CN117947086A - 一种利用引导编辑技术制备抗除草剂植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用引导编辑技术制备抗除草剂植物的方法，所述方法包括利用Cas蛋白和逆转录酶以及第一pegRNA和第二pegRNA对植物进行引导编辑的步骤；所述第一pegRNA包括第一crRNA、第一逆转录模板序列(RTT)和第一引物结合位点序列(PBS)；所述第二pegRNA包括第二crRNA、第二逆转录模板序列(RTT)和第二引物结合位点序列(PBS)；本申请通过引导编辑技术，成功在植物中引入所需序列，得到了具有除草剂抗性的植物。

Description

一种利用引导编辑技术制备抗除草剂植物的方法
本申请要求申请日为2023年3月10日的中国专利申请CN202310241484.8的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明涉及基因编辑领域，特别是引导编辑技术领域。具体地，本发明涉及一种利用引导编辑技术制备抗除草剂植物的方法。
背景技术
植物对除草剂的抗性或敏感性与其靶标基因和非靶标抗性基因的序列变异密切相关。一些发生在非靶标抗性基因的序列变异，例如片段丢失，能使抗性基因失去功能从而导致植物对除草剂敏感，比如，在“Tadukan”、“Peta”等部分现代籼稻品种的祖先种中，HIS1基因(Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型加氧酶，Fe(II)/2-oxoglutarate(2OG)–dependentoxygenases)第三个外显子存在28-bp的小片段缺失，导致基因功能失效而表现出对β-三酮类HPPD抑制剂的敏感性；而一些发生在靶标基因的突变，例如碱基替换，能提高对除草剂的抗性，这一类突变为功能获得型突变，比如，EPSPS蛋白(5-烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶，5-enol pyruvyl shikimate phosphate synthetase，英文简称EPSPS)的TIPS突变(EPSPS基因编码序列的C518T+C529T突变)能提高植物对草甘膦的抗性。
基因编辑技术，例如引导编辑(Prime Editing)技术，能够在特定的位点进行碱基替换或片段插入。然而，引导编辑技术的编辑效率仍然有待提升。
虽然基于引导编辑(Prime Editing)的基因操作技术已经用于不同场合的基因编辑或者性状改良；但是，目前为止，还没有发现利用引导编辑技术制备能够在生产上实际应用的、具有高除草剂抗性的植物的报道。
我们发现pegRNA的配对序列的长度对引导编辑技术的编辑效率有重大影响，并获得了能够显著提高编辑效率的pegRNA，可以用于高效的制备具有除草剂抗性的植物，并且，制备得到的高除草剂抗性的植物可以在生产上实际应用。
发明内容
本发明目的是提供一种利用引导编辑技术制备抗除草剂植物的方法。
本发明第一方面提供了一种在靶核酸中引入目标序列的方法，所述方法包括将靶核酸与下列组分(i)-(iii)接触：
(i)Cas蛋白和逆转录酶；
(ii)第一pegRNA，所述第一pegRNA包括第一crRNA、第一逆转录模板序列(RTT)和第一引物结合位点序列(PBS)；和
(iii)第二pegRNA，所述第二pegRNA包括第二crRNA、第二逆转录模板序列(RTT)和第二引物结合位点序列(PBS)；
其中，所述第一RTT序列包含第一片段和第一配对序列，所述第二RTT序列包含第二片段和第二配对序列，所述第一配对序列与所述第二配对序列互补；
所述目标序列包括所述第一片段、所述第一配对序列和所述第二片段的反向互补序列。
本发明中，所述目标序列可以是任何所需要的序列；比如，目标序列可以是与靶核酸不同物种来源的外源序列，也可以是能够替换靶核酸某段序列的特定所需序列，还可以是与靶核酸来源于相同物种的所需目标序列。
在另一优选例中，所述Cas蛋白为切口酶(nickase)或者具有切割单链靶核酸活性的Cas蛋白。
在优选的实施方式中，所述Cas蛋白为nCas9蛋白。
在优选的实施方式中，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在另一优选例中，所述逆转录酶是来自逆转录病毒或逆转录转座子的天然存在的逆转录序列或其变体。
在另一优选例中，所述逆转录酶选自M-MLV逆转录酶(莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶)或者AMV逆转录酶(禽类成肌细胞增多病毒逆转录酶)中的任意一种或几种。
在优选的实施方式中，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
在优选的实施方式中，所述逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在另一优选例中，所述Cas蛋白和逆转录酶通过接头连接。
本发明中，接头可以用于连接本发明的任何肽或蛋白结构域。在某些实施方案中，接头是多肽。在某些实施方案中，接头是共价键(例如，碳-碳键、二硫键、碳-杂原子键等)。在某些实施方案中，接头是酰胺连接的碳-氮键。在某些实施方案中，接头是环状或无环的、取代或未取代的、支链或无支链的脂族或杂脂族接头。在某些实施方案中，接头是聚合的(例如聚乙烯、聚乙二醇、聚酰胺、聚酯等)。在某些实施方案中，接头包含氨基链烷酸的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头包含氨基链烷酸(例如甘氨酸、乙酸、丙氨酸、β-丙氨酸、3-氨基丙酸、4-氨基丁酸、5-戊酸等)。在某些实施方案中，接头包含氨基己酸(Ahx)的单体、二聚体或聚合物。在某些实施方案中，接头基于碳环部分(例如环戊烷，环己烷)。在其他实施方案中，接头包含聚乙二醇部分(PEG)。在其他实施方案中，接头包含氨基酸。在某些实施方案中，接头包含肽。在某些实施方案中，接头包含芳基或杂芳基部分。在某些实施方案中，接头基于苯环。接头可以包含官能化部分以促进来自肽的亲核体(例如硫醇，氨基)与接头的附接。任何亲电体可以用作接头的一部分。
