CN117946888A - 一种乳酸片球菌、生产d-乳酸和合成d-丙交酯的工艺 - Google Patents
一种乳酸片球菌、生产d-乳酸和合成d-丙交酯的工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种乳酸片球菌、生产D‑乳酸和合成D‑丙交酯的工艺，属于生物炼制领域。所述乳酸片球菌的保藏编号为CCTCC NO:M 20221557。本发明还公开了一种利用木质纤维素原料生产D‑乳酸的方法和一种利用木质纤维素原料生产D‑丙交酯的方法。本发明中采用的工艺方法解决了现有技术中影响D‑乳酸发酵和D‑乳酸纯度的抑制物问题和D‑乳酸发酵品中所含非葡萄糖残糖的问题，获得的D‑乳酸使用常规催化剂经过缩聚、解聚和纯化后，可以获得高手性度的D‑丙交酯。
Description
技术领域
本发明属于生物炼制领域，具体涉及一种乳酸片球菌、生产D-乳酸和合成D-丙交酯的工艺。
背景技术
聚D-乳酸(poly(D-lactide)，PDLA)与聚L-乳酸形成的立构复合体能够有效提高生物可降解塑料聚乳酸的机械性、耐热性和耐水解性能。因此，PDLA对高性能的聚乳酸生产十分重要。D-丙交酯是合成PDLA的关键前体，D-丙交酯是由D-乳酸单体通过缩聚、解聚反应合成，D-乳酸的生产依赖于价格昂贵、资源有限的淀粉类粮食作物。因此，资源丰富、可再生的木质纤维素生物质是替代淀粉原料生产手性乳酸单体以合成D-丙交酯的最佳原料。
木质纤维素生物质生产的D-乳酸到D-丙交酯的合成的主要障碍主要有以下两点：(1)来自木质纤维素预处理过程中产生的抑制物(乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛)会抑制D-乳酸的发酵，并对D-乳酸的纯度造成不利影响；(2)木质纤维素来源的可发酵单糖主要是葡萄糖和非葡萄糖单糖(木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖)，非葡萄糖的利用速率和利用率低会导致大量残糖剩余，严重影响D-乳酸的纯度，阻碍了纤维素D-乳酸到D-丙交酯的聚合反应。因此，克服以上障碍对于商业化生产高性能的聚乳酸材料是十分必要的。
发明内容
为了解决现有技术中纤维素D-乳酸合成D-丙交酯面临木质纤维素的预处理会产生抑制物以及非葡萄糖的利用速率和利用率低，导致了D-乳酸发酵的抑制并影响D-乳酸的纯度，阻碍纤维素D-乳酸到D-丙交酯的聚合反应的技术问题，本发明提供一种乳酸片球菌、利用木质纤维素原料生产的D-乳酸和合成D-丙交酯的工艺。该工艺利用生物降解的方法基本完全脱除木质纤维素原料预处理过程中产生的影响乳酸发酵的抑制物(乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、4-羟基苯甲醛、香草醛和丁香醛)，同时使用的进化后的菌株乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ZY80高效代谢木质纤维素原料产生的五种主要可发酵单糖(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖)，实现了高浓度、极低残糖的纤维素D-乳酸的发酵。抑制物的脱除以及极低的残糖含量使得D-乳酸纯化的难度大大降低，经常规的纯化步骤后，纤维素手性D-乳酸成功合成了D-丙交酯，实现了利用木质纤维素来源的D-乳酸到D-丙交酯的合成。
为解决上述技术问题，本发明的第一方面提供一种乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，所述乳酸片球菌的保藏编号为CCTCC NO:M 20221557(乳酸片球菌ZY80)。
乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ZY80对预处理及脱毒后的木质纤维素原料进行D-乳酸的发酵，同步代谢可发酵单糖，使最终残糖量降至极低，解除残糖对于D-乳酸提纯的影响。
本发明的第二方面提供一种利用木质纤维素原料生产D-乳酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)木质纤维素原料进行预处理；
