CN117986625A - 一种促凝血高粘附水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种促凝血高粘附水凝胶及其制备方法和应用，包括将多巴胺‑多肽‑叠氮‑氧化透明质酸(PD‑OHA‑azide)和多巴胺‑多肽‑炔‑氧化透明质酸(PD‑OHA‑alkyne)在室温下溶于含有催化剂的去离子水中，在室温下静置交联得的水凝胶。本申请的水凝胶通过叠氮‑炔的点击反应得到，温和条件下具有较高收率和选择性，该水凝胶不仅且具有优异的粘附性、止血效果和力学性能，并具有可生物降解性和高生物相容性，能够在封闭出血伤口医学领域具有较大的应用。
Description
技术领域
本申请涉及高分子材料制备领域，具体涉及一种促凝血高粘附水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
水凝胶作为一种亲水性聚合物构成的三维网状高分子材料，能够在水中吸收大量水分发生溶胀而不溶解。由于其独特的柔软性、吸湿性、高生物相容性，常用于伤口敷料，药物缓释，医疗美容等领域。目前，随着水凝胶的发展，为了拓宽水凝胶的使用范围，其与各种基体的粘附性也受到广泛关注。
“一种负载富血小板血浆的缓释水凝胶及其制备方法与应用”(公开号：CN117159452A)中，制备出巯基修饰的透明质酸，再融合富含血小板血浆和钙离子活化的凝血酶，通过钙离子与巯基形成金属配位，凝血酶本身又可以促进富血小板血浆中的纤维蛋白原形成更为稳定的双网络结构。但其对组织的粘附性较低，止血效果较慢。“一种可吸收生物止血材料及其制备方法”(公开号：CN109589446A)中，制备了鱼胶原蛋白溶液，并向其中加入海藻酸钠、透明质酸钠、壳聚糖、凝血酶、保护剂以及增塑剂，制备出止血凝胶。但该材料只有止血成分可以被人体吸收，保护剂以及增塑剂无法回收利用，对生物体有较大的危害。
发明内容
针对现有的医用水凝胶技术的不足，本申请提供具有优异止血效果、高粘附性、高生物相容性、可降解吸收或代谢的医用水凝胶。本申请先通过多巴胺和多肽修饰氧化透明质酸(多巴胺-多肽-氧化透明质酸)，再分别将叠氮基和炔基引入到多巴胺-多肽-氧化透明质酸上，得到多肽-多巴胺-叠氮-氧化透明质酸(PD-OHA-azide)和多肽-多巴胺-炔-氧化透明质酸(PD-OHA-alkyne)；将PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne按一定比例溶于含有催化剂的去离子水中，室温下静置交联，得水凝胶。
该水凝胶由于多巴胺的存在，对各种基体特别是生物组织有很高的粘附性。同时，本申请通过叠氮-炔的点击反应来制备水凝胶，在温和的条件下就可以实现交联。同时，侧链上的多肽可以结合血液中的凝血酶，通过将凝血酶富集、激活凝血因子，从而实现快速止血。该水凝胶生物相容性高、可生物降解吸收或代谢，因此在粘合伤口、封闭出血方面有高的价值。
本申请的第一方面，分别提供多巴胺-多肽-叠氮-氧化透明质酸(PD-OHA-azide)和多肽-多巴胺-炔-氧化透明质酸(PD-OHA-alkyne)，其分子结构示意图分别如下所示：
本申请的第二方面，提供上述PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne的制备方法，所述制备方法包括：在室温(20～25℃)下，将氧化透明质酸溶解在去离子水中，然后加入多巴胺和多肽，反应8～12h后，得到多巴胺-多肽-氧化透明质酸；
向多巴胺-多肽-氧化透明质酸溶液中加入6-叠氮基己胺，室温下反应12～16h，透析后冷冻干燥得到PD-OHA-azide；
向多巴胺-多肽-氧化透明质酸溶液中加入3-氨基丙炔，室温下反应12～16h，透析后冷冻干燥得到PD-OHA-alkyne。
PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne制备过程如下图所示：
氧化透明质酸的结构式如下图：
优选的，氧化透明质酸的分子量10万～20万g/mol，氧化度为30％～40％(醛基含量为0.75mmol/g～1.0mmol/g)，其制备方法按照文献(Buffa R，et al.α，β-Unsaturatedaldehyde of hyaluronan—Synthesis,analysis and applications[J].CarbohydratePolymers,2015,134:293-299)所述，并以全文的方式引入本申请中，制备方法如下：