在优选的实施方式中，接头为XTEN接头。
在另一优选例中，所述第一配对序列的长度为5-30bp。
在另一优选例中，所述第二配对序列的长度为5-30bp。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列的长度为10-26bp。
在优选的实施方式中，所述第二配对序列的长度为10-26bp。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列的长度为10bp、18bp或26bp。
在优选的实施方式中，所述第二配对序列的长度为10bp、18bp或26bp。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列与所述第二配对序列长度相同。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列与所述第二配对序列互补配对，并具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％的互补序列同一性。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列与所述第二配对序列完全互补配对。
在另一优选例中，所述目标序列的长度为15-50bp。
在优选的实施方式中，所述目标序列的长度为25-46bp。
在优选的实施方式中，所述目标序列的长度为25bp或46bp。
在另一优选例中，所述第一crRNA包括第一引导序列和第一骨架区，所述第二crRNA包括第二引导序列和第二骨架区。
在优选的实施方式中，所述第一PBS序列与所述第一引导序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第二PBS序列与所述第二引导序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第一PBS序列与所述第一引导序列的部分序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第二PBS序列与所述第二引导序列的部分序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第一PBS序列的部分序列与所述第一引导序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第二PBS序列的部分序列与所述第二引导序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第一PBS序列和所述第一引导序列分别与靶核酸的两条链互补配对。
在优选的实施方式中，所述第二PBS序列和所述第二引导序列分别与靶核酸的两条链互补配对。
在另一优选例中，所述第一RTT序列与靶核酸序列相比，其互补同源性小于100％，或小于95％，或小于90％，或小于85％，或小于80％，或小于70％，或小于60％，或小于50％，或小于40％，或小于30％，或小于20％，或小于10％，或小于5％。
在另一优选例中，所述第二RTT序列与靶核酸序列相比，其互补同源性小于100％，或小于95％，或小于90％，或小于85％，或小于80％，或小于70％，或小于60％，或小于50％，或小于40％，或小于30％，或小于20％，或小于10％，或小于5％。
在另一优选例中，所述第一RTT序列与靶核酸序列不互补。
在另一优选例中，所述第二RTT序列与靶核酸序列不互补。
在另一优选例中，所述第一RTT序列与靶核酸序列互补，同时具有一个或多个核苷酸不配对，即具有至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少40％，至少60％，至少80％，至少90％，至少95％的核苷酸不配对。
在另一优选例中，所述第二RTT序列与靶核酸序列互补，同时具有一个或多个核苷酸不配对，即具有至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少40％，至少60％，至少80％，至少90％，至少95％的核苷酸不配对。
在另一优选例中，所述第一pegRNA从5’到3’方向包括第一crRNA、第一RTT序列以及第一PBS序列。
在另一优选例中，所述第一pegRNA从3’到5’方向包括第一crRNA、第一RTT序列以及第一PBS序列。
优选的，所述第一RTT序列从5’到3’方向包括第一配对序列、第一片段。
优选的，所述第一RTT序列从3’到5’方向包括第一配对序列、第一片段。
在另一优选例中，所述第二pegRNA从5’到3’方向包括第二crRNA、第二RTT序列以及第二PBS序列。
在另一优选例中，所述第二pegRNA从3’到5’方向包括第二crRNA、第二RTT序列以及第二PBS序列。
优选的，所述第二RTT序列从5’到3’方向包括第二配对序列、第二片段。
优选的，所述第二RTT序列从3’到5’方向包括第二配对序列、第二片段。
在优选的实施方式中，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：4所示。
在优选的实施方式中，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：5所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：6所示。
在优选的实施方式中，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：7所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：8所示。
在优选的实施方式中，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：9所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：10所示。
