CN117980300A - 自分泌运动因子抑制剂 - Google Patents

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CN117980300A CN202280064024.6A CN202280064024A CN117980300A CN 117980300 A CN117980300 A CN 117980300A CN 202280064024 A CN202280064024 A CN 202280064024A CN 117980300 A CN117980300 A CN 117980300A
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R·尼奇
U·丹洛夫斯基
F·克劳斯
J·沃格特
H·M·托雷斯·戈麦斯
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Abstract

本发明涉及根据通式(I)的自分泌运动因子(ATX)抑制剂、包含所述式(I)和至少一种赋形剂的药物组合物、它们在药物中的用途以及包括将化合物(II)转化为化合物(III)的方法。

Description

自分泌运动因子抑制剂
技术领域
本发明涉及通式(I)的自分泌运动因子(ATX)抑制剂、包含所述式(I)和至少一种赋形剂的药物组合物，以及包括将式(II)的化合物转化为式(III)的化合物的方法。
背景技术
大脑，即中枢神经系统，是迄今为止人体最复杂的器官。由于其复杂性，大脑易患多种疾病，例如精神病、神经病和神经退行性疾病。这些疾病包括但不限于精神分裂症、抑郁症、焦虑症、对压力的易感性、恐慌症、双相型障碍、注意缺陷多动障碍(ADHD)、进食障碍，还包括多发性硬化症、癫痫、阿尔茨海默病和缺血性中风。
由于当今对大脑功能的了解还很少，对大脑疾病的治疗仍然存在显著的未满足的医疗需求。
具体而言，精神分裂症、抑郁症和双相型障碍是严重的精神疾病，在西方世界中约每百人中就有1人患病，引起严重的个人和家族性痛苦，并造成社会和经济成本。这些疾病的神经生物学原因可以追溯到大脑突触传递中的功能障碍，目前推荐使用主要依赖于改变多巴胺或血清素信号传导途径的抗精神病药来治疗。然而，这些疗法会引起频繁的且有时是严重的副作用。
最近，已经发现生物活性脂质信号传导和蛋白质-脂质相互作用参与突触信号传导过程的所有步骤。已经确定该途径的遗传控制物，即磷酸酶类分子“可塑性相关基因1”(PRG-1)，当其“失活”时，会导致小鼠出现行为缺陷，表明患有精神疾病(Trimbuch等人，2009年)。PRG-1的基因序列从实验动物到人都是高度保守的。
WO2017071799A1已经公开了最近报道的PRG-1中遗传突变(单核苷酸多态性(SNP))R345T通过失去对LPA突触水平的控制和随后突触处谷氨酸释放的增加来干扰该通路。这种基因突变频率约为0.6％，相当于大约3.5百万欧洲公民和1.5百万美国公民。此外，在WO2017071799A1中，使用感觉和EEG测量评价了人群，发现该基因突变的携带者表现出感觉门控降低——滤出无关感觉信息的能力降低。感觉门控降低与精神分裂症和其他行为障碍相关。
人脑中的神经元可以大致分为两类：兴奋性的或抑制性的，这取决于它们是否倾向于诱导或抑制动作电位的产生。维持兴奋和抑制的正确平衡(E/I平衡)会确保神经活动被稳态调节并保持在狭窄且安全的范围内。兴奋性神经元的特征在于神经递质谷氨酸的释放和突触处水平的增加导致E/I系统的失衡。已经提示与该稳态系统相关的功能障碍有助于精神障碍的病理生理学(Harrison和Weinberger，2005；Javitt等人，2008)。PRG-1严格控制溶血磷脂酸(LPA)的存在，而溶血磷脂酸反过来控制突触处的谷氨酸的释放(Trimbuch等人，2009)。
恢复正常的E/I平衡可以为一系列精神和神经疾病提供潜在的治疗。
如WO2017071799A1中所公开的，在这种新鉴定的途径中，已经发现不受调节的LPA的合成或不受控制的突触LPA水平导致突触处过量谷氨酸释放，并导致E/I平衡的改变。因此，降低大脑中溶血磷脂酸(LPA)水平可以治疗或预防许多中枢神经系统病症。
在WO2017071799A1中已经发现并公开了失活的PRG-1导致不受控制的，即过量的LPA水平。因此，通过激活或上调PRG-1来治疗中枢神经系统疾病是有前途的。
LPA由在LPA-LPA2/PRG-1轴上游作用的蛋白自分泌运动因子(ATX)合成(Moolenaar&Perraki，2011)。WO2017071799A1公开了自分泌运动因子的抑制降低LPA水平。
此外，WO2017071799A1中已经显示，具有改变的兴奋/抑制平衡的小鼠，已知是与人精神分裂症相关的精神疾病的内表型(例如Harrison和Weinberger，2005；Javitt等人，2008)，在用自分泌运动因子抑制剂治疗后，显示出从改变的前脉冲抑制(PPI)中完全恢复，PPI是与精神疾病例如精神分裂症相关的最佳的小鼠表型(Davis，1984；Swerdlow等人，1994；Braff等人，2001)。该测试也类似地用于人类并且评估大脑的感觉门控能力，发现感觉门控在携带PRG-1基因功能丧失突变的个体中改变，因此强烈地表明自分泌运动因子抑制剂在人类中也可以是有效的。
WO2017071799A1中在小鼠模型中已经证明自分泌运动因子抑制剂有效地减少食物剥夺后的食物摄取，这表明它们可以用于治疗进食障碍或受益于食物摄取减少的障碍，例如肥胖。
也有证据表明该途径在其它精神疾病如焦虑症和ADHD以及神经疾病如多发性硬化和缺血性中风中起作用。对于后者，在WO2017071799A1中，在动物模型中收集了第一批数据，表明通过使用ATX抑制剂PF8380可显著降低梗塞面积和中风相关的运动缺陷。
E/I平衡已被认为涉及多种精神障碍，包括精神分裂症和双相型障碍，以及恐慌症、ADHD，并且更通常涉及弹性——人体对压力和逆境的先天抗性。这种治疗策略不仅适用于治疗患有精神疾病的患者，而且还可以预防性地用于特别易受精神健康问题影响的个体。
还认为LPA调节和通过该途径对神经元兴奋过度的调节在许多神经病症如癫痫、多发性硬化、阿尔茨海默病以及中风中起到重要作用。对于中风，在WO2017071799A1中已经公开了如下数据：当给予PF8380时，在小鼠模型中梗塞大小和中风相关的运动缺陷显著减少。
此外，US2012/0202827A1公开了自分泌运动因子抑制剂适合于治疗各种癌症形式。
因此，对于进一步自分泌运动因子抑制剂的若干医学应用存在机会，其理想地显示出比现有技术的自分泌运动因子抑制剂更好的药效学和/或药代动力学性质。
发明内容
本发明涉及通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、对映体或水合物
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
J是CH2或C＝O，优选CH2。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据通式(I)的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
另一方面，本发明涉及根据通式(I)的化合物用于医药的用途。
另一方面，本发明涉及通式(I)的化合物或药物组合物，其用于预防或治疗受试者中的疾病，其中自分泌运动因子的抑制、调节和/或调控起作用，优选包括降低所述受试者靶向组织中，更优选所述受试者脑中溶血磷脂酸(LPA)的水平。
另一方面，本发明涉及通式(I)的化合物或药物组合物，其用于预防或治疗受试者的中枢神经系统紊乱，包括降低所述受试者脑中溶血磷脂酸(LPA)的水平、纤维化疾病，或用于预防或治疗癌症。
另一方面，本发明涉及一种优选用于制备化合物(III)的方法，包括
a)将化合物(II)转化为化合物(III)的步骤
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代；和/或
b)形成化合物(IV)
和/或
c)形成化合物(IV)并在化合物(IV)的乙烯基上加成化合物(V)。
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
与现有技术中的化合物相比，本发明的化合物显示出改善的药代动力学性质，同时保持了自分泌运动因子抑制活性。
附图说明
图1：MJK2134025(化合物(A))表现出与PF8380相当的ATX抑制作用。
图2：使用人肝微粒体(Corning)分析MJK2134025(化合物(A))的代谢，与双氯芬酸(作为内标)和PF8380相比显示了有利的衰变时间过程。
图3：比较MJK2134025与现有技术ATX前导抑制剂MSC2285264和GLPG 1690的体外药代动力学性质的微粒体稳定性试验。
图4：在人肝微粒体中评价的MJK2134025(化合物(A))的代谢途径。
图5：对接评分和结合能之间的比较。
图6：通过对接分数(A)和结合能(B)选择的最佳姿态的对接分数和结合能。
图7：所研究化合物的结合能分布。
图8：对接期间计算的相互作用能量的C1-PC2评分图，(A)所有姿态，(B)通过对接选择的最佳姿态(B)。
图9：对接模拟后对通过对接选择的最佳姿态获得的交互指纹的PC1-PC2得分图。
图10：共结晶抑制剂PF-8380的最佳对接姿态(再对接；A)、MJK2134025(B)、1(C)、2(D、MJK2234002)、3(E)、4(F)和5(G)。A-G是指图12中的结构。化合物编号1-5参考图5-9。
图11：一些化合物与蛋白质表面的结合位置比较。PF-8380、3、1、2。
图12：PF-8380(A)、MJK2134025(表1化合物(A))(B)、以及化合物1(C)、2(D、MJK2234002)、3(E)、4(F)和5(G)的CYP2C9所致的代谢风险总结。圆圈表示固有反应性和总分数；较大的尺寸用于较高的评分，较暗的颜色用于较高的反应性。线表示Fe-可及性。
图13至17：化合物MJK2234001、MJK2234002和MJK2134025以及对比例的ATX抑制活性。
图18：测定MJK2134025、MJK2234001、MJK2234002和对比化合物的微粒体稳定性。
图19：MJK2134025和GLPG 1690各自作为湿磨的水性微悬浮液以在1％羧甲基纤维素和0.5％ Tween 80中3mg/g的浓度施用，制剂的剂量以10.0g/kg体重进行，相当于30mg/kg体重。测量食物摄入量。
图20：MJK2134025和GLPG 1690在30mg/kg口服剂量下血浆浓度随时间的变化。
图21：显示实施例5.7的结果。
具体实施方式
本发明的技术方案在以下进行了描述，在所附实施例中进行了举例说明，在附图中进行了说明并在权利要求中进行了反映。
