CN117946993A - 一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用，涉及生物工程技术领域。该里氏木霉工程菌的构建方法，包括将重组载体转化入里氏木霉宿主菌中，通过基因重组构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；所述里氏木霉工程菌通过过表达聚苹果酸合酶蛋白来生产聚苹果酸；所述聚苹果酸合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述重组载体的骨架载体为LML2.0a，包括pma基因N端片段。本发明以里氏木霉菌为出发菌株，不引入任何外源基因，通过过表达内源的聚苹果酸合成酶基因，使原先不具备聚苹果酸生产能力的里氏木霉，改造为可以高效生产聚苹果酸的基因工程优化菌株，构建成符合食品安全的聚苹果酸生产菌株。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
聚苹果酸(Poly malic acid，PMLA)又名聚羟基丁二酸酯是一种生物高分子材料，是以唯一的单体L-苹果酸(L-malic acid，L-MA)通过无数酯键聚合后形成的脂肪族聚合物。聚苹果酸是唯一一种含酯键又能快速水解的高分子聚合物，水解产物为L-苹果酸单体，可进入三羧酸循环中被降解。聚苹果酸侧链存在大量游离的羧基，容易被修饰或改性，与具有功能分子的活性基团相结合，从而使其附有特殊功能。因此在生物医药、食品、化妆品等领域具有广泛的应用前景。聚苹果酸作为高分子聚酯材料，具有优良的水溶性、生物相容性、生物可降解性、生物可吸收性、易修饰性、非免疫原性和无毒性，在生物医学材料、可降解塑料、吸水材料、抗菌食品包装材料等领域有广泛的应用前景，是最具发展潜力的“绿色塑料”。
目前，聚苹果酸的合成方法主要分为化学合成法和生物合成法。化学合成法主要有开环聚合法和直接聚合法，可以得到3种构型的PMLA，其中开环聚合法技术较为成熟。但与生物合成法相比，化学法合成的PMLA分子量较小，合成步骤长，提纯工艺复杂，生产成本高，严重制约了其规模化发展。微生物合成法是由微生物体内通过三羧酸循环代谢，能得到相对分子量较大的PMLA，且具有较高的化学纯度和光学纯度，性能优异，成为当前的研究热点。微生物合成聚苹果酸时，一般会加入碳酸钙等中和剂，合成聚苹果酸钙。聚苹果酸钙除了可以酸化获得聚苹果酸、L-苹果酸单体外，还可以直接作为人和动物的保健食品，应用于食品添加剂和动物养殖中。聚苹果酸钙在肠道通过缓释效应而分解成L-苹果酸和有机钙。L-苹果酸是一种可被生物体利用的天然有机酸，是动物机体内部循环的重要中间产物，易被吸收且可影响动物肠道pH值，对肠道刺激性较小，安全性高，同时能够有效促进羧酸盐代谢、促进线粒体呼吸、增强钙的活性。此外聚苹果酸钙的分解产物L-苹果酸可通过增强乳酸的代谢作用来影响反刍动物的乳酸调控，从而防止瘤胃酸中毒的发生。聚苹果酸钙还具有抗氧化、抗菌等生理功能，能有效降低动物机体的发病率，增强动物机体的健康，改善肉的品质。
目前，很多能够合成PMLA的微生物，大多是致病微生物，具有一定的安全风险，难以应用在食品和饲料行业；或者是难于扩大培养的微生物，鲜有产业化成功的案例。利用易于扩大培养的食品安全级别的微生物高效合成PMLA，是解决上述问题的新研究方向。
里氏木霉是重要的工业生产菌株，符合GRAS(Generally Regarded as Safe)标准，其发酵产物已被广泛应用于食品、饲料等行业。目前还未出现利用里氏木霉菌株发酵生产聚苹果酸的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过提高聚苹果酸合成酶基因的表达强度，构建出高效生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌，利用该里氏木霉工程菌发酵生产聚苹果酸，产量可达90g/L。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种聚苹果酸合酶蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供一种上述的聚苹果酸合酶蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。
本发明还提供一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌的构建方法，包括将重组载体转化入里氏木霉宿主菌中，通过基因重组构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；
所述里氏木霉工程菌通过过表达聚苹果酸合酶蛋白来生产聚苹果酸；
所述聚苹果酸合酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述重组载体的骨架载体为LML2.0a，包括pma基因N端片段；
所述pma基因N端片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述聚苹果酸合酶蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述重组载体含有依次连接的pma基因上游序列、启动子和所述pma基因N端片段。
进一步地，所述pma基因上游序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.7所示。
进一步地，所述里氏木霉宿主菌为QM6a、QM9414、RUT-C30、RL-P37、NG14或PC-3-7。
本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的里氏木霉工程菌。
本发明还提供上述的里氏木霉工程菌在生产聚苹果酸或L-苹果酸中的应用。
本发明还提供一种生产聚苹果酸的方法，包括利用上述的里氏木霉工程菌发酵生产得到聚苹果酸的步骤。
本发明还提供一种生产L-苹果酸的方法，包括利用上述的里氏木霉工程菌发酵生产得到聚苹果酸，再将所述聚苹果酸水解，得到所述L-苹果酸的步骤。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以里氏木霉菌为出发菌株，不引入任何外源基因，通过过表达内源的聚苹果酸合成酶基因，使原先不具备聚苹果酸生产能力的里氏木霉，改造为可以高效生产聚苹果酸的基因工程优化菌株，构建成符合食品安全的聚苹果酸生产菌株，避免产生生物安全性和转基因安全性等问题。
