CN117986325A - 一种多肽单体分子mbp、多肽共组装纳米粒及其应用 - Google Patents

一种多肽单体分子mbp、多肽共组装纳米粒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117986325A
CN117986325A CN202410107411.4A CN202410107411A CN117986325A CN 117986325 A CN117986325 A CN 117986325A CN 202410107411 A CN202410107411 A CN 202410107411A CN 117986325 A CN117986325 A CN 117986325A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
unit
monomer molecule
antibiotic
mbp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410107411.4A
Other languages
English (en)
Inventor
高春生
李志平
邹鹏飞
杨美燕
龚伟
王玉丽
杨阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA filed Critical Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority to CN202410107411.4A priority Critical patent/CN117986325A/zh
Publication of CN117986325A publication Critical patent/CN117986325A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5169—Proteins, e.g. albumin, gelatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于多肽及生物医药技术领域，具体涉及一种多肽单体分子MBP、多肽共组装纳米粒及其应用。本发明所述多肽共组装纳米粒借助所述多肽单体分子MBP中的脂多糖(LPS)靶向单元靶向细菌外膜脂多糖，克服细菌渗透性屏障保护作用，穿膜到达细胞内；借助所述多肽单体分子EIP中的硫醇氧化酶(DsbA)靶向单元靶向细菌胞内的DsbA酶，与细菌DsbA酶强力结合，将多肽共组装纳米粒的纳米粒状态转变成纳米纤维，使所述纳米组合物具有更强的DsbA酶竞争结合能力，抑制DsbA酶活性，导致下游耐药性关键酶β‑内酰胺酶合成受阻，从而发挥抗生素佐剂效应，实现抗生素的精准递送。

Description

一种多肽单体分子MBP、多肽共组装纳米粒及其应用
技术领域
本发明属于多肽及生物医药技术领域，具体涉及一种多肽单体分子MBP、多肽共组装纳米粒及其应用。
背景技术
抗生素耐药(Antimicrobial resistance，AMR)已经成为全球各个国家面临的重要医疗难题，是人类健康面临的全球十大公共卫生威胁之一。抗生素靶点的范围非常有限，绝大多数已批准上市的抗生素主要针对DNA/RNA合成、蛋白合成、膜完整性或细胞壁合成等，所有这些抗生素均产生了不同程度的耐药性，例如“超级细菌”的出现。目前，全球抗生素新药研发缓慢，耐药性进程加快，因此，亟需开发出具有新的作用机制的疗法以逃避现有的耐药机制，且能够不导致耐药。
β-内酰胺类抗生素作为抗生素治疗的第一道防线，是临床上最常用的抗生素之一，目前已经产生了严重的耐药。β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因是革兰氏阴性细菌胞内产生了β-内酰胺酶，它能够水解抗生素导致耐药。针对这种酶产生的耐药性，已经上市了多种β内酰胺酶竞争性抑制剂，可以竞争性抑制β-内酰胺酶，从而恢复细菌对抗生素的敏感，这类抑制剂主要有舒巴坦钠、唑巴坦钠等。然而，有报告显示，临床上也存在这类抗生素佐剂失效的问题，其失活机制尚不明确。
多肽因其生物相容性好、毒性低等优点而成为近年来对抗细菌耐药性的“潜力分子”。随着多肽自组装纳米技术的迅速发展，针对多肽类药物的不足，已有多种新型自组装纳米多肽相继被设计和制备出来，并具有显著的体内外抗菌活性提升能力和抗蛋白酶降解能力，展示出其作为新型安全高效抗菌药物的独特优势，新型自组装纳米多肽药物的设计与研究正成为当前国际前沿热点。
近年来，靶向细菌毒力的策略，成为抗生素佐剂疗法的新模式。靶向毒力而不直接杀死细菌，可以保护宿主内源性微生物群，减少细菌耐药性产生的可能。最新研究表明，硫醇氧化酶(DsbA)是细菌外胞质环境中协助β内酰胺蛋白酶折叠的关键蛋白酶。因此，抑制DsbA蛋白酶活性可以使下游的β-内酰胺酶稳定性受损，是开发下一代抗生素佐剂治疗耐药性感染的新方法。然而，由于革兰氏阴性细菌外膜的渗透性屏障的保护作用，DsbA酶抑制剂难以到达胞内靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽单体分子MBP、多肽共组装纳米粒及其应用，所述多肽单体分子MBP能够克服细菌渗透性屏障保护作用，辅助多肽共组装纳米粒跨越细菌外膜实现抗生素和/或抗生素佐剂精准地递送至细胞内，辅助逆转抗生素耐药性，恢复抗生素效力。