优选的，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明第二方面提供了一种利用引导编辑(Prime Editing)技术制备抗除草剂的植物的方法，所述的方法包括：
(a)提供一植物细胞、植物组织或植物部分，将所述植物细胞、植物组织或植物部分与下列组分(i)-(iii)接触，从而在所述植物基因组的靶核酸中引入目标序列，进而赋予或增强所述植物对除草剂的抗性；
(b)将步骤(a)中的植物细胞、植物组织或植物部分再生成植株；
所述组分(i)-(iii)包括：
(i)Cas蛋白和逆转录酶；
(ii)第一pegRNA，所述第一pegRNA包括第一crRNA、第一逆转录模板序列(RTT)和第一引物结合位点序列(PBS)；和
(iii)第二pegRNA，所述第二pegRNA包括第二crRNA、第二逆转录模板序列(RTT)和第二引物结合位点序列(PBS)；
其中，所述第一RTT序列包含第一片段和第一配对序列，所述第二RTT序列包含第二片段和第二配对序列，所述第一配对序列与所述第二配对序列互补；
所述目标序列包括所述第一片段、所述第一配对序列和所述第二片段的反向互补序列。
本发明中，所述目标序列可以是任何所需要的序列；比如，目标序列可以是与靶核酸不同物种来源的外源序列，也可以是能够替换靶核酸某段序列的特定所需序列，还可以是与靶核酸来源于相同物种的所需目标序列。
在另一优选例中，所述Cas蛋白为切口酶(nickase)或者具有切割单链靶核酸活性的Cas蛋白；
在优选的实施方式中，所述Cas蛋白为nCas9蛋白。
在优选的实施方式中，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在另一优选例中，所述逆转录酶选自M-MLV逆转录酶(莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶)或者AMV逆转录酶(禽类成肌细胞增多病毒逆转录酶)中的任意一种或几种。
在优选的实施方式中，所述逆转录酶为M-MLV逆转录酶。
在优选的实施方式中，所述逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在另一优选例中，所述Cas蛋白和逆转录酶通过接头连接。
在优选的实施方式中，接头为XTEN接头。
在另一优选例中，所述第一配对序列的长度为5-30bp。
在另一优选例中，所述第二配对序列的长度为5-30bp。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列的长度为10-26bp。
在优选的实施方式中，所述第二配对序列的长度为10-26bp。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列的长度为10bp、18bp或26bp。
在优选的实施方式中，所述第二配对序列的长度为10bp、18bp或26bp。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列与所述第二配对序列长度相同。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列与所述第二配对序列互补配对，并具有至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％的互补序列同一性。
在优选的实施方式中，所述第一配对序列与所述第二配对序列完全互补配对。
在另一优选例中，所述目标序列的长度为15-50bp。
在优选的实施方式中，所述目标序列的长度为25-46bp。
在优选的实施方式中，所述目标序列的长度为25bp或46bp。
在另一优选例中，所述第一crRNA包括第一引导序列和第一骨架区，所述第二crRNA包括第二引导序列和第二骨架区。
在优选的实施方式中，所述第一PBS序列与所述第一引导序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第二PBS序列与所述第二引导序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第一PBS序列与所述第一引导序列的部分序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第二PBS序列与所述第二引导序列的部分序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第一PBS序列的部分序列与所述第一引导序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第二PBS序列的部分序列与所述第二引导序列反向互补。
在优选的实施方式中，所述第一PBS序列和所述第一引导序列分别与靶核酸的两条链互补配对。
在优选的实施方式中，所述第二PBS序列和所述第二引导序列分别与靶核酸的两条链互补配对。
在另一优选例中，所述第一RTT序列与靶核酸序列相比，其互补同源性小于100％，或小于95％，或小于90％，或小于85％，或小于80％，或小于70％，或小于60％，或小于50％，或小于40％，或小于30％，或小于20％，或小于10％，或小于5％。
在另一优选例中，所述第二RTT序列与靶核酸序列相比，其互补同源性小于100％，或小于95％，或小于90％，或小于85％，或小于80％，或小于70％，或小于60％，或小于50％，或小于40％，或小于30％，或小于20％，或小于10％，或小于5％。
在另一优选例中，所述第一RTT序列与靶核酸序列不互补。
在另一优选例中，所述第二RTT序列与靶核酸序列不互补。
在另一优选例中，所述第一RTT序列与靶核酸序列互补，同时具有一个或多个核苷酸不配对；例如，具有至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少40％，至少60％，至少80％，至少90％，至少95％的核苷酸不配对。
