CN117965429A - 一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用 - Google Patents
一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117965429A CN117965429A CN202410371370.XA CN202410371370A CN117965429A CN 117965429 A CN117965429 A CN 117965429A CN 202410371370 A CN202410371370 A CN 202410371370A CN 117965429 A CN117965429 A CN 117965429A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- curcumin
- loaded
- exosomes
- exosome
- mir
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 title claims abstract description 214
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 184
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 title claims abstract description 110
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 title claims abstract description 107
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 title claims abstract description 107
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 107
- 108091060382 miR-140 stem-loop Proteins 0.000 title claims abstract description 93
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 116
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 66
- 108091030617 miR-140-1 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 108091023370 miR-140-2 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 35
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 18
- JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 1-hexadecanoyl-2-(9Z,12Z-octadecadienoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/C\C=C/CCCCC JLPULHDHAOZNQI-ZTIMHPMXSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 229940083466 soybean lecithin Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 31
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 10
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 7
- 230000000887 hydrating effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000010025 steaming Methods 0.000 claims description 7
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 7
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 239000012620 biological material Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 42
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 20
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 8
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 6
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 6
- 241000534000 Berula erecta Species 0.000 description 5
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 208000008558 Osteophyte Diseases 0.000 description 5
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 101150022482 zen gene Proteins 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 201000010934 exostosis Diseases 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000001011 safranin dye Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 description 3
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 description 3
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 3
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 3
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 102100035100 Transcription factor p65 Human genes 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 108091032320 miR-146 stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 108091024530 miR-146a stem-loop Proteins 0.000 description 2