本发明提供了一种多肽单体分子MBP，包括疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元；所述疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元通过酰胺键顺次连接；所述脂多糖靶向单元包括具有靶向细菌外膜脂多糖功能的多肽、小分子化合物、蛋白或核酸适配体。
优选的，所述疏水单元包括软脂酸、硬脂酸或胆固醇；
所述酶切单元为三肽，所述三肽的氨基酸序列为Cys-X-X，X为任意氨基酸；
所述连接单元为多肽，所述多肽的N端第一个氨基酸为Cys。
优选的，所述多肽单体分子MBP的结构如式Ⅰ所示。
本发明提供了一种多肽共组装纳米粒，所述多肽共组装纳米粒包括多肽单体分子EIP和上述技术方案所述的多肽单体分子MBP；
所述多肽单体分子EIP包括疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元；所述疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元通过酰胺键顺次连接；所述硫醇氧化酶靶向单元包括靶向结合并抑制硫醇氧化酶的多肽、小分子化合物、蛋白或核酸适配体。
优选的，所述多肽单体分子MBP和多肽单体分子EIP的摩尔比为0：1～1：20，所述摩尔比不为0。
优选的，在所述多肽单体分子EIP中，所述疏水单元包括软脂酸、硬脂酸或胆固醇；所述组装单元为五肽，所述五肽的氨基酸序列为Phe-Phe-Val-Leu-Al a；所述连接单元为三肽，所述三肽的氨基酸序列为Gly-Gly-Gly；所述硫醇氧化酶靶向单元为九肽，所述九肽的氨基酸序列为Pro-Ser-Pro-Phe-Ala-Thr-Cys-Asp-Phe。
本发明还提供了上述技术方案所述多肽单体分子MBP或上述技术方案所述多肽共组装纳米粒在抗生素递送、抗生素佐剂递送和逆转抗生素耐药性中的一项或多项中的应用。
本发明还提供了一种载抗生素多肽共组装纳米粒，所述载抗生素多肽共组装纳米粒包括上述技术方案所述的多肽共组装纳米粒和包载在所述多肽共组装纳米粒的中的抗生素。
优选的，在所述载抗生素多肽共组装纳米粒中，所述多肽共组装纳米粒的浓度为0.005mM～1mM；所述抗生素的浓度为0～1mM，所述抗生素的浓度不为0。
本发明还提供了上述技术方案所述的载抗生素多肽共组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：将多肽单体分子MBP的溶液、多肽单体分子EIP的溶液和抗生素的溶液在水相中进行超声处理，得到超声处理液；
将所述超声处理液在PBS缓冲液中进行透析，得到的截留液中含有所述载抗生素多肽共组装纳米粒。
有益效果：
本发明提供了一种多肽单体分子MBP，包括疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元；所述疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元通过酰胺键顺次连接；所述脂多糖靶向单元包括具有靶向细菌外膜脂多糖功能的多肽、小分子化合物或蛋白。本发明利用多肽单体分子MBP中的脂多糖(LPS)靶向单元靶向细菌外膜脂多糖，克服细菌渗透性屏障保护作用，实现将包括细菌硫醇氧化酶(DsbA)抑制剂在内的抗生素佐剂精准递送至细胞内。
基于所述多肽单体分子MBP的优势，本发明还提供了一种多肽共组装纳米粒，所述多肽共组装纳米粒包括多肽单体分子EIP和上述技术方案所述的多肽单体分子MBP；所述多肽单体分子EIP包括疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元；所述疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元通过酰胺键顺次连接；所述硫醇氧化酶靶向单元包括靶向结合并抑制硫醇氧化酶的多肽、小分子化合物或蛋白。本发明所述多肽共组装纳米粒借助所述多肽单体分子MBP的穿膜效应到达细胞内；借助所述多肽单体分子EIP中的硫醇氧化酶靶向单元靶向细菌胞内的DsbA酶，与细菌DsbA酶强力结合，将多肽共组装纳米粒的纳米粒状态转变成纳米纤维，使所述纳米组合物具有更强的Ds bA酶竞争结合能力，抑制DsbA酶活性，导致下游耐药性关键酶(β-内酰胺酶)合成受阻，从而发挥抗生素佐剂效应，实现抗生素的精准递送；同时多肽单体分子EIP能够屏蔽部分多肽单体分子MBP过多的表面正电荷，降低了细胞毒副作用。
