CN117981772A - 防治多种卵菌病害的贝莱斯芽孢杆菌yl2021及其应用 - Google Patents
防治多种卵菌病害的贝莱斯芽孢杆菌yl2021及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种生防菌剂，其中有效活性成分由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YL2021组成。其特征在于：该生防菌剂发酵培养基组分为：葡萄糖20 g/L，NH4Cl 2g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，KH2PO4 0.5g/L，天冬酰氨1g/L。该生防菌剂是水剂，其组成与重量百分含量为：贝莱斯芽孢杆菌YL2021：89.5‑99.8％；十二烷基磺酸钠：0.1‑10％；山梨酸钾：0.1‑0.5％，pH 6.5‑7.0。应用时，将上述水剂灌根用于防治辣椒疫病，果实表面均匀喷施用于防治荔枝霜疫病，叶片表面均匀喷施用于防治马铃薯晚疫病和黄瓜霜霉病。其优点是：通过引进对人畜安全、对多种植物卵菌病害具有较好防治作用的贝莱斯芽孢杆菌YL2021，达到利用生防菌剂防治植物卵菌病害，减少化学药剂用药量；同时改善生态环境、减少化学药剂在农产品中残留量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种防治多种卵菌病害的贝莱斯芽孢杆菌YL2021及其应用。
背景技术
卵菌又称藻菌或“伪真菌”，由于其菌丝呈丝状生长的特性，一直以来被当作真菌并被归入鞭毛菌亚门的卵菌纲，同时因为其进化程度相对较低，一直被当作低等真菌。近些年来根据生化分析、核糖体RNA序列及线粒体基因序列建立的系统发育树分析，发现卵菌与真菌亲源关系较远，因此根据其亲缘关系的认定而被整体划入色藻界(又名藻菌界或原藻界)淡色藻门的伪真菌亚门，也就是说，卵菌已经不再被认定为真菌。卵菌是自然界中存在的一类重要病原生物，以产生卵孢子而得名，由卵菌引起的植物病害十分广泛和严重，包括在农作物上常见的霜霉病、疫病、猝倒病、白锈病等，它们的病原菌分别是霜霉菌、疫霉菌、腐霉菌以及白锈菌等，几乎可以为害所有种植的蔬菜，因其发病快、破坏性强、传播迅速等特点，防治难度极大，给农业生产造成严重威胁。
荔枝霜疫病是由荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)引起的，荔枝产区普遍发生且危害严重的一种重要病害。该病可以侵染嫩叶、嫩枝、花穗和果实，一般年份可造成10-30％的产量损失，流行年份可造成80％的产量损失。目前国内外尚未发现荔枝霜疫病的抗病品种，因此生产上荔枝霜疫病主要依赖化学防治。长期、大量使用化学药剂不仅增加农产品有毒化学物质残留，影响农产品安全和人类健康，而且造成生态环境严重污染，病原菌易产生抗药性等。生物防治对人畜安全、环境兼容性好、病菌不易产生抗药性，越来越受到人们的重视，并初见成效。目前荔枝霜疫病防治上国内外研究和应用较多的生防细菌主要有：解淀粉芽孢杆菌(郑丽，2021年，《广东农业科学》；Zheng et al.，2021年，《Frontiers inMicrobiology》；Situ et al.，2023年，《Postharvest Biology and Technology》)、枯草芽孢杆菌(蔡学清，2008年，《福建农林大学学报》)。此外室内生测有拮抗作用的生防细菌有：多粘类芽孢杆菌(陈海英，2010年，《园艺学报》)、发光杆菌(孙东磊，2013年，广东农业科学)等，生防真菌有：链霉菌(张晓宇，2018年，《环境昆虫学报》)、青霉(许兰兰，2011年，《中国生物防治学报》)、土壤菌核寄生黄蓝状菌(Dethoup et al.，2007年，《Thai Journal ofAgricultural Science》)等。
江苏省农业科学院从江苏省南京市采集的土样中，分离纯化后获得一株生防菌YL2021。前期研究结果表明：生防菌YL2021对多种病原细菌和病原真菌(黄单胞菌、欧文氏菌、水稻纹枯病菌和稻瘟病菌)有很好的室内抑制作用(刘邮洲等，2022年，《中国生物防治学报》)；刘邮洲等，2023年，《中国生物防治学报》)。经中国科学院微生物研究所检测鉴定，根据细胞形态、生理生化特征、16S rRNA基因序列等实验数据综合分析，生防菌YL2021鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。贝莱斯芽孢杆菌YL2021已于2022年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24302。