本发明获得基因工程优化菌株不携带转基因成分，不含有任何外源基因序列，不含有抗性筛选标记，能以葡萄糖、乳糖等常见碳源为基础，直接发酵生产大量的聚苹果酸，其最高产量可达90g/L。本发明提供的聚苹果酸可以快速水解成L-苹果酸。优化菌株来源于食品安全菌株，属于非转基因物种，其生产的聚苹果酸属于非转基因食品。本发明提供了利用食品安全微生物发酵聚苹果酸的新方法，可应用于聚苹果酸和L-苹果酸的工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为表达载体和基因工程优化菌株的构建流程图；其中，A为pdcOEpma表达载体及其基因工程优化菌株的构建流程图；B为cbhOEpma表达载体及其基因工程优化菌株的构建流程图；图中“终止子”为里氏木霉聚苹果酸合酶基因pma本身的终止子，构建表达载体时不需要终止子序列，基因工程优化菌株中终止子序列不发生改变；
图2为pdcOEpma优化菌株发酵生产聚苹果酸的产量结果；
图3为cbhOEpma优化菌株发酵生产聚苹果酸的产量结果；
图4为纯化的聚苹果酸钙示意图；
图5为聚苹果酸钙的酸水解时间对L-苹果酸产量的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例中使用的培养基配方如下：
发酵培养基1：胰蛋白胨6g/L、K2HPO40.15 g/L、KH2PO40.15 g/L、NaCl 0.05g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.1g/L、微量元素1mL/L、葡萄糖100g/L和CaCO380 g/L。
发酵培养基2：胰蛋白胨6g/L、K2HPO40.15 g/L、KH2PO40.15 g/L、NaCl 0.05g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、CaCl2·2H2O 0.1g/L、微量元素1mL/L、葡萄糖80g/L、乳糖20g/L和CaCO380 g/L。
微量元素配方：MnSO4·4H2O 1.6g/L、FeSO4·7H2O 5g/L、CoCl2·6H2O 2g/L和ZnSO4·7H2O1.4g/L。
聚苹果酸的含量测定方法如下：
聚苹果酸检测原理：将聚苹果酸彻底水解成L-苹果酸，检测水解液中L-苹果酸的浓度为C，据苹果酸的含量为：C×2×116/134(2代表酸水解时硫酸稀释了一倍；116为聚苹果酸中单体的分子量；134为L-苹果酸的分子量)。取发酵液样品于离心管中，14000×g离心10min，取1mL离心后的上清液加入等体积的2mol/LH2SO4，放入80℃，100rpm的水浴摇床震荡12h，将发酵液与管壁上的水珠混匀后，再取1mL水解液体于1.5mL离心管中，14000×g离心30min，吸取上清，液相测定L-苹果酸含量。
处理后的样品用高效液相色谱(HPLC)测定L-苹果酸含量：流动相：5mM H2SO4；流速：0.6mL/min；柱温：35℃；检测器：紫外检测器；波长：210nm；柱子：AmineX HPX-87X，(300mm×7.8mm)。
以下实施例中使用的LML2.0a质粒已在文献“Zhang et al.Light-induciblegenetic engineering and control of non-homologous end-joining in industrialeukaryotic microorganisms:LML 3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761”中公开。
根据基因组分析，里氏木霉具有聚苹果酸合成酶基因(pma)，但是不能明显地合成聚苹果酸(<5g/L)。本发明在不添加任何外源基因的前提下，通过强化自身的聚苹果酸合成酶的表达水平，提高聚苹果酸的合成能力，构建出不含有任何外源基因的高产聚苹果酸的里氏木霉基因工程优化菌株，具体详述如下：
实施例1
通过同源比对鉴定出里氏木霉菌内源的聚苹果酸合成酶编码基因(pma)，其基因序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
1、内源的聚苹果酸合成酶过表达载体1——pdcOEpma的构建
1)利用引物pma-F1和pma-F2，以里氏木霉基因组为模板扩增内源的聚苹果酸合成酶编码基因的上游序列pma-F。
pma-F1：5’-ATTACGAATTCTTAATTAACGACGACAATGGCGACTCTG-3’(SEQ ID NO.9)；
pma-F2：5’-CATTATACGAAGTTATTCTAGAGGACGGGCGATCAATGGAT-3’(SEQ ID NO.10)；
下划线为引物5’端的插入序列(分别包含与质粒上完全相同的19bp、22bp的同源序列)，用于后续通过Vazyme One Step Clone Kit进行无缝连接。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；10μM引物pma-F1/pma-F2各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
pma-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ATTACGAATTCTTAATTAACGACGACAATGGCGACTCTGCGCTGGGGACATCCCCTTCTCCAGCAGATTGTTATGGCCATGCACCTTACCCCTGGTCCTAAACATGTCTTATCTCAAACATCCTCACTCCTTAATACGACTCCGGACGCCGTGTATGGAGCTATATGTAAAGTTATGATTCGACACAAAGCATCCCCAAACCATGGATCCCAGCCTTCGGGATCGGCACTTCTGCCATTGGTCTGTCTGTCTTGAGATCGGCTCCTAGATCTAAAGCCCTCAGCGTGGGATCGAACATCCCGTTCTTCCGTATGGCAACGAAACAGGGCTCCTTCCCAAATAGGCACCCGGTTACCACGGATTGCTACGATCTTATTCTGCTGGCGGCTCTGATCGGGAAATCCAGAAGCAGCCAATGAGGCTATCGTCAATTTATTATGCGTCGTCATTCGGATTCAAGAGATTGATCCCTTGTCGAGCATTCTCGAACGGGATAATCCACGGGACATGTGTGAGAGATAATCAATGATGCCCTCATCGTCTGTAAGCCCTCATTACTTGGAATCGGCCCCTAGATGTGCAGCCTTGGGCGTGGTGTCTTACATGCCATTCTTTCCCATCGCAATGACGTTACGAGTGGCTACAAGACGACCGGGGGAAAAAGCCCTGCTGCAACTGGCATGTGTGTTCTTTGGGATGGCCATTGTGATCATCCATTGATCGCCCGTCCTCTAGAATAACTTCGTATAATG。
