LMNB的酶切鉴定体系(37℃酶切过夜)
酶切体系 体积
质粒pET-30a(+)-CMV10-LMNB 3μL，约1μg
BamH I(宝生物，货号1010A) 1μL
Xho I(宝生物，货号1094A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
实施例7含有LMN-CTB与Influ Th表位融合蛋白的原核表达载体构建
从表4中选取13个来源于流感病毒的Th表位HA203、NP438、NS1-84、M1-181、HA375、NP24、NP95、NP221、HA434、HA440、NP324、M1-127和M1-210，将其串联在一起，所组成的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示。
通过在线密码子优化软件(http://www.jcat.de/)将所述含有流感病毒Th表位的氨基酸序列优化成大肠杆菌密码子使用偏好的核苷酸序列(SEQ ID NO:49)，经上海捷瑞生物技术有限公司合成后，通过本领域熟知的分子生物学方法插入至原核表达载体pET-30a(+)(Novagen，货号69909)上的多克隆位点Nco I与Xho I之间，构建成可表达融合蛋白抗原的原核表达构建体pET-30a(+)-Influ Th(质粒图谱如图17)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶Nco I和Xho I鉴定载体pET-30a(+)-Influ Th(酶切体系如表14)，其酶切验证图谱如图18所示。
其中，如图17所示，Influ Th1含有8个流感病毒的Th表位，由HA203、NP438、NS1-84、M1-181、HA375、NP24、NP95和NP221串联而成，Influ Th2含有5个流感病毒的Th表位，由HA434、HA440、NP324、M1-127和M1-210组成，Influ Th1和Influ Th2之间引入了EcoR I、SacI和Sal I等3个限制酶酶切位点。
表14：实施例7中的酶切鉴定体系(37℃酶切过夜)
酶切体系 体积
质粒pET-30a(+)-Influ Th 3μL，约1μg
Nco I(宝生物，货号1160A) 1μL
Xho I(宝生物，货号1094A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
设计引物(表15)，以实施例5中的pET-30a(+)-LMN-CTB为模板，用PCR方法扩增含有LMN-CTB编码序列的核酸片段，具体方法参看Ex Taq酶(宝生物，货号RR001B)试剂说明书。然后通过本领域熟知的分子生物学方法将该核酸片段插入实施例7中的pET-30a(+)-Influ Th载体上的Not I和Sal I之间，构建成pET-30a(+)-Influ8-LMNB载体(含8个流感病毒Th表位，质粒图谱如图19)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶BamH I和Xho I鉴定载体pET-30a(+)-Influ8-LMNB(酶切体系如表16)，其酶切验证图谱如图20所示。
如图19所示，pET-30a(+)-Influ8-LMNB载体含有Influ Th1片段，即含有包括表4中的HA203、NP438、NS1-84、M1-181、HA375、NP24、NP95和NP221在内的8个流感病毒Th表位。
表15：实施例7中的引物
引物 序列
7F1(SEQ ID NO:50) GCGCGGCCGCGTTAGCCATAGAGATAGC
7R1(SEQ ID NO:51) GCGTCGACAAGACGACAAGGCCATGGCTATGC
表16：质粒pET-30a(+)-Influ8-LMNB的酶切鉴定体系(37℃酶切过夜)
设计引物(表17)，以实施例5中的pET-30a(+)-LMN-CTB为模板，用PCR方法扩增含有LMN-CTB编码序列的核酸片段，具体方法参看Ex Taq酶(宝生物，货号RR001B)试剂说明书。然后通过本领域熟知的分子生物学方法将该核酸片段分别插入实施例6中的pET-30a(+)-Influ Th载体上的Not I和Xho I之间，构建成pET-30a(+)-Influ13-LMNB载体(含13个流感病毒Th表位，质粒图谱如图21)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶BamH I和Xho I鉴定载体pET-30a(+)-CMV10-LMNB(酶切体系如表18)，其酶切验证图谱如图22所示。