在另一优选例中，所述第二RTT序列与靶核酸序列互补，同时具有一个或多个核苷酸不配对；例如，具有至少1％，至少5％，至少10％，至少20％，至少40％，至少60％，至少80％，至少90％，至少95％的核苷酸不配对。
在另一优选例中，所述第一pegRNA从5’到3’方向包括第一crRNA、第一RTT序列以及第一PBS序列。
在另一优选例中，所述第一pegRNA从3’到5’方向包括第一crRNA、第一RTT序列以及第一PBS序列。
优选的，所述第一RTT序列从5’到3’方向包括第一配对序列、第一片段。
优选的，所述第一RTT序列从3’到5’方向包括第一配对序列、第一片段。
在另一优选例中，所述第二pegRNA从5’到3’方向包括第二crRNA、第二RTT序列以及第二PBS序列。
在另一优选例中，所述第二pegRNA从3’到5’方向包括第二crRNA、第二RTT序列以及第二PBS序列。
优选的，所述第二RTT序列从5’到3’方向包括第二配对序列、第二片段。
优选的，所述第二RTT序列从3’到5’方向包括第二配对序列、第二片段。
在优选的实施方式中，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：4所示。
在优选的实施方式中，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：5所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：6所示。
在优选的实施方式中，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：7所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：8所示。
在优选的实施方式中，所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：9所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：10所示。
在另一优选例中，所述靶核酸是HIS基因和/或EPSPS基因。
在另一优选例中，所述除草剂为HPPD抑制剂类除草剂(或者，称之为HPPD抑制性除草剂)。HPPD抑制剂类除草剂主要包括三酮类、吡唑酮类、异噁唑酮类、二酮腈类和二苯酮类。三酮类除草剂优选硝磺草酮、环磺酮、三唑磺草酮、呋喃磺草酮、双环磺草酮、甲基磺草酮、磺草酮、氟吡草酮、喹草酮或甲基喹草酮中的一种或任意几种；所述吡唑酮类除草剂优选苯唑草酮、磺酰草吡唑、苄草唑、吡草酮、吡唑特、pyrasulfotole或tolpyralate中的一种或任意几种；所述异恶唑酮类除草剂优选异恶唑草酮、异恶氯草酮、异恶草酮中的一种或任意几种。
在另一优选例中，所述的除草剂优选硝磺草酮、异噁唑草酮、环磺酮、甲基喹草酮、苯唑草酮或磺酰草吡唑中的一种或任意几种。
优选的，所述除草剂为硝磺草酮。
在另一优选例中，所述除草剂为草甘膦。
在另一优选例中，所述利用引导编辑技术制备的植物具有至少0.01μM，至少0.1μM，至少1μM，至少10μM，至少20μM，至少40μM，至少60μM浓度的除草剂的耐受性。优选的，所述除草剂为硝磺草酮。
在另一优选例中，所述利用引导编辑技术制备的植物具有至少1％，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少40％，至少41％浓度的除草剂的耐受性。优选的，所述除草剂为草甘膦。
在另一优选例中，所述赋予或增强所述植物对除草剂的抗性是指，在一定除草剂浓度下，利用引导编辑技术获得的植物能够正常生长、或没有药害，亲本植物不能正常生长、产生药害。
在另一优选例中，所述赋予或增强所述植物对除草剂的抗性是指利用引导编辑技术获得的植物与亲本植物相比，对除草剂的最大耐受浓度至少提高了1.1倍，1.2倍，1.5倍，1.8倍，2倍，优选提高了3倍，优选提高了4倍，优选提高了5倍，优选提高了6倍，优选提高了7倍，优选提高了8倍，优选提高了10倍，优选提高了12倍，优选提高了14倍，优选提高了16倍，优选提高了20倍，优选提高了30倍，优选提高了50倍，优选提高了100倍，优选提高了200倍。
在优选的实施方式中，所述除草剂为硝磺草酮，所述靶核酸为HIS基因的核酸序列，所述目标序列如SEQ ID NO：11所示，所述第一配对序列如SEQ ID NO：13所示；所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：4所示。
在优选的实施方式中，所述除草剂为硝磺草酮，所述靶核酸为HIS基因的核酸序列，所述目标序列如SEQ ID NO：11所示，所述第一配对序列如SEQ ID NO：14所示；所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：5所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：6所示。
在优选的实施方式中，所述除草剂为硝磺草酮，所述靶核酸为HIS基因的核酸序列，所述目标序列如SEQ ID NO：11所示，所述第一配对序列如SEQ ID NO：15所示；所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：7所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：8所示。
优选的，所述除草剂为硝磺草酮，所述靶核酸为HIS基因的核酸序列，所述目标序列如SEQ ID NO：11所示，所述第一配对序列如SEQ ID NO：13所示；所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：4所示。