- 238000010603 microCT Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000010168 Myeloid Differentiation Factor 88 Human genes 0.000 description 1
- 108010077432 Myeloid Differentiation Factor 88 Proteins 0.000 description 1
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102100039337 NF-kappa-B inhibitor alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 206010042618 Surgical procedure repeated Diseases 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000001264 anterior cruciate ligament Anatomy 0.000 description 1
- 108010091987 aposome Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及生物材料技术领域，公开了一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用，包括以下步骤：步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；步骤2：加入miR‑140‑5p agomir共培养，分离提取得到负载miR‑140‑5p的外泌体；步骤3：大豆卵磷脂和胆固醇溶液中加入姜黄素溶液，得到脂质体缓冲液；根据脂质体缓冲液得到负载姜黄素的脂质体溶液；步骤4：将步骤2得到的外泌体和步骤3得到的溶液通过冷冻循环法得到所需靶向杂交外泌体；本发明杂交外泌体同时负载姜黄素和miR140，姜黄素和miR140协同抑制NF‑κB通路的激活，增强抗炎效果，并可显著降低姜黄素的细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用。
背景技术
骨关节炎OA是一种特征为软骨进行性退变的退行性慢性关节病，OA发病机制目前尚未完全阐明，也没有彻底治愈OA和抑制OA进展的有效的方法，由于关节软骨缺乏提供营养的血管并且是高度分化的组织，关节软骨自身修复能力有限，目前治疗方法多针对于疼痛管理和关节置换手术。随着对OA发病机制以及关节软骨组织损伤机制的了解，新的治疗靶点不断出现，OA治疗方式从缓解疾病症状转而提升为减缓和阻止OA进展，关节软骨中唯一的细胞是软骨细胞，正常状态下可合成细胞外基质ECM来维持软骨稳态，在维持软骨结构和功能的完整性上起关键作用。
目前有研究证明姜黄素对OA的治疗有一定的效果，但是姜黄素对细胞的毒性较大，并不适用于直接使用，目前还没有很好的减毒措施，限制了其使用。使用脂质体来负载姜黄素是通过将姜黄素颗粒包裹在脂质体颗粒表面的双分子层中，形成球状或类球状载体。这种方法虽然在一定程度上提高了姜黄素分散程度、延长药物作用时间、增加生物相容性。但也存在如下的缺点，研究表明脂质体的靶向性主要集中在脾脏，肝脏，肾脏等器官，这些器官含有大量网状细胞，其他器官则表现出靶向不明确的特点。使用外泌体负载姜黄素，一般是通过孵育法，其药物装载率低，递送效率差。限制了姜黄素在骨关节炎治疗领域的使用。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用。
本发明采用的技术方案是：
一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；
步骤2：步骤1得到的细胞株培养后，加入miR-140-5p agomir共培养，分离提取得到负载miR-140-5p的外泌体；
步骤3：大豆卵磷脂和胆固醇溶液中加入姜黄素溶液，旋蒸后加缓冲液超声，得到脂质体缓冲液；脂质体缓冲液中加入蔗糖，冻干后水合、过滤即可得到负载姜黄素的脂质体溶液；
步骤4：将步骤2得到的负载miR-140-5p的外泌体和步骤3得到的负载姜黄素的脂质体溶液通过冷冻循环法制备得到所需靶向杂交外泌体。
进一步的，所述步骤1中通过基因编辑器对应质粒CAP，转染HEK293细胞，采用抗生素筛选稳定表达质粒的细胞即可得到可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株。
进一步的，所述步骤2中步骤1得到的细胞株长满前加入miR-140-5p agomir共培养24 h～48 h，收集上清，分离提取即可得到负载miR-140-5p的外泌体。
进一步的，所述步骤3中大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为1～10:1，姜黄素与胆固醇的质量比为1～2:1000～25。
进一步的，所述步骤4中负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体的颗粒数比值为1~10：10~1。
进一步的，所述步骤4中制备过程如下：
将负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体混合孵育，在液氮中冷冻30min，37 ℃摇床上放置5 min以上，重复操作N次即可得到所需靶向杂交外泌体。
进一步的，所述步骤3中分离提取过程如下：
取上清液，300 g，离心5 min～10 min；
取上清液，10000 g，在4 ℃条件下，离心30 min以上；
去上清液，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min以上；
取沉淀，重悬，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min以上；
取沉淀，重悬，即可得到外泌体。
一种负载姜黄素和miR 140的靶向杂交外泌体，所述靶向杂交外泌体同时负载有姜黄素和miR-140-5p。
一种负载姜黄素和miR 140的靶向杂交外泌体的应用，所述靶向杂交外泌体在制备治疗骨关节炎药物中的应用。
本发明的有益效果是：
（1）本发明外泌体同时负载姜黄素和miR140，姜黄素和miR140协同可以抑制NF-κB通路的激活，增强抗炎效果；
（2）本发明外泌体同时负载姜黄素和miR140，联用可以显著降低姜黄素的细胞毒性，使得其能够满足临床的需要。
附图说明
图1为本发明中对比例1得到的杂交外泌体及脂质体和外泌体的TEM图。
图2为本发明实施例和对比例得到靶向杂交外泌体及外泌体的CAP和miR140相对表达示意图，A为对比例1步骤1得到的细胞株提取的外泌体及HEK293细胞提取外泌体的CAP的相对表达示意图，B为对比例1得到的靶向杂交外泌体和对比例3得到的靶向杂交外泌体及实施例1得到的靶向杂交外泌体的miR140相对表达示意图。
