CN117946209A - 肿瘤靶向分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光造影剂、放射性药物及核医学技术领域，具体涉及肿瘤靶向分子探针及其制备方法和应用。本发明所提供的分子探针是以赖诺普利衍生物为原料制备的近红外荧光化合物或者放射性化合物。本发明所提供的分子探针是一种通过赖诺普利衍生物制备的影像探针，可用于恶性肿瘤的近红外荧光成像和核医学成像。该分子探针是通过赖诺普利衍生物共价偶联近红外荧光染料可作为肿瘤靶向荧光分子探针，用于肿瘤边界的实时可视化，具有提高手术精准度的优点。该分子探针是通过赖诺普利衍生物偶联诊断/治疗功能的放射性核素，可实现在体实时诊断和精准治疗恶性肿瘤。
Description
技术领域
本发明属于于荧光造影剂、放射性药物及核医学技术领域，具体涉及肿瘤靶向分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤己经成为威胁人类健康和生命的罪魁祸首。因此，肿瘤的诊断以及针对肿瘤有效的治疗显得尤为重要并且迫切。众所周知，肿瘤靶向的分子影像探针是肿瘤诊断、分期及术中导航的有利的工具。其中，肿瘤特异性靶向的配体是肿瘤靶向分子探针的关键所在。目前设计筛选靶向配体的方法主要包括计算机辅助药物设计、先导化合物修饰改造、从代谢产物中发现、药物合成中间体中发现、组合化学和高通量筛选、天然化合物中分离提取、噬菌体展示库筛选以及“老药新用”。不可否认，“老药新用”是一个重要的药物发现途径，1988诺贝尔生理学或医学奖获得者詹姆斯·布莱克提出，新药发现的最佳之路起始于老药。“老药”已经有确定的药代动力学信息和毒理学信息，安全性高是其最明显的特点，只需验证其对新适应症的有效性。追溯“老药新用”的发展历程，临床应用的偶然发现促成了许多成功的经典案例。詹姆斯·布莱克开发的非选择性β受体拮抗剂普萘洛尔和第一个组胺H2受体拮抗剂西咪替丁是“老药新用”的典型例子。普萘洛尔是治疗冠心病和高血压的经典药物，现被用于骨质疏松症和黑色素瘤的治疗；西咪替丁是治疗消化性胃溃疡的革命性药物，经证明适用于治疗慢性阻塞性肺疾病、HIV病毒感染等；《Nature》指出二甲双胍与另一种“老药新用”血红素联用，可用于治疗三阴乳腺癌；又如俗称“砒霜”的三氧化二砷是一种剧毒，最新研究发现其可用于治疗急性早幼粒细胞白血病；前列腺特异性抗原(PSMA)抑制剂早期应用于神经学领域，近年来核素及荧光标记的PSMA小分子抑制剂广泛用于原位及转移性前列腺癌的精准诊疗中。由此可见，“老药新用”策略在药物开发中具有重要指导意义，因此运用“老药新用”策略筛选肿瘤的靶向药物是一种快速有效的方法。
赖诺普利，为血管紧张素转换酶抑制剂，用于治疗原发性高血压及肾血管性高血压，可单独使用或与其他类的抗高血压药如利尿药合并使用。《国家基本药物目录(2018年版)》将其列入心血管系统用药的基本用药目录。
利用赖诺普利来制备肿瘤的靶向药物，比如将其制备成分子探针是一种行之有效的方法。现有的利用“老药”制备的肿瘤靶向分子探针只能针对某一种或者几种特定的肿瘤，不具有广谱肿瘤靶向性。
发明内容
为解决现有技术现有的利用“老药”制备的肿瘤靶向分子探针只能针对某一种或者几种特定的肿瘤，不具有广谱肿瘤靶向性的问题，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种肿瘤靶向分子探针，所述分子探针是以赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2为原料制备的近红外荧光化合物或者放射性化合物，所述分子探针的结构如下：
其中，R选自R1、R2、R3、R4中的任意一种，R1、R2、R3、R4的结构如下：
M为荧光标记、金属螯合剂与金属放射性核素络合物、非金属放射性核素18F及11C中的任意一种。
优选地，所述荧光标记为有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物或生物发光分子中的任意一种。
优选地，所述荧光标记包括MPA、IRDye800、Cy7.5、ICG、Cy5.5、FD1080、CH1055中的任意一种。
优选地，所述金属螯合剂为联肼尼克酰胺、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸、7-[(4-羟基丙基)亚甲基]-1,4,7-三氮杂化壬烷-1,4-二乙酸、1,4,7,10-四氮杂环四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、巯基乙酰三甘氨酸、二乙基三胺五乙酸或它们的组合修饰中的任意一种。
优选地，所述近红外荧光化合物包括Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA及Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA；所述放射性化合物包括Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc、Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc、Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc及Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc。
本发明还提供了所述近红外荧光化合物的制备方法，包括如下步骤：
近红外荧光染料MPA的合成：以冰醋酸、对肼基苯磺酸、甲基异丙基酮、醋酸钠、邻二氯苯、1,3-丙磺酸内脂、N-[(3-(anilinomethylene)-2-chloro-1-cyclohexen-1-yl)methylene]-anilinemonohydrochlorid为原料反应得到中间体MPA-Cl；中间体MPA-Cl在三乙胺存在下于溶剂DMF中与巯基丙酸反应，反应完成后得到目标化合物即为所述近红外荧光染料MPA；
将得到的近红外染料MPA溶于DMF中，然后加入等摩尔量的缩合剂EDCI和NHS，室温反应后往溶液中加入赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2及有机碱DIPEA，室温反应完成后，得到Lisinopril-哌嗪乙酸-R-MPA，即所述近红外荧光化合物。
本发明还提供了所述放射性化合物的制备方法，包括如下步骤：
双功能螯合剂HYNIC-NHS的合成：将6-氯烟酸和80％水合肼加入到乙醇中，将反应完成后得到的粘稠物加入到蒸馏水中，调PH＝5.3～5.7，析出固体为6-联肼烟酸；
6-联肼烟酸和对氨基苯甲醛加入到二甲基亚砜中，反应完成后加入到水中析出，得到的固体与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基琥珀酰亚胺一起加入到DMSO中室温反应，反应完成后加入水中析出固体，得到中间体HYNIC-NHS；
Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC的合成：将中间体HYNIC-NHS溶于DMF中，加入1.5倍摩尔量的Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2，然后再加入3倍摩尔量的DIPEA，室温反应完成后得到Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC；
Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC-99mTc的合成：分别取三苯基磷三间磺酸钠溶液、三甲基甘氨酸溶液、丁二酸-丁二酸钠缓冲液分别和所述Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC混合，然后加入Na 99mTcO4于100℃金属浴加热反应，待反应结束后冷却至室温，得到Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC-99mTc，即所述放射性化合物。
本发明还提供了所述肿瘤靶向分子探针在制备肿瘤分子成像显像剂中的应用，所述的分子成像包括在各种细胞、组织或其他活体生物成像。
优选地，所述显像剂为肿瘤边界精准定位或术中手术导航光学显像试剂。
根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌。
本发明提供了一种肿瘤靶向分子探针及其制备方法和应用，
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种肿瘤靶向分子探针，该肿瘤靶向分子探针具有安全性高，且广谱肿瘤靶向性的优点。本发明提供的该分子探针可靶向至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有较好的摄取和滞留能力，具有高的肿瘤与正常组织信噪比，适合用于制备肿瘤术中手术导航试剂及制备放射性药物，用于肿瘤核医学诊断及精准放疗。
本发明提供的肿瘤靶向分子探针包括荧光与放射性核素探针，该分子探针是以赖诺普利衍生物为原料制备的分子探针，又称为基于赖诺普利衍生物的分子探针，该分子探针与现有技术相比的有益效果为：
1、本发明研究发现，基于赖诺普利衍生物的分子探针能靶向多种肿瘤，且在正常肝组织中无明显摄取，另外，与未经改造的赖诺普利分子探针相比，经修饰改造的赖诺普利衍生物分子探针具有更低的肾脏信号摄取。在借助赖诺普利衍生物能靶向肿瘤的性质，通过偶联荧光染料制备荧光探针，可在术中引导外科医生精确定位肿瘤边界，达到对肿瘤精准切除的目的。另外，赖诺普利衍生物还可偶联具有诊断/治疗功能的放射性核素构建相应的放射性药物，可达到对肿瘤诊断和精准放射治疗的目的。
2、基于赖诺普利衍生物制备的分子探针经体内光学和放射性核素显像结果证实对多种肿瘤具有优异的靶向效果，包括肝癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌等。所述探针可特异性靶向肿瘤部位的特性将有可能实现对恶性肿瘤的核医学诊断、治疗以及光学手术导航。
3、本发明中使用了稳定性以及水溶性更理想的近红外荧光染料MPA作为光学显像基团，改善了药物在体内的药代动力学。
4、本发明中使用HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用Tricine和TPPTS作为协同配体从而使“99mTc-HYNIC”核具有更好的体内外稳定性。
附图说明
图1为本发明中分子探针的结构示意图；
图2为本发明中R的结构示意图；
图3为本发明中近红外荧光染料MPA的合成路线；
图4为本发明中Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-4-MPA的化学结构，其中，A为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA的结构；B为Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA的结构；C为Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA的结构；D为Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA的结构。
图5为本发明中Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-3-MPA质谱分析结果，其中，A为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA的质谱结果；B为Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA的质谱结果；
图6为本发明中Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA的质谱结果；
图7是本发明中Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC的化学结构和质谱分析结果，其中，其中，A为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC的化学结构；B为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC的质谱分析结果；
图8是本发明中制备的荧光化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-4-MPA在荷瘤鼠体内的4h荧光成像(肿瘤种植在腋下)。A为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在肝癌MHCC97-H荷瘤鼠体内的荧光成像；B为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在结直肠癌HT29荷瘤鼠体内的荧光成像；C为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在乳腺癌MDA-MB-231荷瘤鼠体内的荧光成像；D为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在乳腺癌MCF-7荷瘤鼠体内的荧光成像；E为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在结直肠癌HCT116荷瘤鼠体内的荧光成像；F为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在胃癌MG3-803荷瘤鼠体内的荧光成像；G为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在肝癌Huh-7荷瘤鼠体内的荧光成像；H为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在胰腺癌MiaPaCa-2荷瘤鼠体内的荧光成像；I为Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA在肝癌MHCC97-H荷瘤鼠体内的荧光成像；J为Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA在肝癌Huh-7荷瘤鼠体内的荧光成像；K为Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA在肝癌MHCC97-H荷瘤鼠体内的荧光成像；L为Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA在肝癌Huh-7荷瘤鼠体内的荧光成像；M为Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA在肝癌Huh-7荷瘤鼠体内的荧光成像；N为Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA在胰腺癌SW1990荷瘤鼠体内的荧光成像；
图9是本发明中荧光探针Lisinopril-PEG4-MPA的质谱图；
图10是本发明中荧光探针Lisinopril-PEG4-MPA在肝癌MHCC97-H荷瘤鼠体内的荧光成像；
