CN117969853A - 代谢标志物在制备用于评估待测个体的糖尿病并发症患病风险或其并发症的产品中的应用 - Google Patents
代谢标志物在制备用于评估待测个体的糖尿病并发症患病风险或其并发症的产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种代谢标志物在制备用于评估待测个体的糖尿病并发症患病风险或诊断糖尿病并发症的产品中的应用，该代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸、吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。该标志物能够作为用于糖尿病并发症诊断的代谢标志物，为糖尿病并发症的诊断提供依据，具有灵敏度高、特异性好等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种糖尿病并发症诊断或风险评估的代谢标志物及其应用。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病若不及时治疗，随着病情的发展会引发严重的并发症，可累及全身各个器官系统，包括心脑血管、肾脏、神经、视网膜、皮肤及四肢等。
糖尿病并发症的诊断通过患者本身的症状和体征以及医院的仪器来检查。例如，糖尿病视网膜病变可由眼科医生进行眼底的检查(有没有眼底出血、黄斑变性等等)或者进行眼底照相来判断是否存在视网膜病变。冠心病的诊断则需要进行冠状动脉造影(诊断冠心病的金标准)。一方面冠状动脉造影是一种介入测量手段，需要介入手术，且诊断昂贵。另一方面，医生还需要依据对患者的心电图、心动图、平板运动试验、CT等检查结果给出最终诊断。为了改善患者的生活质量，降低患者受到的生命威胁，我们亟需发展一种具有诊断率高、经济、无侵入性、操作简便等特性的诊断方法。
代谢组学研究的代谢物不仅反映了基因组与蛋白组的变化，还受到其他因素如环境因素和肠道菌群的影响，代谢物具有更强的动态性，对生物体的变化反映更加灵敏。分析代谢物的差异获得可以指示各种生化反应的代谢标志物。因其简便、快速、经济且相对无创的优点，代谢标志物已成为一种疾病诊断方法。中国专利CN111630386A公开了在大鼠生物样本中检测的代谢物2-氨基-6-((2,4,5-三羟基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3-基)氨基)己酸(亦称葡萄糖赖氨酸)可作为判断糖尿病并发症有无或发生风险的标志物。然而，尚缺乏代谢产物作为2型糖尿病并发症诊断的标志物。
发明内容
本发明的目的，提供一种糖尿病并发症诊断或风险评估的代谢标志物其应用，为糖尿病并发症的诊断提供依据，具有灵敏度高、特异性好等优点。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
在本发明的第一方面，提供一种代谢标志物在制备用于评估待测个体的糖尿病并发症患病风险或诊断糖尿病并发症的产品中的应用，所述代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸、吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。
作为优选实施方式，所述产品包括试剂盒、芯片。
作为优选实施方式，所述产品通过以下一种或多种方法测定代谢标志物的水平：色谱法、光谱法、质谱法、荧光测定、电泳、免疫亲和、免疫杂交、免疫化学、荧光分析、化学分析、光散射分析、比浊法。
作为优选实施方式，所述评估待测个体的糖尿病并发症患病风险或诊断糖尿病并发症的方法包括以下步骤：
(1)提供一来源于待测个体的样品，对样品中所述代谢标志物的水平进行检测；
(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据进行比较；
所述的参考数据包括来源于糖尿病并发症个体和健康个体的所述代谢标志物的水平。
作为优选实施方式，所述的样品选自血液、血浆或血清中的任意一种。
在本发明的第二方面，提供一种代谢标志物在制备用于筛选治疗糖尿病并发症的候选药物中的应用，其中，所述的代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。
在本发明的第三方面，提供一种筛选治疗糖尿病并发症的候选药物的方法，包括以下步骤：
(1)在测试组中，向待测个体施用测试药物，检测测试组中来源于所述个体的样品中各个代谢标志物的水平A；在对照组中，向待测个体施用空白对照，检测对照组中来源于所述个体的样品中各个代谢标志物的水平B；
(2)比较步骤(1)检测得到的水平A和B，从而确定所述测试药物是否治疗糖尿病的候选药物，其中所述的代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。
作为优选实施方式，所述待测个体为糖尿病并发症动物模型。
作为优选实施方式，如果癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中一个或多个代谢标志物的水平A显著低于水平B，表明测试药物为治疗糖尿病并发症的候选药物。