图3为本发明实施例和对比例得到的靶向杂交外泌体及脂质体和外泌体的粒径分布示意图，A为对比例1得到脂质体的粒径，B为实施例1中步骤1得到细胞株提取的外泌体，C为对比例1得到的杂交外泌体，D为实施例1得到的靶向杂交外泌的粒径。
图4为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体及对比例1得到的脂质体和实施例步骤1得到的外泌体的电位图。
图5为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例1得到的脂质体和HEK293细胞提取的外泌体的粒径统计结果。
图6为本发明中对比例1得到的杂交外泌体及脂质体和HEK293细胞提取的外泌体的体外靶向测试结果，A为荧光测试结果，B为荧光半定量结果。
图7为本发明对比例1得到的杂交外泌体及实施例1步骤1得到细胞株提取的外泌体和HEK293细胞提取的外泌体的体内靶向测试结果，A为不同时间点的活体荧光成像，B为A的荧光图像定量结果。
图8为本发明对比例1得到的杂交外泌体及实施例1步骤1得到的细胞株提取的外泌体和HEK293细胞提取的外泌体的体内靶向测试结果，A为在不同脏器的富集荧光示意图，B为在关节表面和界面的富集靶向程度，C为B的荧光图像半定量结果。
图9为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例得到的杂交外泌体与细胞体外共培养不同时间后的细胞增殖结果示意图。
图10为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例得到的杂交外泌体与细胞体外共培养不同时间后的FDA/PI染色结果示意图。
图11为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例得到的杂交外泌体与细胞体外共培养不同时间后的细胞衰老β-半乳糖苷酶试剂盒染色结果示意图。
图12为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例得到的杂交外泌体与细胞体外共培养不同时间后染色结果的衰老染色半定量分析结果示意图。
图13为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例得到的杂交外泌体与细胞体外共培养不同时间后的番红染液和TB染液染色结果示意图。
图14为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例得到的杂交外泌体与细胞体外共培养不同时间后的番红染液和TB染液染色的半定量分析结果示意图，A为番红染液染色结果，B为TB染液染色结果。
图15为采用本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例得到的杂交外泌体进行体外动物实验得到的CT图。
图16为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例得到的杂交外泌体进行体外动物实验的病理染色结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；
采用具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器（CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种）对应质粒CAP通过电穿孔的方式转染HEK293细胞（使用Bio-rad伯乐Gene Pulser MXcell™电穿孔系统和电击杯，选择293细胞对应电压参数）。加入0.8 mg/mL的G418抗生素48小时后筛选稳定表达质粒的细胞（0.8mg/ml的浓度是通过14天的cck8预实验筛选出来的浓度，可以筛选出转染成功的HEK293细胞）。该步骤得到的细胞株提取的外泌体简称为CAP/EXO。
步骤2：步骤1得到的细胞株培养后，加入miR-140-5p agomir共培养，分离提取得到负载miR-140-5p的外泌体；
使用DMEM高糖培养基培养质粒-HEK293细胞，在质粒-HEK293细胞长满前加入50nM浓度的miR-140-5p agomir共培养24h～48 h，在不含外泌体的293专用培养基中培养，收集细胞上清，通过对上清进行离心的方法来提取CAP-HEK293细胞产生的负载miR-140-5p的外泌体。
超速离心法离心获取外泌体的囊泡颗粒，囊泡颗粒大小相近。分离提取过程如下：
取上清液，300 g，离心5 min～10 min，保留上清液，去除死细胞及细胞碎片；
取上清液，10000 g，在4 ℃条件下，离心30 min以上；
去上清液，120000 g，在4 ℃条件下，离心60min以上；
取沉淀，重悬，120000 g，在4 ℃条件下，离心60min以上；
取沉淀，100 μL PBS重悬，即可得到外泌体。
步骤3：大豆卵磷脂和胆固醇溶液中加入姜黄素溶液，旋蒸后加缓冲液超声，得到脂质体缓冲液；脂质体缓冲液中加入蔗糖，冻干后水合、过滤即可得到负载姜黄素的脂质体溶液；
其中大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为1～10:1，姜黄素与胆固醇的质量比为1～2:1000～25。
步骤4：将步骤2得到的负载miR-140-5p的外泌体和步骤3得到的负载姜黄素的脂质体溶液通过冷冻循环法制备得到所需靶向杂交外泌体。
将负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体溶液按照颗粒数1～10:10～1的比例混合孵育，在液氮中冷冻30 min，在37 ℃摇床上放置5 min以上，重复上述操作N次。通过冷冻循环的方法得到靶向软骨细胞且含有miR-140-5p和姜黄素的靶向杂交外泌体。以下简称为CAP/hyEXO-Cur-miR140。
实施例1
一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；
采用具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器（CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种）对应质粒CAP通过电穿孔的方式转染HEK293细胞（使用Bio-rad伯乐Gene Pulser MXcell™电穿孔系统和电击杯，选择293细胞对应电压参数）。加入0.8 mg/mL的G418抗生素48小时后筛选稳定表达质粒的细胞（0.8mg/ml的浓度是通过14天的cck8预实验筛选出来的浓度，可以筛选出转染成功的HEK293细胞）。该步骤得到的细胞株提取的外泌体简称为CAP/EXO。
步骤2：步骤1得到的细胞株培养后，加入miR-140-5p agomir共培养，分离提取得到负载miR-140-5p的外泌体；
使用DMEM高糖培养基培养质粒-HEK293细胞，在质粒-HEK293细胞长满前（本实施例中选择长到50%～60%）加入50 nM浓度的miR-140-5p agomir共培养24h，在不含外泌体的293专用培养基中培养，收集细胞上清，通过对上清进行离心的方法来提取CAP-HEK293细胞产生的负载miR-140-5p的外泌体。
超速离心法离心获取外泌体的囊泡颗粒，囊泡颗粒大小相近。分离提取过程如下：
取上清液，300 g，离心5 min，保留上清液，去除死细胞及细胞碎片；
