CN117987402A - L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体 - Google Patents

L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了L‑天冬氨酸α‑脱羧酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明L‑天冬氨酸α‑脱羧酶突变体BaADC‑I46V‑I88M‑L92R‑I126R的比酶活为54.2U·mg‑1，是野生型的1.6倍。将表达BaADC‑I46V‑I88M‑L92R‑I126R的大肠杆菌全细胞进行L‑天冬氨酸转化，可获得298.2g·L‑1的β‑丙氨酸，L‑天冬氨酸的摩尔转化率为99％；将含有突变体BaADC‑I46V‑I88M‑L92R‑I126R的全细胞进行的DL‑天冬氨酸混合物转化，可获得137.6g·L‑1的β‑丙氨酸，DL‑天冬氨酸混合物中L‑天冬氨酸的摩尔转化率为100％。

Description

L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体
技术领域
本发明涉及L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase，EC 4.1.1.11，ADC)能特异性识别L-天冬氨酸(L-Asp)，并催化L-天冬氨酸脱羧生成β-丙氨酸，是制备β-丙氨酸的核心酶。β-丙氨酸又名3-氨基丙酸，虽然不直接参与蛋白质的合成，却是生物合成含氮化合物的重要中间体，可广泛应用于食品、饲料、化工及医药等领域，具有巨大的应用潜力与广阔的市场前景。
目前，β-丙氨酸的主要生产方法为化学法，虽然生产效率高、生产成本较低，但是该方法存在污染严重、产物有毒、能耗较大、纯化困难，条件苛刻、设备易损等难以解决的问题。因此，绿色环保且条件温和的酶法，成为了当前更有前景的β-丙氨酸制备方法。目前，用于制备β-丙氨酸的L-天冬氨酸α-脱羧酶主要来自枯草芽孢杆菌、杰氏棒杆菌、赤拟谷盗。然而，野生型L-天冬氨酸α-脱羧酶及其突变体普遍存在酶活较低及底物耐受性差的问题，在实际的催化转化过程中，需要较高的加酶量或全细胞浓度才可达到一定的β-丙氨酸产量，且转化时间较长，需要添加辅酶，增大了纯化难度，提高了生产成本。例如，张腾辉等对枯草芽孢杆菌来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶进行E56S位点定向突变，利用OD600＝80的全细胞进行9h转化，最终可获得215.3g·L-1的β-丙氨酸产物；陈虹通过对赤拟谷盗来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶进行R38H及K351S双突变，利用OD600＝80的全细胞进行48h转化，最终获得了170.5g·L-1的β-丙氨酸。因此，寻找新的具有高催化性能的L-天冬氨酸α-脱羧酶，同时利用定点突变技术提高该酶的催化转化性能，对生物法制备β-丙氨酸的工业化应用具有重要意义。
天冬氨酸拥有D-型与L-型两种手性构象，两种构象氨基酸各自的功能和应用差异显著，因此，DL-天冬氨酸(DL-Asp)的手性拆分对医学、保健、食品等领域都具有重要意义。目前较为成熟的氨基酸手性拆分法为化学拆分法，但是该方法收率较低，副产物较多，且光学纯度不高。酶法拆分具有高度立体的专一性，且反应条件温和，但目前DL-天冬氨酸手性拆分用酶仅为L-天冬氨酸β-脱羧酶，产物为高附加值的D-天冬氨酸和附加值较低的L-丙氨酸。未见L-天冬氨酸α-脱羧酶进行酶法拆分联产两种高附加值产品D-天冬氨酸和β-丙氨酸的报道。此外，由于L-天冬氨酸或DL-天冬氨酸都是酸性底物，转化过程中底物的添加会导致反应体系pH降低到5.0以下，随着反应的进行pH回升到7.0附近，整个反应过程pH一直不断振荡，容易导致L-天冬氨酸α-脱羧酶的反应效率降低甚至酶失活。在反应过程中，L-天冬氨酸α-脱羧酶的活性口袋中的识别位点Arg会首先对底物的γ-COOH离子键进行识别与结合，之后原Ser位置上的丙酮酰基会与L-天冬氨酸的氨基相结合，生成一种亚胺类的中间体。在丙酮酰基活性中心周围其它疏水残基的影响下，α-位的羧基会发生分子内的重排，释放出CO2。最后，亚胺类中间体发生水解反应，通过接受Tyr残基提供的质子，重新形成具有催化活性的L-天冬氨酸α-脱羧酶及β-丙氨酸产物。但是，在重新形成丙酮酰基的过程中，存在两种不同的质子化过程，当底物被质子化时，会生成正确的产物并重新形成具有催化活性的丙酮酰基基团；当酶的丙酮基被质子化时，一个氨基就会转移到丙酮基上，从而造成L-天冬氨酸α-脱羧酶的失活。另外，已有的L-天冬氨酸α-脱羧酶普遍酶活较低，底物耐受性不佳，容易失活，导致催化转化性能较差，与实际的工业化生产应用还有较大差距。
因此，寻找一种耐受低pH、并且可以在更宽pH范围具有稳定性的，更高催化能力的新型L-天冬氨酸α-脱羧酶对DL-天冬氨酸酶法拆分的工业化应用具有重要意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体。