如图21所示，pET-30a(+)-Influ13-LMNB载体含有Influ Th1和Influ Th2片段，即含有包括表4中的HA203、NP438、NS1-84、M1-181、HA375、NP24、NP95和NP221在内的8个流感病毒Th表位和包括表4中的HA434、HA440、NP324、M1-127和M1-210在内的5个流感病毒Th表位。该载体总共包括表4中的所有13个流感病毒Th表位。
表17：实施例7中的引物设计
引物 序列
7F2(SEQ ID NO:52) GCCTCGAGGTTAGCCATAGAGATAGCA
7R2(SEQ ID NO:53) GCGCGGCCGCGACGACAAGGCCATGGCTATG
表18：实施例7中的酶切鉴定体系(37℃酶切过夜)
酶切体系 体积
质粒pET-30a(+)-Influ13-LMNB 3μL，约1μg
BamH I(宝生物，货号1010A) 1μL
Xho I(宝生物，货号1094A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
实施例8融合蛋白的表达纯化
分别将实施例4中构建的原核表达载体pET-30a(+)-LMN、实施例5中构建的原核表达载体pET-30a(+)-LMN-CTB、实施例6中构建的原核表达载体pET-30a(+)-CMV5-LMNB和pET-30a(+)-CMV10-LMNB、实施例7中构建的原核表达载体pET-30a(+)-Influ8-LMNB和pET-30a(+)-Influ13-LMNB转化至BL21(DE3)感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司，货号CB105，转化方法参见感受态细胞说明书)，根据《pET系统手册》(TB055 8th Edition02/99，Novagen)分别制备重组蛋白LMN(其氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示)、LMNB(其氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示)、LMNB-C10(其氨基酸序列如SEQ ID NO:58所示)、LMNB-I8(其氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示)和LMNB-I13(其氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示)，所制蛋白分装后，-80℃保存。
经BCA法(碧云天生物技术研究所，货号P0009)检测，所制备的重组蛋白浓度为1mg/mL，检测方法参看检测试剂盒说明书。经凝胶法(厦门鲎试剂实验厂有限公司，货号G011000)检测，所制备的重组蛋白内毒素含量<1EU/mg，符合动物实验要求，检测方法参看鲎试剂说明书。
实施例9动物免疫实验
实施例2、3以及实施例8所制备的疫苗信息如表19。DNA疫苗载体pVKD1.0由苏州工业园区唯可达公司提供，DNA疫苗pVKD1.0-NP(表达源于毒株A/Shanghai/02/2013(H7N9))的流感抗原NP(NCBI参考序列:YP_009118476.1)由苏州工业园区唯可达公司提供，蛋白疫苗VP1(肠道病毒71型VP1蛋白，参见中国专利申请201310088364.5)由苏州工业园区唯可达公司提供。
从苏州大学动物实验中心购买16只6-8周龄的雌性BAL B/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心SPF级动物房中。实验动物分组与疫苗接种规划如表20。所有DNA疫苗均为小腿胫骨前肌肉注射，100μg/只。所有蛋白疫苗均在与完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)充分乳化后，背部皮下注射，10μg/只。最后一次免疫完成后两周，处死小鼠，收集血清和脾细胞，分别进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和酶联免疫实验(ELISA)。
小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司(货号：551083)，方法参见BD公司IFN-γELISPOT试剂盒说明书。刺激肽为NY-ESO-1 41#肽(WITQCFLPVFLAQPP)，为上海科肽生物科技有限公司合成，刺激终浓度为10μg/mL。阳性刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和离子霉素(inomysin)均购自美国Sigma公司。