定义
****
注意，除非上下文另有明确指示，如本文所用单数形式“一”(a)、“一”(an)和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，并且提及“该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的等同步骤和方法，其可以被修改或替代本文所述的方法。
除非另有说明，在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元素。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这些等同方案也包括在本发明中。
无论在本文何处使用，术语“和/或”都包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任何其它组合”的含义。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，词语“包括”及其变体如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所述的整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其它整体或步骤或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时当在本文中使用时用术语“具有”代替。当在本文中使用时，“由……组成”排除未指定的任何要素、步骤或成分。
术语“包括”是指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。
应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是要限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
术语“烷基”是指饱和直链或支链烃的单价基团。优选地，烷基包含1至5个碳原子，即1、2、3、4、5个碳原子，更优选1至3个碳原子，最优选1个碳原子。示例性的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基(iso-pentyl)、仲戊基、新戊基、1，2-二甲基-丙基、异戊基(iso-amyl)等。
术语“芳基”是指芳族环烃的单价基团。优选地，芳基含有5至6个碳原子，其排列在一个环中(例如苯基)。示例性的芳基包括环丙烯基鎓、环戊二烯基、苯基。优选地，“芳基”是指含有6个碳原子的单环或含有10个碳原子的芳族双环体系。优选的实例是苯基和萘基。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
“药学上可接受的盐”是指保留指定化合物的游离酸和碱的生物学有效性并且在生物学上或其它方面不是不希望的盐。本发明的化合物可以具有足够的酸性官能团、足够的碱性官能团或这两种官能团，因此与许多无机或有机碱以及无机和有机酸中的任何一种反应，形成药学上可接受的盐。示例性的药学上可接受的盐包括通过本发明的化合物与无机或有机酸或无机碱反应制备的盐，例如包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐、甲烷-磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐和扁桃酸盐的盐。
如果本发明化合物是碱，则所需的药学上可接受的盐可通过本领域可获得的任何合适的方法制备，例如用无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，或用有机酸如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸，羟基酸如柠檬酸、乳酸或酒石酸，氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸如苯甲酸或肉桂酸，磺酸如对甲苯磺酸或乙磺酸等处理游离碱。
本文所用的术语“溶剂化物”是指在溶剂(例如有机溶剂(例如脂族醇(例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇)、丙酮、乙腈、醚等)、水或这些液体中两种或多种的混合物)中的溶解物质的加成复合物，其中所述加成复合物以晶体或混合晶体的形式存在。加成复合物中所含的溶剂的量可以是化学计量的或非化学计量的。“水合物”是溶剂化物，其中溶剂是水。
“对映体”是一对立体异构体，它们是彼此不能重叠的镜像。
本发明的化合物
本发明涉及通式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、对映体或水合物
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
J是CH2，或C＝O，优选CH2。
其中E和F是CH2的实例是表1中的化合物(A)。
其中E或F是C＝O的实例是表1中的化合物(B)。
其中E和/或F是CH(C1-C5)烷基的实例是表1中的化合物(C)和(D)。
其中J是C＝O的实例是表1中的化合物(E)。
优选地，如果J是C＝O，则E和F不是C＝O。
表1：本发明的示例性化合物
化合物的合成
本发明的化合物的合成可以包括一个或多个以下步骤：
步骤1：
其中X是离去基团。优选地，X是磺酸基或卤素。更优选地，所述卤素选自Cl、I、Br和F，最优选F。更优选地，所述磺酸基选自甲磺酸基(甲基磺酸基)、甲苯磺酸基(对甲苯磺酸基)、三氟甲磺酸基(三氟甲基磺酸基)。
用2-巯基乙醇和碱转化化合物(VI)。优选地，所述碱是弱碱，例如K2CO3或Na2CO3。
优选地，所述反应在升高的温度下进行，例如80至200℃，更优选90至150℃，最优选100至120℃。
优选地，所述反应在极性非质子溶剂中进行。更优选地，支持所述反应的优选升高的反应温度的极性非质子溶剂，例如1，4-二噁烷。
步骤2：
在步骤2中，(VII)的末端羟基被转化成离去基团LG。
优选地，所述离去基团LG是磺酸基或卤素。更优选地，所述卤素选自Cl、I、Br和F，更优选地，所述磺酸基选自甲磺酸基(甲基磺酸基)、甲苯磺酸基(对甲苯磺酸基)、三氟甲磺酸基(三氟甲基磺酸基)。
将羟基转化成离去基团，特别是磺酸基的方法是本领域已知的，参见例如PeterG.M.Wuts,Greene’s Protective Groups in Organic Chemistry,Fifth Edition,Wiley2014。
步骤3：
在式(I)中，如果J是C＝O，则可以进行步骤3。
步骤3表示步骤1的替代方案。
化合物(VI)可以用巯基乙酸甲酯和碱转化为化合物(XII)。优选地，所述碱是弱碱，例如K2CO3或Na2CO3。
化合物(XII)可以通过本领域技术人员熟知的常规方法水解酯基转化为化合物(XIII)。优选地，使用强无机碱如LiOH、NaOH和KOH，更优选地，在水和/或有机溶剂如四氢呋喃、甲醇、乙醇的存在下进行。
步骤4：
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；更优选CH和G为H：
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
在步骤4中，(VIII)中的LG被胺(V)取代。
优选地，所述反应在其它碱，优选弱碱，如i-Pr2EtN，Et3N，K2CO3和Na2CO3的存在下进行。
优选地，所述反应在极性非质子溶剂如THF(四氢呋喃)或二恶烷中进行。
优选地，所述反应在15至100℃，更优选50至90℃，最优选65至80℃下进行。
步骤5：
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
由羧酸和胺形成酰胺是本领域已知的。例如，可以使用在弱碱如NEt3和i-Pr2Net的存在下，试剂如EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、丙基膦酸酐。
步骤6：
可以对化合物(XIV)应用相同的条件，得到相应的化合物(XV)
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
在步骤6中，将化合物(IX)中的硝基还原为相应的氨基。
本领域技术人员已知的任何合适的试剂都可以用于还原。优选地，使用Na2S2O4进行还原。
优选地，所述反应在极性质子溶剂如醇和/或水中进行。更优选乙醇和/或水。
优选地，所述反应在升高的温度下进行，例如20至100℃，更优选40至90℃，最优选50至80℃。
步骤7：
或者可以对化合物(XIV)应用相同的条件，得到相应的化合物(XV)
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
在步骤5中，化合物(IX)中的两个氨基都环化成五元环。
优选地，所述环化反应使用含NO2 -的试剂如NaNO2进行。
优选地，所述反应在酸性溶剂如乙酸，特别是冰乙酸中进行。
优选地，所述反应在15至50℃，更优选18至30℃，最优选20℃下进行。
步骤8：
步骤8的相同条件可以应用于化合物(XV)，得到相应的化合物(XVI)
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
硫醚(XI)氧化成相应的磺酰基化合物(III)可以两种可选择的途径实现。
a)使用mCPBA的氧化
如实施例所证实的，发现除根据需要氧化硫醚外，用mCPBA氧化还可导致6元环中氮的氧化和6元环的消除。
作为消除的结果，在化合物(XI)用作起始原料的情况下，可以形成化合物(IV)。
/>
为了得到化合物(III)，可以使化合物(IV)和反应。
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
氧化/消除和随后与化合物(V)的反应可以在一锅中进行。
优选地，所述反应在非极性非质子溶剂如二氯甲烷中进行。
本发明包括一种优选用于制备(III)的方法，该方法包括：
a)将化合物(II)转化为化合物(III)的步骤
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代；和/或
b)形成化合物(IV)
和/或
c)形成化合物(IV)并在化合物(IV)的乙烯基上加成化合物(V)。
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n为1-4，优选1-3，更优选1
b)或者，可以施用(NH4)6Mo7O24·4H2O和H2O2来进行所需的氧化。
已经观察到，应用(NH4)6Mo7O24·4H2O和H2O2优选不氧化6元环的氮，并且优选不引起化合物(IV)的消除和形成至实际相关的程度。