取上清液，10000 g，在4 ℃条件下，离心30 min（只要能够达到相应效果即可）；
去上清液，120000 g，在4 ℃条件下，离心60min（只要能够达到相应效果即可）；
取沉淀，重悬，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min（只要能够达到相应效果即可）；
取沉淀，100 μL PBS重悬，即可得到外泌体。
步骤3：大豆卵磷脂和胆固醇溶液中加入姜黄素溶液，旋蒸后加缓冲液超声，得到脂质体缓冲液；脂质体缓冲液中加入蔗糖，冻干后水合、过滤即可得到负载姜黄素的脂质体溶液；
本实施例中采用100 mg大豆卵磷脂和20 mg胆固醇，置于圆底烧瓶中，加入4 mL氯仿溶解后，随后避光条件下加入1 mL无水乙醇溶解的0.9 mg姜黄素。将圆底烧瓶中加入4mL的PBS缓冲液，超声2 h。全部溶解后在脂质体缓冲液中加入10 %的蔗糖，将脂质体缓冲液分成每管1 mL放入-20 ℃冰箱过夜，过夜后冻干24 h。冻干后每管加入1 mL PBS缓冲液进行水合，使用0.22 um滤头进行过滤，即可得到负载姜黄素脂质体液体。
步骤4：将步骤2得到的负载miR-140-5p的外泌体和步骤3得到的负载姜黄素的脂质体溶液通过冷冻循环法制备得到所需靶向杂交外泌体。
将负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体溶液按照颗粒数1:1的比例混合孵育，在液氮中冷冻30 min，在37 ℃摇床上放置5 min以上，重复上述操作N次。通过冷冻循环的方法得到靶向软骨细胞且含有miR-140-5p和姜黄素的靶向杂交外泌体。以下简称为CAP/hyEXO-Cur-miR140。
实施例2
一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；
采用具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器（CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种）对应质粒CAP通过电穿孔的方式转染HEK293细胞（使用Bio-rad伯乐Gene Pulser MXcell™电穿孔系统和电击杯，选择293细胞对应电压参数）。加入0.8 mg/mL的G418抗生素48小时后筛选稳定表达质粒的细胞（0.8mg/ml的浓度是通过14天的cck8预实验筛选出来的浓度，可以筛选出转染成功的HEK293细胞）。该步骤得到的细胞株提取的外泌体简称为CAP/EXO。
步骤2：步骤1得到的细胞株培养后，加入miR-140-5p agomir共培养，分离提取得到负载miR-140-5p的外泌体；
使用DMEM高糖培养基培养质粒-HEK293细胞，在质粒-HEK293细胞长满前（本实施例中选择长到50%～60%）加入50 nM浓度的miR-140-5p agomir共培养48h，在不含外泌体的293专用培养基中培养，收集细胞上清，通过对上清进行离心的方法来提取CAP-HEK293细胞产生的负载miR-140-5p的外泌体。
超速离心法离心获取外泌体的囊泡颗粒，囊泡颗粒大小相近。分离提取过程如下：
取上清液，300 g，离心10 min，保留上清液，去除死细胞及细胞碎片；
取上清液，10000 g，在4 ℃条件下，离心30 min（只要能够达到相应效果即可）；
去上清液，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min（只要能够达到相应效果即可）；
取沉淀，重悬，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min（只要能够达到相应效果即可）；
取沉淀，100 μL PBS重悬，即可得到外泌体。
步骤3：大豆卵磷脂和胆固醇溶液中加入姜黄素溶液，旋蒸后加缓冲液超声，得到脂质体缓冲液；脂质体缓冲液中加入蔗糖，冻干后水合、过滤即可得到负载姜黄素的脂质体溶液；
本实施例中采用20 mg大豆卵磷脂和20 mg胆固醇，置于圆底烧瓶中，加入4 mL氯仿溶解后，随后避光条件下加入1 mL无水乙醇溶解的0.8 mg姜黄素。将圆底烧瓶中加入4mL的PBS缓冲液，超声2 h。全部溶解后在脂质体缓冲液中加入10 %的蔗糖，将脂质体缓冲液分成每管1 mL放入-20 ℃冰箱过夜，过夜后冻干24 h。冻干后每管加入1 mL PBS缓冲液进行水合，使用0.22 um滤头进行过滤，即可得到负载姜黄素脂质体液体。
步骤4：将步骤2得到的负载miR-140-5p的外泌体和步骤3得到的负载姜黄素的脂质体溶液通过冷冻循环法制备得到所需靶向杂交外泌体。
将负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体溶液按照颗粒数1:10的比例混合孵育，在液氮中冷冻30 min，在37 ℃摇床上放置5 min以上，重复上述操作N次。通过冷冻循环的方法得到靶向软骨细胞且含有miR-140-5p和姜黄素的靶向杂交外泌体。以下简称为CAP/hyEXO-Cur-miR140。
实施例3
一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；
采用具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器（CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种）对应质粒CAP通过电穿孔的方式转染HEK293细胞（使用Bio-rad伯乐Gene Pulser MXcell™电穿孔系统和电击杯，选择293细胞对应电压参数）。加入0.8 mg/mL的G418抗生素48小时后筛选稳定表达质粒的细胞（0.8mg/ml的浓度是通过14天的cck8预实验筛选出来的浓度，可以筛选出转染成功的HEK293细胞）。该步骤得到的细胞株提取的外泌体简称为CAP/EXO。
步骤2：步骤1得到的细胞株培养后，加入miR-140-5p agomir共培养，分离提取得到负载miR-140-5p的外泌体；
使用DMEM高糖培养基培养质粒-HEK293细胞，在质粒-HEK293细胞长满前（本实施例中选择长到50%～60%）加入50 nM浓度的miR-140-5p agomir共培养36h，在不含外泌体的293专用培养基中培养，收集细胞上清，通过对上清进行离心的方法来提取CAP-HEK293细胞产生的负载miR-140-5p的外泌体。
超速离心法离心获取外泌体的囊泡颗粒，囊泡颗粒大小相近。分离提取过程如下：
取上清液，300 g，离心5 min，保留上清液，去除死细胞及细胞碎片；
取上清液，10000 g，在4 ℃条件下，离心30 min（只要能够达到相应效果即可）；
去上清液，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min（只要能够达到相应效果即可）；
取沉淀，重悬，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min（只要能够达到相应效果即可）；
取沉淀，100 μL PBS重悬，即可得到外泌体。
步骤3：大豆卵磷脂和胆固醇溶液中加入姜黄素溶液，旋蒸后加缓冲液超声，得到脂质体缓冲液；脂质体缓冲液中加入蔗糖，冻干后水合、过滤即可得到负载姜黄素的脂质体溶液；