图11是本发明中制备的放射性化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-4-HYNIC-99mTc在荷瘤鼠体内1h的SPECT-CT成像(肿瘤种植在腋下)。A为Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc在肝癌MHCC97-H荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像；B为Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc在胰腺癌SW1990荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像；C为Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc在乳腺癌MDA-MB-231荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像；D为Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc在胃癌MGC-803荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种肿瘤靶向分子探针，所述分子探针是以赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2为原料制备的近红外荧光化合物或者放射性化合物。分子探针的结构如图1所示。其中，R选自R1、R2、R3、R4中的任意一种，R1、R2、R3、R4的结构如图2所示；M为荧光标记、金属螯合剂与金属放射性核素络合物、非金属放射性核素18F及11C中的任意一种。
荧光标记为有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物或生物发光分子中的任意一种。具体的，荧光标记包括近红外一区荧光染料MPA、IRDye800、Cy7.5、ICG、Cy5.5或近红外二区荧光染料FD1080和CH1055中的任意一种。
金属螯合剂为联肼尼克酰胺、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸、7-[(4-羟基丙基)亚甲基]-1,4,7-三氮杂化壬烷-1,4-二乙酸、1,4,7,10-四氮杂环四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、巯基乙酰三甘氨酸、二乙基三胺五乙酸或它们的组合修饰中的任意一种。
其中，以赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2为原料制备的近红外荧光化合物包括Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA及Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA，它们的结构如图4所示。上述近红外荧光化合物即为近红外荧光分子探针(质谱分析结果参见图5～6)。
以赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2为原料制备的放射性化合物包括Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc、Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc、Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc及Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc。Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc的结构如图7所示。上述放射性化合物即为放射性探针。
下面以具体实施例对本发明进行详细说明：
以下实施例中涉及的实验动物、试剂和用品如下：
1、实验动物
实施例中所有的荷瘤鼠模型均来源于江西中医药大学癌症研究中心实验室，肿瘤模型均通过向裸鼠腋下注射约5×106肿瘤细胞获得，裸鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
所有的肿瘤模型鼠包括：肝癌MHCC97-H荷瘤鼠、结直肠癌HT29荷瘤鼠、乳腺癌MDA-MB-231荷瘤鼠、乳腺癌MCF-7荷瘤鼠、直肠癌HCT116荷瘤鼠、胃癌MGC-803荷瘤鼠、肝癌Huh-7荷瘤鼠、胰腺癌MiaPaCa-2荷瘤鼠、胰腺癌SW1990荷瘤鼠。
2、实验试剂和用品
化合物03(甲基异丙基酮)、化合物02(苯肼-4-磺酸)、冰醋酸购自、乙酸乙酯、化合物05(1,3-丙基磺酸内酯)、邻二氯苯、甲醇、异丙醇、化合物07((E)-2-氯-3-(羟甲烯基)环己烯-1-甲醛)、乙醇、三乙胺、DMF(:N,N-二甲基甲酰胺)、赖诺普利二水合物、哌嗪-1,4-二乙酸、EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)、赖氨酸、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、三氟乙酸(TFA)、6-氯烟酸、80％水合肼、对氨基苯甲醛、TPPTS(三苯基磷三间磺酸钠)、Tricine(三甲基甘氨酸)、生理盐水均购自上海毕得医药科技有限公司。ZORBAX SB-C18半制备柱(9.4×250mm，5μm)购自安捷伦公司。
实施例1
一种近红外荧光化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA的制备方法，包括如下步骤：
(1)近红外荧光染料MPA的合成(近红外荧光染料MPA的合成路线如图3所示)
称取市售的10g化合物03(甲基异丙基酮)，量取17.2mL的化合物02(苯肼-4-磺酸)及30.0mL冰醋酸/氮气保护下加热至回流，回流3小时后，薄层色谱监测，待原料反应完全后，停止加热，降至室温后继续搅拌，即可析出大量粉色固体。待析晶完全后过滤，滤饼用少量乙酸乙酯洗涤，滤饼干燥后得11.5g粉红色固体，即化合物04。然后称取2.0g化合物04及3.0g化合物05(1,3-丙基磺酸内酯)及20.0mL邻二氯苯/氮气保护下加热到180℃，过程采用HPLC监测反应程度，待原料反应完全后，停止加热，降至室温后，倾倒出清液，固体以甲醇-异丙醇打浆后过滤得2.0g粉红色固体，即化合物06。1.0g化合物06，238.0mg化合物07((E)-2-氯-3-(羟甲烯基)环己烯-1-甲醛)以及20.0mL乙醇/氮气保护下加热至回流，反应过程采用HPLC跟踪，待原料反应完全后，停止加热，降至室温后减压浓缩，硅胶柱层析后得500.0mg目标化合物08。500.0mg化合物08与89.0μL三乙胺在10.0mL有机溶剂DMF中氮气保护下室温反应过夜(≥12h)，HPLC跟踪，待化合物08反应完全后，将溶剂浓缩干后硅胶柱层析，得目标化合物200.0mg MPA。所有的中间体及目标化合物MPA均经质谱及核磁确认了其结构。目标化合物MPA即近红外荧光染料MPA。
(2)Lisinopril-哌嗪乙酸的合成
将100.0mg市售赖诺普利二水合物与250.0mg哌嗪-1,4-二乙酸在DMF溶液于60℃反应5小时，反应完成后经制备液相纯化并经质谱确证后得到关键中间体95.0mgLisinopril-哌嗪乙酸。
(3)赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-NH2的合成