(2)生物降解：使用生物脱毒菌株对预处理后的物料进行生物降解以降低其中抑制物的含量；
(3)发酵：用乳酸片球菌对生物降解和预糖化后的物料进行发酵代谢，得到残糖浓度不高于1.8g/L的D-乳酸发酵液；所述生物降解和预糖化为在进行所述生物降解前对预处理后的物料进行预糖化，或者，在进行所述发酵前对所述生物降解后的物料进行预糖化；
(4)对得到的D-乳酸发酵液进行分离纯化，得到D-乳酸。
如本发明的第二方面所述的方法，所述预处理为干式稀酸预处理；和/或，所述生物脱毒菌株为树脂枝孢霉(Amorphotheca resinae)或宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)的任意一种，例如为保藏编号为CGMCC NO.7452的树脂枝孢霉ZN1或保藏编号为CGMCC NO.17665的宛氏拟青霉FN89。
如本发明的第二方面所述的方法，所述乳酸片球菌为如本发明的第一方面所述的乳酸片球菌(进化菌株Pediococcus acidilactici ZY80)。
本发明中，所述发酵方式包括但不限于分步糖化与发酵或同步糖化与共发酵。
在本发明的优选实施方案中，步骤(3)发酵过程中伴随着酶解过程，为同步糖化共发酵。其将木质纤维素产生的可发酵单糖(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖)基本转化为高浓度手性D-乳酸，解除残余单糖对D-乳酸提纯的影响。
如本发明的第二方面所述的方法，所述生物降解的时间为20-48h，和/或所述脱毒菌株的接种量为7％-20％，和/或所述生物降解的通气量为0.2-1.5vvm，和/或所述生物降解的温度为25-38℃。
于一实施方案中，当所述生物脱毒菌株宛氏拟青霉FN89时，在生物降解过程进行搅拌，搅拌的转速优选为600-800rpm。
如本发明的第二方面所述的方法，所述脱毒后的木质纤维素原料的固含量为20-30％(w/w)。
本发明中，使用脱毒菌株对预处理的木质纤维素原料中的抑制物进行生物降解，将抑制物(乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、香草醛和丁香醛)转化为二氧化碳和水，解除抑制物对D-乳酸发酵和D-乳酸提纯的影响。
于一实施方案中，在进行所述生物降解处理前先对预处理后的物料进行预糖化处理，即将预处理后的木质纤维素原料进行预糖化处理，再接入生物脱毒菌株进行生物降解以脱除抑制物，所述脱毒后的木质纤维素原料用于发酵。预糖化处理的条件为：温度45-52℃，pH 5-6，时间8-16h，纤维素酶的用量为2-6mg蛋白/g物料。
于一实施方案中，预糖化处理的搅拌转速为150-500rpm。
于一实施方案中，在进行所述发酵前对生物降解后的物料先进行预糖化处理，然后用于步骤(3)发酵。所述预糖化条件为：温度45-52℃，pH 5-6，时间6-10h，纤维素酶的用量为2-6mg蛋白/g物料。
于一实施方案中，预糖化处理的搅拌转速为150-500rpm。
如本发明的第二方面所述的方法，所述发酵的温度为40-50℃，pH为5.0-6.0。
于一实施方案中，发酵的搅拌转速为100-500rpm。
如本发明的第二方面所述的方法，发酵时加入营养盐。
在本发明的优选实施方案中，所述营养盐包括蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸氢二铵、一水硫酸锰和泛酸(B5)和烟酸(B3)。
于一实施方案中，所述营养盐包括8-12g/L酵母提取物，8-12g/L蛋白胨，8-12g/L柠檬酸氢二铵，0.2-0.3g/L一水硫酸锰，2.1-2.2mg/L泛酸(B5)和9.0-9.2mg/L烟酸(B3)。
在本发明的优选实施方案中，使用pH中和剂调节发酵液的pH，所述pH中和剂为氢氧化钙。
如本发明的第二方面所述的方法，所述木质纤维素原料选自小麦秸秆、玉米秸秆、稻草、蔗渣、棉花秸秆、玉米纤维、木材或木屑、竹材和竹屑中的一种或多种。
在本发明的优选实施方案中，所述木质纤维素原料为小麦秸秆。
如本发明的第二方面所述的方法，发酵生产的D-乳酸的手性纯度为99.00-99.99％，D-乳酸的浓度为110-140g/L。