将1.0g透明质酸钠溶解在100mL含有5等量磷酸氢钠的去矿化水中。加入催化剂2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO，0.01eq.)，短暂搅拌，在5℃下加入0.5等量次氯酸钠。反应混合物在此温度下搅拌2小时后，透析并冷冻干燥。
优选的，氧化透明质酸在去离子水中的浓度为0.02～0.05g/mL；
优选的，所述多巴胺的加入量为氧化透明质酸中醛基摩尔量的10％～20％；
优选的，所述多肽为(N-对甲苯磺酰基)-甘氨酸-脯氨酸-赖氨酸-4-硝基苯胺，所述(N-对甲苯磺酰基)-甘氨酸-脯氨酸-赖氨酸-4-硝基苯胺的化学结构如下，其加入量为氧化透明质酸中醛基摩尔量的10％～20％；
优选的，6-叠氮基己胺和3-氨基丙炔的加入摩尔量均为多巴胺-多肽-氧化透明质酸体系中醛基摩尔量的1.1～1.2倍，即(醛基摩尔量-多巴胺摩尔量-多肽摩尔量)×(1.1～1.2)；
优选的，透析膜分子量截止值为10000g/mol，透析时间为3天，每12小时换水一次。
本申请的第三方面，提供一种促凝血高粘附的水凝胶，水凝胶结构示意图如下：
本申请的第四方面，促凝血高粘附的水凝胶的制备方法包括：将上述制备的PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne在室温(20～25℃)下溶于含有催化剂的去离子水中，静置交联得到水凝胶(G)。
PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne的投料比为PD-OHA-azide的叠氮基和PD-OHA-alkyne的炔基摩尔比为1:1；
优选的，PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne在水中的总浓度为0.03～0.05g/mL；
优选的，催化剂为五水硫酸铜与抗坏血酸钠的混合物、氯化亚铜(CuCl)或五甲基环戊二烯氯化钌(Cp*RuCl)，进一步优选氯化亚铜(CuCl)；
优选的，催化剂在水中的浓度均为0.2～0.5mg/mL；
优选的，静置时间为3～6小时。
在一些实施例中制备的水凝胶样品粘附力为8.8～27.7KPa，能较好的粘附人体组织；压缩强度为218.9～320.8KPa，能有效抵抗外力作用；而且水凝胶具有优良的凝血效果，凝血时间为28～45s；具有良好的生物相容性，细胞存增殖率均在90％以上，为I或0级，具有优异的细胞相容性；具有较好的生物降解性，降解7天后所有样品的失重率都在90％以上。本申请的水凝胶可以用于医学领域或医疗设备。
本申请的一个或多个实施例有以下有益效果：
(1)本申请的水凝胶，制备方法简单、条件温和，实用性强，易于推广。
(2)本申请的水凝胶通过叠氮-炔点击反应得到，反应具有高选择性、高收率、无副反应的特点，并且对其他基团具有较好的惰性，通过与多肽之间的协同作用，保证了接枝的多肽链段对凝血酶的富集能力。
(3)本申请的水凝胶含有特殊的多肽结构((N-对甲苯磺酰基)-甘氨酸-脯氨酸-赖氨酸-4-硝基苯胺)，与多巴胺、叠氮-炔反应协同作用可以结合血液中的凝血酶，从而富集凝血酶、激活凝血因子，起到快速止血的功能。
(4)本申请的水凝胶含有儿茶酚单元，具有类似贻贝粘蛋白的结构，因此具有很高的粘附性，不仅可以用于普通的人体伤口、组织粘附等医用领域，还可以用于潮湿环境下对伤口和组织的粘合。
(5)该水凝胶的主要原料为氧化透明质酸、多巴胺、多肽，均具有高生物相容性，并且可降解被组织吸收或代谢，因此本申请的水凝胶具有较高的生物相容性和可生物降解性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1为本申请实施例中水凝胶G-I'、G-Ⅱ、G-Ⅲ体外降解失重图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
在本申请中，除非特别指出，所用术语具有本领域技术人员公知的一般含义。
实施例1：
室温下(20～25℃)，将3.0g氧化透明质酸(Mn＝12万g/mol,氧化度＝30％)溶解在100mL去离子水中，搅拌均匀后，加入0.036g多巴胺和0.14g多肽混合物，搅拌下反应10h，加入0.28g 6-叠氮基己胺，室温下反应16h，透析3天(透析膜分子量截止值为10000g/mol，每12h换水一次)，冷冻干燥得到PD-OHA-azide(PD-OHA-azide-I)。