ELISA的方法为本领域人员熟知，简述如下。96孔酶标板购自江海玻璃仪器总厂。重组LMN和NY-ESO-1均由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。用NaHCO3缓冲液(pH9.6)包被蛋白，4℃过夜，包被浓度为10μg/mL。用含0.1％牛血清白蛋白(bovine serumalbumin,BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭30分钟，再用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗5遍后，室温孵育小鼠血清1小时，初始稀释度为1:100，PBST洗5遍后，1:5000孵育羊抗鼠HRP二抗(美国Santacruz公司)，37℃、30分钟，PBST洗5遍后用3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetraamthyl benzidine,TMB)底物显色，37℃、15分钟，用2M稀硫酸终止后用酶标仪(美国Thermo公司)在450nm波长下读取吸光度(A)值。大于阴性对照A值2.1倍判断为阳性值，阳性值中的最高稀释度的倒数定义为血清抗体滴度。滴度小于起始稀释度1:100时，定义其滴度为50。
表19：疫苗信息
表20：分组与免疫规划
细胞免疫应答检测结果如图23所示。其中，初免pVKD1.0-CI-LMNB DNA疫苗，LMNB-I13蛋白加强(即实施例8中的D组)免疫效果最好，显著性高于其平行对照(B组)以及LMNB-I8加强组(C组))。而且LMNB-I13蛋白加强组的细胞免疫应答水平与平行对照组(B组)相比，提高了将近3倍。表明装有流感病毒13个Th表位(D组)能大幅度提高弱免疫原的细胞免疫应答水平。
实施例10含有LMN-CTB与CMV Th表位融合蛋白的原核表达载体构建
设计引物(表21)，以实施例5中的pET-30a(+)-LMN-CTB为模板，用PCR方法扩增含有LMN-CTB编码序列的核酸片段，具体方法参看Ex Taq酶(宝生物，货号RR001B)试剂说明书。然后通过本领域熟知的分子生物学方法将该核酸片段插入实施例6中的pET-30a(+)-CMV Th载体上的Not I和Sal I之间，构建成pET-30a(+)-CMV5-LMNB载体(质粒图谱如图24)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶BamH I和Xho I鉴定载体pET-30a(+)-CMV5-LMNB(酶切体系如表22)，其酶切验证图谱如图25所示。如图24所示，pET-30a(+)-CMV5-LMNB含有CMV Th1片段，即该载体含有表4中前5个CMV Th表位。这些表位是pp65-11、pp65-71、pp65-92、pp65-123和pp65-128。
表21：实施例10中的引物设计
引物 序列
7F1(SEQ ID NO:50) GCGCGGCCGCGTTAGCCATAGAGATAGC
7R1(SEQ ID NO:51) GCGTCGACAAGACGACAAGGCCATGGCTATGC
表22：pET-30a(+)-CMV10-LMNB的酶切鉴定体系(37℃酶切过夜)
酶切体系 体积
质粒pET-30a(+)-CMV10-LMNB 3μL，约1μg
BamH I(宝生物，货号1010A) 1μL
Xho I(宝生物，货号1094A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
实施例11融合蛋白的表达纯化
如实施例8所述，将实施例10中构建的原核表达载体pET-30a(+)-CMV5-LMNB转化至BL21(DE3)感受态细胞(天根生化科技(北京)有限公司，货号CB105，转化方法参见感受态细胞说明书)，根据《pET系统手册》(TB055 8th Edition02/99，Novagen)制备重组蛋白LMNB-C5(其氨基酸序列如SEQ ID NO:57所示)，所制蛋白分装后，-80℃保存。
经BCA法(碧云天生物技术研究所，货号P0009)检测，所制备的重组蛋白浓度为1mg/mL，检测方法参看检测试剂盒说明书。经凝胶法(厦门鲎试剂实验厂有限公司，货号G011000)检测，所制备的重组蛋白内毒素含量<1EU/mg，符合动物实验要求，检测方法参看鲎试剂说明书。
实施例12动物免疫实验