本实施例中采用200 mg大豆卵磷脂和20 mg胆固醇，置于圆底烧瓶中，加入4 mL氯仿溶解后，随后避光条件下加入1 mL无水乙醇溶解的2.0 mg姜黄素。将圆底烧瓶中加入4mL的PBS缓冲液，超声2 h。全部溶解后在脂质体缓冲液中加入10 %的蔗糖，将脂质体缓冲液分成每管1 mL放入-20 ℃冰箱过夜，过夜后冻干24 h。冻干后每管加入1 mL PBS缓冲液进行水合，使用0.22 um滤头进行过滤，即可得到负载姜黄素脂质体液体。
步骤4：将步骤2得到的负载miR-140-5p的外泌体和步骤3得到的负载姜黄素的脂质体溶液通过冷冻循环法制备得到所需靶向杂交外泌体。
将负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体溶液按照颗粒数10:1的比例混合孵育，在液氮中冷冻30 min，在37 ℃摇床上放置5 min以上，重复上述操作N次。通过冷冻循环的方法得到靶向软骨细胞且含有miR-140-5p和姜黄素的靶向杂交外泌体。以下简称为CAP/hyEXO-Cur-miR140。
对比例1
为了与上述实施例进行对比说明，制备杂交外泌体CAP/hyEXO。
步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；
采用具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器（CRISPR/Cas9基因编辑器、TALENs基因编辑器、ZENs基因编辑器中的一种）对应质粒CAP通过电穿孔的方式转染HEK293细胞（使用Bio-rad伯乐Gene Pulser MXcell™电穿孔系统和电击杯，选择293细胞对应电压参数）。加入0.8 mg/mL的G418抗生素48小时后筛选稳定表达质粒的细胞（0.8mg/ml的浓度是通过14天的cck8预实验筛选出来的浓度，可以筛选出转染成功的HEK293细胞）。该步骤得到的细胞株提取的外泌体简称为CAP/EXO。
步骤2：大豆卵磷脂和胆固醇溶液，旋蒸后加缓冲液超声，得到脂质体缓冲液；脂质体缓冲液中加入蔗糖，冻干后水合、过滤；大豆卵磷脂和胆固醇的比值及制备过程与实施例1均相同，不同之处在于不添加姜黄素。
步骤3：将步骤1得到的CAP/EXO和步骤2得到的脂质体溶液混合，其中脂质体溶液和CAP/EXO中颗粒数比值为1:1。混合孵育，在液氮中冷冻30 min，在37 ℃摇床上放置30min，重复上述操作4次。通过冷冻循环的方法得到靶向软骨细胞的杂交外泌体，简称为CAP/hyEXO。
对比例2
为了与上述实施例进行对比说明，制备负载姜黄素的杂交外泌体CAP/hyEXO-Cur。
具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，不含步骤2，同时步骤4中采用步骤1得到的外泌体与步骤3得到的负载姜黄素的脂质体溶液，通过冷冻循环法制备得到所需杂交外泌体，简称为CAP/hyEXO-Cur。
对比例3
为了与上述实施例进行对比说明，制备负载姜黄素的杂交外泌体CAP/hyEXO-Cur-NC。
具体制备方法与实施例1相同，不同之处在于，步骤2中转染的不是miR140，而是miRNA阴性对照物。
为了进行对比，以下测试结果中的EXO表示HEK293细胞中提取得到的外泌体。
图1为本发明中对比例1得到的杂交外泌体及脂质体和外泌体的TEM图。从图中可以看出，脂质体、CAP/EXO和CAP/hyEXO样品均具有球形囊泡和纳米级特征。
图2A为本发明对比例1步骤1得到的细胞株提取的外泌体及HEK293细胞提取外泌体的CAP的相对表达示意图，图2B为本发明对比例1得到靶向杂交外泌体和对比例3得到靶向杂交外泌体及实施例靶向杂交外泌体的miR140相对表达图。从图中可以看出，转染质粒CAP后的293细胞分泌的外泌体，其CAP相对表达比未转染质粒的CAP的293细胞分泌的外泌体的CAP相对表达量要更高，说明了质粒转染的成功。从图B中可以看出在步骤1筛选出来的细胞株转染了miR-140-5p agomir后，相比较未转染（对比例1）和转染了阴性对照物（对比例3）转染了miR-140-5p agomir后其分泌的外泌体miR140的水平大幅度上升。进一步证明通过转染实验，提取到了负载了miRNA140的外泌体。
图3为本发明实施例和对比例得到的靶向杂交外泌体及脂质体和外泌体的粒径分布示意图，A为对比例1得到的脂质体的粒径，B为实施例1中步骤1得到细胞株提取的外泌体，C为对比例1得到的杂交外泌体，D为实施例1得到的靶向杂交外泌的粒径。从图中可以看出脂质体、CAP/EXO、CAP/hyEXO-Cur-miR140的平均粒径分别为172.3 nm、140.7 nm、180nm、183 nm。脂质体与CAP/EXO的膜融合之后制备的CAP/hyEXO尺寸更大。与单纯CAP/hyEXO负载药物后CAP/hyEXO-Cur-miR140的尺寸还要略大一些。
图4为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体及对比例1得到的脂质体和外泌体的电位图。从图中可以看出负载两种药物的外泌体表面电位为（5.75±0.15）mV, CAP/EXO的负电荷为（-27.2±0.1）mV，脂质体的正电荷为（33.1±014）mV。杂交外泌体具有良好的阳离子表面和稳定性，这种特性可能有助于杂交外泌体与带负电荷的软骨细胞表面和软骨组织中的糖胺聚糖链结合，并在体内复杂的动态环境中保持更长时间。
图5为本发明实施例1得到的靶向杂交外泌体和对比例1得到的脂质体和HEK293细胞提取的外泌体的粒径统计结果。将上述实施例及对比例得到的样品静置，在不同时间节点进行粒径测试，结果如5所示。从图中可以看出杂交的CAP-hyEXO-Cur-miR140比EXO和脂质体显示出更好的稳定性，因为它们的大小至少保持不变14天，而EXO在第6天之后逐渐聚集。
图6-图8为本发明对比例1得到的杂交外泌体，实施例1步骤1得到的外泌体和HEK293细胞提取的外泌体，其中图6A为体外靶向测试荧光结果图，蓝色标记细胞，黄色标记外泌体，B为荧光图像A的半定量结果。图7中A为不同时间点的活体荧光成像，B为A的荧光图像定量结果。图8中A为在不同脏器的富集荧光示意图，B为在关节表面和界面的富集靶向程度，C为B的荧光图像半定量结果。
从图6中可以看出将DiI标记的EXO组或杂交的CAP/hyEXO与软骨细胞或L929细胞在体外孵育6小时后，可以观察到CAP/hyEXO组软骨细胞内的荧光信号比天然EXO组更多，表明更多的CAP/hyEXO被软骨细胞摄取。从图6中A可以看出，当与L929孵育时，EXO组和CAP/hyEXO组显示出相当水平的荧光。平均光密度的半定量分析也显示了相同的趋势：CAP/hyEXO组的软骨细胞摄取显著较高，但所有组的L929摄取相似。综上所述，这些结果证明了CAP/hyEXO在体外对软骨细胞的特异性靶向作用增强。
为了说明CAP/hyEXO在体内的滞留情况，将EXO、CAP/EXO和CAP/hyEXO用DIR标记注射到大鼠膝关节内，并通过IVIS Spectrum系统进行监测，结果如图7所示。从图7中A可以看出，关节内注射后，两组样本在关节内保留长达7天。虽然随着时间的推移，三组辐射信号逐渐降低，但CAP/EXO组和CAP/hyEXO组辐射信号的降低速率比EXO对照组慢。半定量分析结果可以看出，保留的辐射信号密度依次为CAP/hyEXO>CAP/EXO>EXO。