技术方案：本发明所述的一种L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，所述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体是通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶中的第46位、88位、92位以及126位氨基酸进行突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体是通过在出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶中的第46位异亮氨酸残基被替换成缬氨酸残基第88位异亮氨酸残基被替换成甲硫氨酸残基，第92位亮氨酸残基被替换成精氨酸残基，并将第126位异亮氨酸残基被替换成精氨酸残基得到的，命名为BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R。
在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬氨酸α-脱羧酶来源于阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)Gel-09。
本发明还提供了编码上述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，编码所述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了携带上述基因的表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体。
在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pET24a(+)载体。
本发明还提供了携带上述基因或上述表达载体的宿主细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)或大肠杆菌JM109。
本发明还提供了上述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的制备方法，所述方法为将上述宿主细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的细胞沉淀物中分离上述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体。
本发明还提供了应用上述方法制备得到的L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体。
本发明还提供了一种制备β-丙氨酸的方法，以所述突变体，或所述宿主细胞为催化剂，以L-天冬氨酸或DL-天冬氨酸为底物进行反应。
在本发明的一种实施方式中，在37℃、200rpm，至少反应12h。
本发明还提供了一种拆分DL-天冬氨酸的方法，以所述突变体，或所述宿主细胞为催化剂，以DL-天冬氨酸为底物进行反应，在37℃、200rpm，至少反应12h。
本发明还提供了所述突变体，或所述基因，或所述表达载体，或所述宿主细胞在制备β-丙氨酸或拆分DL-天冬氨酸方面的应用。
有益效果：
1、本发明L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的比酶活有了明显的提高，利用本发明的方法将携带编码本发明L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的基因的大肠杆菌摇瓶诱导发酵36h，即可使细胞破碎上清中的酶活力达到16.7U·mL-1，是野生型的1.4倍。
2、本发明L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的比酶活为54.2U·mg-1，是野生型的1.6倍。
3、本发明L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的最适pH为5.0，较野生型下降了1.0，pH稳定性范围更宽，在pH3.5-pH8.0均能保持80％以上的活性；而野生型仅能在pH5.0-pH6.0范围内保持80％以上的活性。
4、本发明L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的最适温度为85℃，较野生型提高了10℃；在30-70℃孵育12h，残余酶活保留90％以上。
5、本发明L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体全细胞分批补料，可获得298.2g·L-1的β-丙氨酸，L-天冬氨酸的摩尔转化率为99％。
6、本发明是L-天冬氨酸α-脱羧酶酶法拆分DL-天冬氨酸混合物联产D-天冬氨酸与β-丙氨酸的首次应用，最终β-丙氨酸的产量为137.6g·L-1，是野生型的2.82倍，DL-天冬氨酸混合物中L-Asp的摩尔转化率为100％。
附图说明
图1是本发明中BaADC及其突变体的最适pH及pH稳定性的示意图。
图2是本发明中BaADC及其突变体的最适温度及温度稳定性的示意图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。
下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coli JM109以及大肠杆菌E.coli BL21(DE3)购自北纳生物，pET24a(+)载体购自Novagen公司；(上述菌株大肠杆菌E.coli JM109、大肠杆菌E.coli BL21(DE3)均可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1。