目前已有的文献报道中贝莱斯芽孢杆菌主要作为根围有益促生菌，防治各种植物真菌病害，例如：芒果炭疽病(张晓勇等，2021年，《园艺学报》)、香蕉枯萎病(谭寿湖等，2021年，《现代农业科技》)、小麦纹枯病(夏明聪等，2021年，《河南农业科学》)、花生白绢病(潘梦诗等，2021年，《生物学杂志》)、苹果轮纹病(李永丽等，2021年，《果树学报》)、铁皮石斛茎腐病(戚菊峰，2021年，浙江大学硕士论文)、桃树根腐病(成娜娜，2021年，山东农业大学硕士论文)、稻瘟病(沙月霞，2019年，《中国农业科学》)、稻曲病(王晓荣，2018年，《农业开发与装备》)、水稻白叶枯病(方园等，2022年，《微生物学报》)等。卵菌病害包括：辣椒疫病(张德珍等，2021年，《山东农业科学》；颜瑾等，2022年，《南方农业学报》；祝文慧等，2023年，《中国生物防治学报》)、马铃薯晚疫病(闫浩浩，2021年，山东农业大学硕士论文)等。已有的申请专利中贝莱斯芽孢杆菌主要也是作为生防细菌，防治各种植物病害，包括：病毒病(专利号：CN109868250B、CN109762754B)、葡萄灰霉病(专利号：CN111100820B)、香蕉枯萎病(专利申请号：CN113061554A)、马铃薯枯萎病(专利申请号：CN113215010A)、大豆根腐病(专利申请号：CN113151051A)、稻瘟病菌(专利申请号：CN113151062A)、水稻稻曲病(专利号：CN109576179B)、烤烟赤星病(专利申请号：CN113005056A)、文心兰炭疽病(专利申请号：CN112920975A)、根肿病(专利申请号：CN112899196A)、水稻细菌性基腐病(专利申请号：CN113278541A)、黄瓜细菌性角斑病(专利申请号：CN112746046A)等。
目前，国内外利用贝莱斯芽孢杆菌防治荔枝霜疫病的研究尚未见报道。有3个专利申请中提到贝莱斯芽孢杆菌对包括荔枝霜疫霉在内的多种病原菌的室内抑制作用，但均未进行活体或田间防治试验(CN109022304A、CN111040974A和CN117004517A)。申请人分离获得的贝莱斯芽孢杆菌YL2021作用标靶病原菌与以往研究报道的完全不同，具体如下：1、众所周知，贝莱斯芽孢杆菌是生产应用上较为广阔的一类生防菌。需要强调的是：在贝莱斯芽孢杆菌这个大家族中，不同菌株的靶标病原菌不完全一致。一株贝莱斯芽孢杆菌对病原菌有抑制作用，并不能代表所有的贝莱斯芽孢杆菌对该病原菌有抑制作用。申请人分离获得的贝莱斯芽孢杆菌YL2021对包括荔枝霜疫霉在内的多种卵菌均有防治作用，其他贝莱斯芽孢杆菌未必均有防治作用。进一步说，虽然辣椒疫霉、致病疫霉、荔枝霜疫霉、瓜果腐霉和悬柄植物腐霉等均属于卵菌，但其形态特征、生物学特性、致病机理及侵染循环等千差万别。因此已有文献报道能防治辣椒疫病、马铃薯晚疫病的贝莱斯芽孢杆菌未必就能防治荔枝霜疫病等其他卵菌病害。2、平板对峙生长实验一般只是用来筛选有希望的生防菌，但早有研究报道，皿内菌株拮抗实验与实际防治效果之间缺乏必然的联系(Weller D.H.，AnnualReview Phytopathology，26：379-407，1988)。因此一株优良性状的生防菌除了平板对峙生长实验抑菌作用显著外，必须形成产品去田间应用考证。目前虽然有3个申请专利提到贝莱斯芽孢杆菌对荔枝霜疫霉的室内抑制作用，但其是不是一株优良性状的生防菌还需要田间应用试验来验证。
终上所述，本发明解决的问题是：1、明确贝莱斯芽孢杆菌YL2021对包括荔枝霜疫霉在内的多种卵菌均具有良好的室内抑制作用；2、筛选并优化贝莱斯芽孢杆菌YL2021发酵培养基组分，发酵生产形成产品；3、利用贝莱斯芽孢杆菌YL2021发酵产品，开展包括荔枝霜疫病在内的多种卵菌病害活体或田间防治试验。目前国内外均未见相关报道，本专利具有创造性和新颖性。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有较好应用前景的生防菌株-贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YL2021，该菌株已于2022年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.24302。