发酵结束后几乎全部的木质纤维素来源的可发酵单糖葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖都被转化为手性D-乳酸，葡萄糖、木糖、总残糖浓度极低。
如本发明的第二方面所述的方法，所述分离纯化的步骤包括固液分离、脱色、结晶、酸解和脱盐。
在本发明的优选实施方案中：
所述固液分离为离心、压滤和/或抽滤；
所述脱色为使用脱色物质进行脱色，所述脱色物质为活性炭和/或硅藻土，所述脱色物质的添加量为1-12％，脱色的温度为55-70℃，脱色时长为1-3h；
所述结晶的浓度为90-210g/L，结晶的温度为-20～4℃；
所述酸解的介质为硫酸；和/或，
所述脱盐的方法为离子交换法、萃取法和/或电渗析法。
于一实施方案中，将发酵得到的D-乳酸发酵醪进行固液分离，通过离心、压滤、抽滤等方式中的一种或几种去除木质纤维素生物质残渣。
于一实施方案中，向得到的D-乳酸发酵液中加入1-12％脱色物质在55-70℃(水浴)脱色1-3h。
于一实施方案中，将得到基本无色的D-乳酸发酵液浓缩至100-200g/L后置于零下20℃至4℃条件下结晶得到乳酸钙晶体。
于一实施方案中，利用水或者无水乙醇对乳酸钙晶体进行清洗，以去除乳酸钙表面附着的杂质，得到乳酸钙固体。
于一实施方案中，将乳酸钙固体进行加热溶解后，利用硫酸溶液对乳酸钙溶液进行酸解，将乳酸钙置换成乳酸，减压抽滤得到粗纤维素D-乳酸。
于一实施方案中，采用离子交换法、萃取法、电渗析法等方法的一种或几种对得到的粗纤维素D-乳酸进行脱盐操作以去除盐离子。在所述分离纯化后最终获得的纤维素D-乳酸的质量纯度不低于98％。
本发明的第三方面提供一种利用木质纤维素原料生产D-丙交酯的方法，使用如本发明第二方面所述的方法得到的D-乳酸进行脱水反应、缩聚反应、解聚反应和提纯，得到D-丙交酯。
如本发明的第三方面所述的方法，所述缩聚反应的温度为120-140℃，和/或所述解聚反应的温度为230-240℃。
如本发明的第三方面所述的方法，所述脱水反应的温度为80-90℃，和/或绝对压力为0-0.01MPa。
如本发明的第三方面所述的方法，所述缩聚反应为加入催化剂后，将反应温度升至所述缩聚反应的温度，绝对压力为0.07-0.1MPa。
如本发明的第三方面所述的方法，所述催化剂为辛酸亚锡和/或氧化锌。
如本发明的第三方面所述的方法，所述解聚反应为将反应温度升高至所述解聚反应的温度，绝对压力为0-0.06Mpa。
如本发明的第三方面所述的方法，所述缩聚反应的温度为120-140℃，和/或所述解聚反应的温度为230-240℃。
于一实施方案中，将浓缩后的D-乳酸转移至反应釜中，并加入0.5～2％(w/w)的辛酸亚锡催化剂，升温到120-140℃，将绝对压力控制在0.07MPa至0.1MPa，保持1.5-3h，进行缩聚反应。将温度升至230-240℃，将绝对压力控制在0MPa至0.06MPa进行解聚反应得到粗D-丙交酯。
在本发明的优选实施方案中，D-丙交酯提纯的纯化方法为重结晶法、膜分离法、升华法和/或精馏法。
于一实施方案中，采用重结晶法、膜分离法、升华法、精馏法中的一种或几种对粗D-丙交酯进行精制，得到高纯度的D-丙交酯。
本发明中采用的生物降解方法解除了抑制物对D-乳酸发酵和D-乳酸纯度的影响，本发明的发酵方法获得了高浓度和极低残糖的纤维素手性D-乳酸，抑制物的彻底脱除以及极低的残糖含量使得D-乳酸纯化至聚合级纯度的难度大大降低。使用此方法获得的纤维素手性D-乳酸进行提纯、脱水、缩聚、解聚、提纯等步骤，实现了从木质纤维素原料合成D-丙交酯。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有技术相比，本发明具有以下积极效果：
本发明涉及到的抑制物生物降解方法可以脱除影响纤维素乳酸发酵的抑制物(乙酸、糠醛、5-羟甲基糠醛、香草醛和丁香醛等)，解除了抑制物对D-乳酸发酵和D-乳酸纯度的影响；发酵过程中使用的乳酸片球菌ZY80可以稳定地维持高效利用可发酵单糖，且对葡萄糖和木糖的利用速率稳定，同时代谢木质纤维素来源的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖，同时，在发酵时添加的优化营养盐使其最终残糖浓度降至极低，得到抑制物浓度不高于0.5g/L和残糖浓度不高于1.8g/L的D-乳酸发酵液，实现了高浓度、极低残糖、高手性的纤维素D-乳酸的发酵。