2)利用引物pdc-F和pdc-R，以里氏木霉基因组为模板扩增pdc启动子Ppdc序列。
pdc-F：5’-CTAGTGAGCTCATTTGAAAGGAGGGAGCATTCTTCGA-3’(SEQ ID NO.11)；pdc-R：5’-CATGATTGTGCTGTAGCTGCG-3’(SEQ ID NO.12)；
下划线为pdc-F引物5’端15bp的插入序列——与质粒上完全相同的同源序列。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；10μM引物pdc-F/pdc-R各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃45sec，运行30个循环；68℃5min。
pdc启动子Ppdc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
CTAGTGAGCTCATTTGAAAGGAGGGAGCATTCTTCGACTTGCGGCAATTGCATGCACATGTACGATTGGAAGCGCGGGCGATGTATTCGCAATCATGTTTAGAAGGACGGCGTTTGGAAACGTTGGGATGCTGTTGAAGCGTTGGAAACAGGGGCAATTAGAAACACCGAGCCAGACAGAGTCAATGGTACGAGGTCAGCCAGTATCATGACCTGTGTGCGCATGGTGGCGAGAGATTCCGAGCCATGCCACGGGAGACGAGCAATGAAAAAACTCTTCACTCACTTGTCGAGGCTCTCTCAACCTATCGACTTATCAAGTAGACGATGAAAGCCTTGCAACTGTGGTGATGTGGCTCATCAATGTGCGACGTCGTATCCATGTCTGAGGCCATTCGATATCGTGATGCGACTACCTAGTAAAGCCCGGCCAGAGGGCAAACCGGGGCGACAGGGGCAGGCAATTGACCGGATGGCTGCATGTGCCGAAGCAGCCCCGATGGAATCGAGATGTCTGTCGGATGGACCGCTGAGCGGCCTGGCAAGGTGTCCCAGATACGAAGATGGAAGTGAAGTCAGAGGTGGTCGTTAATTGTCCGACGAGCGAATCGGCCGCTCCTTCGGATTGCCGGCTCTGCTGTATGTACCGTGCATGAAGCCACCCGGGATCCATGTTACGATGGATAGGTTCCAACTCTCTAGTAGCTATAGTGGACCTGAGGCTATCTAGTATCACTGGAGGAGCAGCCGTCCACTATCGTCGAGCGCTGTAGAAGCAGCTGCATTAGCGGCTGCCCACCCGCGCAGAAATGGCCCCATTACATCACTATCATGACAGCGGCGCGTCCAAAAGTGAGCTCATGCTTGCCGATGGCACGAGCAGCTGCAACTGGCGGGGCTCCTGCCTGCCGTCTCCGGTGCCGCTGCCCATTTGAGTTTGTCCGAGCTGTTGATGGTTGAAACCGAGACCGATGGATGATTCAACACTTCGAAGTCTAGGTAGATAAAAAACATCTATATATCCTCATTCATTGCCCTGTCAGTGTGTTGGCTCACGTCTCCAATCCTCCGCCCCTCCTCCTGCAAAGTAAATACCTTCTCAAAACACGTCTGGAATCCTGCAAGTCTCCATCACAAGGAGCTTCTTCATCAACCACCTTATACGAGCAACATCATTTGCATCATCGTTGATCCACATCTCCTCGCGCCTCAGAGTGTCGTCACCAGTATAAATAACCGCATCAAGCTCTCGTCCTTCTTCGTTCCACAATCCAAGAAGCACCTCAAAACGATCAAAGCAGCGCAGCTACAGCACAATCATG。
3)利用引物pma-P1和pma-R，以里氏木霉基因组为模板扩增聚苹果酸合成酶编码区N端部分基因序列pma-O(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，得到扩增产物pma-O1(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)。
pma-P1：5’-AGCTACAGCACAATCATGAGCTCTCTACAGACCCCG-3’(SEQ ID NO.13)；pma-R：5’-AGTGCCAAGCTTATTTCCAAGAGTCCACCACGAAGC-3’(SEQ ID NO.14)；
下划线为引物5’端的插入序列，pma-P1引物包含与pdc启动子末端完全相同的15bp的同源序列，pma-R引物包含与质粒上完全相同的16bp的同源序列。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；10μM引物pma-P1/pma-R各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
SEQ ID NO.3：