基于所述多肽共组装纳米粒的优势，本发明提供了一种载抗生素多肽共组装纳米粒，所述载抗生素多肽共组装纳米粒包括上述技术方案所述的多肽共组装纳米粒和包载在所述多肽共组装纳米粒内腔的抗生素。本发明所述载抗生素多肽共组装纳米粒可以将抗生素精准递送至细菌胞内，显著提升药物疗效，降低给药剂量，减小毒副反应发生；该载抗生素多肽共组装纳米粒能够逆转包括细菌β-内酰胺类抗生素在内的抗生素的耐药性、延长抗生素使用寿命，在治疗耐药性细菌感染方面潜力巨大。同时，所述载抗生素多肽共组装纳米粒可以包载不同种类的疏水性抗生素，具有抗生素递送的普适性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中多肽单体分子EIP的结构示意图；
图2为实施例1中多肽单体分子MBP的结构示意图；
图3为实施例1中多肽共组装纳米粒的透射电镜图；
图4为实施例2中载抗生素的多肽共组装纳米粒的透射电镜图；
图5为实施例3中细胞毒性实验结果图；
图6为实施例6中DsbA酶触发多肽共组装纳米粒形变的透射电镜实验结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种多肽单体分子MBP，包括疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元；所述疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元通过酰胺键顺次连接；所述脂多糖靶向单元包括具有靶向细菌外膜脂多糖功能的多肽、小分子化合物或蛋白。
在本发明中，所述脂多糖靶向单元优选为具有靶向细菌外膜脂多糖功能的多肽，所述靶向细菌外膜脂多糖的多肽的氨基酸序列优选为Lys-Lys-Arg-Ala-Lys-Lys-Phe-Phe-Lys-Lys-Pro-Arg-Val-Ile-Gly-Val-Ser-Ile-Pro-Phe(SEQ ID NO.1)；所述脂多糖靶向单元可以特异性地靶向细菌外膜中的脂多糖，进而穿越细菌外膜，克服细菌渗透性屏障。本发明所述疏水单元优选包括软脂酸、硬脂酸或胆固醇，更优选为软脂酸；所述疏水单元在所述多肽单体分子MBP中具有增强分子的疏水性，平衡分子的亲疏水平衡的作用。本发明所述酶切单元优选为三肽，所述三肽的氨基酸序列优选为Cys-X-X，其中X为任意氨基酸；所述酶切单元在所述多肽单分子MBP中具有被DsbA酶特异性识别并切断分子的作用。本发明所述连接单元优选为多肽，所述多肽的第一个氨基酸优选为Cys；所述多肽的氨基酸序列优选为Pro-Ser-Pro-Phe-Ala-Thr-Cys-Asp-Phe(SEQ ID NO.2)；所述连接单元在所述多肽单分子MBP中具有提供二硫键合成位点，连接酶切模块与靶向模块的作用。
在本发明中，所述多肽单体分子MBP的结构如式Ⅰ所示：式Ⅰ所示的结构式的分子式为C150H249N39O29S2。
在本发明中，所述疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元通过酰胺键顺次连接，所述连接的过程和条件没有特殊限定，采用本领域中常规连接过程和条件即可。
本发明利用多肽单体分子MBP中的脂多糖(LPS)靶向单元靶向细菌外膜脂多糖，克服细菌渗透性屏障保护作用，实现包括细菌硫醇氧化酶(DsbA)抑制剂在内的抗生素佐剂精准递送至细胞内。
本发明还提供了一种多肽共组装纳米粒，所述多肽共组装纳米粒包括多肽单体分子EIP和上述技术方案所述的多肽单体分子MBP；
所述多肽单体分子EIP包括疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元；所述疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元通过酰胺键顺次连接；所述硫醇氧化酶靶向单元包括靶向结合并抑制硫醇氧化酶的多肽、小分子化合物或蛋白。
在本发明所述多肽单体分子EIP中，所述疏水单元优选包括软脂酸、硬脂酸或胆固醇，更优选为软脂酸；所述疏水单元具有增强分子的疏水性，平衡分子的亲疏水平衡(疏水力)的作用。本发明所述组装单元优选为五肽，所述五肽的氨基酸序列优选为Phe-Phe-Val-Leu-Ala(SEQ ID NO.3)；所述组装单元具有为分子组装提供驱动力(氢键、π-π相互作用)作用。本发明所述连接单元优选为三肽，所述三肽的氨基酸序列优选为Gly-Gly-Gly；所述连接单元具有连接同时间隔组装模块与靶向模块的作用。本发明所述硫醇氧化酶靶向单元优选为九肽，所述九肽的氨基酸序列优选为Pro-Ser-Pro-Phe-Ala-Thr-Cys-Asp-Phe(SEQ IDNO.2)；所述硫醇氧化酶靶向单元可以选择性地靶向结合并抑制硫醇氧化酶，导致下游耐药性关键酶(β-内酰胺酶)合成受阻，从而发挥抗生素佐剂效应，逆转抗生素的耐药性。
本发明所述多肽单体分子EIP的结构优选如式Ⅱ所示，
式Ⅱ；式Ⅱ所示的结构式的分子式为C99H143N17O23S。
在本发明所述多肽单体分子EIP中，所述疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元通过酰胺键顺次连接，所述连接的过程和条件没有特殊限定，采用本领域中常规连接过程和条件即可。
在本发明中，所述多肽单体分子MBP和多肽单体分子EIP的摩尔比为优选为0：1～1：20，进一步优选为1：1～1：10，更优选为3：7～1：9；所述摩尔比不为0。
本发明所述多肽共组装纳米粒的制备方法优选包括：将多肽单体分子MBP和多肽单体分子EIP分别溶解于良溶剂中，分别得到多肽单体分子MBP溶液和多肽单体分子EIP溶液；