在优选的实施方式中，所述除草剂为草甘膦，所述靶核酸为EPSPS基因的核酸序列，所述目标序列如SEQ ID NO：12所示，所述第一配对序列如SEQ ID NO：16所示；所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：9所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：10所示。
在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物选自下组的一种或多种植物：豆科植物、十字花科、禾本科、茄科、葫芦科、藜科、蓼科、胡麻科、菊科、锦葵科、蔷薇科、胡麻科、旋花科、薯蓣科、伞形花科、百合科、姜科、棕榈科植物。
在另一优选例中，所述植物来源于选自下组的一种或多种植物：大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、苜蓿、高粱、大麦、小麦、小米、甘薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、菠菜、甜菜、花生、西瓜、白菜、草莓、黄瓜、椰子或其组合。
在另一优选例中，所述植物选自大豆、拟南芥、水稻、烟草、番茄、马铃薯、玉米、棉花、花生、高粱、黄瓜、椰子。
优选的，所述植物为水稻。
优选的，所述植物为水稻S1035、水稻“Tadukan”、水稻“Peta”、籼稻或水稻秀水134。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
如本文所用，所述“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。比对方法为本领域技术人员已知的常规方法，比如BLAST运算法则。
术语“互补”或“互补配对”是指核酸分子之间按照碱基互补配对原则存在的特定匹配关系。比如在DNA分子中有四种碱基：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)。A和T之间存在互补配对关系，C和G之间存在互补配对关系。因此，如果DNA分子的一条链上的一个碱基是A，那么其互补链上的对应碱基是T；如果DNA分子的一条链上的一个碱基是C，那么其互补链上的对应碱基是G。
术语“基因工程”是指通过人工干预的方式对控制生物遗传信息的核苷酸进行改造和利用，从而获得新的遗传特性、或新品种、或新产品的技术，包括本领域所公开的所有基因改造技术，如基因诱变、转基因或基因编辑等方法。基因诱变的方法包括但不限于物理诱变(比如紫外线诱变)、化学诱变(比如吖啶类染料)、生物诱变(如病毒、噬菌体诱变)等。
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。
术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。
本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。
术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。
术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
术语“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。
术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。
本发明所述的“抗除草剂的植物”是指在同等除草剂使用量或浓度下，可以减少或抑制或杀死不想要植物但不影响其(抗除草剂的植物)生长或生存能力。
本发明所述的“抗除草剂”或“除草剂抗性”是指植物在保持生存力或植物生长情况下，所能承受除草剂的能力，一般可以用除草剂的使用量或使用浓度等参数进行表征。
术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
术语“植物细胞”应理解为来自或者发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearingtree)、以及灌木和其他苗木。
CRISPR系统
如本文中所用，术语“规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR-相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统”或“CRISPR系统”可互换地使用并且具有本领域技术人员通常理解的含义，其通常包含与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达有关的转录产物或其他元件，或者能够指导所述Cas基因活性的转录产物或其他元件。
Cas蛋白
Cas蛋白、或CRISPR相关蛋白是指适用于CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)系统的核酸酶。优选地，所述Cas蛋白为CRISPR酶，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。所述的Cas蛋白可以根据其来源不同而具有不同的结构，如来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来源于葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SaCas9；还可以根据结构特征(如结构域)进行下位分类，如Cas12家族包括Cas12a(又名Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12i等。所述的Cas蛋白可以具有双链或单链或无切割活性。本发明所述的Cas蛋白可以是野生型或其突变体，所述的突变体的突变类型包括氨基酸的替换、取代或缺失，所述的突变体可以改变也可以不改变Cas蛋白的酶切活性。比如nCas9是指Cas9(H840A)突变体，具有单链核酸的切割活性。本领域技术人员所知，现有技术中已报到的多种具有核酸切割活性的Cas蛋白，该公知蛋白或其改造后的变体均可以实现本发明的功能，本文通过引用方式将其纳入保护范围。
