CN117980318A - 一种甾体类化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种甾体类化合物、其制备方法及其应用。一方面提供了式I所示化合物、其制备方法及其在羊毛甾醇的分离纯化方法中的应用，另一方面提供了一种羊毛甾醇的分离纯化方法，该方法操作简单、工艺稳定、产能大、成本低，且得到羊毛甾醇纯度高，能够满足其医药应用。
Description
本申请要求申请日为2021年8月31日的中国专利申请2021110137424的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
本发明涉及有机化合物的分离纯化领域，具体涉及一种甾体类化合物其制备方法及其应用。
羊毛甾醇属于四环三萜类化合物，是胆甾醇生物合成的中间体。目前，羊毛甾醇主要从羊毛甾醇粗品中分离提取获得。然而，羊毛甾醇粗品是从羊毛脂中通过结晶分离出来的一类四环三萜类混合物，其中一般含约60％的羊毛甾醇(CAS号：79-63-0)和约30％的二氢羊毛甾醇(CAS号：79-62-9)，以及其它杂质，例如胆固醇(CAS号：57-88-5)等。其中，由于羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇极性十分相近，非常难以将二者分离开。
虽然CN101691391报道了羊毛甾醇的高效液相色谱分离制备，分离纯度达97％，但制备量仅为250mg，成本高昂，难以大规模商业化生产。目前，尚未有规模化生产制备纯度高于90％的羊毛甾醇的纯化工艺，难以满足医药应用的需求。
此外，羊毛甾醇和其它杂质化合物的分离也非常困难，几乎难以通过柱层析和重结晶完全分离出羊毛甾醇。例如，有研究发现将混有其它杂质的羊毛甾醇进行重结晶后，发现析出的羊毛甾醇的晶体中杂质比例与结晶前无显著变化。
因此，为了更好的研究羊毛甾醇并将其应用到医药领域，市面上亟需一种分离纯化羊毛甾醇的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本发明提供了一种甾体类化合物其制备方法及其应用，本发明还提供了一种纯化羊毛甾醇的方法，该方法可从羊毛甾醇粗品中分离纯化羊毛甾醇，操作简单、工艺稳定、产能大、成本低，且得到的羊毛甾醇纯度高，能够满足其医药应用。
本发明的一个方面，提供了一种化合物，其具有式I所示的结构，
其中，X为
R
1、R
2和R
3各自独立地为C
1-4烷基、C
1-4烷氧基、5-9元杂芳基或C
6-10芳基，所述5-9元杂芳基中杂原子选自N、O或S，所述5-9元杂芳基中杂原子的个数为1、2或3个；
根据本发明的一些实施方式，X为TMS、TES、TBS、TBDPS、TIPS、DMIPS、TBDMS或MDIPS。
本发明的另一个方面，提供了一种所述式I化合物的制备方法，其包括以下步骤：羊毛甾醇与羟基保护剂反应，得到式I化合物。
根据本发明的一些实施方式，所述羟基保护剂为硅醚保护剂；根据本发明的一些实施方式，所述羟基保护剂为选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三叔丁基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、二甲基异丙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、甲基二异丙基氯硅烷、三异丙基氯硅烷和叔丁基二甲基硅基三氟甲磺酸酯。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇与所述羟基保护剂的反应可以在有机溶剂的存在下进行。根据本发明的另一些实施方式，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇与所述羟基保护剂的反应是在缚酸剂的存在下反应的；根据本发明的另一些实施方式，所述缚酸剂为有机碱或无机碱；根据本发明的再一些实施方式，所述缚酸剂为吡啶、咪唑、二异丙胺、三乙胺、三乙醇胺、碳酸钾或碳酸钠。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇与所述羟基保护剂的反应可以在25～120℃的温度下进行。根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的反应可以在60～85℃的温度下进行。
本发明的另一方面，提供了一种所述式I化合物的分离纯化方法，其包括以下步骤，将原料A通过柱层析进行分离纯化；得到式I化合物；所述原料A包含式I化合物和式 I’化合物；