LB固体培养基：酵母粉5.0g·L-1、胰蛋白胨10.0g·L-1、NaCl 10.0g·L-1、琼脂粉15g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1。
TB培养基：甘油5.0g·L-1、胰蛋白胨12.0g·L-1、酵母粉24.0g·L-1、K2HPO4·3H2O16.4g·L-1、KH2PO4 2.3g·L-1、甘氨酸7.5g·L-1、卡那霉素50μg·mL-1。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活的测定方法：
分别吸取500μL底物(所用底物为375mM，pH 6.5的L-天冬氨酸溶液)、1.5mL 10mMpH为6.5的MES缓冲液加入到15mL的具塞试管中，混匀后置于37℃水浴锅中进行预热，10min后加入酶液500μL立即摇匀，37℃准确反应10min，加入100μL NaOH(1mol·L-1)并煮沸10min终止反应，利用高效液相色谱检测方法测定β-丙氨酸产物的生成量并计算酶活。
酶活力(U)定义为：在上述分析测定条件下，每分钟催化产生相当于1μmolβ-丙氨酸的酶量定义为一个活力单位(1U)。
L-天冬氨酸α-脱羧酶比酶活的测定方法：
测定纯化后的L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活(U·mL-1)，并且，采用Bradford法测定纯化后的L-天冬氨酸α-脱羧酶的蛋白含量(mg·mL-1)，以计算L-天冬氨酸α-脱羧酶的比酶活；
其中，L-天冬氨酸α-脱羧酶比酶活的计算公式如下：
L-天冬氨酸α-脱羧酶比酶活(U·mg-1)＝纯化后的L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活(U·mL-1)/纯化后的L-天冬氨酸α-脱羧酶的蛋白含量(mg·mL-1)。(Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.(1976)A rapid and sensitive method for the quantificationof microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding.Analytical Biochemistry,72,248-254.”中)
菌浓度的测定方法：
使用分光光度计检测发酵液的OD600。
实施例1：野生型L-天冬氨酸α-脱羧酶的表达
具体步骤如下：
(1)以提取的B.aryabhattai Gel-09菌株的基因组DNA为模板，利用引物对目标基因panD进行PCR克隆扩增，得到如SEQ ID NO.1所示野生型L-天冬氨酸α-脱羧酶的编码基因panDBa；
(2)将目的基因经过Nde I和Hind III双酶切后与表达载体pET24a(+)连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli JM109，转化产物涂布于含50μg·mL-1卡那霉素的LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入含有50μg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，获得测序正确的重组质粒pET24a(+)-panDBa；
(3)将测序正确的重组质粒pET24a(+)-panDBa热激转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，于含50μg·mL-1卡那霉素的LB固体培养基上于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基中于37℃培养8-10h，得到种子液；
(4)将种子液按5％接种量接入TB培养基中于37℃培养至OD600为0.6，再用15g·L-1的乳糖于30℃继续摇瓶诱导培养36h，得到含有野生型L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液，命名为发酵液BaADC。
实施例2：L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的制备及表达
具体步骤如下：
(1)利用质粒PCR定点突变技术，以实施例1获得的重组质粒pET24a(+)-panDBa为模板进行定点突变，获得突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R；
突变体BaADC-I46V是通过在野生型L-天冬氨酸α-脱羧酶(SEQ ID No.1)的第46位异亮氨酸残基被替换成缬氨酸残基；突变体BaADC-I46V-I88M是在突变体BaADC-I46V基础上，将第88位异亮氨酸残基被替换成甲硫氨酸残基；突变体BaADC-I46V-I88M-L92R是在突变体BaADC-I46V-I88M基础上，将第92位亮氨酸残基被替换成精氨酸残基；突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R是在突变体BaADC-I46V-I88M-L92R基础上，将第126位异亮氨酸残基被替换成精氨酸残基得到的，所用引物如下：
panDBa-I46V-F：
5’-CGAAAAAGTCCAAGTTGTAAACAATAATAACGGAGCTCGC-3’；