本发明提供了一种生防菌剂，其中有效活性成分由贝莱斯芽孢杆菌YL2021组成。
本发明所述的生防菌剂，其发酵培养基组分为：葡萄糖20g/L，NH4Cl 2g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，KH2PO40.5g/L，天冬酰氨1g/L。
本发明所述的生防菌剂，它是水剂。
本发明所述的水剂，其特征在于：各组成及重量百分含量如下：贝莱斯芽孢杆菌YL2021：89.5-99.8％；十二烷基磺酸钠：0.1-10％；山梨酸钾：0.1-0.5％；pH6.5-7.0。
本发明所述的水剂灌根用于防治辣椒疫病，果实表面均匀喷施用于防治荔枝霜疫病，叶片表面均匀喷施用于防治马铃薯晚疫病和黄瓜霜霉病。
本发明的优点在于：开发对人畜安全、对多种植物卵菌病害具有较好防治作用的贝莱斯芽孢杆菌YL2021，达到利用生防菌剂防治植物卵菌病害，减少化学药剂用药量；同时改善生态环境、减少化学药剂在农产品中残留量的目的。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是Plich’s培养基中贝莱斯芽孢杆菌YL2021对几种卵菌的抑制作用
图中A：贝莱斯芽孢杆菌YL2021；B：辣椒疫霉；C：致病疫霉；D：荔枝霜疫霉；E：瓜果腐霉；F：悬柄植物腐霉
图2是优化后NP培养基中贝莱斯芽孢杆菌YL2021对几种卵菌的抑制作用
图中A：贝莱斯芽孢杆菌YL2021；B：辣椒疫霉；C：致病疫霉；D：荔枝霜疫霉；E：瓜果腐霉；F：悬柄植物腐霉
具体实施方式：
实施例1 确定贝莱斯芽孢杆菌YL2021和卵菌对峙生长时的最适培养基
卵菌由于其菌丝呈丝状生长的特性，一直以来被当作真菌，但其实卵菌与真菌亲源关系较远。特别是细胞壁成分差异很大，真菌细胞壁的主要成分是几丁质，而卵菌细胞壁的主要成分是纤维素，因此卵菌的生长特性与真菌完全不同。常见的真菌生长培养基(如PDA培养基)可能并不是卵菌的最适生长培养基，对评价生防菌的抑菌活性就会产生干扰影响，造成结果不准确。据此，申请者查阅国内外文献，从生防菌和卵菌的常见培养基中选择了8种代表性的培养基，分别开展卵菌生长能力测试和生防菌室内抑制实验，旨在明确合适的培养基，既然满足卵菌的正常生长，同时生防菌的抑菌效果最佳。
A、供试培养基及组分
8种培养基：①Luria-Bertani(LB)培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、琼脂20g、加水至1000mL；②丁二酸培养基(Succinic Acid Medium)：KH2PO43g、K2HPO46g、MgSO4·7H2O 0.1g、(NH4)2SO41g、丁二酸4g、琼脂20g、加水至1000mL；③M9基础培养基(M9 Minimal Medium)：配置10×M9盐溶液：Na2HPO460g、KH2PO430g、NaCl 5g、NH4Cl10g，水1000mL，pH7.4，灭菌备用。1M MgSO4溶液：MgSO4·7H2O 2.46g，水10mL，灭菌备用。1MCaCl2溶液：CaCl21.11g，水10mL，灭菌备用。40％葡萄糖溶液：葡萄糖8g，蒸馏水20mL，0.22微米滤器过滤除菌。无菌操作配制M9培养基：10×M9盐溶液100mL、1M MgSO4溶液2mL、1M CaCl2溶液0.1mL、40％葡萄糖溶液5mL、琼脂20g、加水至1000mL；④PDA培养基(Potato DextroseAgar)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、加水至1000mL；⑤10％V8培养基：V8汁100mL、CaCO30.2g、琼脂20g、加水至1000mL；⑥黑麦培养基：黑麦60g，用800mL水浸泡，高压蒸汽灭菌30min，后用搅拌机打碎，4层纱布过滤，加水至1000mL。分装，每200mL加入蔗糖4g和琼脂4g；⑦Plich’s培养基：KH2PO40.5g、MgSO4·7H2O 0.25g、Yeast extract 0.5g、天冬酰氨1g、葡萄糖25g、琼脂20g、加水至1000mL；⑧黑麦和V8蔬菜汁混合培养基：黑麦60g，用600-800mL水浸泡，高压蒸汽灭菌30min，后用搅拌机打碎，4层纱布过滤获得液体；取150ml的V8蔬菜汁，加入1.5g碳酸钙搅拌均匀后用2层纱布过滤出100ml滤液，加入到黑麦汁中，加水至1000mL，并加入蔗糖20g和琼脂20g。