将20.0mg关键中间体Lisinopril-哌嗪乙酸溶于DMF中，然后加入6.5mg的缩合剂EDCI和3.9mg的NHS，室温反应1小时后，往反应液中加入1.5倍摩尔当量的赖氨酸侧链氨基被Boc保护的R1-Boc及2倍摩尔当量的有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应完成后通过制备液相分离纯化并冻干，冻干完成后通过加入2.0mL的三氟乙酸室温震荡脱掉赖氨酸侧链氨基保护基Boc，最后分离纯化得到相应的赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-NH2。
(4)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA的合成
将5.0mg近红外染料MPA溶于DMF中，然后加入1.0mg缩合剂EDCI和0.6mg的NHS，室温搅拌反应1小时后往溶液中加入1.5倍当量的赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-NH2及2倍摩尔当量的有机碱DIPEA，然后室温反应2小时，反应完成后经制备液相纯化分离得到相应的目标荧光化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA，即所述近红外荧光化合物(如图4-A所示)。
其中，步骤(1)和(2)中使用的液相色谱的条件为：
使用了Agilent 1220Infinity II系列HPLC系统配备Agilent ZORBAX SB-C18半制备柱(9.4×250mm，5μm)，梯度淋洗60分钟，流速为：2mL/min，其中流动相A为超纯水-0.01％TFA，B为乙腈-0.01％TFA。淋洗梯度设定为：0～5分钟时95％A和5％B，15分钟时80％A和20％B，45分钟时50％A和50％B，60分钟时5％A和95％B。
实施例2
一种近红外荧光化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA的制备方法，与实施例1的制备方法相似，不同之处是将Boc保护的R1-Boc替换成Boc保护的R2-Boc。
实施例3
一种近红外荧光化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA的制备方法，与实施例1的制备方法相似，不同之处是将Boc保护的R1-Boc替换成Boc保护的R3-Boc。
实施例4
一种近红外荧光化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA的制备方法，与实施例1的制备方法相似，不同之处是将Boc保护的R1-Boc替换成Boc保护的R4-Boc。
实施例5
一种近红外荧光化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-Cy7.5的制备方法，与实施例1的制备方法相似，不同之处是将荧光染料MPA替换成市售染料Cy7.5(CASNo:847180-48-7)。
实施例6
一种近红外荧光化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-Cy7.5的制备方法，与实施例1的制备方法相似，不同之处是将荧光染料MPA替换成市售染料Cy7.5(CASNo:847180-48-7)。
实施例7
一种放射性化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc的制备方法，包括如下步骤：
(1)双功能螯合剂HYNIC-NHS的合成
将1.0g 6-氯烟酸和2.0mL 80％水合肼加入到10mL乙醇中，加热回流反应4小时，反应完成后减压旋蒸溶剂，得到的粘稠物加入到蒸馏水中，调pH＝5.5左右，析出固体，抽滤烘干得到黄色固体0.86g，产品经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为6-联肼烟酸。得到的0.86g6-联肼烟酸和0.61g对氨基苯甲醛加入到3.0mL DMF中，加热反应6小时，反应完成后加入到水中析出，抽滤，烘干得固体1.2g。水中析出固体，此固体通过硅胶柱纯化后干燥，称重1.3g，ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为中间体HYNIC-NHS。其中，ESI-MS的正离子分析结果为：[M+H]＝382.1508。
(2)Lisinopril-哌嗪乙酸的合成
将100.0mg市售赖诺普利二水合物与250.0mg哌嗪-1,4-二乙酸在DMF溶液于60℃反应5小时，反应完成后经制备液相纯化并经质谱确证后得到关键中间体95.0mgLisinopril-哌嗪乙酸。
(3)赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-NH2的合成
将20.0mg关键中间体Lisinopril-哌嗪乙酸溶于DMF中，然后加入6.5mg的缩合剂EDCI和3.9mg的NHS，室温反应1小时后，往反应液中加入1.5倍摩尔当量的赖氨酸侧链氨基被Boc保护的R1-Boc及2倍摩尔当量的有机碱N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应完成后通过制备液相分离纯化并冻干，冻干完成后通过加入2.0mL的三氟乙酸室温震荡脱掉赖氨酸侧链氨基保护基Boc，最后分离纯化得到相应的赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-NH2。
(4)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC的合成
将纯化的3.0mg中间体HYNIC-NHS溶于0.5mLDMF中，往混合液中加入等摩尔当量的Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-NH2及3倍摩尔当量的DIPEA，室温反应2小时。反应完成后通过制备液相进行分离纯化产物，最后得到黄色固体1.9mg，通过质谱确证为目标产物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC。Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC的化学结构和质谱分析结果如图7所示。
(5)放射性化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc的合成
分别配制浓度为100.0mg/mL的TPPTS(三苯基磷三间磺酸钠)溶液，浓度为130.0mg/mL的Tricine(三甲基甘氨酸)，浓度为102.4mg/mL的丁二酸-丁二酸钠缓冲液。丁二酸-丁二酸钠缓冲液中的丁二酸77.0mg，丁二酸钠25.4mg。
分别取10.0μLTPPTS溶液，10.0μLTricine溶液，10.0μL丁二酸-丁二酸钠缓冲液分别和10.0μL浓度为1.0mg/mL的Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC混合于西林瓶中，然后加入10mCi Na99mTcO4于100℃金属浴加热20分钟，待反应结束后冷却至室温，制得放射性药物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc，即放射性化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc，产品经AgilentZORBAX SB-Aq分析柱分析鉴定。
其中，步骤(4)中使用的液相色谱的条件为：