panDBa-I46V-R：
5’-GTTATTATTGTTTACAACTTGGACTTTTTCGTTTGCTGCA-3’；
panDBa-I88M-F：
5’-CGTCATCATTATGTCTTATGCGCTCGTAGCAAATG-3’；
panDBa-I88M-R：
5’-AGCGCATAAGACATAATGATGACGATATCTCCAGGCT-3’；
panDBa-L92R-F：
5’-CTCTTATGCGCGCGTAGCAAATGAAGAAGTAGCTCAC-3’；
panDBa-L92R-R：
5’-CTTCATTTGCTACGCGCGCATAAGAGATAATGATGACG-3’；
panDBa-I126R-F：
5’-CAGCTGGTACACGTCTATAAGAGCTCCGTCGACAAG-3’；
panDBa-I126R-R：
5’-GGAGCTCTTATAGACGTGTACCAGCTGGTTCTTGTTT-3’。
PCR反应体系为：5×PS buffer 2μL，dNTP 0.8μL，正向引物(10μM)0.2μL，反向引物(10μM)0.2μL，模板DNA 0.1μL，HSDNA聚合酶(5U·μL-1)0.1μL，加入双蒸水至6.6μL；
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行30个循环(94℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s)；72℃继续延伸20min。
(2)PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向10μL扩增产物中加入0.5μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1.5h，将DpnI处理后的扩增产物转化大肠杆菌E.coli JM109，转化产物涂布于含50μg·mL-1卡那霉素的LB固体培养基，于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入含有50μg·mL-1卡那霉素的LB液体培养基培养，于37℃培养10h后提取质粒，将突变质粒进行序列测定，获得测序正确的含有编码突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R酶蛋白编码基因的重组质粒pET24a(+)-panDBa-I46V、pET24a(+)-panDBa-I46V-I88M、pET24a(+)-panDBa-I46V-I88M-L92R、pET24a
(+)-panDBa-I46V-I88M-L92R-I126R。
(3)将测序正确的含有编码突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的基因的重组质粒pET24a(+)-panDBa-I46V-I88M-L92R-I126R热激转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，于含50μg·mL-1卡那霉素的LB固体培养基上于37℃培养8h，在LB固体培养基上挑取转化子，接入LB液体培养基中于37℃培养8-10h，得到种子液；
(4)将种子液按5％接种量接入TB培养基中于37℃培养至OD600为0.6，再用15g·L-1的乳糖于30℃继续摇瓶诱导培养36h，得到含有突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R酶的发酵液。
实施例3：BaADC及其突变体酶活力的检测
具体步骤如下：
1、样品处理
将实施例1获得的发酵液BaADC(菌浓OD600＝15)以及实施例2获得的发酵液BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R(菌浓OD600＝15)分别于4℃、10000g离心10min，收集细胞沉淀；将沉淀用磷酸盐缓冲液重悬至OD600＝15，置于冰上进行超声破碎，功率采用130KW，超声5s，间歇5s，共10min，获得细胞破碎液；10000g离心10min，收集细胞破碎上清液；
2、样品检测
检测上述步骤中细胞破碎上清液中的L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活，检测结果如下：
发酵液BaADC中细胞破碎上清液的酶活力为12.3U·mL-1；
发酵液BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R中细胞破碎上清液的酶活力分别为13.7、13.9、14.3、16.7U·mL-1，分别是野生型BaADC的1.11、1.13、1.16和1.36倍。
可见，L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的酶活力较野生型均有一定程度的提升。
实施例4：BaADC及其突变体酶的分离纯化与性质表征
1、酶的分离纯化
具体步骤如下：