疫苗信息如表19。DNA疫苗pVKD1.0-CI(实施例3)由苏州工业园区唯可达公司提供。
从苏州大学动物实验中心购买20只6-8周龄的雌性BAL B/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心SPF级动物房中。实验动物分组与疫苗接种规划如表23。所有DNA疫苗均为小腿胫骨前肌肉注射，100μg/只。所有蛋白疫苗均在与完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)充分乳化后，背部皮下注射，10μg/只。最后一次免疫完成后两周，处死小鼠，收集血清和脾细胞，分别进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)和酶联免疫实验(ELISA)。
小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司(货号：551083)，方法参见BD公司IFN-γELISPOT试剂盒说明书。刺激肽为NY-ESO-1 41#肽(WITQCFLPVFLAQPP)，为上海科肽生物科技有限公司合成，刺激终浓度为10μg/mL。阳性刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和离子霉素(inomysin)均购自美国Sigma公司。
ELISA的方法为本领域人员熟知，简述如下。96孔酶标板购自江海玻璃仪器总厂。重组LMN和NY-ESO-1均由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。用NaHCO3缓冲液(pH9.6)包被蛋白，4℃过夜，包被浓度为10μg/mL。用含0.1％牛血清白蛋白(bovine serumalbumin,BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)37℃封闭30分钟，再用含0.5％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗5遍后，室温孵育小鼠血清1小时，初始稀释度为1:100，PBST洗5遍后，1:5000孵育羊抗鼠HRP二抗(美国Santacruz公司)，37℃、30分钟，PBST洗5遍后用3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetraamthyl benzidine,TMB)底物显色，37℃、15分钟，用2M稀硫酸终止后用酶标仪(美国Thermo公司)在450nm波长下读取吸光度(A)值。大于阴性对照A值2.1倍判断为阳性值，阳性值中的最高稀释度的倒数定义为血清抗体滴度。滴度小于起始稀释度1:100时，定义其滴度为50。
表23：分组与免疫规划
细胞免疫应答检测结果如图26所示。其中，初免pVKD1.0-CI-LMNB DNA疫苗，LMNB-C5蛋白加强(即实施例11中的C组)和LMNB-C10蛋白加强(即实施例11中的D组)免疫效果最好，显著性高于其平行对照(B组)。表明装有CMV病毒5个Th表位(C组)和10个Th表位(D组)均能大幅度提高弱免疫原的细胞免疫应答水平。
实施例13肿瘤预防动物实验
实施例2、3以及实施例8所制备的疫苗信息如表19。DNA疫苗载体pVKD1.0由苏州工业园区唯可达公司提供，DNA疫苗pVKD1.0-NP(表达源于毒株A/Shanghai/02/2013(H7N9))的流感抗原NP(NCBI参考序列:YP_009118476.1)由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供，蛋白疫苗VP1(肠道病毒71型VP1蛋白，参见中国专利申请201310088364.5)由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供。
从苏州大学动物实验中心购买60只6-8周龄的雌性BAL B/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心SPF级动物房中。实验动物分组与疫苗接种规划如表24。所有DNA疫苗均为小腿胫骨前肌肉注射，100μg/只。所有蛋白疫苗均在与完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)充分乳化后，背部皮下注射，10μg/只。最后一次免疫完成后两周，小鼠皮下接种4T1-hNY-ESO-1稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为1×105细胞/只，接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过2000mm3时，对小鼠处死。