优选地，所述氧化在酸性溶剂如乙酸，优选冰乙酸中进行。
步骤8
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
在(III)中，G可以被交换，例如从-C(O)O(C1-C6)烷基交换到-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基。
如果在-C(O)O(C1-C6)烷基中，烷基是叔丁基，-C(O)O(C1-C6)烷基可以在酸性条件下用氢代替，例如HCl-二恶烷。添加和除去保护基团的一般条件公开于例如PeterG.M.Wuts,Greene’s Protective Groups in Organic Chemistry,Fifth Edition,Wiley2014。
一旦G是氢，就会与碱和HO(CH2)n(C5-C6)芳基组合应用CDI(羰基二咪唑)允许(III)转化为G，其中G是-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基。
碱可选自NEt3和iPr2NEt，优选NEt3。
药物组合物
本发明进一步涉及包含通式(I)化合物和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些液体，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物口服给药时，水是优选的载体。当药物组合物静脉内给药时，盐水和水性葡萄糖是优选的载体。盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液优选用作注射溶液的液体载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等形式。该组合物可与传统的粘合剂和载体如甘油三酯一起制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。这样的组合物将含有治疗有效量的治疗剂(优选以纯化的形式)以及适量的载体，以便提供用于适当施用给患者的形式。制剂应适合给药方式。
调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用若干分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。为了易于给药和剂量的均匀性，将肠内组合物配制成剂量单位形式是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗个体的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性化合物以及所需的药物载体。本发明的剂量单位形式的规格直接依赖于(a)活性化合物的独特特征和要达到的特定治疗效果，和(b)配制用于治疗个体敏感性的这种活性化合物的领域中固有的限制。
医药用途
通式(I)的化合物和药物组合物可以用于医药用途。
本发明进一步涉及根据通式(I)的化合物或药物组合物，其用于预防或治疗受试者中的疾病，其中自分泌运动因子的抑制、调节和/或调控起作用，优选包括降低所述受试者的靶组织中，更优选所述受试者的脑中的溶血磷脂酸(LPA)的水平。
本发明进一步涉及根据通式(I)的化合物或药物组合物，其用于预防或治疗受试者的中枢神经系统紊乱，包括降低所述受试者的脑中溶血磷脂酸(LPA)的水平、纤维化疾病或用于预防或治疗癌症。
同样如上所述，降低溶血磷脂酸(LPA)的水平优选通过本发明的化合物抑制合成LPA的蛋白质自分泌运动因子(ATX)来实现。
优选地，中枢神经系统紊乱是精神障碍，更优选地，精神障碍选自精神分裂症、抑郁症、焦虑症、对压力和压力相关障碍的易感性、恐慌症、双相型障碍、进食障碍和ADHD，最优选地，精神障碍是肥胖症或导致肥胖症的进食障碍。
优选地，进食障碍为暴食障碍。
优选地，中枢神经系统紊乱是神经系统疾病，更优选地，神经系统疾病选自多发性硬化、癫痫、阿尔茨海默病和缺血性中风。
优选地，所述癌症选自纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、上皮癌(carcinoma)、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、注射器癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、骨髓癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌(epithelial carcinoma)、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤(haemangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、脑膜瘤、黑素瘤神经母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinaemia)和重链疾病。
优选地，所述纤维化疾病选自特发性肺纤维化和肝纤维化。
从以下实施例将更好地理解本发明及其优点，提供这些实施例仅用于说明性目的。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
本发明的实施例
实施例1：化合物(A)的合成——路线1
目标化合物(A)的合成以2-巯基乙醇和5-氟-2-硝基苯胺1的芳香亲核取代反应开始，使用K2CO3作为碱，在110℃下，在1，4-二恶烷作为溶剂中，生成醇2，产率97％。
方案1：硫醚6的合成。试剂和条件：a)2-巯基乙醇、K2CO3、1，4-二氧六环、110℃、24h、97％。b)TsCl、Et3N、DMAP、DCM、rt、18h、90％。c)哌啶，Et3N，THF，70℃，5h，83％。d)Na2S2O4，EtOH：H2O，70℃，1.5h，82％。e)NaNO2，AcOH冰，室温，50分钟，45％。
醇2的甲苯磺酰化和随后用过量哌啶取代得到叔胺4。在70℃下，在乙醇和水的混合物中，使用过量的连二亚硫酸钠作为还原剂，将4的硝基成功还原成相应的苯二胺5。化合物5在室温趋于氧化，因此它不经任何进一步纯化而直接用于下一步骤。
通过将亚硝酸钠加入到作为溶剂的冰醋酸溶液5中形成苯并三唑6。在加入之后，观察到气体释放。
苯并三唑6经历一锅法氧化-消除-加成反应，得到产物9，产率54％(方案2)。首先，6被过氧化成砜-N-氧化物中间体7，其进行Cope型消除以产生反应性乙烯基砜8，然后通过加入N-boc-哌嗪将其捕集。
方案2：9的合成。试剂和条件：f)mCPBA，DCM，rt，18h，g)1-Boc-哌嗪，rt，16h，54％。
在二恶烷中用HCl裂解N-Boc，以定量收率得到胺10。然后在羰基二咪唑存在下，在碱性条件下，10与相应的苄醇缩合，得到目标化合物，产率为26％(方案3)。如果反应进行＞24小时，产率提高到90％。
方案3：化合物(A)＝MJK2134025的合成。试剂和条件：h)HCl-二噁烷，iPrOH，45℃，1小时，99％。i)3，5-双(三氟甲基)苄醇，CDI，Et3N，THF，3h，26％。
2-((3-氨基-4-硝基苯基)硫代)乙-1-醇(2)的合成
将2-巯基乙醇(9.02mL，128.1mmol)加入5-氟-2-硝基苯胺(10g，64.05mmol)和K2CO3(17.71g，128.11mmol)的1，4-二恶烷悬浮液中，并加热到110℃。
24小时后，一些5-氟-2-硝基苯胺仍未反应，加入另外的2-巯基乙醇(3mL，0.25eq)，并将反应在110℃下保持另外10小时。趁热过滤反应物；用EtOAc洗涤滤饼直到滤液无色。在真空下除去溶剂，得到橙色固体(13g，95％)。该固体不再进一步纯化。该化合物可用EtOAc重结晶。
精确质量(ESI)：m/z＝215.0484(C8H10N2O3S[M+H]+计算值215.0485)。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.85(d,J＝9.1Hz,1H),7.44(s,2H,NH2),6.86(d,J＝2.1Hz,1H),6.50(dd,J＝9.1,2.1Hz,1H),5.05(s,broad,1H,OH),3.63(t,J＝6.6Hz,2H),3.08(t,J＝6.6Hz,2H).
4-甲基苯磺酸2-((3-氨基-4-硝基苯基)硫基)乙酯(3)的合成
在N2下，将TsCl(4.45g，30.3mmol)一次性加入到2(5g，23.3)、Et3N(2.4g，30.3mmol)和DMAP(0.29g，2.3mmol)的无水DCM溶液中，并在室温下搅拌18小时。将反应混合物用DCM稀释，用NaHCO3溶液、盐水和水洗涤。干燥(Na2SO4)有机层，减压除去溶剂，得到黄色油状物。该化合物不经进一步纯化即用于下一步骤。
精确质量(ESI)：m/z＝369.0570(C15H17N2O5S2[M+H]+的计算值369.0573)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝9.0Hz,1H),7.79(d,J＝8.3Hz,2H),7.75(d,J＝8.4Hz,1H),7.35(d,J＝8.8Hz,2H),7.31(s,1H),5.86(s,broad,2H,NH2),4.21(t,J＝6.9Hz,2H),2.84(t,J＝6.6Hz,2H),2.45(s,3H).
2-硝基-5-((2-(哌啶-1-基)乙基)硫基)苯胺(4)的合成
将哌啶(2.4g，28mmol)加入甲苯磺酸酯3(3.4g，9.33mmol)的THF溶液中，加热至45℃。3小时后，通过TLC观察到一种主要的极性更强的化合物，在45℃向混合物中加入另外的哌啶(1mL)。24小时后反应完成。将反应混合物冷却至室温，倒入水中，用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机层，减压除去溶剂，重新溶解在DCM中，并吸附在硅胶上，通过快速色谱法进一步纯化。黄色树脂(2.2g，83％)。
精确质量(ESI)：M/z＝282.1266(C13H20N3O2S[M+H]+的计算值282.1271)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.99(d,J＝9.0Hz,1H),6.59(d,J＝1.9Hz,1H),6.54(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),6.13(s,2H),3.13–3.04(m,5H),2.87–2.78(m,5H),2.67–2.57(m,6H).