将实施例1获得的发酵液BaADC以及实施例2获得的发酵液BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R、分别于4℃、10000g离心10min，收集细胞沉淀；将沉淀用等体积的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上进行超声破碎，功率采用130KW，超声5s，间歇5s，共10min，获得细胞破碎液，10000g离心20min，收集细胞破碎上清液；往细胞破碎上清液中缓慢加入40％的(NH4)2SO4，于4℃放置盐析8-12h，得到盐析液；将盐析液于4℃、10000g离心20min，收集沉淀；将沉淀用50mmol·L-1pH为6.8的磷酸缓冲液复溶后，在50mmol·L-1pH为6.8的磷酸缓冲液中透析8-12h，期间更换2-3次透析缓冲液，得到透析液；将透析液通过0.22μm膜过滤，制成上样样品；采用AKTA蛋白纯化仪对上样样品进行纯化，得到纯化后的野生型L-天冬氨酸α-脱羧酶BaADC以及突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R。
其中，整个纯化过程在层析柜中进行，控制温度为4℃，阴离子交换色谱纯化步骤包括：(1)平衡：用5倍体积的50mmol·L-1磷酸缓冲液平衡DEAE阴离子交换色谱柱；(2)上样：预先处理好的样品以1mL·min-1的流速上样；(3)洗脱，流速1.0mL·min-1，进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分部收集含L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活的洗脱液。
2、不同L-天冬氨酸α-脱羧酶比酶活的检测
具体步骤如下：
对步骤1获得的野生型BaADC和突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R进行比酶活的检测，检测结果为：野生型BaADC的比酶活为33.9U·mg-1，突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的比酶活分别为38.9、40.7、46.44、54.2U·mg-1，是野生型的1.15、1.20、1.37和1.60倍，可见，突变体的比酶活较野生型BaADC有了一定程度的提升。
3、L-天冬氨酸α-脱羧酶及其突变体最适pH和pH稳定性的检测
具体步骤如下：
在实施例2和实例3的基础上，将发酵生产的野生型BaADC和L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R以L-天冬氨酸为底物，在50℃、pH 4.5-8.5条件下，检测L-天冬氨酸α-脱羧酶BaADC突变体的活力，以确定突变体的最适pH，测定的最高酶活力定为100％，计算其他pH条件下的相对酶活；将酶液分别在pH 3.5-8.0的缓冲体系下于4℃保存6h，测定其残余酶活，定义初始酶活力为100％；检测结果显示，突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的最适pH分别为6.0、6.0、5.5和5.0，其中BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R较野生型下降了1.0。此外，BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R的作用pH范围与野生型相当；突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的作用pH范围相比于野生型的更宽。突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在pH3.5-pH8.0能保持80％以上的活性；而野生型仅能在pH5.0-pH6.0范围内保持80％以上的活性。突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在酸性及弱碱性的条件下仍然能保持较高的L-天冬氨酸α-脱羧酶的催化活力。由于L-天冬氨酸或DL-天冬氨酸都是酸性底物，转化过程中底物的添加会导致反应体系pH降低到5.0以下，随着反应的进行pH回升到7.0附近。突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R有更低的最适pH以及更宽的pH作用范围，有利于在转化过程中维持较高的活性以及稳定性，进而有利于转化的进行。
4、L-天冬氨酸α-脱羧酶及其突变体最适温度和热稳定性的检测
具体步骤如下：
在实施例2和实施例3的基础上，将发酵生产的野生型BaADC和突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在不同的温度条件(37-95℃)下，测定L-天冬氨酸α-脱羧酶酶活力，以确定L-天冬氨酸α-脱羧酶的最适温度。以测得的最高酶活力定义为100％，计算其他温度条件下的相对酶活。在其他条件相同的情况下，将L-天冬氨酸α-脱羧酶分别在不同温度条件(30-85℃)下孵育12h，孵育结束后，取样测定其酶活力，定义初始酶活力为100％。检测结果如图2a和图2b。
结果表明，野生型的最适温度为75℃，而突变体BaADC-I46V、BaADC-I46V-I88M、BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R的最适温度分别为75、75、80、85℃，BaADC-I46V-I88M-L92R、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R较野生型分别提高了5和10℃(部分数据参见图2a)；由图2b可知，野生型BaADC在60℃以下孵育12h，能保持90％以上的酶活；最适温度最高的突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在70℃以下孵育12h，能保持94％以上的酶活，热稳定性较野生型有了较大程度的提高。突变体最适温度及热稳定性的提高，意味着酶结构更加稳定，能够耐受物理、化学等不利因素的影响，有利于在发酵及转化过程中保持酶蛋白结构的完整，进而保持活性、不易失活。