在关节腔内注射48 h后解剖大鼠，收集不同器官包括心、肝、脾、肺和肾，用IVISSpectrum系统检测，结果如图8所示。从图8中A可以看出EXO组肝脏明显出现大量荧光信号，表明DIR标记的EXO聚集。CAP/EXO组和CAP/hyEXO组均未见明显荧光信号。激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）观察关节面及横截面结果如图8中B所示。在表面和切片图像上都表现出相似的趋势，CAP/hyEXO组的绿色荧光信号最强，CAP/EXO组次之，EXO组最少。半定量分析可以看出，CAP/hyEXO组和CAP/EXO组的荧光密度分别是EXO组的近4倍和3.8倍。
从图6-图8可以看出，CAP赋予的软骨细胞特异性靶向性，明显增强了CAP/EXO和CAP-/hyEXO的软骨细胞特异性靶向性，从而延长了它们在关节腔内的滞留时间。
将实施例和对比例得到的杂交外泌体放置于24孔板中，在孔板底部接种IL-1β刺激过的软骨细胞（OA软骨细胞），将孔板置于培养箱中在37 ℃、5 %的CO2的条件下培养，培养期间每隔2天更换一次培养基。培养基是在DMEM基础培养基的基础上加入质量浓度为1%青霉素和链霉素混合液、92 μg/mL的抗坏血酸以及质量浓度为10 %的胎牛血清得到，青霉素和链霉素混合液由HyClone公司提供。在培养1天、3天和7天后，使用CCK-8测试其中细胞的增殖情况，增殖情况如图9所示。图中，IL-1β为用IL-1β处理正常软骨细胞后得到的OA细胞，为了进行对比，对比为正常软骨细胞组。
从图中可以看出单独负载姜黄素的杂交外泌体和同时负载姜黄素和miR140的杂交外泌体相比，同时负载姜黄素和miR140的杂交外泌体促进细胞增殖的作用大大增强。姜黄素由于其可以抑制细胞增殖，限制了其应用，从结果可以看出外泌体负载姜黄素后对其细胞增殖作用有一定增强，说明杂交外泌体可以一定程度改善姜黄素的细胞毒性。但是杂交外泌体同时负载姜黄素和miR140后，其促进细胞增殖作用大大加强，说明该促进细胞增殖的效果并非仅仅由杂交外泌体所带来。miR140和姜黄素发生了协同作用可以共同抑制OA细胞中NF-κB通路的激活。
在上述培养1天、3天和7天后，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，然后用含有FDA和PI的PBS缓冲液中染色1 min，通过激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察细胞的生长状态和分布情况，FDA/PI染色结果如图10所示。天然组为正常软骨细胞、对照组为1L-1β处理过得到的OA细胞。
从图10中可以看出负载单种姜黄素，同时负载两种药物（姜黄素和miR140），促进细胞增殖作用大大增强，相比较对照组，单纯负载单一药物组，OA细胞在两种药物共同作用下是增殖效果是最好的，趋势与图9相同。
在上述培养1天、3天和7天后，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，然后用含细胞衰老β-半乳糖苷酶试剂盒进行染色，通过光学显微镜观察软骨细胞衰老情况，染色结果如图11所示。
可以看到，单一使用姜黄素时，也有一定的抗衰老作用，负载两种药物时（姜黄素和miR140），抗衰老作用大大增强了，主要是miR140起到的抗衰老作用，姜黄素也有一定促成效果。半定量分析结果如图12所示，趋势与图11相同。
在上述培养1天、3天和7天后，用PBS缓冲液清洗细胞2遍，然后用4 %多聚甲醛固定细胞，用番红染液（上半部分图）和TB染液（下半部分图）对细胞染色，通过光学显微镜观察其中的细胞的软骨相关基质分泌的情况，染色结果如图13所示，负载两种药物（姜黄素和miR140）比单一负载药物，促进软骨细胞基质合成，治疗效果较强提升。
图13的半定量分析结果如图14所示，从图14中A和B中均可以看出分析结果趋势与图13的测试结果一致。对大鼠采用ACLT术势来构建OA关节模型，并在4周、8周的时间点进行关节腔内注射不同的材料，进行OA治疗实验。
采用本发明实施例和对比例得到的杂交外泌体进行动物实验，选取雄性SD大鼠进行膝关节前交叉韧带的横断手术，并在不限制大鼠活动6周之后，即成功构建了大鼠OA模型。设置了4个实验组、空白组和天然组。实验组1是在大鼠关节腔内注射对比例1制备的CAP/hyEXO ，实验组2是在大鼠关节注射了对比例2制备的CAP/hyEXO-Cur ，实验组3是在大鼠关节注射了对比例3制备的CAP/hyEXO-Cur-NC，实验组4是在大鼠关节注射了实施例1制备的 CAP/hyEXO-Cur-miR140。对照组在关节腔内注射PBS，天然组为正常关节组，不进行任何手术操作。
在注射材料后4周和8周后取材进行Micro-CT扫描，结果如图15所示。OA的另一种特征性表现是骨赘，是对关节损伤的一种补偿。从图15中可以看出，三维Micro-CT图像显示PBS组、CAP/hyEXO 、CAP/hyEXO-Cur 、 CAP/hyEXO-Cur-NC 、CAP/hyEXO-Cur-miR140组有骨赘形成，而天然组无骨赘形成。然而，PBS组骨赘体积明显大于其他组，而CAP/hyEXO-Cur-miR140在四组中最小，提示CAP/hyEXO-Cur-miR140可以减少骨赘形成，缓解OA进展。对实验组、对照组和天然组的大鼠膝关节组织进行取样，依次进行脱钙、石蜡包埋和切片，随后进行SO/FG、H&E、和马松染色观察关节软骨的结构、蛋白多糖和胶原沉积，结果如图16所示。由图16可知，PBS组的表面侵蚀、结构紊乱和蛋白聚糖丢失最严重。天然组和CAP/hyEXO-Cur-miR140组关节软骨表面光滑，细胞排列整齐，结构正常。从图15和图16可以看出单纯负载姜黄素有一定的治疗效果，但是同时负载两种药物，对缓解骨关节炎进展，维持关节形态的作用最大。这是因为miR140和姜黄素可以协同作用来抑制NF-κB通路的激活，增强抗炎效果。同时miR140还对软骨细胞衰老起调控作用，姜黄素还可以上调Ⅱ型胶原的表达来抑制细胞外基质的降解和促进细胞外基质合成，所以负载两种药物的治疗效果最好。综上所述，随着OA的进展，本发明的CAP/hyEXO-Cur-miR140可以有效地减轻OA的结构和成分损伤。
与外泌体相比，杂交外泌体通过与脂质体融合的方式，不仅可以提高药物负载率，而且具有良好的生物相容性和更高的安全性，加速了药物递送的发展。杂交外泌体的靶向性将有助于将姜黄素和miR140-5p选择性递送到软骨细胞或关节软骨。一方面，对HEK293细胞中使用外泌体膜蛋白溶酶体相关膜蛋白2b（Lamp2b）进行基因工程改造，开发了含有表面展示的软骨细胞亲和力肽（CAP）的软骨细胞靶向杂交外泌体。由于Lamp-2b的n端延伸出外泌体膜，在这一端融合靶向肽不会影响外泌体的表达和功能。另一方面，混合外泌体具有轻微的正电荷，有利于负载和传递带负电荷的核酸，靶向软骨内带负电荷的糖胺聚糖链，并与带负电荷的细胞和关节软骨表面相互作用。对于改善进展性OA，除了维持细胞活力和促进ECM合成以维持软骨稳态外，提供良好的润滑关节腔微环境以减少软骨表面的磨损，对于抑制OA进展性软骨损伤同样重要。