ATGAGCTCTCTACAGACCCCGTCAGAACTCGCAGTCTTGCTTGAGGGTTTCTGTTCTCTACCAATATCCGATATTAGCACACATGGAGAGTTCCAACGACTCCTACATTCGGATGCTGATAAAGAACGAATCCTAGAGTCGATACCAAGTACGCCGAATCCCTCCCATCGACCACTCGCTTTACTACATCTCTTGTTGAGCGAGCTACGGGGATCATGGCCGACATTCCCTCTGATCAGATGCTACACAAGGCTGTATCACTTGTTGCCAGAAGATGCAAAGTCTCGTCGGGATAAGAATCTAGCACAGCTGGTTCATGTTACTTCGGATCTGGTCAAGAAGTCTTATACATCTTTTGCCTCTTTTCTCGTTTCCAGTTCGCAACCGGCTTTGCGCTCTTCAACACCTGGAGACTTCATCACCCACAATGGGCTACGGAATTTCGTTGATAGCTTTCACCTCCCAACAAACGGTTCTGCGCGCAAGCCAGTCGTTGCGATAGCTCTTCCTAATGGTCCCTTGCTGGCGGCCACTTGCATCGCTGTCACTACCTACTATACGTCTGCGCCAATCAATCCCGCTGCCGGTGCAGAGCAATTCCGCGCAGACGTTCAGCAAGCTGGTGCGCAGTTCATACTGACCACAAGCGACGACTGTGAGAGGCTCGGCCTGAGAGATCCGTGGGTTGCCGCAGCAGGAATCGAAGTCTTCTTGATGAGATGGGACAACCGTGACGAGATCGATGTTCGAGACCTTGGGGGCTCTCCCCTCCCACTTCAAAGGCAAAAACCTAACTATAACGGGCCAGATGACTTTGGATTGATATTGTTCACGAGTGGCACTTCTGGCACCAAGAAGGTCGTGCCCTTGACAGTACATTCCATCATTGCCGGCATCAGCTTCGTGGTGGACTCTTGG。
pma-O1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
AGCTACAGCACAATCATGAGCTCTCTACAGACCCCGTCAGAACTCGCAGTCTTGCTTGAGGGTTTCTGTTCTCTACCAATATCCGATATTAGCACACATGGAGAGTTCCAACGACTCCTACATTCGGATGCTGATAAAGAACGAATCCTAGAGTCGATACCAAGTACGCCGAATCCCTCCCATCGACCACTCGCTTTACTACATCTCTTGTTGAGCGAGCTACGGGGATCATGGCCGACATTCCCTCTGATCAGATGCTACACAAGGCTGTATCACTTGTTGCCAGAAGATGCAAAGTCTCGTCGGGATAAGAATCTAGCACAGCTGGTTCATGTTACTTCGGATCTGGTCAAGAAGTCTTATACATCTTTTGCCTCTTTTCTCGTTTCCAGTTCGCAACCGGCTTTGCGCTCTTCAACACCTGGAGACTTCATCACCCACAATGGGCTACGGAATTTCGTTGATAGCTTTCACCTCCCAACAAACGGTTCTGCGCGCAAGCCAGTCGTTGCGATAGCTCTTCCTAATGGTCCCTTGCTGGCGGCCACTTGCATCGCTGTCACTACCTACTATACGTCTGCGCCAATCAATCCCGCTGCCGGTGCAGAGCAATTCCGCGCAGACGTTCAGCAAGCTGGTGCGCAGTTCATACTGACCACAAGCGACGACTGTGAGAGGCTCGGCCTGAGAGATCCGTGGGTTGCCGCAGCAGGAATCGAAGTCTTCTTGATGAGATGGGACAACCGTGACGAGATCGATGTTCGAGACCTTGGGGGCTCTCCCCTCCCACTTCAAAGGCAAAAACCTAACTATAACGGGCCAGATGACTTTGGATTGATATTGTTCACGAGTGGCACTTCTGGCACCAAGAAGGTCGTGCCCTTGACAGTACATTCCATCATTGCCGGCATCAGCTTCGTGGTGGACTCTTGGAAATAAGCTTGGCACT。
聚苹果酸合成酶基因pma完整的编码区序列(其中包含三个内含子序列)如SEQ IDNO.5所示：
ATGAGCTCTCTACAGACCCCGTCAGAACTCGCAGTCTTGCTTGAGGGTTTCTGTTCTCTACCAATATCCGATATTAGCACACATGGAGAGTTCCAACGACTCCTACATTCGGATGCTGATAAAGAACGAATCCTAGAGTCGATACCAAGTACGCCGAATCCCTCCCATCGACCACTCGCTTTACTACATCTCTTGTTGAGCGAGCTACGGGGATCATGGCCGACATTCCCTCTGATCAGATGCTACACAAGGCTGTATCACTTGTTGCCAGAAGATGCAAAGTCTCGTCGGGATAAGAATCTAGCACAGCTGGTTCATGTTACTTCGGATCTGGTCAAGAAGTCTTATACATCTTTTGCCTCTTTTCTCGTTTCCAGTTCGCAACCGGCTTTGCGCTCTTCAACACCTGGAGACTTCATCACCCACAATGGGCTACGGAATTTCGTTGATAGCTTTCACCTCCCAACAAACGGTTCTGCGCGCAAGCCAGTCGTTGCGATAGCTCTTCCTAATGGTCCCTTGCTGGCGGCCACTTGCATCGCTGTCACTACCTACTATACGTCTGCGCCAATCAATCCCGCTGCCGGTGCAGAGCAATTCCGCGCAGACGTTCAGCAAGCTGGTGCGCAGTTCATACTGACCACAAGCGACGACTGTGAGAGGCTCGGCCTGAGAGATCCGTGGGTTGCCGCAGCAGGAATCGAAGTCTTCTTGATGAGATGGGACAACCGTGACGAGATCGATGTTCGAGACCTTGGGGGCTCTCCCCTCCCACTTCAAAGGCAAAAACCTAACTATAACGGGCCAGATGACTTTGGATTGATATTGTTCACGAGTGGCACTTCTGGCACCAAGAAGGTCGTGCCCTTGACAGTACATTCCATCATTGCCGGCATCAGCTTCGTGGTGGACTCTTGGGGACTGTCGGCATCGGATATCTGCCTCAACATGATGCCCTTATACCATGTGTAAGTATATGGAGACGCGGCTGCTATAGAGTACTTTCTGAGCTGATGATTGCAATAGCGGCGGCCTAGTCAGAAACATCTTTGCTCCAATCTTCTCGGGCGGCTCGACTGTCTGCTGTCCAGCGTTCGATCCCAGTTTGTTTTGGGATGTTGTTCAGGAGGTTCCGGTAACGTGGTACTACGCATCTCCGTCAATGCATTCGGTCATTCTGGCTGCAGCCT