如本文所用，术语“切口酶(nickase)”是指两个核酸酶结构域之一(比如HNH结构域)失活的Cas酶(例如Cas9)，这种酶只能切割靶核酸的一条链。
crRNA
如本文所用，术语“crRNA”、或“CRISPR RNA”是指适用于CRISPR系统的指导RNA(或引导RNA)，其包括引导序列(或称为间隔序列)和骨架区，其骨架区可以与CRISPR蛋白(或者，Cas蛋白)相互作用，从而使Cas蛋白和crRNA形成复合物，并引导复合物与靶核酸结合；其引导序列(或称为间隔序列)与靶核酸序列互补。
Prime Editing技术
Prime Editing(引导编辑)技术如专利CN113891936A、CN113891937A、CN114127285A、或CN114729365A所述，是指使用核酸可编程DNA结合蛋白(如Cas9)、聚合酶(如逆转录酶)和引导编辑指导RNA(pegRNA)进行基因编辑的方法。所述pegRNA包括间隔区、gRNA核心(gRNA核心也称为骨架区)和延伸臂，延伸臂包括DNA结合模板(包括编辑模板和同源臂)和引物结合位点。引导编辑技术的原理是核酸可编程DNA结合蛋白(如Cas9)切割靶核酸的一条链(非靶链)，产生切口的靶核酸链与pegRNA的延伸臂相互作用，引发聚合，聚合酶(如逆转录酶)合成含有目标序列的ssDNA，含有目标序列的DNA链由于包含同源臂序列可以与内源的靶核酸链杂交，并将原DNA链替换，所述目标序列最终被插入靶核酸中。
Grand Editing技术
Grand Editing(成对pegRNA部分序列互补延伸技术，genome editing by RTtemplates partially aligned to each other but non-homologous to targetedsequences duo pegRNA)技术可以认为是一种优化的Prime Editing技术。Grand Editing技术如专利WO2022242660A1中的描述，是指使用Cas9蛋白、逆转录酶和成对pegRNA进行基因编辑的方法。pegRNA包括crRNA、引物结合位点序列(PBS)和逆转录酶模板序列(RTT)，RTT序列包括配对序列。Grand Editing技术的原理是Cas蛋白切割靶核酸的两条链(如果两个切口之间存在靶核酸的原有片段，此原有片段将被目标序列取代；如果两个切口之间没有靶核酸的原有片段，目标序列将直接插入靶核酸中)，逆转录酶在pegRNA作用下逆转录，合成含有目标序列的DNA链，含有目标序列的两条DNA链在配对序列作用下互补配对，暴露出原靶核酸链的5’flap，经过5’flap的切割和DNA修复后，目标序列插入靶核酸中。
通过Grand Editing技术可以实现靶核酸的碱基替换或者碱基插入。比如，两个切口之间存在靶核酸的原有片段，目标序列与靶核酸的原有片段的长度相同，并且目标序列与靶核酸的原有片段相比具有一个或多个核苷酸不同时，可以通过Grand Editing技术使靶核酸的原有片段替换成目标序列。两个切口之间没有靶核酸的原有片段或者目标序列的长度大于靶核酸的原有片段的长度时，可以通过Grand Editing技术在靶核酸中插入含有目标序列的碱基片段。也可以通过Grand Editing技术同时完成碱基替换和碱基插入。
Grand Editing技术中的pegRNA与Prime Editing技术中的pegRNA的区别在于(i)Grand Editing技术中的pegRNA有两条，并且这两条pegRNA含有互相配对的序列；PrimeEditing技术中的pegRNA只有一条；(ii)Prime Editing技术中的pegRNA的延伸臂含有同源臂，与靶核酸序列同源；Grand Editing技术中的pegRNA不含有同源臂，其pegRNA的RTT序列与靶序列可以没有同源性或者互补同源性。
Grand Editing技术与Prime Editing技术相比，优点是可以插入非常大的目标序列或片段、RTT序列与靶核酸不需要具有同源性(理论上Grand Editing技术可以插入任意序列)、具有更高的编辑效率和特异性。
在本发明中，Grand Editing技术是引导编辑(Prime Editing)技术中的一种，引导编辑(Prime Editing)技术包括Grand Editing技术。
在本发明中，pegRNA可以是Grand Editing技术中的pegRNA，也可以是PrimeEditing技术中的pegRNA。
本发明涉及的序列如下：
本发明的主要优点：
本发明对引导编辑在植物中的应用进行了优化，特别是在用于制备具有高除草剂抗性的植物时的应用进行优化，从而可以高效的制备高除草剂抗性的植物，首次实现了通过引导编辑技术制备生产上可用的抗除草剂的植物，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1.A部分为成对的pegRNA的示例性结构，B部分为Grand Editing技术原理。
图2.Grand Editing技术修复Oshis1基因的序列设计(A部分)及编辑效率(B部分)。
图3.A部分为野生型水稻植株(WT)和利用Grand Editing技术获得的水稻植株(RTT-10transformants)对除草剂硝磺草酮的抗性，B部分为野生型水稻植株(WT)和利用Grand Editing技术获得的双等位基因突变水稻植株(RTT-10#3(Bi))基因型测序结果。
图4.Prime Editing技术创制OsEPSPS基因TIPS突变的序列设计(A部分)及编辑效率(B部分)。
图5.Grand Editing技术创制OsEPSPS基因TIPS突变的序列设计(A部分)及编辑效率(B部分)。
图6.A部分为野生型水稻植株(WT)和利用Grand Editing技术获得的水稻植株(EPSPS-TIPS杂合突变体)对除草剂农达(含41％有效成分的草甘膦异丙胺盐)的抗性，B部分为野生型水稻植株(WT)和利用Grand Editing技术获得的水稻植株(#110(He)、#133(He))基因型测序结果。