使用了Agilent 1220Infinity II系列HPLC系统配备Agilent ZORBAX SB-C18半制备柱(9.4×250mm，5μm)，梯度淋洗60分钟，流速为：2mL/min，其中流动相A为超纯水-0.01％TFA，B为乙腈-0.01％TFA。淋洗梯度设定为：0～5分钟时95％A和5％B，15分钟时80％A和20％B，45分钟时50％A和50％B，60分钟时5％A和95％B。
步骤(5)中使用的HPLC法为配备了放射性在线检测器(Flow-RAM)和AgilentZORBAX SB-Aq分析柱(4.6×250mm，5μm)的Agilent 1220Infinity II系列HPLC系统。梯度淋洗45分钟，流速1mL/min，其中流动相A为超纯水-0.01％TFA，B为乙腈-0.01％TFA。淋洗梯度设定为：0-5分钟时95％A和5％B，15分钟时70％A和30％B，20分钟时65％A和35％B，25分钟时45％A和55％B，45分钟时5％A和95％B。
实施例8
一种放射性化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc的制备方法，与实施例7的制备方法相似，不同点在于：将步骤(5)中的Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC替换为Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC。
实施例9
一种放射性化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc的制备方法，与实施例7的制备方法相似，不同点在于：将步骤(5)中的Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC替换为Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC。
实施例10
一种放射性化合物Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc的制备方法，与实施例7的制备方法相似，不同点在于：将步骤(5)中的Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC替换为Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC。
对比例1
一种单体荧光化合物Lisinopril-PEG4-MPA的制备方法，包括如下步骤：
MPA-PEG4-Lisinopril的合成
称取市售的赖诺普利水合物50mg以及45mg Boc-NH-PEG4-COOH加入到800μL DMSO中，然后加入24mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)偶联剂以及14.2mgN-羟基丁二酰亚胺(NHS)，混匀后再加入32mg N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温反应2小时，反应完成后用制备液相进行分离纯化，冷冻干燥得到中间体Boc-NH-PEG4-Lisinopril。此中间体经200μL等体积的三氟乙酸和二氯甲烷混合液室温脱Boc，可得到中间体NH2-PEG4-Lisinopril。取此中间体30mg以及16mg 3-(三苯甲硫基)丙酸加入到加入到500μL DMSO中，然后加入9mg缩合剂EDCI以及5.5mg NHS，混匀后再加入21mg DIPEA，室温反应2小时，反应完成后用制备液相进行分离纯化，冷冻干燥得到中间体3-(三苯甲硫基)丙酸-PEG4-Lisinopril。取20mg中间体3-(三苯甲硫基)丙酸-PEG4-Lisinopril加入到200μL等体积的三氟乙酸和三乙基硅烷中室温搅拌1小时脱掉巯基保护基三苯基，后经制备液相分离纯化，冷冻干燥得到关键中间体3-硫基丙酸-PEG4-Lisinopril。取10mg关键中间体3-硫基丙酸-PEG4-Lisinopril与12mg近红外染料前体MPA-Cl溶于二甲基亚砜中，加入适量的DIPEA，氮气保护下室温反应过夜，反应完成后经制备液相纯化分离得到荧光化合物，制备的荧光化合物经ESI-MS质谱分析确认为目标化合物MPA-PEG4-Lisinopril，ESI-MS：[M-2H]3-＝780.28以及[M-3H]3-＝520.25(如下图9)。其中，Boc-NH-PEG4-COOH的结构见化合物CAS号：756525-91-4)。
制备液相条件如下所示：使用了Agilent 1220Infinity II系列HPLC系统配备Agilent ZORBAX SB-C18半制备柱(9.4×250mm，5um)，梯度淋洗60分钟，流速2mL/min，其中流动相A为超纯水(0.01％TFA)，B为乙腈(0.01％TFA)。淋洗梯度设定为：0-5分钟时95％A和5％B，15分钟时80％A和20％B，45分钟时50％A和50％B，60分钟时5％A和95％B。
本发明实施例1～6制备的近红外荧光化合物为一种近红外荧光探针，是以赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2为原料制备的，是经修饰改造的赖诺普利衍生物分子探针。该近红外荧光探针具有更低的肾脏信号摄取。在借助赖诺普利衍生物能靶向肿瘤的性质，通过偶联荧光染料制备荧光探针，可在术中引导外科医生精确定位肿瘤边界，达到对肿瘤精准切除的目的。
为了对本发明所提供的近红外荧光探针的效果进行说明，本发明作了如下研究：
(1)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在肝癌MHCC97-H荷瘤鼠体内的荧光成像。
取实施例1制备好的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA并配制成浓度为100nmol/mL的生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只体重约22克的肝癌MHCC97-H荷瘤裸鼠的尾静脉，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper Life Sciences)成像系统进行光学信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8A，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA能特异性靶向肝癌MHCC97-H。
(2)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在结直肠癌HT29荷瘤鼠体内的荧光成像
按实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA分别注射于3只结肠癌HT29荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8B，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA能靶向结直肠癌HT29。
(3)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在乳腺癌MDA-MB-231荷瘤鼠体内的荧光成像
按实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA分别注射于3只乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8C，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA能靶向乳腺癌MDA-MB-231。