CCGAGCGCCAGGACGCTTTGCAGCAGAACTGCATCAGATTAGCATGTAATGCTGCTGGA
GGTCTCTTGCCGTCGCTGGCGTGTCGACTTCGAGACACATTCAGTTGCACAGTACTCCC
AAGCTACGGAATGACTGAGTAAGGAGCATAGAGTTGATTTGCTGCTGGTGCAGGATGAT
GTTCTGACACGTGTATGCAGATGTATGCCGATATCAACGCCTCCCTTGGATTACCAGCTT
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TGGTTCGACACTGGCGACCTTGGCTATATGGACAAAGATGGCTACCTTTACATCACTGGT
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ACGCTATTATGCGTTTATCCATGTCGCCAGAGTCGCCCCTGCATGGGCGTGTCGCTCAAG
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CCCAAACGAACGCTCCTCGTGCCGACCTGAAGACGTTGCAGAACGCATTGCGGTCCTCT
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CAACAAAGTGTTGAGAATTAAATTGGGCCAGCGATGTGGCATTCCGGAGCTGACGGACG
ACACACCGTACTTGAGCAGGCATTGGCAGGCCATATGCCCCCTGCCAGACACGGATCTC
TCAATACCTATCAAGTCATCGCCCTGCACTATCGACTACAGCAAGCTGTCAGCCTGCGTG
AGCGATATGTTTCCAGCCAGTAGCTTCAGACACTACTGCAGACAGCATCATCTCAGGGG
GACCGTGGAGGCTTTCATTGCTCCCCTCGAGGGTAGCTCAGGGGCATCGAGGGCATCAT
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GATGATGCACTAGATGTACTCCTTGCAGGCATGGGCAGCGCTTCTTCAAAGAAACTCGA
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TGGACATTGAGCTCGACATTGACTTTTTCGCCCTTGGAGGAGACTCTTTGAAGGCAGGG
CGCCTGGCATCTGCCTTACGATCAACCTTCAATACCCAGATCCCAATCAGTCTCGTTTTC
AATCAAGGGACTGTTTCCGCTATTGCCGCCTTCATCGAGAAAACGGCAGACTTTACACC
TGAGCCTTCAGCTCAGGACGAGAGCTTTGGCTGTTCCAAGACCTACAGCTCCACGAATC
CTTTGCTCATGCTCATTCAACTCATCCCTCTTGCTGTTGTATATCCACTGCGCCGTGCCGT
CCAATGGACTGCATTCATCATCGTTATGAGTTATGTGCAGAGATGGCCGACGAATCAACA
CACGACCGGCCGGCTGCTTAACGTGGCGGTGTCGGTCATGTTTTCCAAGTTCATCATCA
GATGCGTTTCCCCTGTCTTTGGCATCATTGCCAAGTGGCTGATCATTGGCCGTTATCGCG
AAGGGCTCTATCCCATGTGGGGAGCATACCACACACGCTGGTGGATGGTCCAGAAGATT
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TCGCCTGATGGGAGCCAAGATTGGTAAAGACGTCAAGATTGCTGGGACATCGCTTGGGG
AGTGGGATCTTCTCGACATTCGAGACGGCGCAACCCTGACGCGCTGTCTTTGTCGTCCA
TTCGCTGCGGAAGGCAACACTTCGATGTATCTGGGCCAGATTGTCATTGGAGAAAACGC
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GGGCCAAACTCATCCAGCTGGGAGCTAGAGGATGCCGACGAGGAGAACCGAGACCTTT
CTCCTAGCCAAGCACCAAAACCTCATCTACTCCTCACCTGTTTCTTCACCGTCCCACTGG
TTCTACTCTCATGGATACTTTCGATTCTGCCCTGGATGGCTGGCCTTGTCGGTATGGTACA
AGACATGCCTTCAGAAGATGCCTCGACGGTGAGGGACATTCTGGACTGGTTCTCAGAGA
ACAAGAGGGTGGCATTTCACTCCCTTGCTCTGGTATTGCGATGCCTTGTCGGCCCCTTTA
TGTTCTTTGCGTTTGCCGTGCTGGTGAAATTGCTGCTGGATGCCGTACTGGGAAAGATGA
CCTTTACCTCCGCTAGGGACCGGGGCGCCATCGTCACCTGGCGAGCAGATCTGATGAAG
ACGCTGCTACCGGTGTCACGCCTGCACGATGTGACGTCGATGTTTGGACAACATTATGA
AGCGACCTCCATAGCCTTGCGGCTTCTAGGGGGCCGAATCGGCAAGCGAGTCTACTGGC
CGGGCACGGGTCCAAGCATCGGGGACTACCATCTCTTGGACGTTGGCAACGACGTCGTA
TTTGGCTCCCGAGCTCACCTCATGACCTCAGATGGCACTGGATCTGAAAAAATAACGAT
CCAAGACCGTGCCATGATCGCGGACAGAGTGTGCCTGCTTCCTGGGGTCACGGTTGGCG
AGCAAACCACAATGGGCTCTGGCGCCTTGACACGCCGGGGAAGTTCGTATCTACCAGG
AGGTACATATGTCGGCTCCAAGGGTCGTGATTGTATCCACCTCTCTGGCGGCCGCAGCAC