表24：分组与免疫规划
各组免疫小鼠肿瘤生长情况如图27所示。其中，对照组(A组)小鼠在攻瘤后(即肿瘤接种后)第14天全部出现肿瘤，并迅速生长。各免疫组小鼠肿瘤生长滞后于对照组，其中，LMNB-I13加强免疫组(D组)小鼠和LMNB-I13与LMNB-C10混合加强免疫组(E组)小鼠肿瘤生长最慢，因此，此两组疫苗效果最好。
此外，小鼠无瘤存活分析的结果如图28所示。其中，对照组A组小鼠的无瘤存活(TFS)中位数为14天。各疫苗免疫组小鼠无瘤存活均显著高于对照组。表明所有疫苗均能提高免疫后小鼠的无瘤存活期。其中，带有I13表位融合肽的D组，带有I13和C10表位融合肽的E组和F组效果最好，最高增加了一倍的小鼠无瘤存活期。与常规疫苗组(B组)相比，带有I13表位融合肽的疫苗组(D组)显著提高了无瘤存活期，提高了约40％的无瘤存活。表明装有流感病毒13个Th表位或10个CMV Th表位能大幅提高肿瘤疫苗的肿瘤保护效果。
最后，小鼠总体存活分析的结果如图29所示。其中，对照组A组小鼠的总体存活(OS)中位数为35天。各疫苗免疫组小鼠总体存活均显著高于对照组。表明所有疫苗均能提高免疫后小鼠的存活。其中，带有I13表位融合肽的D组，带有I13和C10表位融合肽的E组和F组效果最好，总体存活最高增加了83％。与常规疫苗组(B组)相比，带有I13表位融合肽的疫苗组(D组和F组)显著增加了无瘤存活期，最高增加了28％。表明装有流感病毒13个Th表位或10个CMV Th表位能大幅提高肿瘤疫苗的肿瘤保护效果。
实施例14肿瘤治疗实验
所涉及的疫苗见实施例9。从苏州大学动物实验中心购买30只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心SPF级动物房中。实验动物分组与疫苗接种规划如表25。所有DNA疫苗均为小腿胫骨前肌肉注射，100μg/只。所有蛋白疫苗均在与完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)充分乳化后，背部皮下注射，10μg/只。最后一次免疫完成后两周，小鼠皮下接种肿瘤细胞4T1-hNY-ESO-1稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为1×105细胞/只，分别在肿瘤细胞接种后第1天，第8天和第15天给相应小鼠皮下接种蛋白疫苗。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过2000mm3时，对小鼠处死。
表25：分组与免疫规划
各组免疫小鼠肿瘤生长情况如图30所示。其中，对照组(A组)小鼠在攻瘤后(即肿瘤接种后)第14天全部出现肿瘤，并迅速生长。与未治疗的对照组(A组)相比，LMNB-I13蛋白疫苗治疗组(C组)小鼠肿瘤生长最慢。而且，在小鼠攻瘤后第22天，LMNB-I13蛋白疫苗治疗组小鼠肿瘤大小显著小于对照组(A组)，直到第30天，两组之间的肿瘤大小还存在显著性差异。到第35天，C组小鼠肿瘤生长开始加快，可能与LMNB-I13蛋白疫苗停止接种有关。该结果表明LMNB-I13蛋白疫苗能抑制小鼠肿瘤生长。
实施例15肿瘤治疗实验
所涉及的疫苗见实施例9。从苏州大学动物实验中心购买30只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心SPF级动物房中。实验动物分组与疫苗接种规划如表26。所有DNA疫苗均为小腿胫骨前肌肉注射，100μg/只。所有蛋白疫苗均在与完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)充分乳化后，背部皮下注射，10μg/只。最后一次免疫完成后两周，小鼠皮下接种肿瘤细胞CT26-hLAGE-1稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为1×105细胞/只，分别在肿瘤细胞接种后第1天，第8天和第15天给相应小鼠皮下接种蛋白疫苗。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过2000mm3时，对小鼠处死。
表26：分组与免疫规划