根据本发明的一些实施方式，所述的原料A中，所述的化合物I的质量百分比为45％-85％；根据本发明的一些实施方式，所述的原料A中，所述的化合物I的质量百分比为55％～70％；根据本发明的一些实施方式，所述的原料A中，所述的化合物I的质量百分比为60％-70％。
根据本发明的一些实施方式，所述柱层析为硅胶柱层析。
根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析中所选用的硅胶的规格为100～200目、200～300目或300～400目。
根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂为石油醚、正庚烷、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂中加入氨水。根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂可以为正庚烷与乙酸乙酯的混合物，正己烷与乙酸乙酯的混合物，或者正庚烷、乙酸乙酯和氨水的混合物。根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂可以为正庚烷与乙酸乙酯的混合物，其中正庚烷与乙酸乙酯的体积比为(90～100):(10～0)，例如为100:1。根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂可以为正己烷与乙酸乙酯的混合物，其中正己烷与乙酸乙酯的体积比为(90～100):(10～0)，例如为100:1。
根据本发明的一些实施方式，所述原料A与100～200目硅胶拌样之后，再进行上述硅胶柱层析。
根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析可以进行1次或多次，例如进行1、2、3、4或5次。
根据本发明的一些实施方式，所述式I化合物的分离纯化方法，进一步包括以下步骤：将羊毛甾醇粗品与羟基保护剂反应，得到所述的原料A；
根据本发明的一些实施方式，所述羟基保护剂为硅醚保护剂；例如选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三叔丁基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、二甲基异丙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、甲基二异丙基氯硅烷、三异丙基氯硅烷和叔丁基二甲基硅基三氟甲磺酸酯。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的反应在有机溶剂的存在下进行。根据本发明的一些实施方式，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的反应是在缚酸剂的存在下反应的。根据本发明的一些实施方式，所述缚酸剂为有机碱或无机碱；根据本发明的一些实施方式，所述缚酸剂为吡啶、咪唑、二异丙胺、三乙胺、三乙醇胺、碳酸钾或碳酸钠。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的反应在25～120℃的温度下进行；根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的反应在60～85℃的温度下进行。
本发明的另一个方面，提供了一种所述式I化合物在分离纯化羊毛甾醇中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述应用包含以下步骤：对式I化合物进行羟基脱保护，得到羊毛甾醇；
根据本发明的一些实施方式，所述羟基脱保护在乙酸、四烷基氟化铵、三氟乙酸或 盐酸中的一种或多种的存在下进行。根据本发明的一些实施方式，所述羟基脱保护在四丁基氟化铵存在下进行。
根据本发明的一些实施方式，所述应用进一步包括以下步骤：将原料A通过柱层析进行分离纯化；得到式I化合物；所述原料A包含式I化合物和式I’化合物；
其中，X为
R
1、R
2和R
3各自独立地为C
1-4烷基、C
1-4烷氧基、5-9元杂芳基或C
6-10芳基，所述5-9元杂芳基中杂原子选自N、O或S，所述5-9元杂芳基中杂原子的个数为1、2或3个。
根据本发明的一些实施方式，所述X为TMS、TES、TBS、TBDPS、TIPS、DMIPS、TBDMS或MDIPS。