B、试验方法：
不同培养基中供试卵菌的生长情况测试：各卵菌在PDA平板18-25℃培养7d后，沿菌落边缘用直径5mm的打孔器打孔，将菌块置于8种不同培养基平板中央，分别于接种后5d和10d调查卵菌生长情况。
贝莱斯芽孢杆菌YL2021菌液制备：将菌株YL2021的新鲜菌苔接种于20mL LB液体培养基中，28℃、150rpm培养过夜，按照1∶100的比例接种于100mL LB液体培养基中，28℃、150r/min摇培至OD600＝1.0，用无菌水调至菌含量108CFU/mL，备用。
贝莱斯芽孢杆菌YL2021与卵菌对峙生长拮抗实验：各卵菌在PDA平板18-25℃培养7d后，沿菌落边缘用直径5mm打孔器打孔，将菌块置于8种不同培养基平板中央。培养皿四周呈“十”字形(距培养皿中心30mm)滴加拮抗菌发酵液(平板水平线，菌含量108CFU/mL)和清水对照(平板竖直线)各25μL。每处理重复3皿。18-25℃恒温培养7d，测量不同培养基中贝莱斯芽孢杆菌YL2021生长情况，计算抑制率。
抑制率(％)＝[(对照卵菌生长直径-处理卵菌生长直径)/对照卵菌生长直径]×100％。
C、试验结果：
试验结果见表1、表2和图1。结果表明：不同卵菌在8种供试培养基中生长不一致。其中致病疫霉不能在LB培养基、丁二酸培养基和M9培养基中生长，在PDA培养基、10％V8培养基和Plich’s培养基中生长一般，适合在黑麦培养基、黑麦和V8蔬菜汁混合培养基中生长。荔枝霜疫霉适合在10％V8培养基、黑麦培养基、Plich’s培养基、黑麦和V8蔬菜汁混合培养基中生长，在LB培养基和PDA培养基中生长一般，而在丁二酸培养基和M9培养基中生长较差。辣椒疫霉、瓜果腐霉和悬柄植物腐霉3株卵菌对培养基的生长要求基本一致，适合LB培养基、PDA培养基、10％V8培养基、黑麦培养基、Plich’s培养基、黑麦和V8蔬菜汁混合培养基中生长，生长10d后菌丝生长直径达83-90mm，在丁二酸培养基和M9培养基和生长一般。综上所述，5株卵菌能在PDA培养基、10％V8培养基、黑麦培养基、Plich’s培养基、黑麦和V8蔬菜汁混合培养基中生长良好(表1)。
贝莱斯芽孢杆菌YL2021在LB培养基、PDA培养基、10％V8培养基、Plich’s培养基、黑麦和V8蔬菜汁混合培养基中生长良好，而在丁二酸培养基、M9培养基和黑麦培养基中生长较差(表2)。室内对峙生长试验结果表明(表2、图1)：在8种供试培养基中，贝莱斯芽孢杆菌YL2021对不同卵菌的室内抑制作用在Plich’s培养基中表现最明显，抑制率达43.28％～57.86％。因此我们选择Plich’s培养基作为初始培养基进行优化。
表1 不同培养基中供试卵菌的生长情况
表2 不同培养基中贝莱斯芽孢杆菌YL2021的菌落生长直径及其对供试卵菌的抑制作用
如图1所示。
实施例2 不同碳源、氮源对菌株YL2021生长及其对卵菌的抑制作用影响
A、供试病原菌：
病原菌包括辣椒疫霉、致病疫霉、荔枝霜疫霉、瓜果腐霉和悬柄植物腐霉，均由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。选择实施例1中的Plich’s培养基作为初始培养基。
B、试验方法：
碳源优化：在Plich’s培养基中加入25g/L不同碳源(葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、蔗糖和甘油)，灭菌倒平板备用。
氮源优化：在Plich’s培养基中加入0.5g/L不同氮源(蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、KNO3、(NH4)2SO4和NH4Cl)，灭菌倒平板备用。
贝莱斯芽孢杆菌YL2021菌液制备同实施例一。
贝莱斯芽孢杆菌YL2021与卵菌对峙生长拮抗实验同实施例一。各卵菌菌块置于不同碳源(或氮源)培养基平板中央。培养皿四周呈“十”字形(距培养皿中心30mm)滴加拮抗菌发酵液(平板水平线，菌含量108CFU/mL)和清水对照(平板竖直线)各25μL。每处理重复3皿。18-25℃恒温培养7d，测量不同碳源(或氮源)培养基中贝莱斯芽孢杆菌YL2021生长情况，计算抑制率。