实施例5：BaADC及其突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R全细胞转化L-天冬氨酸制备β-丙氨酸的应用
具体步骤如下：
在实施例2和实施例3的基础上，以离心获得的野生型及稳定性最佳的突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R全细胞作为催化剂，在含有40mL反应混合物的250mL锥形烧瓶中进行全细胞催化反应。反应混合物由全细胞催化剂(全细胞终浓度20～80g/L湿重)、30g/L L-天冬氨酸和初始pH为5.0的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液组成。整个细胞催化反应的温度及转速控制在37℃、200rpm。在转化过程中，每隔1h，测定反应体系的pH，同时取样150μL，用于检测底物与产物的含量，并向反应体系补加终浓度30g/L L-天冬氨酸底物。当1小时内，体系pH变化在1.0以内时，即刻停止补料。当震荡转化达到12h，结束全细胞分批补料转化。
当全细胞催化剂终浓度为20g/L湿重，进行转化时。结果显示，野生型BaADC在分批补料全细胞转化12h时，可转化150g·L-1L-天冬氨酸，得到90.4g·L-1β-丙氨酸，转化率为90％。突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在分批补料全细胞转化12h时，转化210g·L-1L-天冬氨酸，β-丙氨酸产量为129.3g·L-1，底物的摩尔转化率为92％。BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R突变体的β-丙氨酸产量较野生型提高了43.03％，全细胞转化能力相较野生型有了进一步的提高。
当全细胞催化剂终浓度为40g/L进行转化L-天冬氨酸时。结果显示，野生型BaADC在分批补料全细胞转化12h时，可转化210g·L-1L-天冬氨酸，得到129.3g·L-1β-丙氨酸，转化率为92％。突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在分批补料全细胞转化12h时，转化300g·L-1L-天冬氨酸，β-丙氨酸产量为198.4g·L-1，底物的摩尔转化率为98.8％，BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R突变体的β-丙氨酸产量较野生型提高了53.44％。
当全细胞催化剂终浓度为60g/L进行转化L-天冬氨酸时。结果显示，野生型BaADC在分批补料全细胞转化12h时，可转化270g·L-1L-天冬氨酸，得到169.9g·L-1β-丙氨酸，转化率为94％。突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在分批补料全细胞转化12h时，转化390g·L-1L-天冬氨酸，β-丙氨酸产量为258.4g·L-1，底物的摩尔转化率为99％，BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R突变体的β-丙氨酸产量较野生型提高了52.09％
当全细胞催化剂终浓度为80g/L进行转化L-天冬氨酸时。结果显示，野生型BaADC在分批补料全细胞转化12h时，可转化330g·L-1L-天冬氨酸，得到209.8g·L-1β-丙氨酸，转化率为95％。突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在分批补料全细胞转化12h时，转化450g·L-1L-天冬氨酸，β-丙氨酸产量为298.2g·L-1，底物的摩尔转化率为99％，BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R突变体的β-丙氨酸产量较野生型提高了42.13％
实施例6：野生型BaADC与突变体全细胞转化拆分L-天冬氨酸联产D-天冬氨酸与β-丙氨酸的应用
1、野生型BaADC全细胞转化
具体步骤如下：
在实施例2和实施例3的基础上，以离心获得的野生型全细胞作为催化剂，在含有40mL反应混合物的250mL锥形烧瓶中进行12h的全细胞分批补料催化反应。反应混合物由全细胞催化剂(全细胞终浓度20g/L)、DL-天冬氨酸和初始pH为5.0的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液组成。整个细胞催化反应的温度及转速控制在37℃、200rpm。底物DL-天冬氨酸的初始浓度为30g·L-1。在转化过程中，每隔1h，测定反应体系的pH，同时取样150μL，并向反应体系补加终浓度15-30g/L底物DL-天冬氨酸。当1小时内，体系pH变化在1.0以内时，即刻停止补料。当震荡转化达到12h，结束全细胞分批补料转化。
结果显示，在全细胞转化过程中，野生型BaADC从第5h开始便出现明显的失活现象。全细胞转化结束时，DL-天冬氨酸加入的总浓度为120g·L-1(901.55mmol·L-1)，得到β-丙氨酸的产量为25.49g·L-1(286.11mmol·L-1)，L-天冬氨酸的摩尔转化率为63％。