GGCACAGGATGAGAAGAACCCTGCTCGACACCGCATGCGGCACATGAGCAGTGATGAG
ACTCTCATGAGCACCAAGGCGGAACCGAAGAAGGGCGCCGTACGAACCCAAATCCAAC
GCTCCGGCAGTGAAGACACATTGGCAGAATTGCAGTCTTCAGAGGCGAAGCCAGGCAA
GTTGCGTGCTGGTAGCCCCAAAGAGCTGTGCACATCTTCTGGAAGCGATACGGACGACA
ACAGATCAGAAAAGGGGGAAGCAGACAGCATGTCCCCATTCGGACGGGCTTTCTATCTG
AAGCTTGCGCCTTACCGCGTTCTCGGGCCGCTGACCATCTTTTGCTACTCTTCGTTCATC
ACGGTCTTCAGCTCCTTTTACTGGAATGTGCCGATCGTTGCCTGCGCACAGCTGGTTGAC
TTGCTCATGAACCGGTTCATCCCCCGGGAGTCGGGGACCGCATACAACATCGCAGTTCT
TTTCTTGATGTCTTGGGCTGCCATTGCAGCGCTCTTCACCATAATGGCCGCCGTGGCGCT
CTTGATCGTCGTTGCGAGCAAGTGGATTCTGCTGGGCCGCCGCATGCCTGGTAACTATGA
CTGGGACAAGTCTTCCTATTGCCAGCGGTGGCAGCTTTTCTTGAGCATTGAGCGGCTTC
GACGCCATTGCTTCCATAGCCAAGGCGTCTTGGGGCTTCTCACGGGAACCCATTGGATT
GTGCTCTACTTTCGAGCGCTGGGAGCAGACATTGGCAAAGACTGTGCCCTTTTCGCCAA
TGGCAACCCCAGCCTCATGTTCACGGAGCCCGATTTGATAAAGCTCGGAGACCGAGTGA
CAATTGACGATGCCAGTGTCGTTGCTCACATCAATACCCGAGGCAAGTTTGATCTGAATA
GGCTGAGCATTGGGGATCGATGTGTGATGCGGTCAGGGAGCAGACTGCTTAGCGGCGCC
ACGATGAAGAACGACAGCTGTCTCTTGGAGCACACGCTCATTATGGGTGGCGATGTGGT
GGAAGAGAAGTGGACGATGCAGGGATGGCCTGCGGAGAGGTTTTCGGGGAAGCGAGCAGCGACTCATTGA。
聚苹果酸合成酶基因pma编码的聚苹果酸合成酶蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示：
MSSLQTPSELAVLLEGFCSLPISDISTHGEFQRLLHSDADKERILESIPSTPNPSHRPLALLHLLLSELRGSWPTFPLIRCYTRLYHLLPEDAKSRRDKNLAQLVHVTSDLVKKSYTSFASFLVSSSQPALRSSTPGDFITHNGLRNFVDSFHLPTNGSARKPVVAIALPNGPLLAATCIAVTTYYTSAPINPAAGAEQFRADVQQAGAQFILTTSDDCERLGLRDPWVAAAGIEVFLMRWDNRDEIDVRDLGGSPLPLQRQKPNYNGPDDFGLILFTSGTSGTKKVVPLTVHSIIAGISFVVDSWGLSASDICLNMMPLYHVGGLVRNIFAPIFSGGSTVCCPAFDPSLFWDVVQEVPVTWYYASPSMHSVILAAASERQDALQQNCIRLACNAAGGLLPSLACRLRDTFSCTVLPSYGMTECMPISTPPLDYQLDREGTSGISTGPEISILDWSDSGVSTGDVGRICVRGEPVFPGYLKPDGTLDRSPFNPSGWFDTGDLGYMDKDGYLYITGRSKEVINRGGELISPFEVENAIMRLSMSPESPLHGRVAQALAFSVPHDVLQEVVAVVLVTQTNAPRADLKTLQNALRSSLQQVKWPVLVTYMDDLPKKNNKVLRIKLGQRCGIPELTDDTPYLSRHWQAICPLPDTDLSIPIKSSPCTIDYSKLSACVSDMFPASSFRHYCRQHHLRGTVEAFIAPLEGSSGASRASYHQLDELKRKLIESTHGYMVPEHIHLLPNPLPLDRSGAVDDDALDVLLAGMGSASSKKLEASIEGRVRKVFGEILCQPPMDIELDIDFFALGGDSLKAGRLASALRSTFNTQIPISLVFNQGTVSAIAAFIEKTADFTPEPSAQDESFGCSKTYSSTNPLLMLIQLIPLAVVYPLRRAVQWTAFIIVMSYVQRWPTNQHTTGRLLNVAVSVMFSKFIIRCVSPVFGIIAKWLIIGRYREGLYPMWGAYHTRWWMVQKIVSICGKGLFNTNDSTKRLYYRLMGAKIGKDVKIAGTSLGEWDLLDIRDGATLTRCLCRPFAAEGNTSMYLGQIVIGENASIGISSIVAPGSVIPPNTCIGPNSSSWELEDADEENRDLSPSQAPKPHLLLTCFFTVPLVLLSWILSILPWMAGLVGMVQDMPSEDASTVRDILDWFSENKRVAFHSLALVLRCLVGPFMFFAFAVLVKLLLDAVLGKMTFTSARDRGAIVTWRADLMKTLLPVSRLHDVTSMFGQHYEATSIALRLLGGRIGKRVYWPGTGPSIGDYHLLDVGNDVVFGSRAHLMTSDGTGSEKITIQDRAMIADRVCLLPGVTVGEQTTMGSGALTRRGSSYLPGGTYVGSKGRDCIHLSGGRSTAQDEKNPARHRMRHMSSDETLMSTKAEPKKGAVRTQIQRSGTDSMSPFGRAFYLKLAPYRVLGPLTIFCYSSFITVFSSFYWNVPIVACAQLVDLLMNRFIPRESGTAYNIAVLFLMSWAAIAALFTIMAAVALLIVVASKWILLGRRMPGNYDWDKSSYCQRWQLFLSIERLRRHCFHSQGVLGLLTGTHWIVLYFRALGADIGKDCALFANGNPSLMFTEPDLIKLGDRVTIDDASVVAHINTRGKFDLNRLSIGDRCVMRSGSRLLSGATMKNDSCLLEHTLIMGGDVVEEKWTMQGWPAERFSGKRAATH。