4-((2-(哌啶-1-基)乙基)硫基)苯基-1，2-二胺(5)的合成
将连二亚硫酸钠(3.7g，21.3mmol)的水分散液加入到预先加热(70℃)的4(1.0g，3.6mmol)的乙醇溶液中，在70℃搅拌1小时。过滤反应混合物，用乙醇洗涤滤饼，减压除去乙醇，用NaOH 1M稀释残余物，用DCM(6×20mL)萃取，干燥合并的有机层(Na2SO4)，减压除去溶剂。浅黄色固体树脂(731mg，82％)。
精确质量(ESI)：m/z＝252.1526(C13H22N3S[M+H]+的计算值252.1529)。
6-((2-(哌啶-1-基)乙基)硫基)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑(6)的合成在室温下，将NaNO2(220.4mg，3.2mmol)加入5(731mg，2.9mmol)的冰乙酸(10mL)溶液中。在添加之后，注意到颜色从黄色变为橙色并放出气体。50分钟后停止反应。将反应混合物用1M NaOH(40mL)稀释，并在冰浴中用Na2CO3将pH缓慢调节至pH～8，然后用DCM(3×20mL)萃取，将合并的有机层干燥(Na2SO4)，减压除去溶剂，再溶解于DCM中，并吸附在硅胶上以进一步纯化。将粗残余物吸附在少量硅胶/硅藻土上，并通过柱色谱法纯化。
分离得到黄色固体状目标化合物，收率45％(340mg)。
精确质量(ESI)：m/z＝263.1318(C13H19N4S[M+H]+的计算值262.1325)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ12.35(s,1H),7.81(dd,J＝1.6,0.8Hz,1H),7.59(dd,J＝8.6,0.8Hz,1H),7.21(dd,J＝8.7,1.6Hz,1H),3.23–3.16(m,2H),2.82–2.76(m,2H),2.67–2.61(m,4H),1.67(p,J＝5.7Hz,4H),1.48(t,J＝5.8Hz,2H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ139.64,139.10,133.37,127.53,115.82,115.09,57.69,54.14,30.78,25.29,25.16,25.07,23.83.
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)磺酰基)乙基)哌嗪-1-甲酸叔-丁基酯(9)的合成
室温下将mCPBA(564mg，3.3mmol)加入到6(245mg，0.9mmol)的DCM(25mL)溶液中。2小时后，形成无色沉淀。将N-Boc-哌嗪(608.3mg，3.3mmol)一次加入到反应混合物中，将反应在室温下保持18小时。18小时后，用NaHCO3溶液(3×15mL)洗涤反应混合物，将有机层用Na2SO4干燥，吸附在硅胶上，通过快速色谱法进一步纯化。白色固体(200mg，54％)。
精确质量(ESI)：m/z＝396.1695(C17H26N5O4S[M+H]+的计算值396.1700)。
1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.59(dd,J＝1.5,0.9Hz,1H),8.06(dd,J＝8.7,0.9Hz,1H),8.02(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),3.55(t,J＝6.8Hz,2H),3.11(t,J＝5.1Hz,4H),2.77(t,J＝6.8Hz,2H),2.30–2.25(m,4H),1.40(s,9H).
13C NMR(126MHz,MeOD)δ156.21,138.52,133.64,131.08,126.34,119.86,115.61,81.25,54.14,53.34,52.64,28.58.
6-((2-(哌嗪-1-基)乙基)磺酰基)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑(10)的合成
在室温下，将HCl-二恶烷(5mL)加入到砜9(200mg，0.51mmol)的iPrOH溶液中。将反应在40℃搅拌过夜，减压除去溶剂，得到黄色固体。产物不经任何进一步纯化而用于下一步骤。
精确质量(ESI)：m/z＝296.1175(C12H18N5O2S[M+H]+的计算值296.1176)。
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)磺酰基)乙基)哌嗪-1-甲酸3，5-双(三氟甲基)苄酯(A)的合成
室温下，将CDI(91mg，0.56mmol)加入到3，5-双(三氟甲基)苯甲醇(316mg，0.56mmol)的THF(10mL)溶液中，搅拌3小时。将胺10(150mg，0.51mmol)和Et3N(176μL，1.26mmol)溶解在THF(9mL)和DMF(2mL)中，室温下搅拌。将苄基醇CDI反应物加入到该溶液中，并将该混合物在40℃搅拌2小时。将反应混合物倒入冷水中，用乙酸乙酯萃取，并加入NaCl直到饱和。合并的有机层用Na2SO4干燥并蒸发至干燥。通过快速色谱纯化，得到白色固体(75mg，26％)。
精确质量(ESI)：m/z＝566.1302(C22H22F6N5O4S[M+H]+的计算值566.1291)。
1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.59(t,J＝1.2Hz,1H),8.04(dd,J＝8.8,0.9Hz,1H),8.01(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),7.88(s,2H),7.87(s,1H),5.21(s,2H),3.52(t,J＝6.8Hz,2H),3.29–3.19(m,4H),2.78(t,J＝6.8Hz,2H),2.32(t,J＝5.1Hz,4H).
13C NMR(126MHz,MeOD)δ155.93,141.23(2C),138.17,132.79(q,J＝33.3Hz),129.07(q,J＝3.9Hz),126.11,124.48(q,J＝271.9Hz),122.66(p,J＝3.9Hz),119.75,115.51,66.50,54.08,53.14,52.45,44.53.
纯度(UHPLC)：99.02％(tR＝3.95分钟)。
实施例1：化合物(A)的合成——路线2
通过用1-Boc-哌嗪取代甲苯磺酸酯3开始合成目标化合物，得到11。用连二硫酸钠作为还原剂进行硝基还原，随后与亚硝酸钠反应，得到三唑13。用HCl-二恶烷的异丙醇溶液对N-Boc去保护，以定量产率得到哌嗪14(方案4)。
方案4：硫醚14的合成。试剂和条件：a)1-Boc-哌嗪，Et3N，THF，70℃，5h，32％。b)Na2S2O4，EtOH：H2O，70℃，1.5H，97％。c)NaNO2，冰醋酸，rt，50min，52％。d)HCl-二噁烷，iPrOH，45℃，1小时，99％。
用相应的苄醇和14以及作为偶联剂的CDI形成氨基甲酸酯，得到90％的硫醚15。最后，通过在作为溶剂的冰醋酸中逐步加入过氧化氢进行15的氧化。需要酸性条件以避免竞争性N-氧化反应(方案5)。
方案5。化合物A的合成。试剂和条件：e)3，5-双(三氟甲基)苄醇，CDI，Et3N，THF，rt，24h，90％。f)(NH4)6Mo7O24·4H2O，H2O2 35％，冰醋酸，rt，50％。
4-(2-((3-氨基-4-硝基苯基)硫代)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁基酯(11)的合成将1-boc-哌嗪(1.6g，8.8mmol)加入甲苯磺酸酯3(1.7g，5.9mmol)的THF溶液中，加热至70℃。5小时后，将反应混合物冷却至室温，倒入水中，用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机层，减压除去溶剂，重新溶解在DCM中，并吸附在硅胶上，通过快速色谱法进一步纯化。黄色粉末(0.7g，32％)。
精确质量(ESI)：m/z＝83.1741(C17H26N4O4S[M+H]+的计算值383.1748)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.01(d,J＝9.0Hz,1H),6.59(d,J＝2.0Hz,1H),6.55(dd,J＝9.0,2.0Hz,1H),6.16(s,2H),3.48–3.42(m,4H),3.14–3.07(m,2H),2.74–2.64(m,2H),2.45(t,J＝5.1Hz,4H),1.46(s,9H).
4-(2-((3，4-二氨基苯基)硫代)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(12)的合成
将连二亚硫酸钠(1.9g，11.0mmol)的水分散液加入到预先加热(70℃)的11(0.7g，1.8mmol)的乙醇溶液中，在70℃搅拌1小时。过滤反应混合物，用乙醇洗涤滤饼，真空除去乙醇，残余物用NaOH 1M稀释，用DCM(6×20mL)萃取，干燥(Na2SO4)合并的有机层，减压除去溶剂。浅黄色固体树脂(623mg，97％)。
精确质量(ESI)：m/z＝375.1822(C17H28N4O2S[M+H]+的计算值375.1825)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.81–6.76(m,2H),6.63–6.59(m,1H),3.40(t,J＝5.1Hz,4H),2.93–2.86(m,2H),2.62–2.51(m,2H),2.38(t,J＝5.1Hz,4H),1.44(s,9H).
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ154.84,135.26,134.45,125.18,124.27,120.41,117.13,79.76,58.19,52.97,33.01,28.55.
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)硫代)乙基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(13)的合成
室温下，将NaNO2(119mg，1.7mmol)加入到12(600mg，1.7mmol)的冰乙酸(10mL)溶液中。50分钟后，用1M NaOH(40mL)稀释反应混合物，并用Na2CO3冰浴将pH缓慢调节至pH～8，然后用DCM(3×20mL)萃取，干燥合并的有机层(Na2SO4)，减压除去溶剂，再溶解于DCM中，并吸附在硅胶上以进一步纯化。将粗残余物吸附在少量通过柱色谱法纯化的硅胶上。黄色玻璃状固体(322mg，52％)。
精确质量(ESI)：m/z＝364.1792(C17H25N5O2S[M+H]+的计算值364.1802)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.82(dd,J＝8.7,0.8Hz,1H),7.78(s,1H),7.37(dd,J＝8.7,1.6Hz,1H),3.47(t,J＝5.0Hz,4H),3.19–3.09(m,2H),2.75–2.67(m,2H),2.47(t,J＝5.0Hz,4H),1.47(s,9H).
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ155.08,139.22,138.59,135.51,127.58,116.40,113.07,80.26,57.45,52.94,31.12,28.58.