各组免疫小鼠肿瘤生长情况如图31所示，由于未治疗对照组(A组)小鼠在攻瘤后(即肿瘤接种后)有小鼠未能成功接种肿瘤，故未纳入分析，比较了平行疫苗对照组(B组)和LMNB-I13治疗组(C组)小鼠。与B相比，C组小鼠肿瘤生长较慢，而且在在小鼠攻瘤后第22天，LMNB-I13蛋白疫苗治疗组小鼠肿瘤大小显著小于平行疫苗对照组(B组)，直到第30天，两组之间的肿瘤大小还存在显著性差异。同样地，在CT26小鼠模型也观察到C组小鼠在后期肿瘤生长开始加快，可能与LMNB-I13蛋白疫苗停止接种有关。该结果表明LMNB-I13蛋白疫苗能抑制小鼠肿瘤生长。
实施例16穿梭载体pSC65-LMNB-I13构建
I13氨基酸序列(SEQ ID NO:60)含有表4中的HA203、NP438、NS1-84、M1-181、HA375、NP24、NP95和NP221在内的8个流感病毒Th表位和包括表4中的HA434、HA440、NP324、M1-127和M1-210在内的5个流感病毒Th表位。编码I13氨基酸序列的真核密码子优化序列(SEQ ID NO:61)经苏州金唯智生物科技有限公司合成后，通过本领域熟知的分子生物学方法插入穿梭载体pSC65(addgene，货号：30327)上，构建成含有13个流感表位的穿梭载体pSC65-I13。
表达三联融合肿瘤抗原LAGE-1、MAGE-A3、NY-ESO-1以及霍乱毒素B亚单位的载体pVKD1.0-hLMN-CTB(见实施例2)。然后将所述载体中的LMN-CTB片段通过Sal I与Kpn I酶切回收后插入前述的穿梭载体pSC65-I13上，构建成表达三联肿瘤抗原的穿梭载体pSC65-LMNB-I13(质粒图谱如图32)，经测序鉴定正确后入库。其中，LMNB-I13的氨基酸序列如SEQID NO:62所示，其真核密码子优化序列如SEQ ID NO:63所示。用限制内切酶Sal I与Kpn I鉴定载体pSC65-LMNB-I13(酶切体系如表27)，其酶切验证图谱如图33所示。
表27质粒pSC65V3的酶切鉴定体系(37℃酶切2小时)
酶切体系 体积
质粒pSC65-LMNB-I13 3μL，约1μg
Sal I(宝生物，货号1080A) 1μL
Not I(宝生物，货号1166A) 1μL
酶切缓冲液 1μL
ddH2O 补至10μL
实施例17重组痘苗病毒载体rvv-LMNB-I13构建
在143B细胞中获得重组痘苗病毒载体，具体方法如下。第1天，在6孔细胞培养板(JET，TCP-010-006)铺143B细胞(苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，1×106/孔，于37℃二氧化碳细胞培养箱中过夜孵育。第二天，以0.05MOI(即5×104PFU(空斑形成单位)/孔)加入痘苗病毒野生株(由北京生物制品所提供)，然后置于37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育两个小时，期间准备穿梭载体/转染试剂复合物。其中穿梭载体为实施例16中获得的pSC65-LMNB-I13，转染试剂为Turbofect(Thermo Fisher Scientific，R0531)，转染剂量与复合方法可参见转染试剂说明书。复合体系完成后，将143B细胞上清换为2mL/孔的含2％胎牛血清(FBS)的DMEM维持培养基，然后加入穿梭载体/转染试剂复合物。转染48小时后，去上清，收集细胞，并在0.5mL维持培养基中重悬，反复冻融三次，然后将重组细胞裂解物接入新的143B细胞上(含50μg/mL BrdU)，37℃孵育1到2天。期间观察细胞病变，待病毒噬斑出现合适数量时(低于20空斑/孔)，进行单斑纯化。
单斑纯化
将2％低熔点琼脂糖微波炉加热(中高火2分钟左右)至沸，转移至45℃水浴降温并防止其凝固。
吸取适量2×维持培养液(1mL/孔)，按体积比1：50加入X-gal储存液，在45℃水浴中预热。
按等体积比例混合低熔点琼脂糖与含X-gal的2×维持培养液，制成铺斑固体培养基，去细胞上清，小心加入铺斑固体培养基，然后转移至4℃冰箱凝固10分钟，期间不要动6孔板，防止凝固不均匀。
待完全凝固后，转移6孔板至37℃细胞培养箱中孵育2至4小时(有时过夜)，直至蓝斑出现。
待蓝斑出现后，用1mL枪头(预先用剪刀将枪头剪平)优先挑取分散较好的，颜色较深的蓝斑，挑取时一定要将固体培养基下面的细胞层挑到，每孔挑取若干个蓝斑，分别转移至含0.5mL维持培养液的Ep管中。
振荡混匀含病毒的Ep管，反复冻融三次(-80℃冰箱约5分钟，室温约2分钟)，最后振荡混匀，-80℃冻存。
重复六轮单斑纯化，直至纯度至100％。
实施例18重组痘苗病毒载体rvv-LMNB-I13扩增制备与滴定
将实施例17中构建的重组痘苗病毒载体rvv-LMNB-I13，以及痘苗病毒野生株分别在Vero细胞(苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)上扩增，扩增方法如下。