miR-140-5p可通过抑制TLR4/MyD88/TRAF6通路来抑制NF-κB通路起到抗炎的作用，数据表明在miR-140-5p上调表达时，NF-κB 通路抑制因子IκBα表达提升，p65蛋白表达下调，抑制了NF-κB通路的激活。同时姜黄素可靶向miR146a，提升姜黄素浓度可使miR146amRNA 表达提升，靶向TRAF6，使TRAF6 mRNA表达下降，下调p65蛋白的活性，抑制NF-κB 通路的激活。姜黄素还可以直接阻碍p-NF-κB- p65与DNA的相互结合作用。miR-140-5p和姜黄素共同使用可以发挥协同作用来抑制NF-κB通路的激活，增强抗炎效果。所以本发明得到的靶向杂交外泌体具有抗炎效果，对软骨细胞衰老起调控作用，还大大降低了姜黄素对细胞的毒性。本发明得到的靶向杂交外泌体有望大规模用于临床治疗OA药物中。
Claims (9)
1.一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：获取可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株；
步骤2：步骤1得到的细胞株培养后，加入miR-140-5p agomir共培养，分离提取得到负载miR-140-5p的外泌体；
步骤3：大豆卵磷脂和胆固醇溶液中加入姜黄素溶液，旋蒸后加缓冲液超声，得到脂质体缓冲液；脂质体缓冲液中加入蔗糖，冻干后水合、过滤即可得到负载姜黄素的脂质体溶液；
步骤4：将步骤2得到的负载miR-140-5p的外泌体和步骤3得到的负载姜黄素的脂质体溶液通过冷冻循环法制备得到所需靶向杂交外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中通过具有软骨细胞特异性靶向肽序列的基因编辑器对应质粒CAP，转染HEK293细胞，采用抗生素筛选稳定表达质粒的细胞即可得到可稳定表达软骨细胞靶向肽的细胞株。
3.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中步骤1得到的细胞株长满前加入miR-140-5p agomir共培养24 h～48 h，收集上清，分离提取即可得到负载miR-140-5p的外泌体。
4.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中大豆卵磷脂和胆固醇的质量比为1～10:1，姜黄素与胆固醇的质量比为1～2:1000～25。
5.根据权利要求1所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤4中负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体的颗粒数比值为1～10:10～1。
6.根据权利要求5所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤4中制备过程如下：
将负载miR-140-5p的外泌体和负载姜黄素的脂质体混合孵育，在液氮中冷冻30 min，37 ℃摇床上放置5 min以上，重复操作N次即可得到所需靶向杂交外泌体。
7.根据权利要求3所述的一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中分离提取过程如下：
取上清液，300 g，离心5 min～10 min；
取上清液，10000 g，在4 ℃条件下，离心30 min以上；
去上清液，120000 g，在4 ℃条件下，离心60 min以上；
取沉淀，重悬，120000 g，在4 ℃条件下，离心60min以上；
取沉淀，重悬，即可得到外泌体。
8.如权利要求1～7任一所述制备方法得到的负载姜黄素和miR 140的靶向杂交外泌体，其特征在于，所述靶向杂交外泌体同时负载有姜黄素和miR-140-5p。
9.如权利要求8所述一种负载姜黄素和miR 140的靶向杂交外泌体的应用，其特征在于，所述靶向杂交外泌体在制备治疗骨关节炎药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410371370.XA CN117965429B (zh) | 2024-03-29 | 2024-03-29 | 一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410371370.XA CN117965429B (zh) | 2024-03-29 | 2024-03-29 | 一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117965429A true CN117965429A (zh) | 2024-05-03 |
| CN117965429B CN117965429B (zh) | 2024-06-14 |
Family
ID=90858126
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410371370.XA Active CN117965429B (zh) | 2024-03-29 | 2024-03-29 | 一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117965429B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014185090A (ja) * | 2013-03-22 | 2014-10-02 | Kyoto Univ | リポソーム−エキソソームハイブリッドベシクル及びその調製法 |
| CN107913408A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-04-17 | 中南大学 | 一种外泌体‑核酸适配体脂质体复合载药系统及其制备方法和应用 |
| CN108114290A (zh) * | 2018-01-03 | 2018-06-05 | 东南大学 | 一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法 |
| CN114377034A (zh) * | 2022-01-19 | 2022-04-22 | 四川大学华西医院 | 一种用于关节炎治疗的生物制剂及其制备方法和应用 |
| CN117731631A (zh) * | 2023-11-27 | 2024-03-22 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 一种纳米复合物载体及其制备方法和应用 |
-
2024
- 2024-03-29 CN CN202410371370.XA patent/CN117965429B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014185090A (ja) * | 2013-03-22 | 2014-10-02 | Kyoto Univ | リポソーム−エキソソームハイブリッドベシクル及びその調製法 |
| CN107913408A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-04-17 | 中南大学 | 一种外泌体‑核酸适配体脂质体复合载药系统及其制备方法和应用 |
| CN108114290A (zh) * | 2018-01-03 | 2018-06-05 | 东南大学 | 一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法 |