实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1、利用引导编辑技术对HIS1基因进行改造
水稻内源的HIS1基因是Fe(II)/2-酮戊二酸依赖型加氧酶(Fe(II)/2-oxoglutarate(2OG)–dependent oxygenases)家族的一个成员，编码351个氨基酸，对β-三酮类HPPD抑制剂具有广谱的解毒效果。而在“Tadukan”、“Peta”等部分现代籼稻品种的祖先种中，HIS1基因第三个外显子存在28bp的小片段缺失，导致基因功能失效而表现出对β-三酮类HPPD抑制剂的敏感性。调查发现国内生产上使用的631份籼稻品种有将近一半在HIS1基因编码区存在28bp缺失，包括籼稻常规品种、不育系、三系恢复系、两系恢复系等不同类型的材料。因此，HPPD类除草剂目前在籼稻产区推广使用存在巨大的安全风险。为解决这个问题，我们利用Grand Editing技术(其成对pegRNA的结构如图1的A部分所示，其技术原理如图1的B部分所示)，对存在28bp碱基缺失的his1基因型品种进行原位定点改造，目的是把丢失的28-bp小片段原位补全，恢复HIS1基因的正常功能从而恢复其除草剂抗性。
具体地，在籼稻敏感品种S1035功能缺陷型Oshis1基因靶位点附近设计成对guide-PAM序列，切割位点之间的18bp基因组序列将会被删除，然后我们把这18bp和需要补回的28bp拼接在一起形成一段46bp的插入片段。为了降低插入片段与基因组序列的同源性，我们在46bp的片段里引入了多个无义突变，插入新片段的序列(目标序列)如SEQ IDNO：11所示，如图2的A部分所示(方框表示guide-PAM序列，下划线表示PBS序列，RTT-10、RTT-18和RTT-26中间阴影标示的为RTT序列的配对序列)。构建的Grand Editing载体，包括nCas9(其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)和逆转录酶M-MLV(其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)，并设计了成对pegRNA。其中，成对pegRNA中的配对序列长度分别设计为10bp，18bp和26bp三种长度，将不同长度的配对序列合成到RTT序列中。这三组不同长度的成对pegRNA的RTT序列分别命名为RTT-10、RTT-18、RTT-26，这三组成对pegRNA序列如下所示：
(其中，斜体部分是引导序列，正常字体部分是骨架区，下划线部分是RTT序列，加粗部分是PBS序列，下划线并加粗部分是RTT序列中的配对序列)
通过热休克法将载体质粒导入农杆菌EHA105中，以水稻S1035的成熟种子为外植体诱导愈伤组织，上述编辑文库通过农杆菌转入愈伤组织中，在组织培养的筛选阶段通过潮霉素筛选转基因阳性克隆。采用以上方法获得转化植株后，用60μM硝磺草酮(mesotrione)进行喷施处理，两周后观察植株表型。
实验结果表明，使用成对pegRNA(RTT-10)的编辑体系获得了9株(11.5％)抗性植株，而使用成对pegRNA(RTT-18)和成对pegRNA(RTT-26)的编辑体系都只有1株抗性植株(如图2的B部分所示，Ho:纯合突变体；Bi:双等位突变体；He:杂合突变体)。测序结果表明这11株抗性植株都是包含有精准插入片段(上述46bp的片段)的杂合突变体或双等位突变体。
使用成对pegRNA(RTT-10)获得的编辑植株(RTT-10tansformants)的除草剂抗性如图3的A部分所示，野生型水稻植株(WT)对硝磺草酮敏感，喷施两周后植株枯萎死亡；编辑植株(RTT-10tansformants)对硝磺草酮具有抗性，喷施两周后植株仍然保持正常生长、植株形态(高度)正常、呈现绿色。
对使用成对pegRNA(RTT-10)获得的编辑植株(RTT-10#3(bi))进行测序，结果显示抗性植株的OsHIS1基因中精准插入了上述46bp的片段，如图3的B部分所示。这说明GrandEditing技术可以对his1基因进行定点改造，把丢失的28bp小片段原位补全，恢复HIS1基因的正常功能从而恢复其除草剂抗性。
分析实验结果可知，成对pegRNA的配对序列长度对Grand Editing精准插入的效率有重要的影响，成对pegRNA的互补序列长度为10bp的一组的插入效率(11.5％)明显高于长度为18bp和26bp的两组(插入效率分别为1.4％和1.3％)。成对pegRNA的配对序列长度设置为10bp时有利于短片段(特别是46bp的片段)的精准插入。
实施例2、利用引物编辑技术对EPSPS基因进行改造
草甘膦是一种非选择性除草剂，其作用机理是竞争性抑制5-烯醇丙酮酸莽草酸磷酸酯合酶(5-enol pyruvyl shikimate phosphate synthetase，英文简称EPSPS)的活性。EPSPS是植物体内芳香族氨基酸生物合成的关键酶。
EPSPS蛋白的TIPS突变能提高植物对草甘膦的抗性。在水稻中TIPS突变对应于EPSPS编码序列的C518T+C529T突变。我们分别用Prime Editing技术和Grand Editing技术在水稻中创制TIPS突变:利用Prime Editing技术编辑C518和C529，设计的两条pegRNA如图4的A部分所示(方框表示guide-PAM序列，下划线表示PBS序列)。利用Grand Editing技术替换C518和C529，设计的两条pegRNA如图5的A部分所示(方框表示guide-PAM序列，下划线表示PBS序列，灰色阴影部分标示的是RTT序列的配对序列)，替换的新片段(目标序列，其序列如SEQ ID NO：12所示)中包括C518T和C529T以及为消除序列同源性引入的无义突变，设置RTT的配对序列长度为10bp。上述Prime Editing技术中的pegRNA和Grand Editing技术中的pegRNA序列如下所示：
(其中，斜体部分是引导序列，正常字体部分是骨架区，下划线部分是RTT序列，加粗部分是PBS序列，下划线并加粗部分是RTT序列中的配对序列)