根据本发明的一些实施方式，所述的原料A中，所述的化合物I的质量百分比为45％-85％；根据本发明的一些实施方式，所述的原料A中，所述的化合物I的质量百分比为55％～70％；根据本发明的一些实施方式，所述的原料A中，所述的化合物I的质量百分比为60％-70％。
根据本发明的一些实施方式，所述柱层析为硅胶柱层析。
根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析中所选用的硅胶的规格为100～200目、200～300目或300～400目。
根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂为石油醚、正庚烷、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种。根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂中加入氨水。根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂可以为正庚烷与乙酸乙酯的混合物，正己烷与乙酸乙酯的混合物，或者正庚烷、乙酸乙酯和氨水的混合物。根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂可以为正庚烷与乙酸乙酯的混合物，其中正庚烷与乙酸乙酯的体积比为(90～100):(10～0)， 例如为100:1。根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂可以为正己烷与乙酸乙酯的混合物，其中正己烷与乙酸乙酯的体积比为(90～100):(10～0)，例如为100:1。
根据本发明的一些实施方式，所述原料A与100～200目硅胶拌样之后，再进行上述硅胶柱层析。
根据本发明的一些实施方式，所述硅胶柱层析可以进行1次或多次，例如进行1、2、3、4或5次。
根据本发明的一些实施方式，所述应用进一步包括以下步骤：将羊毛甾醇粗品与羟基保护剂反应，得到所述的原料A；
根据本发明的一些实施方式，所述羟基保护剂为硅醚保护剂；例如选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三叔丁基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、二甲基异丙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、甲基二异丙基氯硅烷、三异丙基氯硅烷和叔丁基二甲基硅基三氟甲磺酸酯。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的反应在有机溶剂的存在下进行。根据本发明的一些实施方式，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的反应是在缚酸剂的存在下反应的。根据本发明的一些实施方式，所述缚酸剂为有机碱或无机碱；根据本发明的一些实施方式，所述缚酸剂为吡啶、咪唑、二异丙胺、三乙胺、三乙醇胺、碳酸钾或碳酸钠。
根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的反应在25～120℃的温度下进行；根据本发明的一些实施方式，所述羊毛甾醇粗品与所述羟基保护剂的 反应在60～85℃的温度下进行。
本发明的另一方面，提供了一种式I化合物的精制方法，其包括以下步骤：将原料A通过重结晶得到所述的式I化合物；所述原料A包含式I化合物和式I’化合物；
其中X的定义如前所述，所述重结晶的溶剂选自：
1)乙酸乙酯与异丙醇的混合物，或2)乙酸异丙酯。
根据本发明的一些实施方式，所述乙酸乙酯与异丙醇的混合物中，乙酸乙酯与异丙醇的体积比为1:(0.5～10)；优选地，为1:(1～10)，例如1:(0.5～2)。
根据本发明的一些实施方式，所述原料A中，所述式I化合物的质量百分比为75％以上，优选地，为85％以上，更优选地，为90％以上。
根据本发明的一些实施方式，所述重结晶包括先将所述原料A溶解在所述溶剂中，升高温度至溶解，然后降低至室温。
本发明的另一方面，提供了一种组合物Y，其包括式I化合物和式I’化合物，
其中，X为
R
1、R
2和R
3各自独立地为C
1-4烷基、C
1-4烷氧基、5-9元杂芳基或C
6-10芳基，所述5-9元杂芳基中杂原子选自N、O或S，所述5-9元杂芳基中杂原子的个数为1、2或3个。