6-((2-(哌嗪-1-基)乙基)硫代)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑(14)的合成
在45℃下，将HCl-二恶烷(5mL)加入硫醚13(310mg，0.9mmol)的iPrOH溶液中。1小时后，减压除去溶剂，得到黄色固体(224mg，99％)。产物不经任何进一步纯化而用于下一步骤。
精确质量(ESI)：m/z＝264.1275(C12H17N5S[M+H]+的计算值264.1277)。
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)硫代)乙基)哌嗪-1-甲酸3，5-双(三氟甲基)苄酯(15)的合成
在室温下，将CDI(68mg，0.4mmol)加入到3，5-双(三氟甲基)苯甲醇(103mg，0.4mmol)的THF溶液中，搅拌3小时。将胺14(224mg，0.4mmol)和Et3N(85mg，0.8mmol)溶解在THF(9mL)和DMF(2mL)中，并在室温下搅拌。将苯甲醇-CDI反应物加入到该溶液中，并将混合物在室温搅拌24小时。将反应物倒入冷水中，并用乙酸乙酯萃取，将合并的有机层用Na2SO4干燥并蒸发至干燥。通过快速色谱法纯化，得到白色固体(201mg，26％)。
精确质量(ESI)：m/z＝534.1388(C22H21F6N5O2S[M+H]+的计算值534.1393)。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.05(s,1H),7.82–7.77(m,4H),7.37(dd,J＝8.7,1.5Hz,1H),5.22(s,2H),3.54(t,J＝5.1Hz,4H),3.15–3.10(m,2H),2.74–2.69(m,2H),2.50(t,J＝5.0Hz,4H).
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ154.67,139.44,134.87,132.04(q,J＝33.4Hz),127.88(d,J＝3.9Hz),127.71,123.25(q,J＝272.4Hz),122.15(dd,J＝7.8,4.0Hz),114.01,65.65,57.35,52.72,43.90.
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)磺酰基)乙基)哌嗪-1-甲酸3，5-双(三氟甲基)苄酯(A)的合成
在室温下，将H2O2 35％(2.7μL)加入到(NH4)6Mo7O24·7H2O(21mg，0.02mmol)和硫醚15(30mg，0.06mmol)的冰醋酸(2mL)溶液中。40分钟后，向溶液中加入H2O2 35％(2.7μL)。50分钟后，用2％巯基乙醇(0.5mL)猝灭反应，用1M NaOH稀释反应物至pH 7-8，然后用DCM(3×10mL)萃取，将合并的有机层用Na2SO4干燥并蒸发至干燥。通过快速色谱纯化，得到白色固体(16mg，50％)。
精确质量(ESI)：m/z＝566.1286(C22H22F6N5O4S[M+H]+的计算值566.1291)。
纯度(UHPLC)：97.24％(tR＝3.93分钟)。
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)硫代)乙酰基)哌嗪-1-甲酸3，5-双(三氟甲基)苄酯(MJK2234001)和4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)磺酰基)乙酰基)哌嗪-1-甲酸3，5-双(三氟甲基)苄酯(MJK2232)的合成。
目标化合物的合成开始于硫代乙醇酸甲酯和5-氟-2-硝基苯胺(1)的芳香亲核取代反应，使用K2CO3作为碱在95℃在1，4-二恶烷中生成硫醚16(方案6)。
方案6。硫醚20的合成。试剂和条件：a)硫代乙醇酸甲酯，K2CO3，1，4-二噁烷，95℃，24h，60％。b)Na2S2O4，EtOH：H2O，70℃，1.5h，91％。c)NaNO2，冰醋酸，rt，40min，85％。d)LiOH，THF：H2O，70℃，3h，24％。e)N-Boc-哌嗪，T3P，Et3N，THF，rt，3h，90％。
用连二亚硫酸钠还原成相应的苯二胺17，然后在酸性介质中与亚硝酸钠反应，得到苯并三唑18。化合物18在碱性条件下水解成羧酸19，其在用丙基膦酸酐(T3P)活化后，随后与N-boc-哌嗪反应得到化合物20。
在二恶烷中用HCl进行N-Boc裂解，得到胺21，产率92％。然后在羰基二咪唑存在下，在碱性条件下，21与相应的苄醇缩合，得到MJK2234001，收率61％(方案7)。
方案7。MJK2234001和MJK2234002的合成。试剂和条件：h)HCl-二噁烷，MeOH，40℃，2h，92％。i)3，5-双(三氟甲基)苯甲醇、CDI、Et3N、THF、40℃、2h、61％。h)mCPBA，DCM，rt，78％。
硫醚MJK2234001到目标砜MJK2234002的两步氧化通过将间氯过苯甲酸(mCPBA)分批加入到反应混合物中进行。
2-((3-氨基-4-硝基苯基)硫代)乙酸甲酯(16)的合成
将硫代乙醇酸甲酯(4.3mL，48.03mmol)加入到5-氟-2-硝基苯胺(5g，32.03mmol)和K2CO3(7.97g，57.65mmol)的1，4-二恶烷悬浮液中，并加热至95℃下24h。通过滤纸过滤温热的反应混合物；用乙酸乙酯洗涤滤饼直到滤液无色。减压除去溶剂，得到黄色固体(4.6g，60％)。该固体不进一步纯化并用于进一步的步骤。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.02(d,J＝9.0Hz,1H),6.68(d,J＝2.0Hz,1H),6.58(dd,J＝9.0,2.1Hz,1H),6.15(s,2H),3.77(s,3H),3.72(s,2H).
13C NMR(75MHz,CDCl3)δ169.41,146.31,144.97,130.33,126.85,115.33,114.51,53.11,34.21.
2-((3，4-二氨基苯基)硫代)乙酸甲酯(17)的合成
将连二亚硫酸钠(8.9g，51.60mmol)的水分散液加入到预先加热(70℃)的16(2.5g，10.32mmol)的乙醇溶液中，并在70℃下保持1h，此后溶液由深黄色变为浅黄色。TLC显示原料被完全消耗，极性产物最丰富。过滤反应混合物，用EtOH洗涤滤饼，减压除去溶剂，用NaOH 1M稀释残余物，用DCM(6×20mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机层，减压除去溶剂，产物不经进一步纯化直接用于下一步。浅黄色固体树脂(2.0g，91％)。
精确质量(ESI)：m/z＝213.0687(C9H13N2O2S[M+H]+的计算值213.0692)。
6-((2-(哌啶-1-基)乙基)硫代)-1H-苯并[d][1，2，3]三唑(18)的合成
在室温下，将NaNO2(715.0mg，10.36mmol)加入17(2.0g，9.42mmol)的冰醋酸(20mL)溶液中。加入后，注意到颜色从黄色变为橙色，并有气体放出。50分钟后，TLC(DCM：MeOH 9:1)显示所有原料被消耗，形成了一种主要产物。将反应混合物用1M NaOH(40mL)稀释，在冰浴中用Na2CO3将pH缓慢调节至pH～8，并用DCM(3×20mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机层，减压除去溶剂，重新溶解在DCM中，并吸附在硅胶上进行进一步柱色谱纯化(DCM：(DCM/MeOH 7:3)；1:0→7:3→0:1)。分离得到黄色固体目标化合物，产率85％(1.8g)。
精确质量(ESI)：m/z＝224.0485(C9H10N3O2S[M+H]+的计算值224.0489)。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ14.01(s,1H),7.95(s,1H),7.82(d,J＝8.7Hz,1H),7.44(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H),3.76(s,2H),3.73(s,3H).
2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)硫代)乙酸(19)的合成
将LiOH(289.2mg，12.07mmol)加入到18(1.8g，8.05mmol)的THF：H2O(10％v/v，20mL)的混合物的溶液中在60℃下反应3小时。将溶液倒入水中，用HCl(1M)酸化至pH 2，用乙酸乙酯(3×15mL)萃取。干燥(Na2SO4)合并的有机层，减压除去溶剂，得到浅黄色固体(411mg，24％)。该固体无需任何进一步纯化即可用于下一步。
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)硫代)乙酰基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(20)的合成
将丙基膦酸酐(T3P，2.8mL，50％wt的EtOAC溶液，4.58mmol)加入到19(400mg，1.91mmol)的无水THF溶液中，并在室温下搅拌15分钟。然后，向混合物中加入三乙胺(0.67mL，4.77mmol)和N-boc-哌嗪(428mg，2.29mmol)，室温搅拌4小时。将溶液倒入水中，用乙酸乙酯(3×15mL)萃取，合并的有机层用柠檬酸溶液洗涤，然后用NaOH 1M洗涤，干燥(Na2SO4)。减压除去溶剂，得到浅无色固体(647mg，90％)。产物不经任何进一步纯化而用于下一反应。
精确质量(ESI)：m/z＝378.1587(C17H24N5O3S[M+H]+的计算值378.1594)。
2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)硫代)-1-(哌嗪-1-基)乙烷-1-酮(21)的合成
将HCl-二恶烷(5mL)加入到20(600mg，0.51mmol)的MeOH溶液中，在40℃搅拌混合物2小时。减压除去溶剂，得到黄色固体。产物不经任何进一步纯化而用于下一步骤。LC-MS分析显示残余物是预期产物(89％)和未反应的原料20(11％)的混合物。
精确质量(ESI)：m/z＝278.1063(C12H16N5OS[M+H]+的计算值278.3535)。
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)硫代)乙酰基)哌嗪-1-甲酸3，5-双(三氟甲基)苄酯(MJK2234001)的合成
在室温下将CDI(283.6mg，1.75mmol)加入到苄醇(426.9mg，1.75mmol)的THF溶液中并搅拌。2.5小时后，醇几乎被消耗，反应物再搅拌30分钟。平行地，将胺21(441mg，1.59mmol)和Et3N(0.55mL，3.98mmol)溶于THF(9mL)和DMF(2mL)中，并在室温搅拌。将苯甲醇-CDI反应混合物加入到该溶液中，并将该混合物在40℃搅拌2小时。LC-MS显示所有胺被消耗，形成主要产物。将反应物倾入冷水和NaCl中，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取。合并的有机层用Na2SO4干燥，蒸发溶剂。使用快速色谱法用石油醚：(乙酸乙酯：MeOH 5％)1：0至0：1进行纯化，得到浅黄色固体(530mg，61％)。
精确质量(ESI)：m/z＝548.1184(C22H19F6N5O3S[M+H]+的计算值548.1186)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ8.04(s,1H),7.85(s,1H),7.82(s,2H),7.33(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),5.27(s,2H),3.86(s,2H),3.69(s,4H),3.65–3.57(m,5H).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ162.82,154.65,138.98,132.12(q,J＝33.5Hz),128.20(d,J＝4.0Hz),126.02–120.45(m),122.37,66.05,46.38,44.49–43.36(m),42.00,31.65.