本发明中抑制物的去除与极低的残糖含量极大程度上降低了其对于D-乳酸分离纯化、聚合的影响，纯化后的D-乳酸成功合成了D-丙交酯，实现了木质纤维素生物质来源的D-乳酸到D-丙交酯的合成。
本发明对于商业化生产高质量及高性能的聚乳酸材料具有积极意义，有利于市场的接收、推广及应用。
附图说明
图1为纯化后的木质纤维素来源的D-丙交酯(白色固体)。
生物材料保藏信息
本发明的乳酸片球菌ZY80，已于2022年10月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为：CCTCC NO:M 20221557，培养物名称是ZY80，分类名称为：乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1使用树脂枝孢霉Amorphotheca resinae ZN1对预处理后的小麦秸秆进行生物降解脱除抑制物
小麦秸秆经干式稀酸预处理后，每克预处理后的物料(干基)中的抑制物含量为23.0mg乙酸，5.8mg糠醛，3.5mg 5-羟甲基糠醛，0.4mg 4-羟基苯甲醛，3.3mg丁香醛和3.3mg香草醛。将物料的pH调节至5，接入10％(w/w)的树脂枝孢霉ZN1(Amorphotheca resinaeZN1，保藏编号：CGMCC NO.7452，来源于专利CN202011536358.8)种子，取3kg混合均匀的小麦秸秆和树脂枝孢霉种子装入至生物反应器中，在通气量为0.8vvm，温度为28℃的条件下进行固态生物降解。在生物降解过程中，利用高效液相色谱法对物料中的主要抑制物含量进行测定，36h时，未检测到乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛，基于每克预处理后的物料(干基)计算的4-羟基苯甲醛，香草醛和丁香醛的含量不高于0.8mg，抑制物含量降至极低。
实施例2使用宛氏拟青霉Paecilomyces variotii FN89对预处理后的小麦秸秆进行酶解和生物降解脱除抑制物
小麦秸秆经干式稀酸预处理后，每克预处理后的物料(干基)中的抑制物含量为22.4mg乙酸，1.5mg糠醛，3.3mg 5-羟甲基糠醛，0.1mg 4-羟基苯甲醛，1.3mg丁香醛和0.3mg香草醛。将预处理后的麦秆(约1300g)分批加入5L反应器中，加入1340g水和4mg蛋白/g秸秆(干基)的纤维素酶，在50℃，pH 5.5，300rpm下进行12h的预糖化，得到麦秆水解液。之后进行生物脱毒过程，以10％(v/v)的接种量加入宛氏拟青霉FN89(Paecilomyces variotiiFN89，保藏编号：CGMCC NO.17665，来源于专利CN202011536358.8)孢子培养液，在37℃、750rpm、通气量为1vvm条件下对抑制物进行脱除。24h时，未检测到乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛，基于每克预处理后的物料(干基)计算的4-羟基苯甲醛，香草醛和丁香醛的含量不高于0.8mg，抑制物含量降至极低。
实验例3菌株ZY80在可发酵单糖混合糖条件下的D-乳酸发酵
工程菌株乳酸片球菌ZY15(Pediococcus acidilactici ZY15，保藏编号：CGMCCNO.13612，来源于专利CN201710330067.5)出现可发酵糖(如葡萄糖)代谢能力退化的现象，导致糖代谢速率降低、D-乳酸生成变缓。为了维持乳酸片球菌ZY15高效利用可发酵糖的能力，稳定其发酵性能，将出发菌株乳酸片球菌ZY15在混合糖条件下进行长时间的适应性进化培养，得到进化菌株乳酸片球菌ZY80(保藏编号：CCTCC NO:M 20221557)。
为检测进化菌株的发酵性能，在混合糖培养基条件下进行了D-乳酸的发酵。发酵发酵罐内进行，发酵培养基为含70g/L葡萄糖，50g/L木糖，8g/L阿拉伯糖，2g/L甘露糖和2g/L半乳糖的MRS培养基，以10％(v/v)接种量接入驯化菌株种子液后，发酵条件控制在42℃，150rpm，pH值控制在5.5，发酵时间为72h。种子液的培养方法为：将冻存的菌株接种至含可发酵单糖混合培养基中，培养12h后以10％(v/v)接种量将菌液接种至MRS中，培养5h后将菌液以10％(v/v)接种量接入发酵罐中。发酵至D-乳酸产量基本不变，发酵结束。