抑制率＝[(对照卵菌生长直径-处理卵菌生长直径)/对照卵菌生长直径]×100％。
C、试验结果：
试验结果见表3。不同碳源处理的培养基中，以葡萄糖为唯一碳源的培养基(即初始培养基，Plich’s培养基)最有利于贝莱斯芽孢杆菌YL2021的生长，菌落生长直径为11.5mm；其次是以蔗糖为唯一碳源的培养基，菌落直径为10.2mm，显著高于其他处理。葡萄糖作为唯一碳源时菌株YL2021的抑菌活性亦最强，其次是蔗糖作为唯一碳源的处理。在可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖和甘油作为碳源的培养基中，致病疫霉不能生长，菌株YL2021对瓜果腐霉无抑菌作用，对辣椒疫霉、荔枝霜疫霉和悬柄植物腐霉的抑菌作用较低，平均在12.13～27.38％(表3)。
表4结果表明，菌株YL2021在以KNO3为唯一氮源的培养基中生长较差(菌落直径为6.2mm)，其他有机氮源(蛋白胨、酵母粉和黄豆粉)和无机氮源((NH4)2SO4和NH4Cl)的培养基中菌株YL2021生长情况几乎一致，菌落直径为9.6～11.5mm。但是6种不同的氮源培养基中菌株YL2021的抑菌作用各不相同，以黄豆粉和KNO3为唯一氮源的培养基中，菌株YL2021对瓜果腐霉无抑制作用；以蛋白胨、酵母粉和(NH4)2SO4为唯一氮源的培养基中，菌株YL2021对测试的5种卵菌室内抑制作用相当；菌株YL2021在以NH4Cl为唯一氮源的培养基中，对测试的5种卵菌室内抑制作用最强，抑制率达44.58～65.27％(表4)。综上所述，选用葡萄糖和NH4Cl作为最佳碳源和氮源进行后续试验。
表3 不同碳源培养基中菌株YL2021生长情况及其对供试卵菌的抑制作用
表4 不同氮源培养基中菌株YL2021生长情况及其对供试卵菌的抑制作用
实施例3 采用正交实验优化贝莱斯芽孢杆菌YL2021与卵菌对峙生长的培养基
A、供试病原菌：
病原菌包括辣椒疫霉、致病疫霉、荔枝霜疫霉、瓜果腐霉和悬柄植物腐霉，均由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。选择实施例1中的Plich’s培养基作为初始培养基。
B、试验方法：
利用正交法(参考文献：王辰，张谷月，张园园，等.白刺链霉菌(Streptomycesalbospinus)CT205菌株发酵条件优化及其次生代谢产物性质研究[J].南京农业大学学报，2015，38(2)：304-310)设计二因素四水平的正交试验，把已确定的合适碳源、氮源以浓度梯度分别加入到初始培养基(即Plich’s培养基)中，灭菌倒平板，备用。
贝莱斯芽孢杆菌YL2021菌液制备同实施例一。
贝莱斯芽孢杆菌YL2021与卵菌对峙生长拮抗实验同实施例一。各卵菌菌块(5mm)置于培养基平板中央。培养皿四周呈“十”字形(距培养皿中心30mm)滴加拮抗菌发酵液(平板水平线，菌含量108CFU/mL)和清水对照(平板竖直线)各5μL。每处理重复3皿。18-25℃恒温培养7d，测量不同培养基中贝莱斯芽孢杆菌YL2021生长情况，计算抑制率。
抑制率＝[(对照卵菌生长直径-处理卵菌生长直径)/对照卵菌生长直径]×100％。
C、试验结果：
根据单因素试验结果，选择葡萄糖作为碳源，NH4Cl作为氮源，设计A、B两因素四水平L16(42)的正交试验，因素水平和试验结果见表5和表6。表6显示编号7、8、10、11、12、14、15、16组合的试验结果较好，其中编号7(组合A2B3)组合对5中卵菌的室内抑制作用最强，抑制率达62.92％～75.24％，同时拮抗细菌YL2021的生长较好，菌落生长直径为11.5mm。由此确定最优发酵培养基(New Plich’s培养基，简称NP培养基)配方：葡萄糖20g、NH4Cl 2g、MgSO4·7H2O 0.25g、KH2PO40.5g、天冬酰氨1g、琼脂20g、加水至1000mL。
表5 优化培养基的L16(42)正交试验因素和水平
表6 贝莱斯芽孢杆菌YL2021发酵培养基碳源、氮源正交试验结果
如图2所示。
实施例4 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂的获得
A、菌种准备及活化。