在室温下，将3.0g氧化透明质酸(Mn＝12万g/mol,氧化度＝30％)溶解在100mL去离子水中，搅拌均匀后，加入0.036g多巴胺和0.14g多肽混合物，搅拌下反应10h，加入0.13g3-氨基丙炔，室温下反应12h，透析后3天(透析膜分子量截止值为10000g/mol，每12h换水一次)，冷冻干燥得到PD-OHA-alkyne(PD-OHA-alkyne-I)。
在室温下，将上述制备的0.5g PD-OHA-azide-I和0.48g PD-OHA-alkyne-I溶于含有0.01g CuCl的50mL的去离子水中，静置交联得到水凝胶G-I。
在室温下，将上述制备的1.02g PD-OHA-azide-I和0.98g PD-OHA-alkyne-I溶于含有0.01g CuCl的50mL去离子水中，静置交联得到水凝胶G-I'。
室温下，将上述制备的1.28g PD-OHA-azide-I和1.22g PD-OHA-alkyne-I溶于含有0.01g CuCl的50mL去离子水中，静置交联得到水凝胶G-I”。
实施例2：
室温下(20～25℃)，将4.0g氧化透明质酸(Mn＝15万g/mol,氧化度＝40％)溶解在100mL去离子水中，搅拌均匀后，加入0.06g多巴胺和0.24g多肽混合物，搅拌下反应10h，加入0.48g 6-叠氮基己胺，室温下反应16h，透析3天(透析膜分子量截止值为10000g/mol，每12h换水一次)，冷冻干燥得到PD-OHA-azide(PD-OHA-azide-Ⅱ)。
在室温下，将4.0g氧化透明质酸(Mn＝15万g/mol,氧化度＝40％)溶解在100mL去离子水中，搅拌均匀后，加入0.06g多巴胺和0.24g多肽混合物，搅拌下反应10h，加入0.23g3-氨基丙炔，室温下反应12h，透析后3天(透析膜分子量截止值为10000g/mol，每12h换水一次)，冷冻干燥得到PD-OHA-alkyne(PD-OHA-alkyne-Ⅱ)。
在室温下，将上述制备的1.03g PD-OHA-azide-Ⅱ和0.97g PD-OHA-alkyne-Ⅱ溶于含有0.02g CuCl的50mL去离子水中，静置交联得到水凝胶G-Ⅱ。
实施例3：
室温下(20～25℃)，将5.0g氧化透明质酸(Mn＝20万g/mol,氧化度＝40％)溶解在100mL去离子水中，搅拌均匀后，搅拌均匀后，加入0.16g多巴胺和0.3g多肽混合物，搅拌下反应10h，加入0.52g 6-叠氮基己胺，室温下反应16h，透析3天(透析膜分子量截止值为10000g/mol，每12h换水一次)，冷冻干燥得到PD-OHA-azide(PD-OHA-azide-Ⅲ)。
在室温下，将5.0g氧化透明质酸(Mn＝20万g/mol,氧化度＝40％)溶解在100mL去离子水中，搅拌均匀后，加入0.16g多巴胺和0.3g多肽混合物，搅拌下反应10h，加入0.25g3-氨基丙炔，室温下反应12h，透析后3天(透析膜分子量截止值为10000g/mol，每12h换水一次)，冷冻干燥得到PD-OHA-alkyne(PD-OHA-alkyne-Ⅲ)。
在室温下，将上述制备的1.03g PD-OHA-azide-Ⅲ和0.97g PD-OHA-alkyne-Ⅲ溶于含有0.025g CuCl的50mL去离子水中，静置交联得到水凝胶G-Ⅲ。
实施例4：
室温下(20～25℃)，将6.0g氧化透明质酸(Mn＝20万g/mol,氧化度＝40％)溶解在100mL去离子水中，搅拌均匀后，搅拌均匀后，加入0.19g多巴胺和0.73g多肽混合物，搅拌下反应10h，加入0.54g 6-叠氮基己胺，室温下反应16h，透析3天(透析膜分子量截止值为10000g/mol，每12h换水一次)，冷冻干燥得到PD-OHA-azide(PD-OHA-azide-Ⅳ)。
在室温下，将6.0g氧化透明质酸(Mn＝20万g/mol,氧化度＝40％)溶解在100mL去离子水中，搅拌均匀后，搅拌均匀后，加入0.19g多巴胺和0.73g多肽混合物，搅拌下反应10h，加入0.26-g 3-氨基丙炔，室温下反应16h，透析3天(透析膜分子量截止值为10000g/mol，每12h换水一次)，冷冻干燥得到PD-OHA-alkyne(PD-OHA-alkyne-Ⅳ)。
在室温下，将上述制备的1.02g PD-OHA-azide-Ⅳ和0.98g PD-OHA-alkyne-Ⅳ溶于含有0.01g CuCl的50mL去离子水中，静置交联得到水凝胶G-Ⅳ。