根据本发明的一些实施方式，X为TMS、TES、TBS、TBDPS、TIPS、DMIPS、TBDMS 或MDIPS。
根据本发明的一些实施方式，所述组合物Y中，所述式I化合物的质量百分比为55％-95％，例如为56％、57％、58％、59％、60％、61％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或94％。
本发明的另一方面，提供了一种纯化羊毛甾醇的方法，所述方法包括：
1)使羊毛甾醇粗品与羟基保护剂反应，得到所述原料A，所述原料A包含式I化合物和式I’化合物；
2)将所述原料A进行柱层析，分离得到式I化合物；和
3)对所述式I化合物进行羟基脱保护，得到纯化的羊毛甾醇；
其中，所述羊毛甾醇粗品包含羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇；
所述羟基保护剂为硅醚保护剂。
根据本发明的一些实施方式，所述硅醚保护剂选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三叔丁基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、二甲基异丙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、甲基二异丙基氯硅烷、三异丙基氯硅烷和叔丁基二甲基硅基三氟甲磺酸酯；
其中，所述纯化羊毛甾醇的方法中，原料A、式I化合物及各步骤反应条件与操作如前任意方案所述。
为了实现对羊毛甾醇粗品(原料)的纯化，本发明通过先对羊毛甾醇粗品进行羟基硅醚保护，利用经羟基硅醚保护的羊毛甾醇和羟基硅醚保护的二氢羊毛甾醇之间存在的极性差异，能够通过硅胶柱层析将二者分离开，得到纯的羟基硅醚保护的羊毛甾醇，然后脱除硅醚保护基后得到纯的羊毛甾醇。而且，本发明发现羟基硅醚保护的羊毛甾醇具有很好的结晶性质，在脱除保护基之前进行重结晶，还可以将部分杂质保留在母液中，之后再脱除羟基保护基，从而制备得到纯化的羊毛甾醇。得到的羊毛甾醇不仅符合大规模制备的商业需求，也能满足医药应用的需求。通过大量的实验证明，其他非硅醚基的羟基保护基，例如烷基醚、羧酸酯、氨基酸酯，都无法使羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇分离开。
下面提供实施例以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
本文所使用的溶剂可经市售获得。本文采用下述缩略词：
TIPS：三异丙基硅烷
TIPSCl：三异丙基氯硅烷
DMIPS：二甲基异丙基硅烷
DMIPSCl：二甲基异丙基氯硅烷
TES：三乙基硅烷
TESCl：三乙基氯硅烷
TMS：三甲基硅烷
TBDPS：叔丁基二苯基硅烷
TBDPSCl：叔丁基二苯基氯硅烷
TBS：叔丁基二甲基硅烷
TBSCl：叔丁基二甲基氯硅烷
TMSCl：三甲基氯硅烷
TLC：薄层色谱
TBAF：四丁基氟化铵
THF：四氢呋喃
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
eq：当量
化合物经手工或者
软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
羊毛甾醇原料(粗品)(供应商为山东君瑞有限公司或斯百全化学(上海)有限公司)
实施例
柱层析中，薄层色谱(TLC)跟踪洗脱液中目标中间体的洗脱情况所采用的条件为：石油醚:乙酸乙酯＝5:1，磷钼酸显色。
根据经验并结合核磁分析，将收集的含目标中间体的洗脱液的TLC结果分为三类：基本无杂质点(定义为高纯品，
1H NMR特征峰积分占比或HPLC纯度约在85～90％之间)、有杂质点但纯度有明显改善(定义为较纯品，
1H NMR特征峰积分占比或HPLC纯度约在70～85％之间)、有杂质点且无明显纯度改善且目标中间体在洗脱液中浓度较高(低纯品，
1H NMR特征峰积分占比或HPLC纯度一般＜70％)，其中纯度改善是相对当下柱层析的样品纯度而言。
实施例1
1.1羟基保护
取500g的市售羊毛甾醇原料(羊毛甾醇的纯度约为60％)，平均分成250g两等份，每一份均进行以下处理。
在15℃，向250g羊毛甾醇原料的N,N-二甲基甲酰胺溶液(2500mL)中，加入咪唑(87.8g，1.29mol)和TBSCl(132.5g，879mmol)，在85℃，搅拌6小时。然后，冷却至15℃，加石油醚(2500×2mL)萃取，石油醚相依次用饱和NaCl溶液(2000mL)和水(2000mL)洗涤。
分别得到348g的中间产物1a和350g的中间产物1b。
根据本领域常识，羟基保护反应前后，中间产物1a、1b与羊毛甾醇原料的纯度差异可忽略不计。
1.2柱层析
将348g的中间产物1a，用1000g的100～200目硅胶拌样，再用10kg的200～300目硅胶柱(1000mm×230mm)层析。用正庚烷与乙酸乙酯(100:1)的混合物进行洗脱。通过TLC跟踪洗脱进程，收集纯度较高纯品的洗脱液，经减压蒸馏干燥后，得到125g中间产物1c，收率约66％。
将350g的中间产物1b，用1000g的100～200目硅胶拌样，再用10kg的200～300目硅胶(1000mm×230mm)柱层析。用正庚烷与乙酸乙酯(100:1)的混合物进行洗脱。 通过TLC跟踪洗脱进程，收集高纯品的洗脱液，经干燥，得到121g中间产物1d，收率约64％。
将中间产物1c和1d合并，采用740g的100～200目硅胶拌样，再用7.4kg的200～300目硅胶柱(1000mm×230mm)层析，用正庚烷与乙酸乙酯(100:1)的混合物进行洗脱。通过TLC跟踪洗脱进程，收集高纯品的洗脱液，经减压蒸馏干燥后，得到179g中间产物1e，收率约47％。
将179g中间产物1e用540g 100～200目硅胶拌样，再用5.4kg 200～300目硅胶柱(1000mm×230mm)层析。用正己烷与乙酸乙酯(100:1)的混合物进行洗脱。通过TLC跟踪洗脱进程，收集高纯品的洗脱液并干燥，得到161g中间产物1f，收率约42％。对中间产物1f进行TLC监测，仍能观察到淡的杂质点存在，
1H NMR特征峰积分显示其中TBS-羊毛甾醇约占总甾醇的83％。
将161g中间产物1f，用480g 100～200目硅胶拌样，再用5.0kg 200～300目硅胶柱(1000mm×230mm)层析。用正己烷与乙酸乙酯(100:1)的混合物进行洗脱。通过TLC跟踪洗脱进程，收集高纯品的洗脱液并减压蒸馏干燥后，得到147g中间产物1h。4次纯化的总收率约39％。对中间产物1h进行TLC监测，显示杂质点不明显，
1H NMR特征峰积分显示TBS-羊毛甾醇约占总甾醇含量的91％。
1H NMR(400MHz,CDCl
3)δ＝5.07(br t,J＝7.2Hz,1H),3.17(dd,J＝4.6,11.2Hz,1H),2.05–1.35(m,24H),1.29(br s,5H),1.18–0.97(m,5H),0.95(s,3H),0.90–0.88(m,4H),0.84(s,9H),0.74(s,3H),0.66(s,3H),0.00(d,J＝2.5Hz,7H)ppm.
1.3羟基脱保护
取49.2g中间产物1h，溶解在250mL无水四氢呋喃中。在15℃，加入110mL TBAF溶液(1.0M)，加热回流16小时。TLC监测反应。反应结束后，直接减压旋干反应液得到残渣。向残渣中加入600mL甲醇，回流4小时，得到白色混悬液。在60℃搅拌24小时，然后降温到15℃，过滤，用300mL甲醇洗涤滤饼，抽干得到38.3g终产物，产率约98.4％，HPLC测得羊毛甾醇纯度约为91％。
1H NMR(400MHz,CDCl
3)δ5.12(br t,J＝7.15Hz,1H),3.26(dd,J＝4.64,11.42Hz,1H),1.73–2.13(m,10H),1.71(s,3H),1.64–1.68(m,1H),1.63(s,3H),1.05–1.59(m,12H),1.02(s,3H),1.00(s,3H),0.93(d,J＝6.27Hz,3H),0.90(s,3H),0.83(s,3H),0.71(s,3H)ppm.
实施例2
2.1羟基保护
在15℃，向市售羊毛甾醇原料(250g，羊毛甾醇的纯度约为60％)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(2500mL)溶液中，加入咪唑(87.8g，1.29mol)和TESCl(132.5g，879mmol)，在80℃，搅拌3小时。TLC监测反应。反应结束后，降温至25℃，加入600mL甲醇和300mL水，搅拌，过滤。滤饼用300mL甲醇洗涤，滤饼抽干得到341g中间产物2a。
2.2柱层析
将341g中间产物2a，采用1000g 100～200目硅胶拌样，再用10kg 200～300目硅胶柱(1000mm×230mm)层析，用正庚烷与乙酸乙酯(100:1)的混合物进行洗脱。通过TLC跟踪洗脱进程，收集高纯品的洗脱液并减压蒸馏干燥后，得到168g中间产物2b(TLC仍可观察到淡的杂质点存在)，收率约88％。
将168g中间产物2b，采用540g 100～200目硅胶拌样，再用5.4kg 200～300目硅胶柱(1000mm×180mm)层析。用正庚烷与乙酸乙酯(100:1)的混合物进行洗脱。通过TLC跟踪洗脱进程，收集基本无杂质点的洗脱液并减压蒸馏干燥后，得到117g中间产物2c，收率约62％，
1H NMR特征峰积分显示TES-羊毛甾醇约占总甾醇含量的86％。
2.3羟基脱保护
在25℃，称取27g中间产物2c，溶于干燥的THF(150mL)和TBAF(55mL，0.055mol)中，反应30分钟。然后，将温度升高至60℃，回流，搅拌4小时。通过TLC监测反应，至反应完全。加入80mL水和160mL甲醇，搅拌1小时，有固体析出。过滤，滤饼用少量水和甲醇洗涤，抽干得到18.5g白色固体终产物，收率87％，HPLC测得羊毛甾醇纯度约为89％。
实施例3
3.1羟基保护
在15℃，向市售羊毛甾醇原料(250g，羊毛甾醇的纯度约为60％)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(2500mL)溶液中，加入咪唑(87.8g，1.29mol)和TESCl(132.5g，879mmol)，在80℃，搅拌3小时。通过TLC监测反应。反应结束后，降温至25℃，加入600mL甲醇和300mL水，搅拌，过滤，滤饼用300mL甲醇洗涤，滤饼抽干得到355g中间产物3a。
3.2柱层析
将355g中间产物3a，采用1000g 100～200目硅胶拌样，再用10kg 200～300目硅胶柱(1000mm×230mm)层析。用正庚烷与乙酸乙酯(100:1)的混合物进行洗脱。通过 TLC跟踪洗脱进程，分别收集高纯品和较高纯品的洗脱液并减压蒸馏干燥后，分别得纯度约为87～89％的71g中间产物3b和纯度约为70～80％的96g中间产物3c。
将96g中间产物3c再次用300g 100～200目硅胶拌样，再用3kg 200～300目硅胶柱(1000mm×180mm)层析，用正庚烷与乙酸乙酯(100:1)混合物进行洗脱。通过TLC跟踪洗脱进程并收集纯度较高的洗脱液并减压蒸馏干燥后，得到44g中间产物3d。
合并中间产物3b和3d(命名为中间产物3e)共计115g，收率为61％，
1H NMR特征峰积分显示TES-羊毛甾醇约占总甾醇含量的约90％。
3.3羟基脱保护
在25℃，将中间产物3e(22g,0.04mol)溶于干燥的THF(120mL)中，将TBAF(45mL，0.045mol)加入到反应液中保持30分钟。然后，温度升高至60℃，回流，搅拌4小时。通过TLC监测反应。反应完全后，加入60mL水和120mL甲醇，搅拌1小时，有固体析出。过滤，滤饼用60mL水洗涤，再用100mL甲醇洗涤，过滤得滤饼，在200ml甲醇中回流3小时，冷却析出，再次过滤得到15.2g白色固体，收率约88％，HPLC测定羊毛甾醇的纯度约为92％。
实施例4
4.1重结晶
取实施例3中得到的中间产物3e，50g，加入750ml乙酸乙酯与异丙醇(体积比1:1)的混合物中，加热至90℃，回流2小时，溶清，停止搅拌，然后缓慢降温，有固体析出。过滤固体得到滤饼，滤饼经洗涤并干燥，得到40g中间产物4a，收率80％，
1H NMR特征峰积分显示TES-羊毛甾醇约占总甾醇含量的93％。
1H NMR(400MHz,CDCl
3)δ0.56–0.66(m,6H),0.70–0.91(m,9H),0.92–1.07(m,19H),1.12–1.77(m,21H),1.82–2.12(m,7H),3.25(dd,J＝11.29,4.52Hz,1H),5.12(br t,J＝7.03Hz,1H)。
4.2脱保护
在25℃，将中间产物4a(20g,0.037mol)溶于干燥的THF(120mL)中。将TBAF(1M,1.5eq)加入到反应液中，保持30分钟。将温度升高至60℃，回流，搅拌4小时。通过TLC监测至反应完全。加入60mL水和120mL甲醇，搅拌1小时，有固体析出。过滤，滤饼先后用少量水和甲醇洗涤，过滤，得滤饼。滤饼加200ml甲醇回流3小时，降温析出，过滤得到13g白色固体。收率约85％，HPLC检定羊毛甾醇的纯度>99％。
实施例5
5
.1：羟基保护
在15℃，向市售羊毛甾醇原料(250g，羊毛甾醇的纯度约60％)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(2500mL)溶液中，加入咪唑(87.75g，1.29mol)和TMSCl(95.47g，879mmol)，70℃，搅拌5小时。反应结束后，将反应液冷却至15℃，加石油醚(2500×2mL)萃取，石油醚相用饱和NaCl溶液(2000mL)，水(2000mL)分别洗涤，得到287g中间产物5a。
5.2：柱层析
将287g中间产物5a，用850g 100～200目硅胶拌样，再用8.5kg 200～300目硅胶柱(1000mm×230mm)层析，正庚烷、乙酸乙酯和氨水(100:1:0.05)的混合物进行洗脱。通过TLC跟踪观察，并收集洗脱液并减压蒸馏干燥后，得到53g产物5b，其中TMS-羊毛甾醇中间体的收率约30％，
1H NMR测定纯度约80％，TLC显示可见淡的杂质点。
实施例6
保护剂及实验条件考察实验
在15℃，向市售羊毛甾醇原料(10g，0.023mol，纯度约60％)的100mL DMF溶液中，加入咪唑(3.9g)和三乙基氯硅烷(1～2eq)。TLC监测反应结束，对于转化较干净的反应进行如下后处理操作：降至室温，加石油醚(75×2mL)萃取，石油醚相用饱和NaCl溶液(75mL)，水(750mL)分别洗涤，干燥得相应粗品，柱层析纯化。
改变以上反应中的溶剂、保护试剂、温度、反应时间，考察条件与结果见下表：
备注：a后处理操作为：降至室温，加入甲醇(25mL)，水(12.5mL)，搅拌，过滤，滤饼用少量甲醇洗涤，滤饼抽干得相应粗品，过柱纯化。其中，采用该后处理操作，产物直接析出过滤处理即可。
实施例7
取5.41g实施例2中经过柱纯化的中间产物2c，对重结晶条件进行考察，条件如下表所示，其中溶质与溶剂质量体积比为1g:10mL。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (24)
- 一种化合物，其具有式I所示的结构，其中，X为 R 1、R 2和R 3各自独立地为C 1-4烷基、C 1-4烷氧基、5-9元杂芳基或C 6-10芳基，所述5-9元杂芳基中杂原子选自N、O或S，所述5-9元杂芳基中杂原子的个数为1、2或3个。
- 根据权利要求1所述的化合物，其中，X为TMS、TES、TBS、TBDPS、TIPS、DMIPS、TBDMS或MDIPS。
- 一种权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：羊毛甾醇与羟基保护剂反应，得到式I化合物。
- 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述羟基保护剂为硅醚保护剂。
- 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述羟基保护剂选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三叔丁基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、二甲基异丙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、甲基二异丙基氯硅烷、三异丙基氯硅烷和叔丁基二甲基硅基三氟甲磺酸酯。
- 一种权利要求1或2所述的式I化合物的分离纯化方法，其特征在于，其包括以下步骤，将原料A通过柱层析进行分离纯化；得到式I化合物；所述原料A包含式I化合物和式I’化合物；
- 根据权利要求6所述的式I化合物的分离纯化方法，其进一步包括以下步骤：将羊毛甾醇粗品与羟基保护剂反应，得到所述的原料A；
- 根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，所述羟基保护剂为硅醚保护剂；例如选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三叔丁基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、二甲基异丙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、甲基二异丙基氯硅烷、三异丙基氯硅烷和叔丁基二甲基硅基三氟甲磺酸酯。
- 权利要求1或2所述的式I化合物在分离纯化羊毛甾醇中的应用。
- 根据权利要求9所述的应用，其包含以下步骤：对式I化合物进行羟基脱保护，得到羊毛甾醇；
- 根据权利要求10所述的应用，其进一步包括以下步骤：将原料A通过柱层析进行分离纯化；得到所述的式I化合物；所述原料A包含式I化合物和式I’化合物；
- 根据权利要求11所述的应用，其进一步包括以下步骤：将羊毛甾醇粗品与羟基保护剂反应，得到所述的原料A；
- 一种式I化合物的精制方法，其包括以下步骤：将原料A通过重结晶得到所述的式I化合物；所述原料A包含式I化合物和式I’化合物；其中X的定义如权利要求1或2所述，所述重结晶的溶剂选自：1)乙酸乙酯与异丙醇的混合物，或2)乙酸异丙酯；优选地，所述乙酸乙酯与异丙醇的混合物中，乙酸乙酯与异丙醇的体积比为1:(0.5～10)；优选地，为1:(1～10)，例如1:(0.5～2)。
- 根据权利要求13所述的精制方法，所述原料A中，所述式I化合物的质量百分比为75％以上；优选地，为85％以上；更优选地，为90％以上。
- 一种组合物Y，其包括式I化合物和式I’化合物，其中，X为 R 1、R 2和R 3各自独立地为C 1-4烷基、C 1-4烷氧基、5-9元杂芳基或C 6-10芳基，所述5-9元杂芳基中杂原子选自N、O或S，所述5-9元杂芳基中杂原子的个数为1、2或3个。
- 根据权利要求15所述的组合物Y，其特征在于，X为TMS、TES、TBS、TBDPS、TIPS、DMIPS、TBDMS或MDIPS。
- 根据权利要求15或16所述的组合物Y，其特征在于，所述式I化合物的质量百分比为55％-95％，例如为56％、57％、58％、59％、60％、61％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或94％。
- 一种纯化羊毛甾醇的方法，其特征在于，所述方法包括：1)使羊毛甾醇粗品与羟基保护剂反应，得到权利要求6或14所述的原料A，所述原料A包含式I化合物和式I’化合物；2)将所述原料A进行柱层析，分离得到式I化合物；和3)对所述式I化合物进行羟基脱保护，得到纯化的羊毛甾醇；其中，所述羊毛甾醇粗品包含羊毛甾醇和二氢羊毛甾醇；所述羟基保护剂为硅醚保护剂。
- 根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述硅醚保护剂选自三甲基氯硅烷、三乙基氯硅烷、三叔丁基氯硅烷、叔丁基二苯基氯硅烷、三异丙基氯硅烷、二甲基异丙基氯硅烷、叔丁基二甲基氯硅烷、甲基二异丙基氯硅烷、三异丙基氯硅烷和叔丁基二甲基硅基三氟甲磺酸酯。
- 根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法、权利要求7-8任意一项所述的分离纯化方法，或权利要求18-19任意一项所述的方法，其中，所述的羊毛甾醇与所述羟基保护剂的反应是在有机溶剂的存在下进行；优选地，所述有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷。
- 根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法、权利要求7-8任意一项所述的分离纯化方法，或权利要求18-19任意一项所述的方法，其中所述羊毛甾醇与所述羟基保护 剂的反应是在缚酸剂的存在下反应的；优选地，所述缚酸剂为有机碱或无机碱；更优选地，所述缚酸剂为吡啶、咪唑、二异丙胺、三乙胺、三乙醇胺、碳酸钾或碳酸钠。
- 根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法、权利要求7-8任意一项所述的分离纯化方法，或权利要求18-19任意一项所述的方法，其中所述羊毛甾醇与所述羟基保护剂的反应是在25～120℃的温度下进行；优选地，所述羊毛甾醇与所述硅醚保护剂的反应是在60～85℃的温度下进行。
- 根据权利要求11-12任意一项所述的应用或权利要求18-19任意一项所述的方法，其中，所述柱层析为硅胶柱层析；优选地，所述硅胶柱层析中所选用的硅胶的规格为100～200目、200～300目或300～400目；优选地，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂为石油醚、正庚烷、正己烷、二氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种；更优选地，所述硅胶柱层析使用的洗脱剂中加入氨水。
- 根据权利要求10所述的应用或权利要求18-19任意一项所述的方法，其中所述的羟基脱保护是在乙酸、四烷基氟化铵、三氟乙酸或盐酸中的一种或多种的存在下进行；优选地，所述羟基脱保护在四丁基氟化铵存在下进行。
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