前一天，准备汇集度100％的Vero单层细胞(1×107细胞/皿)，共10皿。
去上清，换为维持培养基，将待扩增的痘病毒接种到细胞上(0.01PFU/细胞)，37℃培养箱孵育2-3天，观察可见明显的细胞病变。
将细胞刮下并收集，1800g离心5分钟，去上清。
用5mL维持培养基进行重悬，在冰上用超声波细胞粉粹机超声，超声条件为：50瓦，5秒超声/5秒间隔，共15分钟。
反复冻融两次(-80℃冰箱约5分钟，室温约2分钟)，最后振荡混匀；
在二级生物安全柜中进行分装至1.5mL离心管中，1mL/支，-80℃冻存。
扩增制备好的痘苗病毒在Vero细胞上进行感染效价滴定，具体方法如下。
前一天，在24孔板中，准备汇集度100％的Vero细胞，3×105/孔。
去上清，每孔添加200μL维持培养液，以防止细胞干涸。
取100μL待测痘病毒加入900μL维持培养基，十倍稀释，连续稀释101，102，103，直到109倍。注意：进行稀释时，因为由高浓度向低浓度稀释，每次向低浓度稀释应更换枪头。
从病毒浓度由小到大(109，108，……104)添加到24孔板中，每孔400μL稀释液，两个重复，连续测定6个稀释倍数。将添加完的24孔板放入37℃细胞培养箱中孵育2天。
显微镜下数出病毒蚀斑的数目，多于20的，记为20+。将可以数出的20(含)以内的蚀斑数目两复孔求平均×2.5(1000μL/400μL)×相应孔的稀释倍数，即为重组病毒滴度(PFU/mL)。
痘苗病毒载体效价滴定结果如表28所示。
表28痘苗病毒载体效价滴定
痘苗病毒 效价(PFU/mL)
痘苗病毒野生型rvv-wt 1.5×108
重组痘苗病毒rvv-LMNB-I13 1.0×108
实施例19肿瘤治疗实验1
从苏州大学动物实验中心购买20只6-8周龄的雌性BAL B/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心SPF级动物房中。在第0天，所有小鼠皮下接种表达MAGE-A3肿瘤抗原的肿瘤细胞CT26-MAGE-A3稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为2×105细胞/只，然后随机分成2两组。在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天给相应小鼠小腿胫骨前肌接种实施例18中制备的痘苗病毒载体(具体疫苗接种规划如表29)。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过10000mm3时，对小鼠处死。
表29实验动物分组与疫苗接种规划
各组免疫小鼠肿瘤生长情况如图34所示。其中，对照组小鼠在肿瘤接种后第15天全部出现肿瘤，并迅速生长。在小鼠攻瘤后第30天，治疗组小鼠肿瘤平均大小显著小于对照组。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-LMNB-I13能抑制带有MAGE-A3表达的肿瘤生长。
小鼠存活状况的生存曲线结果如图35所示，痘苗病毒载体疫苗rvv-LMNB-I13治疗组小鼠总体生存(OS中位数36天)优于对照组小鼠(OS中位数33天，p<0.05)。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-LMNB-I13能提高患有表达MAGE-A3肿瘤的小鼠生存。
实施例20肿瘤治疗实验2
从苏州大学动物实验中心购买20只6-8周龄的雌性BAL B/c小鼠，并饲养于苏州大学动物实验中心SPF级动物房中。在第0天，所有小鼠皮下接种表达LAGE-1肿瘤抗原的肿瘤细胞CT26-LAGE-1稳定转染细胞系(由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)，接种剂量为1×105细胞/只，然后随机分成2两组。在肿瘤细胞接种后第1天，第14天和第28天给相应小鼠小腿胫骨前肌接种实施例18中制备的痘苗病毒载体(具体疫苗接种规划如表30)。接种后连续观察并测量肿瘤生长情况。按照以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)＝长×宽2/2。当小鼠肿瘤体积超过10000mm3时，对小鼠处死。
表30实验动物分组与疫苗接种规划
各组免疫小鼠肿瘤生长情况如图36所示。在攻瘤后第26天，对照组小鼠肿瘤生长迅速，并显著大于治疗组小鼠，一直持续到第50天。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-LMNB-I13能抑制带有LAGE-1表达的肿瘤生长。