将所述多肽单体分子MBP溶液和多肽单体分子EIP溶液进行水浴超声处理，得到水浴超声处理液；
将所述水浴超声处理液在水或PBS磷酸盐缓冲液中进行冰水浴超声处理，得到所述多肽共组装纳米粒。
本发明优选将多肽单体分子MBP和多肽单体分子EIP分别溶解于良溶剂中，分别得到多肽单体分子MBP溶液和多肽单体分子EIP溶液。本发明所述良溶剂优选包括二甲基亚砜或二甲基亚砜的水溶液。
得到所述多肽单体分子MBP溶液和多肽单体分子EIP溶液后，本发明优选将所述多肽单体分子MBP溶液和多肽单体分子EIP溶液进行水浴超声处理，得到水浴超声处理液。本发明所述水浴超声的功率优选为100～600W，进一步优选为100～300W，更优选为200～250W；时间优选为0～30min，更优选为15min。
得到所述水浴超声处理液后，本发明优选将所述水浴超声处理液在水或PBS磷酸盐缓冲液中进行冰水浴超声处理，得到冰水浴超声处理液。本发明所述PBS磷酸盐缓冲液的pH值优选为7.4。本发明所述冰水浴超声处理的功率优选为100～300W，更优选为200～250W；时间优选为0～40min，更优选为30min。所述冰水浴具有降温、防止超声温度过高对纳米粒造成破坏的作用。
得到所述冰水浴超声处理液后，本发明优选将所述冰水浴超声处理液进行静置，得到静置后的超声处理液。本发明所述静置的时间优选为0～1.5h，更优选为1h。
得到超声处理液后，本发明优选将所述静置后的超声处理液在PBS缓冲液中进行透析，得到的截留液，所述截留液即为所述多肽共组装纳米粒。本发明所述透析用透析袋的截留分子量优选为1000Da。本发明所述透析的时间优选为0～4h，更优选为1h。本发明所述PBS缓冲液的pH值优选为7.4。本发明所述透析可以去除游离的多肽单分子。
本发明所述多肽共组装纳米粒借助所述多肽单体分子MBP的穿膜效应到达细胞内；借助所述多肽单体分子EIP中的硫醇氧化酶靶向单元靶向细菌胞内的DsbA酶，与细菌DsbA酶强力结合，将多肽共组装纳米粒的纳米粒状态转变成纳米纤维，使所述纳米组合物具有更强的DsbA酶竞争结合能力，抑制DsbA酶活性，导致下游耐药性关键酶(β-内酰胺酶)合成受阻，从而发挥抗生素佐剂效应，实现抗生素的精准递送；同时多肽单体分子EIP能够屏蔽部分多肽单体分子MB P过多的表面正电荷，降低了细胞毒副作用。
基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述多肽单体分子MBP或上述技术方案所述多肽共组装纳米粒在抗生素递送、抗生素佐剂递送和逆转抗生素耐药性中的一项或多项中的应用，优选包括所述多肽共组装纳米粒在抗生素递送、抗生素佐剂递送和逆转抗生素耐药性中的应用。
本发明还提供了一种载抗生素多肽共组装纳米粒，所述载抗生素多肽共组装纳米粒包括上述技术方案所述的多肽共组装纳米粒和包载在所述多肽共组装纳米粒内腔的抗生素。
本发明所述多肽共组装纳米粒和抗生素优选通过疏水相互作用实现包载。本发明所述多肽共组装纳米粒的浓度优选为0.005mM～1mM，进一步优选为0.005mM～0.5mM，更优选为0.0125mM～0.2mM；所述抗生素的浓度优选为0～1mM，进一步优选为0.01mM～0.1mM，更优选为0.05mM～0.1mM；所述抗生素的浓度不为0。本发明所述抗生素优选包括疏水性抗生素或亲水性抗生素，更优选为疏水性抗生素；所述疏水性抗生素优选包括β-内酰胺类抗生素、头孢菌素类抗生素、喹诺酮类抗生素或多粘菌素，更优选为β-内酰胺类抗生素。
本发明还提供了上述技术方案所述的载抗生素多肽共组装纳米粒的制备方法，包括如下步骤：将多肽单体分子MBP的溶液、多肽单体分子EIP的溶液和抗生素的溶液在水相中进行超声处理，得到超声处理液；
将所述超声处理液在PBS缓冲液中进行透析，得到的截留液中含有所述载抗生素多肽共组装纳米粒。
本发明优选将多肽单体分子MBP、多肽单体分子EIP和抗生素分别溶解于良溶剂中，分别得到多肽单体分子MBP溶液、多肽单体分子EIP溶液和抗生素溶液。本发明所述良溶剂优选包括二甲基亚砜或二甲基亚砜的水溶液。
得到所述多肽单体分子MBP溶液、多肽单体分子EIP溶液和抗生素溶液后，本发明将所述多肽单体分子MBP溶液、多肽单体分子EIP溶液和抗生素溶液在水相中进行超声处理，得到超声处理液。本发明所述超声处理的功率优选为100～600W，进一步优选为100～300W，更优选为200～250W；所述超声处理的时间优选为0～45min，更优选为30min。
得到所述超声处理液后，本发明优选将所述超声处理液在PBS缓冲液中进行透析，得到的截留液。本发明所述透析用透析袋的截留分子量优选为1000Da。本发明所述透析优选为避光透析，原因在于避免抗生素见光不稳定，发生降解。本发明所述透析的时间优选为0～4h，更优选为1h。本发明所述PBS缓冲液的pH值优选为7.4。本发明所述透析可以去除游离的抗生素和多肽单分子。
得到所述截留液后，本发明优选对所述截留液进行离心，取上清，得到所述载抗生素多肽共组装纳米粒。本发明所述离心的转速优选为6000g，时间优选为5min。