(4)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在乳腺癌MCF-7荷瘤鼠体内的荧光成像
按实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA分别注射于3只乳腺癌MCF-7荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8D，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA能靶向乳腺癌MCF-7。
(5)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在结直肠癌HCT116荷瘤鼠体内的荧光成像
按实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA分别注射于3只结直肠癌HCT116荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8E，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA能特异性靶向结直肠癌HCT116。
(6)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在胃癌MGC-803荷瘤鼠体内的荧光成像
按实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA分别注射于3只胃癌MGC-803荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8F，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA能靶向胃癌MGC-803。
(7)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在肝癌Huh-7荷瘤鼠体内的荧光成像
按实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA分别注射于3只肝癌Huh-7荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8G，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA能靶向肝癌Huh-7。
(8)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在胰腺癌MiaPaCa-2荷瘤鼠体内的荧光成像
按实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA分别注射于3只胰腺癌MiaPaCa-2荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8H，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA能靶向胰腺癌MiaPaCa-2。
(9)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA在肝癌MHCC97荷瘤鼠体内的荧光成像
将实施例2制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA分别注射于3只肝癌MHCC97荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8I，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA能靶向肝癌MHCC97。
(10)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA在肝癌Huh-7荷瘤鼠体内的荧光成像
将实施例2制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA分别注射于3只肝癌Huh-7荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8J，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA能靶向肝癌Huh-7。
(11)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA在肝癌MHCC97荷瘤鼠体内的荧光成像
将实施例3制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA分别注射于3只肝癌MHCC97荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8K，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA能靶向肝癌MHCC97。
(12)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA在肝癌Huh-7荷瘤鼠体内的荧光成像
将实施例3制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA分别注射于3只肝癌Huh-7荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8L，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA能靶向肝癌Huh-7。
(13)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA在肝癌Huh-7荷瘤鼠体内的荧光成像
将实施例4制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA分别注射于3只肝癌Huh-7荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8M，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA能靶向肝癌Huh-7。
(14)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA在胰腺癌SW1990荷瘤鼠体内的荧光成像
将实施例4制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA分别注射于3只胰腺癌SW1990荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图8N，可见近红外荧光探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA能靶向胰腺癌SW1990。
(15)近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-PEG4-MPA在肝癌MHCC97荷瘤鼠体内的荧光成像
将对比例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物)Lisinopril-PEG4-MPA采用与上述(1)相同的方法，将Lisinopril-PEG4--MPA分别注射于3只肝癌MHCC97荷瘤裸鼠，并于给药后1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h使用LuminaK(Caliper Life Sciences)成像系统进行荧光信号采集。观察荧光探针在模型鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图10，可见近红外荧光探针Lisinopril-PEG4-MPA能靶向肝癌MHCC97。