与出发菌株乳酸片球菌ZY15相比，进化菌株乳酸片球菌ZY80的葡萄糖、木糖代谢速率和D-乳酸生产明显加快。以发酵前24h的数据为例(表1)，进化菌株的葡萄糖、木糖代谢速率和L-乳酸生成速率分别为2.4g/L/h，1.3g/L/h和2.7g/L/h，均高于出发菌株的1.8g/L/h，1.1g/L/h和2.3g/L/h，分别提高了33.3％，18.2％和17.4％。与出发菌株相比，进化菌株乳酸片球菌ZY80的葡萄糖、木糖代谢和乳酸生成加快，其发酵性能也更为稳定。
表1发酵前24h平均耗糖速率和产D-乳酸速率
表2发酵结束后发酵液中残糖和D-乳酸产量
实施例4利用预处理及脱毒后麦秆进行纤维素D-乳酸的同步糖化与共发酵
如实施例2所述，小麦秸秆在经过预糖化和宛氏拟青霉FN89生物脱毒后，得到的麦秆水解液转入至发酵罐中，以10％(v/v)的接种量接入培养好的乳酸片球菌ZY80种子液和营养盐(10g/L酵母提取物、15g/L蛋白胨、2g/L柠檬酸氢二铵以及0.25g/L一水硫酸锰)，进行同步糖化与共发酵。发酵条件为42℃，300rpm，pH 5.5。经过96h的同步糖化共发酵后，经检测，发酵液中剩余的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖+甘露糖和半乳糖分别为2.73，1.19，0，0.20g/L，最终得到的D-乳酸浓度为90.4g/L，其光学纯度为99.0％。
实施例5补加常规营养盐时，利用预处理及脱毒后麦秆进行纤维素D-乳酸的同步糖化与共发酵
如实施例1所述，麦秆经预处理、树脂枝孢霉Amorphotheca resinae ZN1脱毒后的麦秆加入反应器中，加入1200g水和4mg蛋白/g秸秆(干基)的纤维素酶，在50℃、150rpm、pH5.5下进行6h的预糖化；将温度降低至42℃后，将培养好的进化菌株乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ZY80种子液按照10％(v/v)的接种量接入到反应器中，同时加入常规营养盐(10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，2g/L柠檬酸氢二铵以及0.25g/L一水硫酸锰)，在42℃、150rpm下进行同步糖化与共发酵。在发酵过程中发酵pH维持在5.5。
如表3所示，经过72h的同步糖化共发酵后，木质纤维素来源的单糖基本被转化为高浓度的手性D-乳酸，经检测，发酵液中剩余的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖+甘露糖和半乳糖分别为2.7，6.9，0，0.4g/L，最终总残糖浓度为10g/L，最终得到的D-乳酸浓度为119.9g/L，其光学纯度为99.00％。
表3发酵结束后发酵液中残糖和D-乳酸产量
实施例6补加优化后的营养盐时，利用预处理及脱毒后麦秆进行纤维素D-乳酸的同步糖化与共发酵
如实施例1所述，麦秆经预处理、树脂枝孢霉Amorphotheca resinae ZN1脱毒后的麦秆加入反应器中，加入1200g水和4mg蛋白/g秸秆(干基)的纤维素酶，在50℃、150rpm、pH5.5下进行6h的预糖化；将温度降低至42℃后，将培养好的进化菌株乳酸片球菌Pediococcus acidilactici ZY80种子液按照10％(v/v)的接种量接入到发酵罐中，同时加入优化后的营养盐(10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L柠檬酸氢二铵，0.25g/L一水硫酸锰，2.14mg/L泛酸(B5)和9.10mg/L烟酸(B3))，在42℃、150rpm下进行同步糖化与共发酵。在发酵过程中发酵pH维持在5.5。
如表4所示，经过72h的同步糖化共发酵后，木质纤维素来源的单糖基本被转化为高浓度的手性D-乳酸，经检测，发酵液中剩余的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖+甘露糖和半乳糖分别只有0.7，0.6，0.2，0.30g/L，最终总残糖浓度为1.8g/L，最终得到的D-乳酸浓度达到了128.1g/L，其光学纯度达到了99.02％。