本发明所述载抗生素多肽共组装纳米粒可以将抗生素精准递送至细菌胞内，显著提升药物疗效，降低给药剂量，减小毒副反应发生；该载抗生素多肽共组装纳米粒能够逆转包括细菌β-内酰胺类抗生素在内的抗生素的耐药性、延长抗生素使用寿命，在治疗耐药性细菌感染方面潜力巨大。同时，所述载抗生素多肽共组装纳米粒可以包载不同种类的疏水性抗生素，具有抗生素递送的普适性。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种多肽共组装纳米粒的制备方法，步骤如下：
1)多肽单体分子EIP的结构式如图1所示，多肽单体分子MBP的结构式如图2所示，将多肽单体分子EIP和多肽单体分子MBP分别委托吉尔生化(上海)有限公司，采用多肽固相合成法制备。
多肽共组装纳米粒(EMPX：Y)的制备：精密称取处方量多肽单体分子EIP和多肽单体分子MBP，溶于DMSO中，涡旋震荡溶解，配成10mM的母液，备用。取摩尔比X(EIP)：Y(MBP)(分别为10：0，8：2，7：3，5：5，3：7，2：8，1：9和0：10)的多肽单体分子EIP和MBP涡旋充分混合均匀后，水浴超声15min，转移至1mL PBS磷酸盐缓冲液中(pH为7.4)中，涡旋震荡混合混匀，冰水浴240W超声30min后，静置1h备用。
2)采用负染法制备透射电镜样品：取10μL步骤1)中不同比例的共组装纳米粒，滴在碳支撑铜网(100目)上，静置沉降5min后，使用一次性滤纸吸走液滴。取10μL醋酸双氧铀(2％)滴在吸走液滴后的铜网上，静置1min后，再次使用一次性滤纸吸走染液。使用生物透射电镜(HT 7800)观察，拍摄，结果如图3所示。
3)采用动态光散射(DLS)法测定粒径和电位：取200μL步骤1)中制备的不同比例的共组装纳米粒分别于电位杯和粒径杯中，放于动态光散射粒度分析仪(Malvern,ZS90)测定粒径和电位，结果如表1所示。
表1实施例1中共组装纳米粒的外观、粒径和电位统计结果
由图3和表1可以得出：多肽单分子MBP自组装形成的纳米粒的粒径为24.9±4.5nm，而随着多肽单分子EIP比例的增加(1：9至3：7)，粒径逐渐增大，说明MBP和EIP进行了共组装。而随着EIP比例的进一步增加(5:5至8:2)，出现了部分甚至全部的纳米纤维，纳米纤维不利于跨越细菌外膜的屏障作用。Zeta电位对纳米粒的稳定性有较大影响。一般电位越高，不易沉降、凝结和聚集，体系稳定；电位达到30mV时，可以达到稳定性要求。
实施例2
载头孢哌酮(Cefoperazone，Cefo)抗生素的多肽共组装纳米粒(EMP3-7@Cefo)的制备：精密称取15.77mg多肽单体分子EIP(实施例1制备)，溶于800μL的DMSO中，涡旋震荡溶解，配成10mM的母液，备用。精密称取12.50mg多肽单体分子MBP(实施例1制备)，溶于400μL的DMSO中，涡旋震荡溶解，配成10mM的母液，备用。精密称取Cefo抗生素25.82mg，溶于400μL的DMSO中，涡旋震荡溶解，配成100mM的母液，备用。取3μL多肽单体分子EIP、7μL多肽单体分子MBP和0.9μL的Cefo充分混合均匀后，转移至1mLPBS磷酸盐缓冲液中(pH＝7.4)中，涡旋震荡混合混匀，冰水浴240W超声30min后，将其转移至透析袋(MWCO：1000Da)中，在PBS缓冲溶液(pH＝7.4)中避光透析1h去除游离抗生素，6000g离心5min取上清液，备用。
电镜样品制备方法和粒径电位测量方法同实施例1。电镜检测结果如图4所示，外观、粒径和电位的检测统计结果如表2所示。
表2实施例2中载抗生素的多肽共组装纳米粒的外观、粒径和电位统计结果
考察指标 结果
外观 球状
粒径(nm) 48.7±9.2
电位(mV) 29.0±5.0
由图4和表2可以得出：载Cefo的多肽共组装纳米粒形态较为均一，与空白多肽共组装纳米粒(实施例1)的形貌无明显差异。
实施例3
细胞毒性实验，步骤如下：
取对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，在灭菌后的超净台内，用2mL的PBS缓冲液洗一遍，后加入0.25％的胰蛋白酶2mL，消化4min后立即加入2mL细胞培养液终止消化，反复多次吹打细胞悬液，使细胞悬液密度均一，用血球计数板计算细胞悬液细胞密度，根据计数结果加入对应体积的完全培养液，最终调整细胞密度为6×104个/mL。
取96孔板，每孔加入混匀的细胞悬液100μL(约6×103个细胞)，空白对照组不加细胞悬液，仅加100μL培养基或PBS缓冲液。于37℃，5％CO2条件下培养至细胞贴壁完全，时间约24h。
将实施例1中制备的多肽自组装纳米粒完全培养基悬液(EIP、BMP、EMP3-7)加入96孔板中，每孔100μL药液，使各孔的终浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56μM，未加细胞的空白对照组更换100μL完全培养基，每个组分别设6个复孔。孵育24h后，每孔加入20μL的CCK-8(每100μL含10μL CCK-8溶液)，轻振荡混匀后放入孵育箱内4h，酶标仪检测其在450nm波长下的吸光度值OD450，结果如图5所示。