对比例1：
按实施例4所述的方法，仅加入0.73g多肽，制备出不含多巴胺的水凝胶(G-Ⅴ)，其他步骤与实施例4的步骤相同。
对比例2：
按实施例4所述的方法，仅加入0.19g多巴胺，制备出不含多肽的水凝胶(G-Ⅵ)，其他步骤与实施例4的步骤相同。
对比例3：
按实施例4所述的方法，制备出不含叠氮的样品(G-Ⅶ)，其他步骤与实施例4的步骤相同。
对比例4：
按实施例4所述的方法，制备出不含炔的样品(G-Ⅷ)，其他步骤与实施例4的步骤相同。
分析与说明：以下分析方法用于所有实施例，除非另外说明。
粘附性测试：用制备的水凝胶涂敷在猪皮表面，用紫外光照射使水凝胶固化。固定住猪皮，用万能拉力机以50mm/min的速度对猪皮表面的水凝胶施加拉力，直到将其分开，记录最大应力值以及水凝胶涂层与猪皮的接触面积，水凝胶粘附力由最大应力与接触面积之比得出；
压缩性能测试：水凝胶的压缩模量通过质构仪测试。测试前将制备的水凝胶切为尺寸相同的圆片(厚10mm，直径8mm)，以100％应变对样品进行压缩测试；压缩速率为2mm/min；
体外全血凝结测试：将水凝胶加入离心管中在37℃下保持5min，随后将1mL新鲜兔全血和80μL 0.25M的CaCl2依次加入离心管中混合均匀，每隔5s将离心管倒置观察血液流动情况，待血液完全凝固记录凝血时间；
细胞毒测试：将人脐静脉内皮细胞接种于96孔板上，每孔密度约为5000个细胞。培养24h后，将细胞与灭菌后的水凝胶样品共培养24h，然后取出水凝胶样品，吸走培养液。CCK试剂与培养液按1:9的比例混合。每孔中加入10μL的混合液，37℃孵育24h。采用酶标仪测定450nm波长下的吸光度，以测定细胞增殖率，并根据国标GB/T16886.5-2017的标准将其细胞毒性分级；
降解性测试：取一定质量的水凝胶，记录其质量为M0，放入50mL PBS溶液中(pH＝7.4)，加入胰蛋白酶(酶的浓度为0.1mg/mL)，每隔一天取出水凝胶，用去离子水冲洗，冷冻干燥，测量其重量记为Mt，直至水凝胶消失，即为降解完全。降解失重率(％)计算方式如下：
表1实施例中水凝胶样品的各项性能
如表1中G-Ⅴ、G-Ⅵ、G-Ⅶ、G-Ⅷ中所示，由于G-Ⅴ中不含多肽，所以相比于其它样品，凝血能力最弱，凝血时间最长，为189s；而G-Ⅵ中不含多巴胺，相比于其他样品，粘附力最小，为2.3KPa；由于G-Ⅶ中不含叠氮基，G-Ⅷ中不含炔基，故样品无法交联形成水凝胶。
如表1中G-Ⅰ、G-Ⅰ'、G-Ⅰ"所示，随着固含量的增加，水凝胶中可以交联的基团以及多巴胺也越多，水凝胶的力学性能以及粘附力也越高；当固含量为1.96％时(G-Ⅰ)，水凝胶的粘附力最低，为8.8KPa，压缩强度也最低，为218.9KPa；当固含量为5％时(G-Ⅰ")，水凝胶的粘附力最高，为10.2KPa，压缩强度也最高，为283.1KPa。
如表1所示，当水凝胶固含量一定时(G-Ⅰ'、G-Ⅱ、G-Ⅲ、G-Ⅳ)，多巴胺含量越高，水凝胶的粘附性越强，当多巴胺含量最低(G-Ⅰ')时，水凝胶粘附强度为9.4KPa；不含多巴胺的样品(G-Ⅵ)，粘附强度仅为2.3KPa；多巴胺含量最高时(G-Ⅲ和G-Ⅳ)，水凝胶粘附强度可以达到27KPa以上；这表明多巴胺的引入大大提高了凝胶的粘附能力。G-Ⅱ拥有最高的压缩强度(320.8KPa)，G-Ⅳ拥有最低的压缩强度(243.39KPa)，说明当固含量一定时，随着水凝胶交联度的增加，水凝胶强度升高。。
如表1中G-Ⅰ'，G-Ⅱ，G-Ⅲ，G-Ⅳ所示，当固含量一定时，多肽的含量越高，水凝胶的凝血效果越强，当多肽的含量最低时(G-Ⅰ')时，凝血时间最长，为45s；当多肽含量最高(G-Ⅳ)时，凝血时间最短，为28s。
如表1所示，各组水凝胶的细胞增殖率无明显差异，且都超过了90％，表明该产品具有较好的细胞相容性。
如图1所示，在固含量相同的情况下，由于G-I'具有更低的交联度，降解速率更快，而G-Ⅱ的交联度较高，降解速率较慢，但降解7天后所有样品的失重率都在90％以上，表明该产品具有较好的降解性能。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种促凝血高粘附的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶具有下式结构：
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的制备方法包括：
将PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne在室温溶于含有催化剂的去离子水中，静置交联得到水凝胶；其中，所述PD-OHA-azide的结构式如下：
PD-OHA-alkyne的结构式如下：
3.根据权利要求2所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的制备方法进一步包括：
所述PD-OHA-azide和所述PD-OHA-alkyne的投料比为PD-OHA-azide的叠氮基和PD-OHA-alkyne的炔基摩尔比为1:1；
优选的，PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne在水中的总浓度为0.03～0.05g/mL；
优选的，催化剂为五水硫酸铜与抗坏血酸钠的混合物、氯化亚铜或五甲基环戊二烯氯化钌，进一步优选氯化亚铜；
优选的，催化剂在水中的浓度均为0.2～0.5mg/mL；
优选的，静置时间为3～6小时。
4.根据权利要求2所述的水凝胶，其特征在于，所述PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne的制备方法包括：
在室温下，将氧化透明质酸溶解在去离子水中，然后加入多巴胺和多肽混合物，反应8～12h，得多巴胺-多肽-氧化透明质酸；
向多巴胺-多肽-氧化透明质酸溶液中加入6-叠氮基己胺，室温下反应12～16h，透析后冷冻干燥得到PD-OHA-azide；
向多巴胺-多肽-氧化透明质酸溶液中加入3-氨基丙炔，室温下反应12～16h，透析后冷冻干燥得到PD-OHA-alkyne。
5.根据权利要求4所述的水凝胶，其特征在于，氧化透明质酸的分子式如下：
优选的，氧化透明质酸的分子量10万～20万g/mol，氧化度为30％～40％；
优选的，氧化透明质酸在去离子水中的浓度为0.02～0.05g/mL；
优选的，所述多巴胺的加入量为氧化透明质酸中醛基摩尔量的10％～20％。
6.根据权利要求5所述的水凝胶，其特征在于，
所述多肽为(N-对甲苯磺酰基)-甘氨酸-脯氨酸-赖氨酸-4-硝基苯胺，所述(N-对甲苯磺酰基)-甘氨酸-脯氨酸-赖氨酸-4-硝基苯胺的化学结构如下，
多肽的加入量为氧化透明质酸中醛基摩尔量的10％～20％；
优选的，6-叠氮基己胺和3-氨基丙炔的加入摩尔量均为多巴胺-多肽-氧化透明质酸体系中醛基摩尔量的1.1～1.2倍；
优选的，透析膜分子量截止值为10000g/mol，透析时间为3天，每12小时换水一次。
7.根据权利要求1-6任一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的粘附力为8.8～27.3KPa，压缩强度为218.9～320.8KPa。
8.根据权利要求1-6任一项所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶的凝血时间为28～45s。
9.一种促凝血高粘附的水凝胶的制备方法，其特征在于，将PD-OHA-azide和PD-OHA-alkyne在室温溶于含有催化剂的去离子水中，静置交联得到水凝胶；其中，所述PD-OHA-azide的结构式如下：
PD-OHA-alkyne的结构式如下：
10.一种促凝血高粘附的水凝胶在封闭出血伤口医学领域的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410145449.0A CN117986625A (zh) | 2024-02-02 | 2024-02-02 | 一种促凝血高粘附水凝胶及其制备方法和应用 |
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| CN202410145449.0A CN117986625A (zh) | 2024-02-02 | 2024-02-02 | 一种促凝血高粘附水凝胶及其制备方法和应用 |
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| CN117986625A true CN117986625A (zh) | 2024-05-07 |
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