众所周知，在本领域中，用性能相近或相似的氮基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。因此，聚苹果酸合成酶的氨基酸序列还包括具有与聚苹果酸合成酶相同功能的SEQID NO.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为l-30个，较佳地1-20个，更佳地l-10个，最佳地l-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为30个以内，较佳地为l0个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。
4)以LML2.0a为骨架构建表达载体，对LML2.0a进行PacI/XbaI双酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列pma-F；用SwaI进行单酶切，利用VazymeOne Step Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Ppdc和扩增产物pma-O1；构建出pma基因的过表达质粒pdcOEpma(图1中A)。
2、内源的聚苹果酸合成酶过表达载体2——cbhOEpma的构建
1)利用引物cbh-F和cbh-R，以里氏木霉基因组为模板扩增cbh1启动子Pcbh1序列(SEQ ID NO.7)。
cbh-F：5’-CTAGTGAGCTCATTTACCTGTAAAGCCGCAATGCAGC-3’(SEQ ID NO.15)；cbh-R：5’-GATGCGCAGTCCGCGGTTG-3’(SEQ ID NO.16)；
下划线为引物cbh-F的5’端的15bp插入序列——与质粒上完全相同的同源序列。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；10μM引物cbh-F/cbh-R各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
cbh1启动子Pcbh1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：
CTAGTGAGCTCATTTACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATC。
2)利用引物pma-C1和pma-R，以里氏木霉基因组为模板扩增聚苹果酸合成酶编码区N端部分基因序列pma-O(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，得到扩增产物pma-O2(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)。
pma-C1：5’-CGCGGACTGCGCATCATGAGCTCTCTACAGACCCCG-3’(SEQ ID NO.17)；
下划线为引物pma-C1的5’端15bp的插入序列——与cbh1启动子末端完全相同的同源序列。
扩增反应体系：10×PCRBuffer for KOD-Plus-Neo 5μL；2mM dNTPs 5μL；25mMMgSO43μL；10μM引物pma-C1/pma-R各1.5μL；基因组模板(～200ng)1μL；KOD-Plus-Neo(1U/μL)1μL。
反应程序：94℃2min；98℃10sec，58℃30sec，68℃30sec，运行30个循环；68℃5min。
pma-O2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：
CGCGGACTGCGCATCATGAGCTCTCTACAGACCCCGTCAGAACTCGCAGTCTTGCTTGAGGGTTTCTGTTCTCTACCAATATCCGATATTAGCACACATGGAGAGTTCCAACGACTCCTACATTCGGATGCTGATAAAGAACGAATCCTAGAGTCGATACCAAGTACGCCGAATCCCTCCCATCGACCACTCGCTTTACTACATCTCTTGTTGAGCGAGCTACGGGGATCATGGCCGACATTCCCTCTGATCAGATGCTACACAAGGCTGTATCACTTGTTGCCAGAAGATGCAAAGTCTCGTCGGGATAAGAATCTAGCACAGCTGGTTCATGTTACTTCGGATCTGGTCAAGAAGTCTTATACATCTTTTGCCTCTTTTCTCGTTTCCAGTTCGCAACCGGCTTTGCGCTCTTCAACACCTGGAGACTTCATCACCCACAATGGGCTACGGAATTTCGTTGATAGCTTTCACCTCCCAACAAACGGTTCTGCGCGCAAGCCAGTCGTTGCGATAGCTCTTCCTAATGGTCCCTTGCTGGCGGCCACTTGCATCGCTGTCACTACCTACTATACGTCTGCGCCAATCAATCCCGCTGCCGGTGCAGAGCAATTCCGCGCAGACGTTCAGCAAGCTGGTGCGCAGTTCATACTGACCACAAGCGACGACTGTGAGAGGCTCGGCCTGAGAGATCCGTGGGTTGCCGCAGCAGGAATCGAAGTCTTCTTGATGAGATGGGACAACCGTGACGAGATCGATGTTCGAGACCTTGGGGGCTCTCCCCTCCCACTTCAAAGGCAAAAACCTAACTATAACGGGCCAGATGACTTTGGATTGATATTGTTCACGAGTGGCACTTCTGGCACCAAGAAGGTCGTGCCCTTGACAGTACATTCCATCATTGCCGGCATCAGCTTCGTGGTGGACTCTTGGAAATAAGCTTGGCACT。
3)以LML2.0a为骨架构建表达载体，对其进行PacI/XbaI双酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入上游序列pma-F；用SwaI进行单酶切，利用Vazyme OneStep Clone Kit进行无缝连接，连入启动子Pcbh1和部分基因序列pma-O2；构建出pma基因的过表达载体cbhOEpma(图1中B)。
3、将过表达载体pdcOEpma和cbhOEpma转化里氏木霉，获得聚苹果酸合成酶编码基因过表达的优化菌株