2、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R突变体全细胞转化
具体步骤如下：
在实施例2和实施例3的基础上，以离心获得的突变体全细胞作为催化剂，在含有40mL反应混合物的250mL锥形烧瓶中进行12h的全细胞分批补料催化反应。反应混合物由全细胞催化剂(全细胞添加量为终浓度20g/L湿细胞)、DL-天冬氨酸和初始pH为5.0的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液组成。整个细胞催化反应的温度及转速控制在37℃、200rpm。底物DL-天冬氨酸的初始浓度为30g·L-1。在转化过程中，每隔1h，测定反应体系的pH，同时取样150μL，并向反应体系补加15-30g/L底物DL-天冬氨酸。当1小时内，体系pH变化在1.0以内时，即刻停止补料。当震荡转化达到12h，结束全细胞分批补料转化。
结果显示，在全细胞转化过程中，BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R突变体始终保持较高的催化活性，DL-天冬氨酸混合物中的L-天冬氨酸的转化率始终为100％。全细胞转化结束时，DL-天冬氨酸加入的总浓度为215g·L-1(1615.28mmol·L-1)，得到β-丙氨酸的产量为71.96g·L-1(807.64mmol·L-1)，L-天冬氨酸的摩尔转化率为100％。
3、BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R突变体全细胞转化
参照上述步骤，改变全细胞催化剂添加量，结果如下：
当全细胞催化剂添加量为40g/L湿细胞进行转化DL-天冬氨酸时。结果显示，突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在分批补料全细胞转化12h时，β-丙氨酸产量为93.5g·L-1，底物中L-天冬氨酸的摩尔转化率为100％。
当全细胞催化剂添加量为60g/L湿细胞进行转化DL-天冬氨酸时。结果显示，突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在分批补料全细胞转化12h时，β-丙氨酸产量为110.2g·L-1，底物中L-天冬氨酸的摩尔转化率为100％。
当全细胞催化剂添加量为终浓度80g/L湿细胞进行转化DL-天冬氨酸时。结果显示，突变体BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R在分批补料全细胞转化12h时，β-丙氨酸产量为137.6g·L-1，底物中L-天冬氨酸的摩尔转化率为100％。
对比例1：
具体实施方式参考实施例6，区别在于，以野生型BaADC代替BaADC-I46V-I88M-L92R-I126R突变体，检测不同浓度DL-天冬氨酸为底物转化制备β-丙氨酸的效率，结果表明，当野生型BaADC全细胞催化剂添加量为终浓度20g/L、40g/L、60g/L和80g/L湿细胞时，在分批补料转化12h时，β-丙氨酸产量分别为62.6g·L-1，65.3g·L-1，71.5g·L-1和78.4g·L-1。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，其特征在于，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶的第46位异亮氨酸突变为缬氨酸，第88位异亮氨酸突变为甲硫氨酸，第92位亮氨酸残基被替换成精氨酸，并且第126位异亮氨酸残基被替换成精氨酸。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体，其特征在于，所述载体包括pET载体、pGEX载体和pPICZ载体。
4.携带权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体的重组微生物细胞。
5.如权利要求4所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞为细菌或真菌。
6.一种制备β-丙氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述突变体，或权利要求4或5所述重组微生物细胞为催化剂，以L-天冬氨酸为底物进行反应。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述反应的体系包括权利要求4或5所述重组微生物细胞、L-天冬氨酸和磷酸缓冲液；所述体系中，所述重组微生物细胞的终浓度为20～80g/L。
8.一种拆分DL-天冬氨酸的方法，其特征在于，以权利要求1所述突变体，或权利要求4或5所述重组微生物细胞为催化剂，以DL-天冬氨酸为底物进行反应，在37℃、200rpm，至少反应12h。
9.如权利要求8所述方法，其特征在于，所述反应的体系包括权利要求4或5所述重组微生物细胞、DL-天冬氨酸和磷酸缓冲液；所述体系中，所述重组微生物细胞的终浓度为20～80g/L。
10.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3所述表达载体，或权利要求4或5所述重组微生物细胞在制备β-丙氨酸或拆分DL-天冬氨酸方面的应用。
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