在本发明的第四方面，提供一种建立评估待测个体的糖尿病并发症的患病风险或待测个体糖尿病并发症诊断的质谱模型的方法，所述的方法包括质谱检测模型血液样品中代谢标志物的步骤，其中，所述的代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。
作为优选实施方式，所述糖尿病并发症为由2型糖尿病引发的糖尿病并发症，为糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病性冠心病或糖尿病性脑梗塞中的一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的用于糖尿病并发症诊断的代谢标志物，包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中的一个或多个，本发明提供的代谢标志物能很好地区分健康和2型糖尿病并发症患者，其中，2型糖尿病引发的糖尿病并发症为糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病性冠心病或糖尿病性脑梗塞中的一种；本发明提供的代谢标志物准确性高，灵敏度和特异性强。
采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，通过健康人群和糖尿病并发症血清中差异代谢物的含量判断其用于诊断区分健康人群和糖尿病并发症患者的能力；其中，癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺这4个代谢标志物单个用于诊断区分健康人群和糖尿病并发症患者时，ROC曲线下面积(AUC)均大于等于0.949，表明其诊断力强，癸酰甘氨酸和乙酰酪氨酸在用于糖尿病肾病、糖尿病性冠心病以及糖尿病性脑梗塞时AUC高达1.0，诊断具有临床诊断意义。联合应用时随着联合个数的增加，AUC进一步提高，特异性和灵敏度提高，诊断力更强，具有重要的临床应用价值。
本发明提供了一种快速诊断糖尿病并发症的代谢标志物及其应用，根据不同糖尿病个体的血清代谢物进行分析，从微观代谢物角度诊断糖尿病并发症，并且操作简单，结果精确客观可靠，能够很好地将糖尿病并发症和健康群区分开，为临床准确的诊断糖尿病并发症提供了便利，且这仅需提供血样即可进行，无需其他组织样本，大大提高了临床应用的可能性和可行性，为临床医生早期准确诊断和提供早期干预方案提供参考依据。
附图说明
图1是癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺单个用于诊断糖尿病视网膜病变的受试者工作曲线(ROC)图。
图2是癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺单个用于诊断糖尿病肾病的ROC图。
图3是癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺单个用于诊断糖尿病性冠心病的ROC图。
图4是癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺单个用于诊断糖尿病性脑梗塞的ROC图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，发现了糖尿病并发症的代谢标志物，具体地，本发明发现癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺能够作为糖尿病并发症诊断的代谢标志物，可以用于评估糖尿病并发症的患病风险或糖尿病并发症的诊断，其中，糖尿病并发症为糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病性冠心病或糖尿病性脑梗塞中的一种，本发明提供的糖尿病并发症的代谢标志物具有准确性高、特异性强、灵敏性强的优点，因而具有重要的临床应用价值。在此基础上，完成了本发明。
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明，但并不以此限定本发明的保护范围。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品，未具体描述的试验操作方法均为本领域普通技术人员公知的常规操作方法。
实施例1：
本实施例为了筛选健康人群和糖尿病并发症患者之间血清差异代谢物，具体操作如下：
一、对象和方法
1、样本来源
在获得患者同意后，收集于开封市中医院治疗的148名2型糖尿病并发症患者和84名健康人群的外周静脉血，离心后取血清。148名2型糖尿病并发症患者包括27名单纯性糖尿病视网膜病变、15名单纯性糖尿病肾病、38名单纯性糖尿病性冠心病、19名单纯性糖尿病性脑梗塞，41名患了2种2型糖尿病并发症，以及8名患了3种2型糖尿病并发症。所有患者均经临床医生诊断结果证实。采血时间均为清晨空腹状态。
2、主要试剂