1)将过表达载体pdcOEpma和cbhOEpma分别电转至农杆菌，然后将两种含有过表达载体的农杆菌分别与里氏木霉宿主菌株QM6a(ATCC 13631)、QM9414(ATCC 26921)、RUT-C30(ATCC 56765)、RL-P37(NRRL 15709)、NG14(ATCC 56767)和PC-3-7(ATCC 66589)在IM平板(Covert et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusariumcircinatum.Mycol.Res.105(3):259-264)共培养，进行根瘤农杆菌介导的结合转移，共培养两天后将转化子转接于含有头孢噻肟(300μg/mL)和潮霉素B(75μg/mL)的PDA平板中进行筛选，直至平板长出菌丝和孢子，然后进行验证。为使优化菌株中不含有外源基因，利用发明人之前建立的方案(Zhang et al.Light-inducible genetic engineering and controlof non-homologous end-joining in industrial eukaryotic microorganisms:LML3.0and OFN 1.0.Scientific Reports.2016,6:20761)将潮霉素B抗性标记缺失掉。
2)将上述平板长出的菌株分别接种至250mL三角瓶中的50mL发酵培养基1和发酵培养基2中，接种量为108个孢子/50mL培养基，28℃，200rpm培养，第5天取样测定聚苹果酸含量，来验证其是否为高产聚苹果酸的优化菌株。其中，pdcOEpma载体转化的优化菌株用发酵培养基1培养，cbhOEpma载体转化的优化菌株用发酵培养基2培养。
发酵培养结果显示，过表达聚苹果酸合成酶可以显著提高聚苹果酸的产量，pdcOEpma载体转化的优化菌株中pdcOEpma(QM6a)和pdcOEpma(QM9414)的聚苹果酸产量最高，分别达78.3g/L和74.4g/L(图2)；pdcOEpma载体转化的优化菌株中cbhOEpma(RUT-C30)和cbhOEpma(PC-3-7)的聚苹果酸产量最高，分别达86.5g/L和91.2g/L(图3)。
实施例2纯化聚苹果酸钙，水解聚苹果酸钙产生L-苹果酸
将优化菌株pdcOEpma(QM6a)接种至250mL三角瓶中的50mL发酵培养基1中，接种量为108个孢子/50mL培养基，28℃，200rpm培养5天后，收集发酵液，14000×g离心10min获得发酵上清液。上清液加入0.3倍体积的甲醇，混匀，离心10min去除沉淀，获得第二次的上清液。第二次的上清液中加入四倍体积的甲醇，混匀，离心10min获得第二次的沉淀，沉淀干燥后——即为聚苹果酸钙固体(如图4所示)。
称取该聚苹果酸钙固体1g，溶解于纯净水中，定容到10mL，即为100g/L的苹果酸钙溶液。取1mL上述苹果酸钙溶液置于6个螺纹玻璃管中，再分别加入1mL体积的2mol/LH2SO4，放入80℃，100rpm的水浴摇床，分别震荡酸水解0、0.5、1、2、4、12h后，液相测定水解液中L-苹果酸含量，结果见图5。聚苹果酸钙中单体分子量为136，L-苹果酸分子量为134。因此100g/L聚苹果酸钙完全水解后应该可得98.5g/L的L-苹果酸。
由图5可见，本发明获得的聚苹果酸钙，可在1小时内完全水解，转变为L-苹果酸。目前微生物发酵生产L-苹果酸的方案为：先发酵生产L-苹果酸钙，再用2mol/L稀硫酸酸化L-苹果酸钙获得L-苹果酸，与本发明所用的稀硫酸试剂量和水解时间相同。因此，本发明提供的聚苹果酸合成方法也可以用于获得L-苹果酸。
经过上述实施例可见，本发明经过非转基因的里氏木霉基因工程优化方法，成功构建了高产聚苹果酸的优化菌株。本发明的研究成果首次表明里氏木霉，能以葡萄糖、乳糖等常见碳源，直接发酵生产聚苹果酸，其最高产量可达90g/L以上。优化菌株来源于食品安全菌株，属于非转基因物种，其生产的聚苹果酸属于非转基因食品，避免了转基因涉及的安全性和政策的限制性等问题。并且实验证实了优化菌株发酵生产聚苹果酸的潜力，为聚苹果酸的工业化生产提供了优良的菌株，也为微生物发酵生产L-苹果酸提供了新方法。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种聚苹果酸合酶蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.一种如权利要求1所述聚苹果酸合酶蛋白的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一种生产聚苹果酸的里氏木霉工程菌的构建方法，其特征在于，包括将重组载体转化入里氏木霉宿主菌中，通过基因重组构建得到所述里氏木霉工程菌的步骤；
所述里氏木霉工程菌通过过表达权利要求1所述的聚苹果酸合酶蛋白来生产聚苹果酸；
所述重组载体的骨架载体为LML2.0a，包括pma基因N端片段；
所述pma基因N端片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述聚苹果酸合酶蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述重组载体含有依次连接的pma基因上游序列、启动子和所述pma基因N端片段。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述pma基因上游序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.7所示。
7.一种根据权利要求3-6任一项所述的构建方法构建得到的里氏木霉工程菌。
8.一种如权利要求7所述的里氏木霉工程菌在生产聚苹果酸或L-苹果酸中的应用。
9.一种生产聚苹果酸的方法，其特征在于，包括利用权利要求7所述的里氏木霉工程菌发酵生产得到聚苹果酸的步骤。
10.一种生产L-苹果酸的方法，其特征在于，包括利用权利要求7所述的里氏木霉工程菌发酵生产得到聚苹果酸，再将所述聚苹果酸水解，得到所述L-苹果酸的步骤。
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| CN107653272A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-02-02 | 天津北洋百川生物技术有限公司 | 一种半连续法生产不同分子量聚苹果酸的方法 |
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