表4发酵结束后发酵液中残糖和D-乳酸产量
实施例7纤维素手性D-乳酸的分离纯化
在经过同步糖化与共发酵后，将得到的纤维素D-乳酸发酵液高速离心(10,000rpm,10min)使得纤维素乳酸发酵液与木质纤维素生物质残渣分离。
使用10％(w/v)活性炭对得到的乳酸钙发酵液在60℃脱色1.5h后，将脱色后的乳酸钙发酵液浓缩至100-200g/L，而后于4℃结晶。用水对D-乳酸钙晶体进行洗涤。
在D-乳酸钙晶体中加入适量水，加热溶解，向D-乳酸钙溶液中加入硫酸将乳酸钙置换成乳酸，抽滤得到粗纤维素手性D-乳酸。
将得到的粗纤维素手性D-乳酸泵入装有阳离子交换树脂的层析柱中，以去除盐离子，收集到的流出液为高纯度的纤维素手性D-乳酸。
表5木质纤维素手性D-乳酸进行分离纯化过程中各个物料的颜色状态
分别对精制得到的纤维素D-乳酸中的残糖、蛋白质、乙酸、总酚含量和盐离子进行测定，结果如表6所示。
表6纤维素手性D-乳酸的纯度分析
*水不计入D-乳酸纯度分析
由表6可知，经纯化步骤后，乳酸中的残糖、蛋白质、乙酸和总酚杂质均被完全去除。通过计算可知，纤维素手性D-乳酸的纯度不低于98.8％。
实施例8利用纯化后的纤维素D-乳酸合成D-丙交酯及D-丙交酯的表征分析
通过旋转蒸发仪将纯化后得到的纤维素手性D-乳酸进行脱水操作，以去除D-乳酸中的游离水。
将浓缩后的D-乳酸转移至反应釜中，并加入1％(w/w)的辛酸亚锡催化剂，升温到120-140℃，将绝对压力控制在0.07MPa至0.1MPa，保持1.5-3h，进行缩聚反应。将温度升至230-240℃，将绝对压力控制在0MPa至0.03MPa进行解聚反应得到粗D-丙交酯。
向得到的粗D-丙交酯中加入2-3倍体积的无水乙醇，在50℃加热溶解，然后置于4℃下进行重结晶，减压抽滤，得到纯化后的D-丙交酯，图1为纯化后的木质纤维素来源的D-丙交酯图片。
对合成的D-丙交酯进行了结构及性质的鉴定：
通过差示扫描量热仪(Perkinelmer,DSC8500,USA)测得木质纤维素来源的D-丙交酯的熔点为96.1℃，与文献报道一致(95-98℃)。
利用ESI-高分辨飞行时间质谱仪(Waters,XEVO G2 TOF,USA)对木质纤维素来源的D-丙交酯的分子量进行测定，经计算，D-丙交酯的分子量为144.0581，与购买的D-丙交酯的分子量测定结果完全一致。
此外，称取一定质量的木质纤维素来源的D-丙交酯，利用元素分析仪(ELEMENTAR,Vario EL cube,Germany)对其C、H元素含量进行测定，结果显示：在纤维素D-丙交酯中含有49.72±0.00％的C元素、5.49±0.01％的H元素，基本符合理论值(C:50.00％，H:5.60％)。
利用装有手性柱Superchiral S-IG(Chiralway Biotech Co.,Shanghai,China)的气相色谱进行D-丙交酯手性的测定，计算得出D-丙交酯的手性纯度为99.99％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。
Claims (15)
1.一种乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，其特征在于，所述乳酸片球菌的保藏编号为CCTCC NO:M 20221557。
2.一种利用木质纤维素原料生产D-乳酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对木质纤维素原料进行预处理；
(2)生物降解：使用生物脱毒菌株对预处理后的物料进行生物降解以降低其中抑制物的含量；
(3)发酵：用乳酸片球菌对生物降解和预糖化后的物料进行发酵代谢，得到残糖浓度不高于1.8g/L的D-乳酸发酵液；所述生物降解和预糖化为在进行所述生物降解前对预处理后的物料进行预糖化，或者，在进行所述发酵前对所述生物降解后的物料进行预糖化；
(4)对得到的D-乳酸发酵液进行分离纯化，得到D-乳酸。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预处理为干式稀酸预处理；和/或，