贝莱斯芽孢杆菌YL2021在LB试管斜面上活化，28℃培养24h。
B、液体发酵。
一级发酵：将上述培养好的试管斜面，用接种环移两环菌苔入500mL实施例3提供的NP液体培养基中，30℃、150rpm发酵生产24h，共获得2瓶种子液备用。
二级发酵：80升小型发酵罐中投料50升，调节pH值为7.0，121℃灭菌30分钟。冷却至30.3℃左右时接种上述一级发酵种子液1000mL(接种量约为2％)，搅拌转速200rpm，发酵周期为24h，放罐。
C、水剂配置。
发酵液放灌入沉降池中，加入十二烷基磺酸钠0.1-10％、山梨酸钾0.1-0.5％，搅拌均匀。测得pH值为6.5-7.0。灌装，获得贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂。
实施例5 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂对荔枝霜疫病的活体防治效果
试验地点：江苏省农业科学院内。
试验品种：妃子笑(市售品种)。
试验药剂和对照药剂：贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂由实施例4提供。对照药剂为25％嘧菌酯悬浮剂，广西鑫金泰化工有限公司生产，按其田间推荐剂量使用。
病原菌接种液的制备：荔枝霜疫霉菌株在NP培养基(实施例3提供)上活化，25℃培养5-7d，用无菌水清洗并过滤，滤液即为游动孢子囊悬浮液。显微镜观察其个数，用无菌水调至5×104个孢子囊/mL，备用。
试验方法：室温条件下，将市场采购的“妃子笑”荔枝放置于75％酒精消毒的保鲜盒(350mm×250mm×120mm)中。盒底铺上灭菌滤纸，灭菌水保湿。荔枝果实表面均匀喷雾施药50mL。试验设贝莱斯芽孢杆菌水剂100倍稀释液、200倍稀释液、25％嘧菌酯悬浮剂1500倍稀释液和清水对照共计4个处理，每个处理3次重复，每个重复30个果实。药剂处理24h后喷雾接种荔枝霜疫霉孢子液(接种浓度为5×104个孢子囊/mL)25mL，25℃保湿培养，隔天开始每天观察荔枝发病情况，计算病情指数和防治效果。
荔枝发病情况根据果实表面病斑面积占果实面积的比例进行分级：
0级：果实无病斑；
1级：病斑面积占整个果面积的5％以下；
3级：病斑面积占整个果面积的6％-15％；
5级：病斑面积占整个果面积的16％-25％；
7级：病斑面积占整个果面积的26％-50％；
9级：病斑面积占整个果面积的50％以上或果实全部白霉。
病情指数＝[∑(各级病果数×病级数)/调查总果数×最高病级]×100；
防治效果(％)＝(对照病指-处理病指)/对照病指×100。
试验结果见表7。用药2d后贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液、200倍稀释液和对照药剂25％嘧菌酯悬浮剂1500倍稀释液对荔枝霜疫病的防效无显著性差异，防效高达85.02％-90.51％。随后，荔枝果实发病严重，用药后7d，YL2021水剂100倍稀释液与对照药剂25％嘧菌酯悬浮剂1500倍稀释液的防效相当，防效分别为75.37％和73.21％；YL2021水剂200倍稀释液的防效较差，仅为44.58％。试验结果表明：YL2021水剂100倍稀释液能有效防治荔枝霜疫病。
表7 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂对荔枝霜疫病的活体防治效果
注：同一列不同小写字母表明呈显著性差异。
实施例6 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂对马铃薯晚疫病的苗期防治效果
试验地点：江苏徐淮地区徐州农业科学研究所试验田。
试验品种：费乌瑞它(又称“荷兰薯”、“荷兰15”)，由徐州市农业科学院提供。
试验药剂和对照药剂：贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂由实施例4提供。对照药剂为65％代森锌可湿性粉剂，江苏长青生物科技有限公司生产，按其田间推荐剂量(75-112克/亩)使用。
病原菌接种液的制备：致病疫霉在NP培养基(实施例3提供)上活化，18℃培养10-15d，用无菌水清洗并过滤，滤液即为游动孢子囊悬浮液。显微镜观察其个数，用无菌水调至5×104个孢子囊/mL，备用。