甲醇和乙腈(HPLC纯)购自美国Fisher Chemical公司，甲酸(HPLC纯)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，酮洛芬标准品购自美国Sigma-Aldrich公司，2-氯-L-苯丙氨酸标准品购自百灵威科技有限公司，去离子水由美国密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超纯水系统制备。
3、血浆差异代谢物的筛选
3.1样品制备
-80℃冻存的血清样本，解冻涡旋后，取50μL血清至标记好的1.5mL离心管中，加入150μL甲醇蛋白沉淀剂(含内标酮洛芬和2-氯-L-苯丙氨酸)。涡旋1min混匀后，于16,200g、4℃条件下离心10min。取100μL上清液转移至含内插管带标记的进样小瓶中，待进样分析。
3.2实验条件及参数
采用超高效液相色谱(UHPLC，Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific)系统对血清代谢物进行色谱分离。色谱柱为Waters的ACQUITY BEH C18(100mm×2.1mm,1.7μm)，柱温为40℃。流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为纯乙腈。分析样本进样体积均为5μL，流速为0.35mL/min，分析时间15min。梯度洗脱条件：0～1min为0～5％B相，8min内B相线性增加到100％并保持3min，然后在0.1min内B相线性降低至50％并保持2.9min。
质谱分析采用Q-Orbitrap高分辨率质谱仪(HRMS，Q-Exactive，Thermo FisherScientific)配备了热电喷雾电离源(ESI)，并在全扫描模式下操作，碰撞气为高纯氮气。HRMS同时进行正离子和负离子扫描，正离子电压为3500V，负离子电压为2800V，毛细管温度为320℃，气化温度为300℃。质谱扫描范围设置为80～1,200m/z，分辨率为70,000。在二级扫描模式下，以20、40和60eV碰撞能量碎裂代谢物，分辨率为17,500。
4、数据处理和分析
采集到的质谱数据使用Compound Discoverer 3.0进行预处理。经过峰提取、峰对齐、噪音滤过、数据滤过、缺失值填补和标准化后获得矩阵数据。矩阵数据主要包括与代谢物相关的保留时间、分子量、分子式、各离子在样本中的峰面积等信息。将获得的矩阵数据导入SIMCA14.0进行多元统计分析，建立正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)来寻找健康和糖尿病前期患者之间代谢轮廓贡献较大(VIP>1.0且P<0.05)的代谢物。
通过HMDB(http://www.hmdb.ca/)、MassBank of North America(MoNA)(http://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/spectra/search)和Metline(http://metlin.scripps.edu/)等数据库进行代谢物的鉴定，利用数据库中提供的精确分子量和质谱所得的MS/MS图谱初步鉴定上述差异代谢物的结构。最终通过标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，鉴定差异代谢物。
二、实验结果
根据多元统计分析获得的VIP和单变量分析的P值筛选，人为比对在线数据库鉴定后获得4个血清差异代谢物在糖尿病并发症患者血清中显著变化(结果如表1所示)，分别为：癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺。与健康人群相比，上述4个差异代谢物在糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病性冠心病、糖尿病性脑梗塞患者血清中的含量均上升。
表1
实施例2：
本实施例构建ROC曲线验证4个差异代谢物用于诊断区分健康人群和糖尿病并发症的能力，具体操作如下：
采用受试者工作曲线(ROC)法进行验证，通过健康人群和糖尿病并发症血清中差异代谢物的含量判断其用于诊断区分健康人群和糖尿病并发症患者的能力。图1-4分别为癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺这4个差异代谢物单个用于诊断区分健康人群和糖尿病并发症患者(分别为糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病性冠心病和糖尿病性脑梗塞)时的受试者工作曲线ROC图，从图1-4结果可知，ROC曲线下面积(AUC)均大于等于0.949，表明上述代谢物用于糖尿病并发症的诊断能力强；其中，癸酰甘氨酸和乙酰酪氨酸在用于糖尿病肾病、糖尿病性冠心病以及糖尿病性脑梗塞时AUC高达1.0，诊断具有临床诊断意义。癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺这4个差异代谢物联合应用时随着联合个数的增加，AUC进一步提高，特异性和灵敏度提高，诊断力更强，上述任意两个差异代谢物联合诊断区分健康人群和糖尿病视网膜病变患者如表2所示：
表2
以癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺这4个差异代谢物任意3个或4个联合诊断区分健康人群和糖尿病视网膜病变患者如表3所示。
表3
| 联合个数 | AUC | 灵敏度 | 特异性 |
| 任意三个 | ≥0.990 | ≥98.0％ | 100.0％ |
| 四个 | 0.998 | 98.0％ | 100.0％ |
使用癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺这4个差异代谢物联合应用诊断区分健康人群和糖尿病肾病患者时特异性和灵敏度高，诊断力强。上述任意两个、任意三个、四个差异代谢物联合诊断区分健康人群和糖尿病肾病患者如4所示。
表4
使用癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺这4个差异代谢物联合应用诊断区分健康人群和糖尿病性冠心病患者时特异性和灵敏度高，诊断力强。上述任意两个、任意三个、四个联合诊断区分健康人群和糖尿病性冠心病患者如表5所示。
表5
使用癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺这4个差异代谢物联合应用诊断区分健康人群和糖尿病性脑梗塞患者时特异性和灵敏度高，诊断力强。上述任意两个、任意三个、四个联合诊断区分健康人群和糖尿病性脑梗塞患者如表6所示。
表6
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
Claims (11)
1.代谢标志物在制备用于评估待测个体的糖尿病并发症患病风险或诊断糖尿病并发症的产品中的应用，其特征在于，该代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸、吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过以下一种或多种方法测定代谢标志物的水平：色谱法、光谱法、质谱法、荧光测定、电泳、免疫亲和、免疫杂交、免疫化学、荧光分析、化学分析、光散射分析、比浊法。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述评估待测个体的糖尿病并发症患病风险或诊断糖尿病并发症的方法包括以下步骤：
(1)提供一来源于待测个体的样品，对样品中所述代谢标志物的水平进行检测；
(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据进行比较；
所述的参考数据包括来源于糖尿病并发症个体和健康个体的所述代谢标志物的水平。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的样品选自血液、血浆或血清中的任意一种。
6.代谢标志物在制备用于筛选治疗糖尿病并发症的候选药物中的应用，其中，所述的代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。
7.一种筛选治疗糖尿病并发症的候选药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在测试组中，向待测个体施用测试药物，检测测试组中来源于所述个体的样品中各个代谢标志物的水平A；在对照组中，向待测个体施用空白对照，检测对照组中来源于所述个体的样品中各个代谢标志物的水平B；
(2)比较步骤(1)检测得到的水平A和B，从而确定所述测试药物是否治疗糖尿病的候选药物，其中所述的代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述待测个体为糖尿病并发症动物模型。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，如果癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中一个或多个代谢标志物的水平A显著低于水平B，表明测试药物为治疗糖尿病并发症的候选药物。
10.一种建立评估待测个体的糖尿病并发症的患病风险或待测个体糖尿病并发症诊断的质谱模型的方法，其特征在于，所述的方法包括质谱检测模型血液样品中代谢标志物的步骤，其中，所述的代谢标志物包括癸酰甘氨酸、乙酰酪氨酸、苯乙酰谷氨酸和吲哚乙酰谷氨酰胺中的一种或两种以上的组合。
11.如权利要求1-6任一项所述的应用、权利要求7-10任一项所述的方法，其特征在于，所述糖尿病并发症为由2型糖尿病引发的糖尿病并发症，为糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病性冠心病或糖尿病性脑梗塞中的一种。
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