纯度(UHPLC):92.38％(tR＝4.39min)
4-(2-((1H-苯并[d][1，2，3]三唑-6-基)磺酰基)乙酰基)哌嗪-1-甲酸3，5-双(三氟甲基)苄酯(MJK2234002)的合成
在室温下，每20分钟将间氯过苯甲酸(mCPBA，47mg，0.27mmol)逐步(3份)加入硫醚MJK2234001的DCM溶液中。在最后一部分加入后，搅拌反应直到中间体亚砜完全氧化成砜。通过加入巯基乙醇的甲醇溶液(1％)终止反应。将反应物倒入冷水中，用乙酸乙酯(3×20mL)萃取，用NaOH 1M溶液洗涤。合并的有机层用Na2SO4干燥，蒸发溶剂。通过快速色谱法用石油醚：(乙酸乙酯：MeOH 5％)1：0至0：1进行纯化，得到无色固体(41mg，78％)。
精确质量(ESI)：m/z＝580.1079(C22H19F6N5O5S[M+H]+)的计算值580.1084。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.57(s,1H),8.16–8.05(m,4H),7.99–7.94(m,1H),5.27(s,2H),4.83(s,2H),3.62–3.37(m,8H).
13C NMR(126MHz,DMSO)δ162.34,160.18,154.13,140.34,133.37,132.77,130.34(q,J＝32.3Hz),128.86,128.52,127.96,123.31(q,J＝272.8Hz),121.76,65.03,58.37,45.74,41.29.
纯度(UHPLC)：97.64％(tR＝4.28分钟)。
实施例2：ATX活性测定
2.1抑制剂稀释系列的制备
收到10mM抑制剂的DMSO溶液以进行测试。将40.5μL该溶液加入到959.5μL DMSO中，得到405μM的浓度。将820μL水加入180μL的前述溶液中，得到总体积960μL(将DMSO溶于水中引起的体积减少)和抑制剂浓度75.94μM。对于三倍稀释系列，将800μL18％DMSO的水溶液分配在12个1.5 mL试管中。将400μL75.9μM抑制剂溶液添加至第一小瓶中，并将溶液涡旋。对于每个稀释步骤，转移400μL相应的先前稀释步骤并通过涡旋混合。所获得的浓度为7594nM、2531 nM、844 nM、281 nM、94 nM、31 nM、10 nM、3.47 nM、1.16 nM、0.39 nM、0.13nM、0.043 nM、0.014 nM。在测定中使用31 nM至0.014 nM的八个浓度步长。
2.2进行自分泌运动因子抑制剂测试试剂盒测定
根据测定试剂盒的所附手册进行测定。简言之，将含有ATX的80μL反应缓冲液、10μL来自抑制剂的系列稀释液和10μL荧光ATX底物溶液在96孔板的孔中混合。ATX对底物的切割引起荧光的增加(激发485 nm，发射528 nm)，这通过读板仪以1分钟的间隔测量。使用5分钟和15分钟之间的荧光增加来计算反应速率。
抑制剂对裂隙基质(cleft substrate)荧光的猝灭测试显示没有猝灭，因此不包括在计算中。
2.3统计分析
对靶抑制剂(目标抑制剂)进行四次平行重复的自分泌运动因子反应，对于阳性对照BrP-LPA进行两次平行重复的自分泌运动因子反应。使用“斜率”函数通过Excel计算荧光增加的斜率。IC50通过GraphPad Prism使用非线性回归(曲线拟合)计算：“log(抑制剂)vs.可变斜率响应(四个参数)”。
结果显示在图1和4中。
2.3进一步的生物学测试
表3.化合物的ATX抑制活性和细胞毒性活性。
化合物 IC50(nM)ATX抑制 HeLa中的CC50(nM)
MJK2134025 1.8 45090
MJK2234001 4.0 6200
MJK2234002 2.0 67800
PF-8380 4.8 n.m
化合物MJK2234002和MJK2134025显示出几乎相等的ATX抑制活性(也参见图13-17)。对靶抑制剂MJK2234001和MJK2234002进行三次平行重复的自分泌运动因子反应，对MJK2134025进行两次重复的自分泌运动因子反应，对正性对照BrP-LPA进行两次重复的自分泌运动因子反应。所有ATX试验都使用上述方案进行，只是稍作修改。这些修改涉及稀释原理：
2.4抑制剂稀释系列的制备
收到10mM待测抑制剂的DMSO溶液以进行测试。将40.5μL该溶液加入到959.5μLDMSO中，得到405μM的浓度。将820μL水加入180μL的前述溶液中，得到总体积960μL(由DMSO溶于水中引起的体积减少)和抑制剂浓度75.94μM。加入另外的40μL水，得到1000μL的总体积和72.9μM的抑制剂浓度。对于三倍稀释系列，将800μL18％ DMSO的水溶液分配在12个1.5mL试管中。将400μL75.9μM抑制剂溶液添加至第一小瓶中，并将溶液涡旋。对于每个稀释步骤，转移400μL相应的先前稀释步骤并通过涡旋混合。获得的抑制剂浓度为72.9μM、24.3μM、8.10μM、2.70μM、900nM、300nM、100nM、33.3nM、11.1nM、3.70nM、1.23nM、0.41nM和0.14nM。在测定中使用从300nM到0.14nM的八个浓度步长。在测定期间，反应期间抑制剂的最终浓度为所加抑制剂溶液的1/10th。
实施例3
3.1微粒体稳定性试验
根据内部标准程序进行微粒体稳定性测定。阳性对照化合物双氯芬酸和三个测试项目分别以200μM和20μM的浓度在磷酸盐缓冲液(100mM，pH 7.4)中作为次稀释液新鲜制备。在37℃和1500rpm下，在玻璃螺颈瓶(1.5mL，平底，Macherey-Nagel，Düren，德国)中在Thermomixer C(Eppendorf，德国)上进行一式三份孵育。孵育混合物含有270μL人类肝微粒体(HLM,1.1mg·mL-1,UltraPool HLM 150,Corning B.V.Life Science,Amsterdam,theNetherlands)、270μLNADP再生混合物(1mM NADP、5mM葡萄糖-6-磷酸、5单位·mL-1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和5mM MgCl2)和30μL磷酸盐缓冲液，总体积达到570μL。用热失活(80℃，30分钟)的HLM溶液进行阴性对照。通过加入双氯芬酸或测试项目溶液(30μL)引发反应。在1、15、30、60和90分钟时取100μL的等分试样，立即用100μL乙腈在4℃处理以终止反应，并在4℃以1600rpm振荡2分钟。将混合样品进一步转移到装在玻璃螺颈瓶中的15mm玻璃插入物(0.2mL/6×31mm，Macherey-Nagel，Düren，Germany)中，并在4℃下以4000rpm离心15分钟。取出上清液，进行高分辨率质谱分析，而不进行进一步处理。
3.2微粒体稳定性分析
使用耦合至使用UPLC柱(ACQUITY HSS T3，Waters，1.8μm粒度，2.1×50mm尺寸)的Thermo Scientific QEExactiveHF-X Orbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)的Vanquish Horizon UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)分析样品。柱温保持在25℃，样品保持在4℃。UHPLC系统以0.6mL/min的流速运行，注射体积为5μL。流动相由0.1％(v/v)的甲酸水溶液(洗脱液A)和0.1％(v/v)的甲酸乙腈溶液(洗脱液B)组成。色谱分离如下获得：0至4分钟：5-98％线性梯度的洗脱液B；4至6.5分钟：98％ B的等度洗脱；6.5至7分钟：98至5％ B的线性梯度；7至9分钟：5％ B的等度洗脱。用电喷雾电离正离子模式获得高分辨率质谱。以60,000的分辨率获取半峰宽(full width athalf maximum.)全扫描数据。离子源参数为：喷雾电压3.8kV，毛细管温度320℃，RF水平40，外壳气体压力50，辅助气体10，辅助气体加热器温度300℃。自动增益控制目标值被设定为106。选择扫描范围为m/z 150至1800，并且最大注射时间设定为200ms。色谱峰宽度设定为15s。
3.3微粒体稳定性试验结果的计算
消除速率常数(k)＝(-梯度)
(52.5mg蛋白g-1肝，用于人类；22.0g kg-1肝比体重，用于人类)
(fu：血浆中未结合的药物分数，fu＝1，用于计算；Q：肝血流量，人体为20.0mL/min-1/kg-1)。
结果显示在图2和3中。
化合物MSC2285(MSC2285264)对应于专利申请US2012/0202827A1的化合物Id，并且已经按照其中公开的合成方法制备，以用于对比。
3.4微粒体稳定性
微粒体稳定性的测定类似于上述方法，但为单次测定(图18)。硫醚MJK2234001以与实验药物GLPG 1690(ziritaxestat)相当的速度代谢，而MJK2134025和MJK2234002代谢稳定性几乎相同，并且优于所有其它测试化合物。
实施例4
4.1.对接模拟
所有化合物均成功地完成了模拟。使用Maestro Suite(获自Epik)中预测的不同电离状态中的每一种，从对接模拟中保存了三个姿态。此外，制备共结晶配体(PF-8380，CAS：1144035-53-9)，并将其对接以验证工作流程。表2显示相应的对接得分以及使用带Prime的MM/GBSA方法计算的结合能。认为PF-8380的最好的姿态对应于第二电离状态，其被认为是不太可能的。