| CN114377034A (zh) * | 2022-01-19 | 2022-04-22 | 四川大学华西医院 | 一种用于关节炎治疗的生物制剂及其制备方法和应用 |
| CN117731631A (zh) * | 2023-11-27 | 2024-03-22 | 山东第一医科大学(山东省医学科学院) | 一种纳米复合物载体及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| CHENGLONG WANG 等: "Therapeutic potential of exosome-based personalized delivery platform in chronic inflmmatory diseases", 《ASIAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES》, 31 December 2022 (2022-12-31), pages 7 * |
| SHI-CONG TAO 等: "Exosomes derived from miR-140-5p-overexpressing human synovial mesenchymal stem cells enhance cartilage tissue regeneration and prevent osteoarthritis of the knee in a rat model", 《THERANOSTICS》, 1 January 2017 (2017-01-01), pages 180 - 195 * |
| YUJIE LIANG 等: "Chondrocyte-Targeted MicroRNA Delivery by Engineered Exosomes toward a Cell-Free Osteoarthritis Therapy", 《ACS APPL. MATER. INTERFACES》, 30 July 2020 (2020-07-30), pages 36943 * |
| 周晓菲 等: "基于胰腺癌细胞的杂化外泌体的不同制备方法与表征的比较研究", 《药学学报》, 25 January 2022 (2022-01-25), pages 2 - 3 * |
| 程昊 等: "姜黄素介导的骨髓间充质干细胞外泌体对ACC-M细胞增殖、迁移和侵袭的影响", 《口腔颌面外科杂志》, 29 February 2024 (2024-02-29), pages 34 - 39 * |
| 陆智豪 等: "外泌体微 RNA 治疗骨关节炎研究进展", 《新乡医学院学报》, 5 February 2023 (2023-02-05), pages 188 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117965429B (zh) | 2024-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nagelkerke et al. | Extracellular vesicles for tissue repair and regeneration: Evidence, challenges and opportunities | |
| CN107223153B (zh) | 包含源于正分化成软骨细胞之干细胞的外排体的用于软骨细胞分化诱导或软骨组织再生的组合物 | |
| CA2801010C (en) | Peptide and use thereof for treatment of cartilage damage and arthritis | |
| EP2744503B1 (en) | Muscle tissue regeneration using muscle fiber fragments | |
| US20050014255A1 (en) | Stem cells for clinical and commercial uses | |
| JP6058729B2 (ja) | 椎間板の修復および／または再構成 | |
| KR101629151B1 (ko) | 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 지방세포 분화유도 및 지방조직 재생용 조성물 | |
| CN104958320A (zh) | 一种治疗骨关节炎的细胞制剂及其制备方法 | |
| FR2835749A1 (fr) | Composition pharmaceutique ameliorant le transfert de gene in vivo | |
| US20230330154A1 (en) | Methods of treating systemic graft- versus-host disease with extracellular vesicles | |
| CN115957179A (zh) | 一种负载淫羊藿苷的3d培养间充质干细胞外泌体水凝胶的制备方法和应用 | |
| CN115282065A (zh) | 一种含间充质干细胞外泌体的冻干粉及其制备方法和应用 | |
| CN115725500A (zh) | 脂肪间充质干细胞外泌体、其制备方法及其应用 | |
| CN117965429B (zh) | 一种负载姜黄素和miR140的靶向杂交外泌体、制备方法及应用 | |
| US6730498B1 (en) | Production of functional proteins: balance of shear stress and gravity | |
| US6946246B1 (en) | Production of functional proteins: balance of shear stress and gravity | |
| CN113577108B (zh) | 一种多功能胶原支架、其制备方法与应用 | |
| CN114712380A (zh) | microRNA在制备治疗或预防骨质疏松的药物中的应用 | |
| KR20200018845A (ko) | 분화인자가 함유된 엑소좀 나노 캐리어 조성물 및 이의 제조방법 | |
| KR20150091519A (ko) | 다계열 분화능 세포 생성 방법 | |
| JP2023501925A (ja) | 筋線維断片を利用した回旋腱板療法 | |
| KR20200092860A (ko) | 담즙산을 이용한 표면 개질 엑소좀, 그 생산 방법 및 세포 증식 유도 방법 | |
| US20230047434A1 (en) | Composition for inducing chondrocyte differentiation and regenerating cartilage tissue | |
| BR112020015175A2 (pt) | substrato acelerador de biomaterial de interface compósita | |
| CN117586955B (zh) | 一种epo刺激巨噬细胞来源外泌体的制备与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |