CN117434277B - 用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合及应用 - Google Patents
用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合及应用，该粪便代谢标志物组合为十四烷基膦酸、4‑乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4‑氧代戊酸、4‑羟基异喹、N‑(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L‑高精氨酸、N‑棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中任意至少五项组合。本发明提供的粪便代谢标志物能准确进行克罗恩病早期诊断或筛查，灵敏度高，能够替代现有基于血液和粪便检测的克罗恩病早期诊断或筛查方法，减少漏诊率，降低检测费用，具备临床使用推广价值。
Description
技术领域
本发明属于诊断检测技术领域，具体地说，涉及用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合及应用。
背景技术
克罗恩病是一种致残的慢性自身免疫性疾病，随着病程的进展，消化道发生不可逆的损伤，导致严重的肠功能障碍。由于克罗恩病缺乏特异性的症状和准确的早期诊断手段，克罗恩病的诊断延迟（从首发症状到疾病诊断的时间）很常见，确诊时多已合并肠狭窄、肠瘘等并发症，错过了治疗的“黄金窗”，疾病预后差。在全球范围内，克罗恩病发病率呈上升趋势，疾病负担不可估量。由于缺乏对克罗恩病自然病程的科学认识，其早期诊断非常困难，是其预后差的主要原因之一。
巴黎国际专家共识（参考文献：Am J Gastroenterol. 2012 Dec;107(12):1770-6. doi: 10.1038/ajg.2012.117.）将早期克罗恩病定义为病程在18个月内，且无并发症，没有使用过可影响疾病自然病程的药物（主要指硫唑嘌呤、氨甲蝶呤和/或生物制剂等）的克罗恩病。克罗恩病的早期诊断包括早期克罗恩病的诊断以及克罗恩病前期的识别。2015年，我国炎症性肠病专家李世荣教授率先提出克罗恩病高危人群的伺机性筛查策略（参考文献：胃肠病学，2015年第20卷第6期，DOI:10．3969/j．issn．1008-7125．2015．06．001），采用该策略，本研究团队已成功建立克罗恩病早期诊断队列，并证明该策略是克罗恩病早发现(自然病程前期)和早诊断(无并发症的克罗恩病)的重要策略（参考文献：胃肠病学和肝病学杂志, 2019年1月第28卷第1期，Doi:10．3969 /j．issn．1006-5709．2019．01．020；中华消化杂志, 2020年40卷05期DOI：10.3760/cma.j.cn311367-20200121-00030）。
目前常用的克罗恩病早期诊断或筛查手段主要是结直肠镜检查、组织病理学检查、胶囊内镜检查、影像学检查和血清免疫标志物等。其中，结直肠镜检查联合组织病理学检查是克罗恩病诊断的金标准，但由于早期/前期病变的内镜下表现和组织病理学特征多不典型，通常需长期随访实现诊断，增加诊断延迟风险。此外，结肠镜检查联合组织病理学检查作为一种侵入性检查，会引起出血、疼痛等不适症状，并且对临床医师、内镜医师、病理医师的专业水平要求极高。因此，结肠镜检查联合病理学检查进行克罗恩病早诊及筛查方法的耗时费力、依从性差，急需研究新方法。胶囊内镜检查虽然是高准确性和低侵入性的检查方法，有利于发现小肠细微的粘膜病变，在小肠克罗病的早期诊断中具有较高的特异性和敏感度，但胶囊内镜检查的缺点是有滞留风险，因此，对于疑似克罗恩病，只有排除明显狭窄后，才可采用此方式检查，而且不能进行粘膜活检，鉴别诊断价值有限。此外，胶囊内镜检查价格昂贵，患者难以普遍接受。影像学检查，包括CTE、MRE和腹部超声等，虽有能有效观察肠壁增厚、分层、周围脂肪密度情况，但克罗恩病早期/前期病变炎性反应轻，病灶多呈局限性，消化道累及范围相对较小，限制了其在早期诊断和筛查中的应用。血清免疫标志物是指针对各种细菌表位的循环抗体，具有非侵入性、成本低的优点，但缺点是其在早期克罗恩病病中阳性率低[该专利文本数据来源的临床试验注册研究（ChiCTR-1900022728）显示（iLABMED，DOI: 10.1002/ila2.28），早期CD患者中ASCA IgG、ASCA IgA、AYMA IgG、AYCAIgG、FI2Y IgG、p-ANCA IgG、GAB IgG 和PAB IgG 的阳性率分别为37.0%、3.7%、14.8%、25.9%、18.5%、0.0%、13.6%、7.4%]，难以单独应用进行早期诊断，即使联合诊断，其灵敏度最高也仅为87.3%（ASCA/AYMA/AYCA/FI2Y/GAB/PAB/PANCA），但特异度仅为44.4%。
另外，近些年多组学研究（基因组学、表观基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、微生物组学等）发展迅速，一些以代谢产物、肠道菌群、小分子蛋白等为代表的血浆/血清标志物显示出对疾病早期诊断或筛查的巨大潜力，如专利文献显示（公开号：CN114965733A）：D-山梨糖醇、羟基色胺、N-乙酰基甘氨酸、胸腺嘧啶、5-羟色胺、十二烷酸、1-萘乙酸、4-硝基苯酚中的单个代谢标志物ROC曲线下的面积AUC值大于0.6，在0.603 -0.741之间；多个代谢标志物组合的性能明显优于单个代谢标志物，ROC曲线下的面积AUC值为0 .638～0 .857，并且代谢物组合诊断进展期腺瘤的灵敏度达到64％，特异性超过90％。研究或专利文献显示，基于代谢组学的代谢标志物检测低侵入性、简单、快捷且灵敏度高、特异度好的优点，有望改善当前消化道疾病早诊早治难题，如消化道早癌、炎症性肠病等。但目前，尚缺乏可用于克罗恩病早期/前期病变筛查或诊断的报道，尤其来自于基于前瞻性随访队列的临床注册研究。此外，基于血浆/血清的标志物虽具有很好的临床潜力，但样本的获取方式为有创性，患者常常因为抽取静脉血产生的疼痛或畏惧心理，容易导致患者依从性降低，而粪便因为容易获取且方便，患者更容易接受，故而研究基于粪便来源的新型标志物（如代谢物）具有广阔的临床应用前景，有望显著提高消化疾病的早期诊断率和筛查依从性，尤其是包括克罗恩病在内的炎症性肠病。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，基于首都卫生发展科研专项重点攻关项目《克罗恩病早期诊断的队列建立与临床标志物的组学研究》（首发2018-1-5091，临床注册号：ChiCTR-1900022728），前瞻性地对符合克罗恩病高危条件的回盲部炎症病变（溃疡、糜烂）进行长期随访，以诊断时间为随访终点，建立不同自然病程的克罗恩病患者，在随访过程中收集患者生物样本（血液、组织、血清、粪便等）（伦理审批号：#2016-45、#2017-46)），后进行巢式队列研究以探索可用于克罗恩病早期诊断或筛查的代谢组学标志物，提供灵敏度高、特异性强的代谢标志物或最佳的联合检测组合，并创建有效、无创、价格便宜的早期诊断和筛查方法，能够很好替代传统的结肠镜检查、组织病理学检查、影像学及血清免疫标志物检测的诊断模式，减少创伤和漏诊率，提高克罗恩病早期诊断率，改善疾病预后，具备临床使用推广价值。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明一方面提供一种用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合，所述粪便代谢标志物组合为十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中任意至少五项组合。
进一步地，所述粪便代谢标志物组合包括十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸。
进一步地，所述粪便代谢标志物组合还包括甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中的至少一种。
进一步地，所述粪便代谢标志物组合包括4-乙酰氨基丁酸、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中任意至少五项组合。
进一步地，所述粪便代谢标志物组合包括十四烷基膦酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、4-羟基异喹、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸中任意至少五项组合。
本发明另一方面提供上述用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合在制备早期诊断或筛查克罗恩病的试剂盒中的应用。
本发明又一方面提供一种用于克罗恩病早期诊断或筛查的试剂盒，包括上述用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合的标准品。
进一步地，所述试剂盒还包括提取试剂和内标物。
进一步地，所述内标物为L-苯基丙氨酸。
本发明再一方面提供上述用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合的筛选方法，包括如下步骤：
分别采集经前瞻性克罗恩病早期诊断队列建立（中国临床试验注册中心，临床试验名称：克罗恩病早期诊断的队列建立与临床标志物的组学研究，临床注册号：ChiCTR-1900022728）的健康对照组样本和早期克罗恩病患者组样本[该临床注册试验通过前瞻性地对符合克罗恩病高危条件的回盲部炎症病变（溃疡、糜烂）进行长期随访，以诊断时间为随访终点，建立不同自然病程的克罗恩病患者，在随访过程中收集患者生物样本（血液、粪便、组织等），后进行巢式队列研究以探索可用于克罗恩病早期诊断的组学标志物]；
采用LC-MS检测健康对照组样本和早期克罗恩病患者组粪便样本，经判别分析，获得候选差异代谢物；
对所述差异代谢物及其组合进行受试者工作特征曲线分析，确定用于早期诊断或筛查克罗恩病的代谢标志物组合。
在其中一些实施例中，LC-MS检测的条件为：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1 .8μm，2.1mm*100mm；
流动相：A 相为超纯水（0.1% 的甲酸），B 相为乙腈（0.1 % 的甲酸）；
洗脱梯度程序为：
0 min，A相与B相的体积比为95:5；
11.0 min，A相与B相的体积比为10:90；
12.0 min，A相与B相的体积比为10:90；
12.1min，A相与B相的体积比为95:5；
14.0min，A相与B相的体积比为95:5。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。
本发明对比健康人群与克罗恩病患者粪便代谢组的差异性，筛选出针对克罗恩病早期诊断或筛查的12种粪便代谢物，单个代谢标志物ROC曲线下的面积AUC值大于0.8，在0.80~0.96之间；多个代谢标志物组合的性能明显优于单个代谢标志物，ROC曲线下的面积AUC值为0.89~0.99，并且代谢物组合诊断早期克罗恩病的灵敏度达到94.1%，特异度达到97.4%。采用本发明的12种粪便代谢标志物进行检测诊断时能够在降低早期诊断或筛查成本的同时提升克罗恩病诊断的灵敏度、特异度，仅通过无创性的粪便检测就能实现早期诊断，无需额外采集血液、组织等样本，能够很好地替代或减少对现有结肠镜检查、组织病理学检查、影像学检查、免疫法检测、血清免疫标志物等诊断模式或方法，减少创伤和漏诊率，提高克罗恩病患者早期诊断或筛查的依从性，极大地提高早期诊断率，具备临床使用推广价值。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本申请的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是代谢物OPLS-DA的S-plot图；
图2是差异代谢物箱线图；
图3是十四烷基膦酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图4是4-乙酰氨基丁酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图5是LPE(0:0/18:2)对早期克罗恩病的诊断性能图；
图6是LPE(18:2/0:0)对早期克罗恩病的诊断性能图；
图7是甲基丙二酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图8是4-氧代戊酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图9是4-羟基异喹对早期克罗恩病的诊断性能图；
图10是N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图11是L-高精氨酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图12是N-棕榈酰甘氨酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图13是甲酰四氢叶酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图14是亚叶酸对早期克罗恩病的诊断性能图；
图15是OPLS-DA统计图对早期克罗恩病的诊断性能图。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明基于克罗恩病早期诊断队列（临床注册号：ChiCTR-1900022728），前瞻性随访克罗恩病高危患者（原因不明的顽固性、慢性腹痛和排便习惯改变；阑尾炎术后伴有持续性右下腹疼痛；无明显诱因的频繁口腔溃疡；原因不明的皮肤、关节、眼部病变；克罗恩病患者的一级亲属；结肠镜检查发现回盲部存在单发或多发阿弗他溃疡等），观察并经患者签订知情同意书采集到患者的新鲜粪便样本（伦理审批号：#2016-45、#2017-46），按照《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018年，北京）》中克罗恩病诊断标准，经过疑诊-确诊环节，随访时间超过24个月，最终建立不同自然病程克罗恩病队列（亚临床期、早期、进展期），实现早期诊断（部分数据发表于《中华消化杂志》《Gut pathgens》，早期患者占随访病例12.5%）。
关键实验试剂见下表1：
表1 实验试剂
| 化合物 | CAS编号 | 品牌 |
| 甲醇 | 67-56-1 | Merck |
| 乙腈 | 75-05-8 | Merck |
| 乙酸 | 64-19-7 | Aladdin |
| L-苯基丙氨酸 | 63-91-2 | isoreag |
关键仪器信息分别见下表2：
表2实验仪器信息
| 名称 | 型号 | 品牌 |
| HPLC-TOF-MS | TripleTOF 6600 | SCIEX |
| LC-MS/MS | QTRAP 6500+ | SCIEX |
| 离心机 | 5424R | Eppendorf |
| 离心浓缩仪 | CentriVap | LABCONCO |
| 涡旋混合器 | VORTEX-5 | Kyllin-Be11 |
实施例1
本实施例所述一种用于早期克罗恩病粪便代谢标志物的筛选方法，包括如下步骤：
S1，采集样本
基于中国人民解放军总医院第七医学中心克罗恩病自然病程队列，在取得患者同意后，收集临床医学研究中心的51例健康对照（健康对照组）和28例早期克罗恩病患者的新鲜粪便样本。纳入标准：
健康对照组：（1）近6个月内没有使用抗生素，及激素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、甲氨蝶呤等免疫抑制剂；（2）近6个月未规律口服益生菌或益生元制剂；（3）肠镜检查无肠道炎症史、手术史、肿瘤史等；（4）传染病项目检查（如艾滋、乙/丙肝等）阴性；（5）没有在妊娠期或哺乳期的女性；（6）没有合并需长期药物治疗的慢性病如心脑血管疾病、肿瘤、糖尿病、慢性呼吸系统疾病；（7）经内镜检查没有发现任何消化疾病，无消化道症状或合并症。
早期克罗恩病组：来自对回盲部炎性病变前瞻性随访中诊断并符合巴黎专家共识及《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018年，北京）》的新诊断病例。
排除标准：（1）在采样时间点之前的6个月内使用抗生素、益生菌或益生元；（2）流行性或感染性腹泻；（3）恶性肿瘤。
两组组样本间的年龄和性别均相匹配。粪便采集均在以下条件进行：（1）所有样本均在肠镜检查准备前或肠镜检查后一个月获取；（2）采集新鲜的样本后分装存放于灭菌冻存管， 立即放入 -80℃低温冰箱保存待测，以防止厌氧菌接触氧气，避免在提取 DNA 前细菌过度生长；（3）每例粪便样本量＞5g。
S2，粪便广泛靶向代谢组学分析
（1）样品预处理
从 -80 °C冰箱中取出步骤S1采集的样品，于冰上解冻至样本中没有冰块（后续操作都要求在冰上进行）；样本解冻后，称量样本 20 mg（±1 mg）到对应编号离心管中；加入70 % 甲醇水内标提取液 400 μL，涡旋 3 min，若样本不分散，加入钢珠继续涡旋 3 min；冰水浴中超声 10 min，取出样本继续涡旋 1 min，-20 °C 冰箱中静置 30 min；在 4 °C条件下，12000 r/min 离心 10 min，移取上清液 300 μL 到另一对应编号离心管中；在 4°C 条件下，12000 r/min 再离心 3 min，移取上清液 200 μL 到对应进样瓶内衬管中，用于LC-MS/MS分析。每个样本各取20µL混合成质控样本（QC），每间隔15个样本采集一次。
（2）样品代谢物检测
确定液相色谱条件如下：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 µm，2.1 mm*100 mm；柱温为 40°C；进样量为 2µL。
流动相：A 相为超纯水（0.1% 的甲酸），B 相为乙腈（0.1 % 的甲酸）。洗脱梯度程序为：0 min，A相与B相的体积比为95:5；11.0 min，A相与B相的体积比为10:90；12.0 min，A相与B相的体积比为10:90；12.1 min，A相与B相的体积比为95:5；14.0 min，A相与B相的体积比为95:5。流速 0.4 mL/min。
确定质谱条件如下：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度 500℃，质谱电压 5500 V（positive）或者-4500 V（negative），离子源气体 I（GS I）55 psi，气体 II（GS II）60 psi，气帘气（curtain gas, CUR) 25 psi，碰撞诱导电离（collision-activated dissociation，CAD）参数设置为高。
在三重四极杆（Qtrap）中，每个离子对是根据优化的去簇电压（declusteringpotential， DP）和碰撞能（collision energy，CE）进行MRM模式扫描检测。
按照确定的液相色谱条件和质谱条件分别对样本进行分析检测：随机挑选健康对照组和早期克罗恩病组中各20％的样本，采用增强离子扫描质谱(MIM-EPI)和飞行时间质谱(TOF)结合多反应监测采集模式的代谢组学方法，以及整合本地标准品数据库进行克罗恩病（炎症性肠病）粪便代谢物数据库构建。用液相色谱-质谱联用代谢组学方法和构建的克罗恩病（炎症性肠病）粪便代谢物数据库对采集的粪便样本进行分析，得到各粪便样本的原始质谱数据。
（3）图谱峰面积预处理和积分
基于早期克罗恩病粪便特异性代谢物数据库，对样本的代谢物进行质谱定性定量分析。通过液相色谱能够分离不同分子量的代谢物。利用三重四极杆的多反应监测模式（MRM）筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度（CPS）。用MultiQuant软件打开样本下机质谱文件，根据质荷比、保留时间对原始质谱数据进行预处理和校正，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积（Area）代表对应物质的相对含量，设置S/N>5，保留时间偏移不超过0.2min的峰保留；根据质谱峰强度计算峰面积得到代谢物相对含量信息，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存，用于下一步统计分析。
（4）实验质量控制
通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流图进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。CV值即变异系数（Coefficient of Variation），是原始数据标准差与原始数据平均数的比，可反映数据离散程度。使用经验累积分布函数（Empirical CumulativeDistribution Function, ECDF）可以分析小于参考值的物质CV出现的频率，QC样本的CV值较低的物质占比越高，代表实验数据越稳定：QC样本CV值小于 0.5 的物质占比高于 85%，表明实验数据较稳定；QC样本CV值小于0.3的物质占比高于75%，表明实验数据非常稳定。同时监测检测过程中L-苯基丙氨酸内标CV值变化情况，内标CV值的变化小于20%，表明检测过程中仪器稳定性好。
（5）数据处理分析
将所有样本测试的峰面积积分数据导入SIMCA软件（Version 14.1，Sweden）进行多元统计分析。共检测到964个代谢物，通过建立正交-偏最小二乘法判别（OPLS-DA）模型，寻找健康人与早期克罗恩病患者之间贡献较大的代谢物（VIP > 1.0），差异显著代谢物为136个（上调的代谢物数目为58个，下调的代谢产物数目为78个）。如图1中深色标记的点为VIP > 1.0的代谢物，浅色标记的点为VIP < 1.0的代谢物。然后通过T-test检验和FDR校正，设置FRD < 0.05为差异显著性标准。为方便观察代谢物相对含量的变化规律，对应用筛选标准鉴定得到的差异代谢物的原始相对含量，采用对数变换方法（Log transformationScaling）进行标准化处理，通过R软件ggplot2和tidyverse包绘制箱线图（图2）。最终筛选出VIP > 1.0且FDR < 0.05的差异代谢物，可能是潜在早期诊断或筛查克罗病的代谢标志物。上述分析筛选的潜在早期克罗恩病代谢标志物，根据其保留时间、一级和二级质谱推测标志物的分子质量和分子式，并且与代谢物谱图数据库中的谱图信息进行比对，从而对代谢物进行定性鉴定。最终通过购买标准品，用标准品的分子量、色谱保留时间和相应的多级MS裂解谱比对，验证代谢标志物的结构。
本实施例中利用二元逻辑回归向前逐步法筛选到12种差异代谢物能够诊断区分早期克罗恩病：十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸，代谢物具体信息见下表3和表4：
表3 用于克罗恩病早期诊断或筛查的12种粪便代谢标志物
| 编号 | 中文名称 | 保留时间(RT) | 质荷比(m/z) | 离子化(Ionization) |
| 1 | 十四烷基膦酸 | 12.23 | 277.19 | [M-H]- |
| 2 | 4-乙酰氨基丁酸 | 4.03 | 146.08 | [M+H]+ |
| 3 | LPE(0:0/18:2) | 8.37 | 476.27 | [M-H]- |
| 4 | LPE(18:2/0:0) | 8.36 | 478.32 | [M+H]+ |
| 5 | 甲基丙二酸 | 3.5 | 117.01 | [M-H]- |
| 6 | 4-氧代戊酸 | 2.43 | 115.04 | [M-H]- |
| 7 | 4-羟基异喹 | 3.62 | 192.1 | [M+H]+ |
| 8 | N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸 | 3.62 | 192.06 | [M-H]- |
| 9 | L-高精氨酸 | 9.88 | 189.13 | [M+H]+ |
| 10 | N-棕榈酰甘氨酸 | 10.44 | 312.25 | [M-H]- |
| 11 | 甲酰四氢叶酸 | 2.22 | 474.2 | [M+H]+ |
| 12 | 亚叶酸 | 2.25 | 474.2 | [M+H]+ |
表4 早期克罗病患者组 VS 健康人组代谢物差异
| 中文名称 | 差异倍数 | VIP | P value |
| 十四烷基膦酸 | 0.45 | 4.15 | 3.07E-12 |
| 4-乙酰氨基丁酸 | 0.25 | 1.24 | 6.04E-06 |
| LPE(0:0/18:2) | 0.18 | 1.91 | 1.46E-03 |
| LPE(18:2/0:0) | 0.18 | 1.91 | 1.46E-03 |
| 甲基丙二酸 | 0.48 | 2.25 | 1.17E-03 |
| 4-氧代戊酸 | 0.37 | 1.97 | 1.51E-03 |
| 4-羟基异喹 | 0.21 | 2.07 | 4.83E-04 |
| N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸 | 0.22 | 1.92 | 9.15E-04 |
| L-高精氨酸 | 3.36 | 1.61 | 2.38E-02 |
| N-棕榈酰甘氨酸 | 1.99 | 2.07 | 5.63E-04 |
| 甲酰四氢叶酸 | 2.1 | 1.4 | 6.92E-03 |
| 亚叶酸 | 2.1 | 1.4 | 6.92E-03 |
由上表可以看出，与健康对照相比，早期克罗恩病患者组中的十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸的代谢物含量同步降低，L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸的代谢物含量同步升高。
进一步采用受试者工作特征曲线（ROC）分析代谢物对早期克罗恩病的诊断性能。单个代谢物对早期克罗恩病的诊断性能见图3-图14。
单个及任意2 ~ 11个代谢物联合用于诊断时的AUC值见表5和表6：
表5 单个代谢物用于克罗恩病早期诊断的AUC值
| 编号 | 中文名称 | AUC | 灵敏度 | 特异性 |
| 1 | 十四烷基膦酸 | 0.96 | 0.94 | 0.92 |
| 2 | 4-乙酰氨基丁酸 | 0.90 | 0.94 | 0.92 |
| 3 | LPE(0:0/18:2) | 0.92 | 0.88 | 0.79 |
| 4 | LPE(18:2/0:0) | 0.92 | 0.88 | 0.79 |
| 5 | 甲基丙二酸 | 0.92 | 0.94 | 0.76 |
| 6 | 4-氧代戊酸 | 0.95 | 0.94 | 0.85 |
| 7 | 4-羟基异喹 | 0.91 | 0.94 | 0.71 |
| 8 | N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸 | 0.92 | 0.88 | 0.76 |
| 9 | L-高精氨酸 | 0.80 | 0.82 | 0.77 |
| 10 | N-棕榈酰甘氨酸 | 0.84 | 0.70 | 0.79 |
| 11 | 甲酰四氢叶酸 | 0.92 | 0.82 | 0.92 |
| 12 | 亚叶酸 | 0.92 | 0.82 | 0.92 |
表6 任意代谢物联合用于克罗恩病早期诊断的AUC值
| 联合个数 | AUC | 灵敏度 | 特异性 |
| 任意二个 | >0.8 | >0.7 | >0.7 |
| 任意三个 | >0.8 | >0.7 | >0.7 |
| 任意四个 | >0.9 | >0.8 | >0.7 |
| 任意五个 | >0.9 | >0.8 | >0.9 |
| 任意六个 | >0.9 | >0.8 | >0.9 |
| 任意七个 | >0.9 | >0.8 | >0.9 |
| 任意八个 | >0.9 | >0.8 | >0.9 |
| 任意九个 | >0.9 | >0.8 | >0.9 |
| 任意十个 | >0.9 | >0.9 | >0.9 |
| 任意十一个 | >0.9 | >0.9 | >0.9 |
由上表统计结果可以看出：4-乙酰氨基丁酸、十四烷基膦酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸等10个差异代谢物单个用于早期诊断克罗恩病能力较强，ROC曲线下面积（AUC）均大于0.85,具有临床意义；这10个差异代谢物用于诊断早期克罗恩病时，AUC进一步提高，10个联合诊断早期克罗恩病的AUC达到0.99，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异度分别为94.1%和97.4%。其中，部分示例优选代谢标志物组合及其模型统计结果如下：
采用十四烷基膦酸、LPE(18:2/0:0)、4-氧代戊酸、L-高精氨酸构建克罗恩病早期诊断模型，这4个代谢标志物联合起来诊断克罗恩病的AUC值达到0.97，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为94.1％和89.5％。
采用十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、N-棕榈酰甘氨酸构建诊断克罗恩病模型。这6个代谢标志物联合起来诊断早期克罗恩病的AUC值达到0.98，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为94.1％和94.7％。
采用十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、亚叶酸构建诊断构建克罗恩病早期诊断模型。这10个代谢标志物联合起来诊断构建克罗恩病早期诊断模型的AUC值达到0.99，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为94.1％和97.4％。
另外，参见图15，根据上述差异代谢物绘制不同样本分组之间的OPLS-DA统计图，能够反应代谢标志物具有较好的诊断性能。
实施例2
本实施例提供一种用于区分克罗恩病早期和进展期患者的鉴别方法，包括如下步骤：
研究对象分为均来自实施例1中的克罗恩病早期诊断队列，其中28例早期克罗恩病病患者与实施例1相同，31例进展期克罗恩病患者选取标准为：已有并发症（如狭窄、肠瘘等），接受生物制剂治疗、免疫抑制剂和/或规律类固醇激素等治疗的患者。
样本采集、处理、检测分析方法与实施例1相同，在二元逻辑回归建模时使用上述12个粪便代谢标志物。
经构建模型分析：使用十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸联合用于区分克罗恩病早期和进展期患者的AUC为0.92。
实施例3
本实施例提供一种用于诊断或筛查早期克罗恩病的检测试剂盒，包括：
（1）代谢标志物的标准品：十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸，单独分装或者混合封装。
（2）溶剂：
纯甲醇和50%乙腈水溶液，用于样品提取。
50％乙腈水溶液可以用作溶解标准品的溶剂。
（3）内标物：L-苯基丙氨酸
使用本实施例中用于诊断或筛查早期克罗恩病的检测试剂盒的筛查方法，包括如下步骤：
S1，收集粪便样本，预处理，获得供试液。
S2，采用LC-MS分析检测供试液，获得十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、4-羟基异喹、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸的含量变化信息。
S3，依据上述代谢标志物的含量变化信息，判定是否可能属于早期克罗恩病患者。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Claims (9)
1.一种用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合，其特征在于，所述粪便代谢标志物组合为十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中任意至少五项组合。
2.根据权利要求1所述的一种用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合，其特征在于，所述粪便代谢标志物组合包括十四烷基膦酸、4-乙酰氨基丁酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、甲基丙二酸。
3.根据权利要求2所述的一种用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合，其特征在于，所述粪便代谢标志物组合还包括4-氧代戊酸、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的一种用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合，其特征在于，所述粪便代谢标志物组合包括4-乙酰氨基丁酸、甲基丙二酸、4-氧代戊酸、N-(对甲苯甲酰基)甘氨酸、甲酰四氢叶酸、亚叶酸中任意至少五项组合。
5.根据权利要求1所述的一种用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合，其特征在于，所述粪便代谢标志物组合包括十四烷基膦酸、LPE(0:0/18:2)、LPE(18:2/0:0)、L-高精氨酸、N-棕榈酰甘氨酸。
6.如权利要求1至5任一所述用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合在制备早期诊断或筛查克罗恩病的试剂盒中的应用。
7.一种用于克罗恩病早期诊断或筛查的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至5任一所述用于早期诊断或筛查克罗恩病的粪便代谢标志物组合的标准品。
8.根据权利要求7所述的一种用于克罗恩病早期诊断或筛查的试剂盒，其特征在于，还包括提取试剂和内标物。
9.根据权利要求8所述的一种用于克罗恩病早期诊断或筛查的试剂盒，其特征在于，所述内标物为L-苯基丙氨酸。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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