采用实施例1中的实验方法对秀水134水稻进行EPSPS基因改造。
利用Prime Editing技术获得的编辑植株大多数为嵌合突变体，或者C518T和C529T突变独立发生，只有3株(2.0％)为预期的TIPS突变体(杂合突变)，且只有副编辑产物的植株有9株(6.0％)(He:杂合突变体。Chi:嵌合突变体)，如图4的B部分所示。
对利用Grand Editing技术获得的T0代植株进行测序，结果如图5的B部分所示，有将近20％(12.2％+3.4％)的植株实现了精准的片段替换，其中杂合突变体占12.2％，还得到了3.4％的纯合突变体，副编辑产物的植株有5株，占3.4％(Ho:纯合突变体；He:杂合突变体；Chi:嵌合突变体)。
由于EPSPS基因的TIPS纯合突变具有致死效应，我们利用Grand Editing技术获得的5株纯合突变植株生长发育受严重影响，甚至移栽后死亡，因此我们利用杂合突变体测试其除草剂抗性。我们用600倍稀释的农达(含41％有效成分的草甘膦异丙胺盐)对移栽两周后的野生型水稻植株和利用Grand Editing技术获得的TIPS杂合突变体进行喷施处理两周，实验结果如图6的A部分所示，野生型水稻植株(WT)全部枯萎死亡，而突变体水稻植株(EPSPS-TIPS)没有产生药害症状，能够正常生长、呈现绿色。
选取两株利用Grand Editing技术获得的TIPS杂合突变植株(He)进行测序，结果如图6的B部分所示，TIPS杂合突变体(He)的EPSPS基因中含有预期的TIP突变(C518T、C529T)。
以上结果进一步表明，Grand Editing技术比Prime Editing技术有更高的编辑效率和更高的编辑产物纯度(副编辑产物的植株较少)，能高效地对植物的除草剂靶标基因和非靶标抗性基因进行编辑，从而提高植物对除草剂的抗性。同时，利用Grand Editing技术进行目标基因片段插入或者基因替换时，成对pegRNA的配对序列长度为10bp时效率较高。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.一种利用引导编辑(Prime Editing)技术制备抗除草剂的植物的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(a)提供一植物细胞、植物组织或植物部分，将所述植物细胞、植物组织或植物部分与下列组分(i)-(iii)接触，从而在所述植物基因组的靶核酸中引入目标序列，进而赋予或增强所述植物对除草剂的抗性；
(b)将步骤(a)中的植物细胞、植物组织或植物部分再生成植株；
所述组分(i)-(iii)包括：
(i)Cas蛋白和逆转录酶；
(ii)第一pegRNA，所述第一pegRNA包括第一crRNA、第一逆转录模板序列(RTT)和第一引物结合位点序列(PBS)；和
(iii)第二pegRNA，所述第二pegRNA包括第二crRNA、第二逆转录模板序列(RTT)和第二引物结合位点序列(PBS)；
其中，所述第一RTT序列包含第一片段和第一配对序列，所述第二RTT序列包含第二片段和第二配对序列，所述第一配对序列与所述第二配对序列互补；
所述目标序列包括所述第一片段、所述第一配对序列和所述第二片段的反向互补序列；
所述第一配对序列和所述第二配对序列的长度为5-30bp；
所述目标序列的长度为15-50bp。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas蛋白为切口酶(nickase)或者具有切割单链靶核酸活性的Cas蛋白；
优选的，所述Cas蛋白为nCas9蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录酶选自M-MLV逆转录酶或者AMV逆转录酶中的任意一种或几种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一crRNA包括第一引导序列和第一骨架区，所述第二crRNA包括第二引导序列和第二骨架区；所述第一PBS序列与所述第一引导序列反向互补；所述第二PBS序列与所述第二引导序列反向互补。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一RTT序列或第二RTT序列与靶核酸序列相比，其互补同源性小于100％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一配对序列和所述第二配对序列的长度为10-26bp；
优选的，所述第一配对序列和所述第二配对序列的长度为10bp。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标序列的长度为25-46bp；
优选的，所述目标序列的长度为25bp或46bp。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述除草剂为硝磺草酮和/或草甘膦。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述除草剂为硝磺草酮，所述靶核酸为HIS基因的核酸序列，所述目标序列如SEQ IDNO：11所示，所述第一配对序列如SEQ ID NO：13所示；所述第一pegRNA的序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：4所示；
或者，所述除草剂为草甘膦，所述靶核酸为EPSPS基因的核酸序列，所述目标序列如SEQID NO：12所示，所述第一配对序列如SEQ ID NO：16所示；所述第一pegRNA的序列如SEQ IDNO：9所示；所述第二pegRNA的序列如SEQ ID NO：10所示。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，所述植物为水稻。
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