考虑对接得分，可以注意到化合物1-3(见图12和化合物结构的描述)具有至少一个比PF-8380得分更好的姿态。
另一方面，考虑到MM/GBSA的结合能，与共结晶化合物PF8380相比，预测有更多的姿势具有更好的结合能，其中1-3仍然是良好的候选。然而，不可能清楚地将正确的结合模式与这里预测的结合能相关联。这可以从PF-8380的一个姿态容易地观察到，其显示极好的结合能(-70.76kcal/mol)，但对接得分不理想(-7.38kcal/mol)，RMSD最差
表2：对接模拟的结果
/>
/>
a得自Epik，在Maestro中实施，以定义在特定pH(7±2)下最有利的物种。
b对接得分和以kcal/mol给出的结合能。
图5显示对接得分和结合能之间的比较。每种化合物的最佳姿态反映了最明显的差异(图6)。无论测量结果如何(对接得分或结合能)，新提出的化合物与共结晶配体(PF-8380)的姿态并不密切相关。
考虑对接得分和结合能之间的差异，图7显示了发现的每种化合物的结合能范围。
在对接模拟期间，计算配体与结合口袋残基的相互作用。对这些相互作用进行主成分分析(按照相互作用类型分解的能量项，每个配体＞300个不同的值)(图8)。所产生的分组主要是由于针对每一化合物所考虑的不同电离状态。根据对接得分仅考虑最佳姿态来重复分析。观察到重复的相似性，例如1和2(参见附图和化合物编号的附图描述)在它们的相互作用方面非常相似。
使用相互作用指纹代替(1和0表示与靶内某些残基的相互作用的存在或不存在，而不是特定能量值)进行了类似的分析。结果显示先前发现的一些保守特征(图9)。
图10描绘了根据对接得分的最佳姿态的结构，总是与PF-8380相比较。从外观检查来看，很明显，4和5呈现与晶体结构的姿态相似性最高(图10F，G)。然而，它们显示低的对接得分。1和2显示了相似的构象(图10C，D)，而3很容易区分(图10E)。
使用的工作流程：
1)从SMILES产生3D结构。
2)在pH 7±2(默认)下的互变异构/电离(基于pKa)。
3)在5kcal/mol窗口中进行构象搜索。
4)使用AM1半经验进行几何优化。
5)对接模拟(“经典的”)。
6)结合能的计算(Prime，MM/GBSA)
4.2代谢模拟
使用软件中的三种CYP可利用形式(CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4；而后者仅可用于内在反应性计算，另两种包括Fe可及性和诱导拟合对接的得分)进行代谢位点(SOM)的模拟。根据Fehler！Verweisquelle Konte Nicket Gefunden Werden.2，预测哌嗪部分的N原子没有反应性，这可能是该方法的缺点。无论使用何种异构体，总体结果都是相同的。因此，显示了CYP2C9的结果以供代表。
如所预期的，预计哌嗪的N的α-位(C4、C6和C8；任意编号)在共结晶结构(PF-8380)中具有高度反应性。类似地，MJK2134025在相同的位置显示反应性(表1)。在C4或C4和C6两者上引入甲基(化合物3-5，参见附图和化合物编号的附图描述)没有降低可能的代谢速率(图1和表1)。相反，在C4或C8(分别为1和2)上引入羰基基团显著降低了总体SOM评分(图1)，这表明这些化合物不容易被CYP介导的代谢清除，并产生改善的药代动力学性质。
实施例5：小鼠模型中的药物动力学和作用
5.1禁食诱导的摄食过量模型
实验前，将C57Bl/6J雄性动物(至少10-12周龄)在设备中适应7天，并适应实验条件。将动物的体重和/或年龄进行匹配。在禁食至少16-18小时后的光照阶段(在前一天开始黑暗阶段之前1小时开始)进行实验，同时可随意获得水。为了评估食物消耗，在60分钟的间隔之前和之后对食物称重(图18)。
5.2剂量
MJK2134025和GLPG 1690各自作为湿磨的水性微悬浮液以在1％羧甲基纤维素和0.5％ Tween 80中3mg/g的浓度施用，制剂的剂量为10.0g/kg体重，相当于30mg/kg体重。测量食物摄入量(图19)。
5.3血浆样品采集
血液收集前，在室温下打开minicollect K3 EDTA小瓶以干燥EDTA，以避免血液被液体内容物稀释。口服强饲试验制剂后，在15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和8小时取尾静脉血样。将样品收集在干燥的minicollect K3 EDTA血浆小瓶中。将血液样品(20-25μL)混合并立即冷却至4℃。随后，将样品在3000g离心5-10分钟。将上清液收集在Eppendorf管中，冷冻并储存在-80℃直至进一步加工。
5.4样品处理和生物分析测定
通过LC-MS定量小鼠血浆样品中的MJK2134025和GLPG1690。将冷冻的小鼠血浆样品在冰上解冻。然后，将样品与甲醇中的5ng·mL-1 17:0LPA(作为内标)以1:10(v：v)的比率在具有微量插入物(透明玻璃，平底，0.2mL，31x 6mm，LABSOLUTE，德国)的1.5mL Eppendorf管中沉淀。在Thermomixer C(Eppendorf，德国)中，在4℃和1600rpm下，将Eppendorf管混合2分钟。将Eppendorf管在4℃和16.1rcf下离心2分钟。将上清液转移到HPLC小瓶中，用于UHPLC-HRMS测量，如下节所述。MJK2134025和GLPG1690的校准标准品通过将MJK2134025和GLPG1690的参照物质加入空白样品(没有物质的小鼠血浆)中来制备。校准曲线在7个浓度下产生，权重为1/x。以下浓度用于储备溶液：甲醇中0.1μg、0.5μg、1μg、2.5μg、10μg、50μg和200μg·mL-1。为了制备200μg·mL-1的储备溶液，将0.04mL的1mg·mL-1MJK2134025和0.04mL的1mg·mL-1GLPG1690与0.12mL甲醇混合。将这些储备溶液(各5μL)加入空白血浆(45μL)中。然后在Thermomixer C(Eppendorf，Germany)中，在4℃和1600rpm下，将样品混合2分钟。随后的样品处理与定量样品的相同。所有定量都应被认为是初步估计，因为稳定同位素标记的参考物质不可用，并且不能排除个体基质效应。
所有处理过的血浆样品使用偶联至使用UHPLC柱(LunaR Omega 1.6μm C18100，100×2×1mm)的Thermo Scientific QEExactiveHF-X Orbitrap质谱仪(Thermo FisherScientific，Bremen，德国)的Vanquish Horizon UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific，Bremen，德国)进行分析。含有0.1％甲酸的5mM甲酸铵水溶液(洗脱液A)和含0.1％甲酸的5mM甲酸铵的乙腈溶液：H2O(95:5，％v：v)(洗脱液B)用作流动相。在以下梯度条件下使用0.3mL/min的流速：30％洗脱液B持续1分钟，然后在14分钟内线性增加到98％，保持98％洗脱液B持续5分钟，然后在0.5分钟内降低到30％，接着等度保持3.5分钟。柱温保持在25℃，样品保持在4℃，并将8μL注入UHPLC-MS。QExactive HF-X Orbitrap以60000的分辨率在全半宽和正负模式下获得。使用以下HESI源参数：毛细管电压为3.8kV(负模式)和3.5kV(正模式)，毛细管温度为320℃，漏斗RF水平40，外壳气压49(N2＞95％)，辅助气体10(N2＞95％)，辅助气体加热器温度300℃。自动增益控制(AGC)设定为10E+6。选择的扫描范围为m/z 400-600，注射时间设定为200ms。使用TraceFinder 4.1SP3对感兴趣的化合物的峰面积进行积分。
5.5药代动力学评价
通过计算每个时间点的平均值和标准偏差，列出并总结了每个取样时间点和动物的测量浓度(图20)。基于平均浓度进行PK评估。使用Phoenix WinNonlin 7.0通过非房室方法测定以下PK参数：Cmax、tmax、AUCall(表4)。
表4.药代动力学数据
PK参数 GLPG1690 MJK2134025
Cmax[ng·mL-1] 35234.4 56426.63
Tmax[h] 1 2
AUCall[h ng·mL-1] 118871.2 303182.3
5.6CSF样品收集
对小鼠注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)的混合物，并且在深度麻醉时将其置于立体定位框架中。切开覆盖皮肤的头部，以暴露颅骨和后颈部肌肉。将后者切断直到通过半透明硬脑膜看到枕大池。用棉签清洁任何血液残留物后，用31-规格胰岛素针头(Becton Dickinson)收集CSF，并在-80℃储存直至进一步处理。
5.7CSF样品中18:0LPA相对分析的方法
根据Zhao,Z.和Xu,Y.[8]和Okudaira,M.等人[9]进行来自从CSF样品的溶血磷脂酸和MJK2134025的甲醇提取。简言之，将冷冻的CSF样品在冰上解冻。然后，在1.5mL带有微量插入物(透明玻璃，平底，0.2mL，31×6mm，LABSOLUTE，德国)的Eppendorf管中，用甲醇中的5ng/mL 17:0LPA(作为内标)以1:10(v：v)的比例沉淀样品。在Thermomixer C(Eppendorf，德国)中，在4℃和1600rpm下混合Eppendorf管2分钟。随后，将Eppendorf管在4℃和16.1rcf下离心2分钟。将上清液转移至HPLC小瓶中，用于UHPLC-MS测量，如下节所述。