由图5可以得出：本实施例中的多肽单分子EIP、BMP和共组装纳米颗粒细胞EMP3-7毒性实验中，细胞存活率在80％以上，说明多肽单分子和共组装纳米颗粒均无明显的细胞毒性。
实施例4
药效学实验(最小抑菌浓度实验)，步骤如下：
采用肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)值。对目前临床上常用的代表性的抗生素头孢唑林钠(Cefazolin，Cefa，第一代头孢菌素)，头孢呋辛钠(Cefuroxime，Cefu，第二代头孢菌素)，头孢哌酮(Cefoperazone，Cefo，第三代头孢菌素)和头孢吡肟(Cefepime，Cefe，第四代头孢菌素)进行MIC测定。取单克隆的临床分离的多药耐药性大肠杆菌(E.coli MDRESBL-1(Clinical)，E.coli MDR ESBL-1(Clinical)在ACS Nano.2022,16,(12):20545-20558.中进行公开)。于LB肉汤培养基中，37℃180rpm摇床过夜孵育。次日，取1％上述细菌悬液于新鲜的LB肉汤培养基中，标准化培养至吸光度OD600nm＝0.1(1.0×108CFU/mL)，使用LB培养基稀释至1.5×106CFU/mL。
取96孔板，每孔加入100μL上述细菌悬液，100μL不同药物，不同药物情况如表3所示，其中EMP3-7、EMP2-8、EMP1-9及MBP均为实施例1中所得样品；设置系列样品浓度，每个浓度设置6个复孔，设置空白培养基为空白组，不加药组为对照组。培养箱37℃孵育18h后，测定OD600nm吸光度，以抑制细菌生长的最小浓度作为MIC值。
表3实施例4中的MIC值
由表3可以看出：临床分离的菌株对于临床上常用的抗生素均出现了不同程度的耐药性(MIC>300μM)；而本实施例中的多肽单分子MBP及多肽共组装纳米粒EMP具有一定的抗菌活性。
实施例5
抗生素协同实验，步骤如下：
采用肉汤稀释法测定多肽对抗生素头孢唑林(Cefazolin)、头孢呋辛(Cefuroxime)和头孢哌酮(Cefoperazone)的协同效应。取单克隆的临床分离的多药耐药性大肠杆菌(E.coliMDR ESBL-1(Clinical))于M63肉汤培养基中，37℃180rpm摇床过夜孵育。次日，取1％上述细菌悬液于新鲜的M63肉汤培养基中，标准化培养至吸光度OD600nm＝0.1(1.0×108CFU/mL)，使用M63培养基稀释至1.5×106CFU/mL。
取96孔板，每孔加入100μL上述细菌悬液，50μL实施例1中制备的多肽共组装纳米粒EMP3-7(终浓度依次为12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μM)、50μL抗生素(终浓度依次为25、12.5、6.25、3.13、1.56μM)，每个浓度设置4个复孔，设置空白培养基为空白组，不加药组为对照组。培养箱37℃孵育18h后，测定OD600nm吸光度,计算抑制率(Inhibition rate)。抑制率＝1-[(OD加药组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)]×100％，结果如表4所示。
表4实施例5中抗生素协同效应增敏倍数统计结果
抗生素 增敏倍数
Cefa ＞100
Cefu ＞100
Cefo ＞100
由表4可以得出：单独使用抗生素时(实施例4，表3)，细菌存在明显的抗生素耐药(MIC>300μM)；单独使用多肽共组装纳米颗粒(EMP3-7)时，具有较弱的抗菌活性；而当二者联合用药时，在EMP3-7较低剂量水平时(3.12-6.25μM)，抗生素的MIC能降低至1.56μM，增敏倍数>100倍，说明本实施例中的多肽共组装纳米颗具有抗生素佐剂的效应，能明显逆转细菌抗生素的耐药性，恢复细菌对抗生素的敏感性。
实施例6
DsbA酶触发形变实验：将50μM实施例1制备的多肽共组装纳米粒EMP3-7与50μg/mL的DsbA酶，分别孵育0.5h、1h和4h后，吸取10μL滴在铜网上，静置10min后，滤纸吸弃液体。2％醋酸双氧铀染色5min后，透射电镜观察，结果如图6所示。
由图6可以得出：EMP3-7在溶液态时为纳米粒，当与DabA酶相互作用时，亲疏水平衡发生改变，EMP3-7形态由纳米粒转化为纳米纤维，并且随着时间的推移，纳米纤维逐渐增多。
由以上实施例可以得出：本发明所多肽共组装纳米粒能够跨越细菌外膜实现抗生素和/或抗生素佐剂精准地递送至细胞内，显著提高与DsbA酶的结合能力，抑制下游β-内酰胺酶稳定性，从而逆转耐药性，恢复抗生素效力。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种多肽单体分子MBP，包括疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元；所述疏水单元、酶切单元、连接单元和脂多糖靶向单元通过酰胺键顺次连接；所述脂多糖靶向单元包括具有靶向细菌外膜脂多糖功能的多肽、小分子化合物、蛋白或核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的多肽单体分子MBP，其特征在于，所述疏水单元包括软脂酸、硬脂酸或胆固醇；