试验方法：将马铃薯块茎种植于装有基质的盆钵(直径为15cm)中，每个盆钵中播种一份马铃薯块茎，16-20℃培养。发芽后生长30天，选择生长一致的马铃薯幼苗均匀喷雾施药(20mL/棵苗)。试验设贝莱斯芽孢杆菌水剂100倍稀释液、200倍稀释液、65％代森锌可湿性粉剂和清水对照共计4个处理，每个处理3次重复，每个重复15棵苗。药剂处理24h后接种病原菌，接种浓度5×104个孢子囊/mL，接种量为10mL/棵苗。接种病原菌后7d和10d调查各处理叶片的发病情况，计算病情指数和防治效果。
马铃薯晚疫病分级标准如下：
0级：无病斑；
1级：叶片病斑面积占整个叶片面积的5％以下；
3级：病斑面积占整个叶片面积的6％-10％；
5级：病斑面积占整个叶片面积的11％-20％
7级：病斑面积占整个叶片面积的21％-50％
9级：病斑面积占整个叶片面积的51％以上。
病情指数＝[∑(各级病叶数×病级数)/调查总叶数×最高病级]×100；
防治效果(％)＝(对照病指-处理病指)/对照病指×100。
试验结果见表8。用药7d后，贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液的防效与对照药剂65％代森锌可湿性粉剂的防效相当，两者无显著性差异，防效分别为76.21％和71.96％。用药10d后，YL2021水剂100倍稀释液与对照药剂65％代森锌可湿性粉剂的防效均下降，分别为52.52％和52.15％。贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂200倍稀释液的防效较差，用药10d后防效仅为27.47％。结果表明：贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液能防治苗期马铃薯晚疫病。
表8 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂对马铃薯晚疫病的苗期防治效果
注：同一列不同小写字母表明呈显著性差异。
实施例7 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂防治辣椒疫病的田间实验
试验地点：江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所试验田。
试验品种：苏椒5号，由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。
试验药剂和对照药剂：贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂由实施例4提供。对照药剂为1％申嗪霉素悬浮剂，湖北天泽农生物工程有限公司生产，按其田间推荐剂量(50-120毫升/亩)使用。
试验方法：在辣椒疫病发生初期开始灌根用药，间隔10d左右进行第二次防治。每次用50L/亩。试验设贝莱斯芽孢杆菌水剂100倍稀释液、200倍稀释液、1％申嗪霉素悬浮剂和清水对照共计4个处理。每个处理3次重复，共计12个小区，小区面积20m2。各小区随机排列，相邻小区设保护行，防止药剂漂移及其他可能影响试验结果的情况。每个小区随机调查5点，每点随机调查5株，第二次药后15d和30d分别调查辣椒发病情况，计算病情指数和防治效果。
辣椒疫病分级标准：
0级：健康无症；
1级：地上部仅叶、果有病斑；
3级：地上茎、枝有褐腐斑；
5级：茎基部有褐腐斑；
7级：地上茎、枝与茎基部均有褐腐斑，并且部分枝条枯死；
9级：全株枯死。
病情指数＝∑(各级病株数×病级数)/(调查总株数×最高病级值)×100；
防治效果(％)＝(对照病指-处理病指)/对照病指×100。
试验结果见表9。第二次药后15d和30d，对照药剂1％申嗪霉素悬浮剂按照50-120毫升/亩的使用剂量对辣椒疫病的防效分别为70.72％和78.83％。贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液的防效与对照药剂相当，第二次药后15d和30d，对辣椒疫病的防效分别为69.62％和80.92％；YL2021水剂200倍稀释液的防效略低，分别为62.91％和68.53％。结果表明：贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液和200倍稀释液均能有效防治辣椒疫病。