使用耦合至使用UHPLC柱(C18 CAPCELL PAK ACR柱(C18 CAPCELL PAK ACR柱(1,5x 250mm:Osakasoda,Osaka,Japan)的Thermo Scientific QExactive HF-X Orbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)的Vanquish Horizon UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific，Bremen，Germany)分析所有CSF样品。对于流动相，使用含有0.1％甲酸的5mM甲酸铵水溶液(洗脱液A)和含有0.1％甲酸的5mM甲酸铵乙腈：H2O(95:5，％v：v)溶液(洗脱液B)。在以下梯度条件下应用0.5mL/min的流速：65％洗脱液B持续1分钟，然后在3分钟内线性增加至95％，保持95％洗脱液B持续2分钟，然后在0.5分钟内降低至65％，接着等度保持1.5分钟。柱温保持在25℃。样品保持在4℃，将15μL样品注入UHPLC-MS。以60000的分辨率在半峰全宽和正负离子切换模式下获得质谱。应用以下HESI源参数：喷雾电压3.8kV(负模式)和3.5kV(正模式)，毛细管温度320℃，漏斗RF水平40，外壳气压49(N2>95％)，辅助气体10(N2>95％)，辅助气体加热器温度300℃。自动增益控制(AGC)目标设置为10E+6。选择的扫描范围为m/z 400-600，进样时间设置为200ms。使用TraceFinder4.1SP3对目标化合物的峰面积进行积分。由于CSF样本量和数量非常有限，根据峰面积比进行了LPA18:0的初步测定(图21)。
6.细胞毒性测试
在高密度聚乙烯烧瓶(NUNC 156340)中，温度为37℃，5％的CO2气氛下，将HeLa细胞(DSMACC 57)在补充有10mL·L-1超谷氨酰胺1(CAMBR17-605E/U1)、550μL·L-1硫酸庆大霉素(50mg·mL-1，CAMBR17-518Z)和10％热灭活胎牛血清(GIBCO Life Technologies10270-106)。在不存在测试物质的情况下，将细胞预孵育48小时。随后，将HeLa细胞与测试物质的连续稀释液在96孔微孔板中在37℃的潮湿气氛和5％ CO2下孵育72小时。孵育后，使用比色测定法(亚甲蓝)分析化合物相对于阴性对照(DMSO)的细胞溶解作用。贴壁HeLa细胞通过戊二醛(MERCK 1.04239.0250)固定，并用0.05％的亚甲基蓝(SERVA29198)溶液染色15分钟。温和冲洗后，通过向每孔中加入0.2mL盐酸(0.33M)洗脱染料。在SUNRISE微孔板读数器(TECAN)中在660nm处测量吸收。对每种物质进行四次重复试验。半细胞毒浓度(CC50)定义为相对于各自未处理的对照，单层中活细胞计数减少50％所需的测试化合物浓度。CC50值的所有计算均使用软件Magellan(TECAN)进行。
参考文献
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2.Harrison PJ,Weinberger DR(2005)Molecular psychiatry 10:40-68；image5
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5.Davis M(ed)(1984)The mammalian startle response.New York,NY:PlenumPress
6.Swerdlow NR et al.,(1994)Arch Gen Psychiatry 51:139-154
7.Braff et al.,(2001)Psychopharmacology 156:234-58
8.Zhao,Z.,and Y.Xu.An extremely simple method for extraction oflysophospholipids and phospholipids from blood samples.J Lipid Res.2010.51:652–659.
9.Okudaira,M.,A.Inoue,A.Shuto,K.Nakanaga,K.Kano,K.Makide,D.Saigusa,Y.Tomioka,and J.Aoki.Separation and quantification of 2-acyl-1-lysophospholipids and 1-acyl-2-lysophospholipids in biological samples by LC-MS/MS.J.Lipid Res.2014.55:2178–2192.

Claims (15)

1.通式(I)的化合物或其药学上可接受的载体、溶剂化物、对映异构体或水合物
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
J是CH2或C＝O，优选CH2。
2.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自
3.一种药物组合物，其包含权利要求1和2所述的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。
4.权利要求1或2所述的化合物或权利要求3所述的药物组合物，其用于医药用途。
5.权利要求1或2所述的化合物或权利要求3所述的药物组合物，其用于预防或治疗受试者中的疾病，其中自分泌运动因子的抑制、调节和/或调控起作用，优选包括降低所述受试者靶向组织中，更优选所述受试者脑中溶血磷脂酸(LPA)的水平。
6.权利要求1、2所述的化合物或权利要求3所述的药物组合物，其用于预防或治疗受试者的中枢神经系统紊乱，包括降低所述受试者脑中溶血磷脂酸(LPA)的水平、纤维化疾病，或用于预防或治疗癌症。
7.权利要求6所述的供使用的化合物或所述的供使用的药物组合物，其中
a)所述中枢神经系统紊乱是精神紊乱和/或
b)所述纤维化疾病选自特发性肺纤维化、肝纤维化。
8.权利要求6所述的供使用的化合物，其中所述中枢神经系统紊乱是神经紊乱。
9.权利要求7所述的供使用的化合物，其中所述精神紊乱选自精神分裂症、抑郁症、焦虑症、对压力和压力相关疾病的易感性、恐慌症、双相型障碍、肥胖症、进食障碍和ADHD。
10.权利要求9所述的供使用的化合物，其中所述进食障碍为暴食障碍。
11.权利要求7或9所述的供使用的化合物，其中所述精神紊乱是肥胖症或导致肥胖症的进食障碍。
12.权利要求8所述的供使用的化合物，其中所述神经紊乱选自多发性硬化、癫痫、阿尔茨海默病和缺血性中风。
13.权利要求6所述的供使用的化合物，其中所述癌症选自纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤(leiosarcoma)、横纹肌肉瘤、结肠癌、上皮癌(carcinoma)、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、注射器癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、骨髓癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(Wilm’s tumour)、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌(epithelial carcinoma)、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤(medulloblastoma)、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤(haemangioblastoma)、听神经瘤、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、脑膜瘤、黑素瘤神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinaemia)和重链疾病。
14.一种优选用于制备化合物(III)的方法，其包括：
a)将化合物(II)转化为化合物(III)的步骤：
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n是1-4，优选1-3，更优选1；
任选地，芳基可以被一个或多个选自-CF3、卤素、-OCF3、-SCF3和(C1-C6)烷基的取代基取代。
15.权利要求14所述的方法，其中在步骤a)中，将化合物(II)转化为(III)
i)通过在氧化步骤中使用氧化剂来进行和/或
ii)通过应用氧化步骤来进行，所述氧化步骤包括应用选自(NH4)6Mo7O24·4H2O、H2O2和/或mCPBA中的至少一种试剂，优选mCPBA和/或
iii)包括形成中间体化合物(IV)
iv)在化合物(IV)的乙烯基上加成化合物(V)
其中
E是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
F是CH2、C＝O或CH(C1-C5)烷基；优选CH2；
G是H、-C(O)O(C1-C6)烷基或-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；优选-C(O)O(CH2)n(C5-C6)芳基；
L是N或CH，优选N或CH，G是H；
n为1-4，优选1-3，更优选1。
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