本发明将对比例1制备的单体荧光化合物(未经改造的探针)Lisinopril-PEG4-MPA按照上述实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物，经改造的探针)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA在肝癌MHCC97荷瘤鼠体体内的荧光成像的方法，将对比例1制备的单体荧光化合物(未经改造的探针)Lisinopril-PEG4-MPA用于在肝癌MHCC97荷瘤鼠体体内的荧光成像。
待活体成像完成后，将注射实施例1制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物，经改造的探针)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA、实施例2制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物，经改造的探针)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA、实施例3制备的制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物，经改造的探针)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA、实施例4制备的近红外荧光探针(近红外荧光化合物，经改造的探针)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA与对比例1制备的单体荧光化合物(未经改造的探针)Lisinopril-PEG4-MPA的肝癌MHCC97荷瘤鼠在相同时间进行安乐死并解剖，将肝癌MHCC97肿瘤和主要的组织器官进行体外荧光成像及ROI荧光定量分析。对比实施例1～4与对比例制备的各组探针的肿瘤和正常组织的摄取后发现，与未经改造的探针Lisinopril-PEG4-MPA相比，经改造的探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA在小鼠正常肾中的摄取远低于探针Lisinopril-PEG4-MPA组(图9)，表明了探针Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA在体内将具有更高的肿瘤/肾信噪比及更低的肾毒性。
上述结果表明，本发明所制备的近红外荧光探针有明显的多种肿瘤靶向的作用，具有用于肿瘤靶向成像和肿瘤手术导航的潜力和价值。
本发明实施例7～10制备的放射性化合物为一种放射性核素探针，是以赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2为原料制备的，是偶联具有诊断/治疗功能的放射性核素构建相应的放射性药物。该放射性核素探针可达到对肿瘤诊断和精准放射治疗的目的。
为了对本发明所提供的放射性核素探针的效果进行说明，本发明作了如下研究：
(1)放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc在肝癌MHCC97-H荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像
将实施例5制备的放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc配制成浓度为3mCi/mL的生理盐水溶液，取0.1mL(约300μCi)分别注射于3只肝癌MHCC97-H荷瘤裸鼠尾静脉，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行SPECT-CT信号采集。观察放射性探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集情况。结果见图11A，由图可见放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc能靶向肝癌MHCC97-H部位。
(2)放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc在胰腺癌SW1990荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像
将实施例6制备的放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc采用与上述(1)相同的方法，将放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc配制成浓度为3mCi/mL的生理盐水溶液，取0.1mL(约300μCi)分别注射于3只胰腺癌SW1990荷瘤裸鼠，并于给药后0.5h、1h、2h及4h使用LuminaK(Caliper LifeSciences)成像系统进行SPECT-CT信号采集。结果见图11B，由图可见放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc能靶向胰腺癌SW1990。
(3)放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc在乳腺癌MDA-MB-231荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像
将实施例7制备的放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc采用与上述(1)相同的方法，将放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc配制成浓度为3mCi/mL的生理盐水溶液，取0.1mL(约300μCi)分别注射于3只乳腺癌MDA-MB-231荷瘤裸鼠，并于给药后0.5h、1h、2h及4h使用Lumina K(Caliper LifeSciences)成像系统进行SPECT-CT信号采集。结果见图11C，由图可见放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc能靶向乳腺癌MDA-MB-231。
(4)放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc在胃癌MGC-803荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像
将实施例8制备的放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc采用与上述(1)相同的方法，将放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc配制成浓度为3mCi/mL的生理盐水溶液，取0.1mL(约300μCi)分别注射于3只在胃癌MGC-803荷瘤裸鼠，并于给药后0.5h、1h、2h及4h进行SPECT-CT信号采集。结果见图11D，由图可见放射性探针(放射性化合物)Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc能靶向胃癌MGC-803。
上述结果表明，本发明所制备的放射性核素探针有明显的肿瘤靶向的作用，具有用于肿瘤诊断和放射治疗的潜力和价值。
本发明提供了一种肿瘤靶向分子探针，该肿瘤靶向分子探针具有安全性高，且广谱肿瘤靶向性的优点。本发明提供的该分子探针可靶向至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有较好的摄取和滞留能力，具有高的肿瘤与正常组织信噪比，适合用于制备肿瘤术中手术导航试剂及制备放射性药物，用于肿瘤核医学诊断及精准放疗。本发明提供的肿瘤靶向分子探针可以用于肝癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌多种肿瘤的分子成像中，解决了现有的利用“老药”制备的肿瘤靶向分子探针只能针对某一种或者几种特定的肿瘤，不具有广谱肿瘤靶向性的问题。本发明提供的肿瘤靶向分子探针是基于赖诺普利衍生物制备的分子探针经体内光学和放射性核素显像结果证实对多种肿瘤具有优异的靶向效果，包括肝癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌等。所述探针可特异性靶向肿瘤部位的特性将有可能实现对恶性肿瘤的核医学诊断、治疗以及光学手术导航。
需要说明的是，本发明权利要求书中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。
本发明提供了一种肿瘤靶向分子探针，本发明提供的该分子探针可靶向至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有较好的摄取和滞留能力，具有高的肿瘤与正常组织信噪比，适合用于制备肿瘤术中手术导航试剂及制备放射性药物，用于肿瘤核医学诊断及精准放疗。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.肿瘤靶向分子探针，其特征在于，所述分子探针是以赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2为原料制备的近红外荧光化合物或者放射性化合物，所述分子探针的结构如下：
其中，R选自R1、R2、R3、R4中的任意一种，R1、R2、R3、R4的结构如下：
M为荧光标记、金属螯合剂与金属放射性核素络合物、非金属放射性核素18F及11C中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的肿瘤靶向分子探针，其特征在于，所述荧光标记为有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物或生物发光分子中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的肿瘤靶向分子探针，其特征在于，所述荧光标记包括MPA、IRDye800、Cy7.5、ICG、Cy5.5、FD1080、CH1055中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的肿瘤靶向分子探针，其特征在于，所述金属螯合剂为联肼尼克酰胺、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸、7-[(4-羟基丙基)亚甲基]-1,4,7-三氮杂化壬烷-1,4-二乙酸、1,4,7,10-四氮杂环四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、巯基乙酰三甘氨酸、二乙基三胺五乙酸或它们的组合修饰中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的肿瘤靶向分子探针，其特征在于，所述近红外荧光化合物包括Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-MPA、Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-MPA及Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-MPA；所述放射性化合物包括Lisinopril-哌嗪乙酸-R1-HYNIC-99mTc、Lisinopril-哌嗪乙酸-R2-HYNIC-99mTc、Lisinopril-哌嗪乙酸-R3-HYNIC-99mTc及Lisinopril-哌嗪乙酸-R4-HYNIC-99mTc。
6.根据权利要求5所述的近红外荧光化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
近红外荧光染料MPA的合成：以冰醋酸、对肼基苯磺酸、甲基异丙基酮、醋酸钠、邻二氯苯、1,3-丙磺酸内脂、N-[(3-(anilinomethylene)-2-chloro-1-cycloh exen-1-yl)methylene]-anilinemonohydrochlorid为原料反应得到中间体MPA-Cl；中间体MPA-Cl在三乙胺存在下于溶剂DMF中与巯基丙酸反应，反应完成后得到目标化合物即为所述近红外荧光染料MPA；
将得到的近红外染料MPA溶于DMF中，然后加入等摩尔量的缩合剂EDCI和NHS，室温反应后往溶液中加入赖诺普利衍生物Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2及有机碱DIPEA，室温反应完成后，得到Lisinopril-哌嗪乙酸-R-MPA，即所述近红外荧光化合物。
7.根据权利要求5所述的放射性化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
双功能螯合剂HYNIC-NHS的合成：将6-氯烟酸和80％水合肼加入到乙醇中，将反应完成后得到的粘稠物加入到蒸馏水中，调PH＝5.3～5.7，析出的固体为6-联肼烟酸；
6-联肼烟酸和对氨基苯甲醛加入到二甲基亚砜中，反应完成后加入到水中析出，得到的固体与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及N-羟基琥珀酰亚胺一起加入到DMSO中室温反应，反应完成后加入水中析出固体，得到中间体HYNIC-NHS；
Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC的合成：将中间体HYNIC-NHS溶于DMF中，加入1.5倍摩尔量的Lisinopril-哌嗪乙酸-R-NH2，然后再加入3倍摩尔量的DIPEA，室温反应完成后得到Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC；
Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC-99mTc的合成：分别取三苯基磷三间磺酸钠溶液、三甲基甘氨酸溶液、丁二酸-丁二酸钠缓冲液分别和所述Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC混合，然后加入Na 99mTcO4于金属浴加热反应，待反应结束后冷却至室温，得到Lisinopril-哌嗪乙酸-R-HYNIC-99mTc，即所述放射性化合物。
8.权利要求1所述的肿瘤靶向分子探针在制备肿瘤分子成像显像剂中的应用，其特征在于，所述的分子成像包括在各种细胞、组织或其他活体生物成像。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述显像剂为肿瘤边界精准定位或术中手术导航光学显像试剂。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、胃癌。
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