此外，小鼠存活状况的生存曲线结果如图37所示，痘苗病毒载体疫苗rvv-LMNB-I13治疗组小鼠总体生存(OS中位数75天)优于对照组小鼠(OS中位数51天，p<0.05)。结果表明痘苗病毒载体疫苗rvv-LMNB-I13能提高患有表达LAGE-1肿瘤的小鼠生存。
将实施例13-15中蛋白疫苗的免疫效果与实施例19-20中重组痘苗病毒载体的治疗效果相比，蛋白疫苗在预防肿瘤效果显著(参见图27、28、29)，虽然蛋白疫苗在肿瘤治疗上能维持一定的疗效，但不算特别明显，也不能持续(参见图30、31)。而重组痘苗病毒载体在肿瘤治疗上取得了特别显著的效果，不但持续抑制了肿瘤生长，还在总体存活了有明显改善(参见图34-37)，效果显著。

Claims (10)

1.一种重组病毒载体，所述重组病毒载体包含编码肿瘤抗原的多核苷酸，所述肿瘤抗原选自LAGE抗原、MAGE抗原或NY-ESO-1抗原中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其中，所述LAGE抗原为LAGE-1抗原；优选地，所述LAGE-1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；进一步优选地，所述LAGE-1抗原的编码核酸序列如SEQ ID NO:27或38所示；
优选地，所述MAGE抗原为MAGE-A3抗原；更优选地，所述MAGE-A3抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；进一步优选地，所述MAGE抗原的编码核酸序列如SEQ ID NO:28或39所示；
优选地，所述NY-ESO-1抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示；进一步优选地，所述NY-ESO-1抗原的编码核酸序列如SEQ ID NO:29或40所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组病毒载体，其中，所述重组病毒载体还包含霍乱毒素B亚单位多肽；优选地，所述霍乱毒素B亚单位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；进一步优选地，所述霍乱毒素B亚单位多肽的编码核酸序列如SEQ ID NO:31或41所示。
4.根据权利要求1至3任一项所述的重组病毒载体，其中，所述肿瘤抗原包含LAGE-1抗原、MAGE-A3抗原和NY-ESO-1抗原；优选地，所述肿瘤抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:59所示。
5.根据权利要求1至4任一项所述的重组病毒载体，其中，所述肿瘤抗原和霍乱毒素B亚单位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示。
6.根据权利要求1至5任一项所述的重组病毒载体，其中，所述重组病毒是痘苗病毒载体，优选为复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒天坛株，例如752-1株，或者为非复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒减毒疫苗安卡拉株(Modified Vaccinia Ankara，MVA)。
7.一种免疫组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1-6中任一项所述的重组病毒载体，以及药学上可接受的载体。
8.一种肿瘤疫苗，其包含治疗有效量的根据权利要求1-6中任一项所述的重组病毒载体，以及药学上可接受的载体。
9.一种药盒，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的重组病毒载体、根据权利要求7所述的免疫组合物、根据权利要求8所述的肿瘤疫苗以及其使用说明。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的重组病毒载体、根据权利要求7所述的免疫组合物、根据权利要求8所述的肿瘤疫苗在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途；优选地，所述肿瘤为恶性肿瘤；更优选地，所述恶性肿瘤为乳腺癌或结肠癌。
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