所述酶切单元为三肽，所述三肽的氨基酸序列为Cys-X-X，X为任意氨基酸；
所述连接单元为多肽，所述多肽的N端第一个氨基酸为Cys。
3.根据权利要求1或2所述的多肽单体分子MBP，其特征在于，所述多肽单体分子MBP的结构如式Ⅰ所示：
4.一种多肽共组装纳米粒，其特征在于，所述多肽共组装纳米粒包括多肽单体分子EIP和权利要求1～3任一项所述的多肽单体分子MBP；
所述多肽单体分子EIP包括疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元；所述疏水单元、组装单元、连接单元和硫醇氧化酶靶向单元通过酰胺键顺次连接；所述硫醇氧化酶靶向单元包括靶向结合并抑制硫醇氧化酶的多肽、小分子化合物、蛋白或核酸适配体。
5.根据权利要求4所述的多肽共组装纳米粒，其特征在于，所述多肽单体分子MBP和多肽单体分子EIP的摩尔比为0：1～1：20，所述摩尔比不为0。
6.根据权利要求4或5所述的多肽共组装纳米粒，其特征在于，在所述多肽单体分子EIP中，所述疏水单元包括软脂酸、硬脂酸或胆固醇；所述组装单元为五肽，所述五肽的氨基酸序列为Phe-Phe-Val-Leu-Ala；所述连接单元为三肽，所述三肽的氨基酸序列为Gly-Gly-Gly；所述硫醇氧化酶靶向单元为九肽，所述九肽的氨基酸序列为Pro-Ser-Pro-Phe-Ala-Thr-Cys-Asp-Phe。
7.权利要求1～3任一项所述多肽单体分子MBP或权利要求4～6任一项所述多肽共组装纳米粒在抗生素递送、抗生素佐剂递送和逆转抗生素耐药性中的一项或多项中的应用。
8.一种载抗生素多肽共组装纳米粒，其特征在于，所述载抗生素多肽共组装纳米粒包括权利要求4～6任一项所述的多肽共组装纳米粒和包载在所述多肽共组装纳米粒中的抗生素。
9.根据权利要求8所述的载抗生素多肽共组装纳米粒，其特征在于，在所述载抗生素多肽共组装纳米粒中，所述多肽共组装纳米粒的浓度为0.005mM～1mM；所述抗生素的浓度为0～1mM，所述抗生素的浓度不为0。
10.权利要求8或9所述的载抗生素多肽共组装纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将多肽单体分子MBP的溶液、多肽单体分子EIP的溶液和抗生素的溶液在水相中进行超声处理，得到超声处理液；
将所述超声处理液在PBS缓冲液中进行透析，得到的截留液中含有所述载抗生素多肽共组装纳米粒。
CN202410107411.4A 2024-01-25 2024-01-25 一种多肽单体分子mbp、多肽共组装纳米粒及其应用 Pending CN117986325A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410107411.4A CN117986325A (zh) 2024-01-25 2024-01-25 一种多肽单体分子mbp、多肽共组装纳米粒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410107411.4A CN117986325A (zh) 2024-01-25 2024-01-25 一种多肽单体分子mbp、多肽共组装纳米粒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117986325A true CN117986325A (zh) 2024-05-07

Family

ID=90886604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410107411.4A Pending CN117986325A (zh) 2024-01-25 2024-01-25 一种多肽单体分子mbp、多肽共组装纳米粒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117986325A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102225964A (zh) * 2003-12-05 2011-10-26 西北大学 自组装的肽两亲物和用于生长因子传递的相关方法
CN111333733A (zh) * 2019-04-29 2020-06-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白及其应用
CN112979755A (zh) * 2021-02-22 2021-06-18 中国药科大学 pH响应载药自组装形成水凝胶的多肽、制备方法及用途
CN113754738A (zh) * 2021-08-30 2021-12-07 国家纳米科学中心 一种多肽单体分子及其自组装纳米材料和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102225964A (zh) * 2003-12-05 2011-10-26 西北大学 自组装的肽两亲物和用于生长因子传递的相关方法