所述生物脱毒菌株为树脂枝孢霉(Amorphotheca resinae)或宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii)的任意一种，例如为保藏编号为CGMCC NO.7452的树脂枝孢霉ZN1或保藏编号为CGMCC NO.17665的宛氏拟青霉FN89；和/或，
所述乳酸片球菌为如权利要求1所述的乳酸片球菌；和/或，
发酵过程中伴随着酶解过程，为同步糖化与共发酵。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物降解的时间为20-48h，和/或所述脱毒菌株的接种量为7％-20％，和/或所述生物降解的通气量为0.2-1.5vvm，和/或所述生物降解的温度为25-38℃。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物降解后的木质纤维素原料的固含量为20-30％(w/w)。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行所述生物降解处理前先对预处理后的物料进行预糖化处理，预糖化处理的条件为：温度45-52℃，pH 5-6，时间8-16h，纤维素酶的用量为2-6mg蛋白/g物料。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行所述发酵前对生物降解后的物料先进行预糖化处理，然后用于步骤(3)发酵；预糖化条件为：温度45-52℃，pH 5-6，时间6-10h，纤维素酶的用量为2-6mg蛋白/g物料。
8.如权利要求2～7任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为40-50℃，pH为5.0-6.0；和/或，发酵时加入营养盐；
较佳地，所述营养盐包括蛋白胨、酵母提取物、柠檬酸氢二铵、一水硫酸锰和泛酸和烟酸；
更佳地，所述营养盐包括8-12g/L酵母提取物，8-12g/L蛋白胨，8-12g/L柠檬酸氢二铵，0.2-0.3g/L一水硫酸锰，2.1-2.2mg/L泛酸和9.0-9.2mg/L烟酸。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素原料选自小麦秸秆、玉米秸秆、稻草、蔗渣、棉花秸秆、玉米纤维、木材或木屑、竹材和竹屑中的一种或多种；
优选地，所述木质纤维素原料为小麦秸秆。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，生产的D-乳酸的手性纯度为99.00-99.99％，D-乳酸的浓度为110-140g/L。
11.如权利要求2～10任一项所述的方法，其特征在于，所述分离纯化的步骤包括固液分离、脱色、结晶、酸解和脱盐；优选地，
所述固液分离为离心、压滤和/或抽滤；
所述脱色为使用脱色物质进行脱色，所述脱色物质为活性炭和/或硅藻土，所述脱色物质的添加量为1-12％，脱色的温度为55-70℃，脱色时长为1-3h；
所述结晶的浓度为90-210g/L，结晶的温度为-20～4℃；
所述酸解的介质为硫酸；和/或，
所述脱盐的方法为离子交换法、萃取法和/或电渗析法。
12.一种利用木质纤维素原料生产D-丙交酯的方法，其特征在于，将如权利要求2～11任一项所述的方法得到的D-乳酸进行脱水反应、缩聚反应、解聚反应和提纯，得到D-丙交酯。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述缩聚反应的温度为120-140℃，和/或所述解聚反应的温度为230-240℃；
优选地，所述缩聚反应为加入催化剂后，将反应温度缓慢升温至所述缩聚反应的温度，绝对压力为0.07-0.1Mpa；和/或所述解聚反应为将反应温度迅速升高至所述解聚反应的温度，绝对压力为0-0.06pa。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述脱水反应的温度为80-90℃，和/或绝对压力为0-0.01MPa。
15.如权利要求12～14任一项所述的方法，其特征在于，所述提纯采用重结晶法、膜分离法、升华法和/或精馏法。
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