表9 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂对辣椒疫病的田间防治效果
实施例8 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂防治黄瓜霜霉病的田间实验
试验地点：江苏省农业科学院溧水实验基地。
试验品种：研四黄瓜(市售品种)。
试验药剂和对照药剂：贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂由实施例4提供。对照药剂为80％代森锰锌可湿性粉剂，安道麦股份有限公司生产，按其田间推荐剂量(150-200克/亩)使用。
试验方法：在黄瓜霜霉病零星发生初期开始叶片喷雾用药，每间隔7d左右进行施药，共施药3次。每次用50L/亩。试验设贝莱斯芽孢杆菌水剂100倍稀释液、200倍稀释液、80％代森锰锌可湿性粉剂和清水对照共计4个处理。每个处理3次重复，共计12个小区，小区面50m2。各小区随机排列，相邻小区设保护行。每小区随机取4点调查，每点调查两株，每株调查全部叶片。每次药后7d调查黄瓜叶片的发病情况，计算病情指数和防治效果。
黄瓜霜霉病的分级方法(以叶片为单位)：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占整片叶面积的5％以下；
3级：病斑面积占整片叶面积的6-10％；
5级：病斑面积占整片叶面积的11-25％；
7级：病斑面积占整片叶面积的26-50％；
9级：病斑面积占整片叶面积的51％以上。
病情指数＝∑(各级病叶数×病级数)/(调查总叶数×最高病级值)×100；
防治效果(％)＝(对照病指-处理病指)/对照病指×100。
试验结果见表10。贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液、200倍稀释液和对照药剂80％代森锰锌可湿性粉剂对黄瓜霜霉病均有良好的防治效果。第一次药后7d，3种试验药剂的防效为76.34～79.02％，三者无显著性差异。第二次药后7d，贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液和对照药剂80％代森锰锌可湿性粉剂的防效相当，无显著性差异。贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂200倍稀释液对黄瓜霜霉病的防效略低，但仍达83.90％。第三次药后7d，贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液和对照药剂80％代森锰锌可湿性粉剂的防效显著，均大于90％；贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂200倍稀释液对黄瓜霜霉病的防效达84.70％。结果表明：贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂100倍稀释液和200倍稀释液均能有效防治黄瓜霜霉病。
表10 贝莱斯芽孢杆菌YL2021水剂对黄瓜霜霉病的田间防治效果
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Claims (2)
1.一种生防菌剂及其应用，其特征在于：所述生防菌剂中有效活性成分由贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)YL2021组成；所述生防菌剂为水剂；所述生防菌剂灌根用于防治辣椒疫病，果实表面均匀喷施用于防治荔枝霜疫病，叶片表面均匀喷施用于防治马铃薯晚疫病和黄瓜霜霉病。
2.根据权利要求1所述的生防菌剂，其特征在于：所述生防菌剂发酵培养基组分为：葡萄糖20g/L，NH4Cl 2g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，KH2PO4 0.5g/L，天冬酰氨1g/L。所述生防菌剂各组成及重量百分含量如下：贝莱斯芽孢杆菌：89.5-99.8％；十二烷基磺酸钠：0.1-10％；山梨酸钾：0.1-0.5％，pH 6.5-7.0。
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