CN111333733A (zh) * 2019-04-29 2020-06-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可自组装为蛋白纳米颗粒的融合蛋白及其应用
CN112979755A (zh) * 2021-02-22 2021-06-18 中国药科大学 pH响应载药自组装形成水凝胶的多肽、制备方法及用途
CN113754738A (zh) * 2021-08-30 2021-12-07 国家纳米科学中心 一种多肽单体分子及其自组装纳米材料和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LA MANNA S等: "Self-Assembling Peptides: From Design to Biomedical Applications", INT J MOL SCI, vol. 22, no. 23, 23 November 2021 (2021-11-23), pages 12662 *
任涵等: "自组装多肽的修饰方法及其应用", 有机化学, vol. 41, no. 10, 22 October 2021 (2021-10-22), pages 3983 - 3994 *
赵特等: "自组装多肽用于药物递送的研究进展", 军事医学, vol. 47, no. 10, 25 October 2023 (2023-10-25), pages 783 - 787 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113081956A (zh) 一种氧化海藻酸钠改性的那他霉素滴眼液及其制备方法
CN116617220A (zh) 抗青霉素类耐药菌的绿原酸-小檗碱纳米药物、药物组合物及其制备方法
CN116270525A (zh) 一种用于治疗肺部细菌感染性肺炎的可吸入仿生纳米材料及其制备方法和应用
Li et al. Dynamic nitric oxide/drug codelivery system based on polyrotaxane architecture for effective treatment of candida albicans infection
CN114699370A (zh) 一种共载多粘菌素e和姜黄素的脂质体的制备方法及其应用
CN117986325A (zh) 一种多肽单体分子mbp、多肽共组装纳米粒及其应用
CN114106106A (zh) 一种自组装树状抗菌肽Pal3RP和其制备方法及其自组装纳米颗粒和应用
CN116135230B (zh) 一种盐酸小檗碱/吲哚菁绿纳米颗粒及其制备方法和应用
Clifford et al. Staphylococcal tricuspid valve endocarditis in patients with structurally normal hearts and no evidence of narcotic abuse
CN115025044B (zh) 一种抗菌聚鞣酸纳米粒PTA NPs及其制备方法
CN113577302B (zh) 多糖多肽偶联物在治疗感染性角膜炎中的用途
CN113827593B (zh) 角鲨烯化西达本胺前药自组装纳米粒及制备方法与应用
CN105687137A (zh) 叶酸受体靶向的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物及其制备方法和应用
CN113304122B (zh) 一种Ts抗菌肽-TPGS修饰复合纳米递药系统及其制备与应用
CN114225046A (zh) 一种抗菌/促愈合的双药递送系统、药物组合物及其制备方法和应用
CN110283237B (zh) 来源于病原真菌具有抗微生物功能拟肽及其制备方法，组合物和应用
US20230330020A1 (en) Medication that protects the intestinal microbiota and their preparation methods and applications
CN116262138A (zh) 一种具有核壳结构的pH响应型外泌体载体及其制备方法与应用
CN107827955B (zh) 源于分枝杆菌噬菌体多肽的衍生肽及其应用
CN111588864A (zh) 一种氧化石墨烯载羟基喜树碱纳米靶向药物的制备和应用
CN117069819B (zh) 一种黑腹狼蛛抗菌肽lc-amp-i1及其应用
CN116549420B (zh) 一种抗胃癌的仿生纳米顺铂制剂及其制备方法
Sonavane et al. Acute necrotizing pancreatitis with pancreatic abscess due to Prevotella species in a diabetic
WO2024131811A1 (zh) 一种富含色氨酸且具有自组装性质的抗菌肽及其应用
CN118021934A (zh) 一种海胆形载药抗菌复合物及其制备方法和其在抗角膜炎中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination