CN117942428A - 一种可注射凝胶样骨诱导修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可注射凝胶样骨诱导修复材料及其制备方法，其中，制备方法具体通过以下步骤实现：S1、脱细胞去抗原冻干骨粉的制备；S2、骨胶原的提取；S3、可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备。通过采用本发明方法，不仅避免了通过添加非天然骨成分的合成高分子材料或其他有机材料或无机材料来实现可注射、可塑形、可固化的问题，而且还解决了仅具有骨传导能力且无骨诱导或者骨诱导能力极弱的问题，同时还避免了使用时需要临时调制的问题，从而有效的提升修复材料的便捷性；此外，本发明制备方法得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料成分高度天然仿生、单一相佳且具备高效骨诱导能力。
Description
技术领域
本发明属于骨修复材料技术领域，具体涉及一种可注射凝胶样骨诱导修复材料及其制备方法。
背景技术
可注射骨修复材料是骨修复材料中用量较少，使用场景特殊的非主流产品；可注射、任意塑形或自固化等为其显著的外在特征。作为骨修复材料的一种，其构建依然遵循骨生成，骨传导及骨诱导机制。
在所有骨修复材料中，自体骨因同时具备骨生成、骨传导和骨诱导机制而成为“金标准”；同种异体或动物骨经一定处理后主要以骨传导机制完成骨修复，个别产品具有弱的骨诱导能力，因此，市场上同种异体骨因成分本就是人骨或者异种骨成分最为接近人骨而成为主流产品；人工骨如生物陶瓷、生物活性玻璃、硫酸钙类等无机材料仅具骨传导能力，只有复合骨生长因子如骨形态发生蛋白(BMP)后才兼具骨诱导能力，这类无机材料类人工骨因仿生程度较低，材料降解与新骨生成匹配不佳、骨修复能力较差而市场份额小。
现有的可注射骨修复材料主要存在以下不足或者缺陷：1)为了实现“可注射”、“可塑形”、“可固化”而添加非天然骨成分的合成高分子材料或其他有机材料或无机材料，成分复杂，仿生程度低。2)产品仅具骨传导能力，无骨诱导或者骨诱导能力极弱。3)产品多由粉体(固相)和专用固化液(液相)双相组成，使用时临时调制，使用便捷性差；因此，研发一种新型的可注射骨修复材料仍然是现阶段研发人员主要攻克的主题之一。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明目的在于提供一种成分高度天然仿生、单一相佳且具备高效骨诱导能力的可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法；
本发明的目的还在于提供一种采用上述制备方法制得的可注射凝胶样骨诱导修复材料。
鉴于此，本发明采用的技术方案是：一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，该方法具体通过以下步骤实现：
S1、脱细胞去抗原冻干骨粉的制备
将新鲜天然骨碎成200-500μm的骨粉，并对所述骨粉进行脱细胞去抗原处理，得到脱细胞去抗原冻干骨粉；
S2、骨胶原的提取
称取一定量的所述脱细胞去抗原冻干骨粉，并采用“酸+酶”法提取出骨胶原；
S3、可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备
称取一定量的S2得到的骨胶原，依次加入盐酸、氢氧化钠和PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；
称取一定量的S1得到的所述脱细胞去抗原冻干骨粉加入至所述胶原溶液中，再向所述胶原溶液中加入天然提取的骨形态发生蛋白或基因重组的骨形态发生蛋白混合均匀，得到骨粉混合物；
对所述骨粉混合物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。
进一步地，所述S1中进行脱细胞去抗原处理的具体方法为：
S1-1、清洗：用水浸泡所述骨粉，间隔搅拌8～12min换水一次进行洗涤去血污，得到清洗后的骨粉；
S1-2、脱脂：采用三氯甲烷和甲醇的混合液对所述清洗后的骨粉脱脂处理2～6h，弃去液体，得到脱脂后的骨粉；
S1-3、脱细胞：所述脱脂后的骨粉用脱细胞溶液浸泡，并在35～40℃下搅拌1～3h，得到脱细胞后的骨粉；所述搅拌速率为100～300rpm；
S1-4、对所述脱细胞后的骨粉进行洗涤直至PH值为7.3～7.5，再预冻冻干处理。
进一步地，所述S1-1中，所述骨粉的重量与所述水的体积比为1：(8～12)。
进一步地，所述S1-2中，所述三氯甲烷和甲醇的重量比为1：(0.8～1.2)；所述混合液与所述洗后的骨粉的重量比为1:(4～8)。
进一步地，所述S1-3中，所述脱细胞溶液为包含0.03～0.08％胰蛋白酶、3.5～4.5mM碳酸氢钠及0.2～0.7mM依地酸四钠EDTA的Hank’s平衡盐溶液。
进一步地，所述S2的具体方法为：
S2-1、称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，按1g干骨粉：90～120ml盐酸：80～120mg胃蛋白酶的比例搅拌混合90～100h，得到胃蛋白酶处理后的骨粉；所述盐酸的浓度为0.008～0.012M；
S2-2、向所述胃蛋白酶处理后的骨粉加入氯化钠，搅拌至白色沉淀析出，离心分离，弃去上清液收集沉淀，并用醋酸溶解沉淀，得到酸酶处理后的骨粉；
S2-3、对所述酸酶处理后的骨粉进行透析处理，得到骨胶原。
进一步地，所述S2-2中，所述离心分离时的转速为10000～15000r/min，离心分离的时间为15min；所述醋酸的浓度为0.008～0.015M。
进一步地，所述S3的具体方法为：
S3-1、称取一定量S2得到的骨胶原，加入浓度为0.008～0.012M的盐酸，得到胶原含量为80～120mg/ml的骨胶酸液；
S3-2、向S3-1得到的骨胶酸液中浓度为0.008～0.012M的氢氧化钠和PH＝7.4的PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；
S3-3、向S3-2得到的骨胶原溶液中加入S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，再加入天然提取的骨形态发生蛋白或基因重组的骨形态发生蛋白混合均匀，得到凝胶骨；
S3-4、对所述凝胶骨依次进行冷冻、干燥、灭菌处理，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。
进一步地，所述S3-3中，所述天然提取的骨形态发生蛋白通过如下方法获得：
称取一定量的所述脱细胞去抗原冻干骨粉，依次采用水洗、脱钙、脱蛋白的工艺提取出骨形态发生蛋白，具体方法为：
叠氮钠水洗：称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，加入浓度为2～5mM的叠氮钠水溶液，搅拌混合8～12min，重复上述工序至少三次，得到叠氮钠水洗的骨粉液；
盐酸脱钙：向所述叠氮钠水洗的骨粉液加入浓度为0.4～0.8mol/L的盐酸，搅拌混合均匀，并在2-8℃的条件下冷冻处理，将结块骨粒打碎，加入浓度为0.4～0.8mol/L的盐酸溶液搅拌20～25h，再加入浓度为2～5mM的叠氮钠水溶液搅拌1～3min，更换等量叠氮钠水溶液再次搅拌，如此反复至少三遍，得到盐酸脱钙后的骨粉液；
氯化钙脱蛋白：向所述盐酸脱钙后的骨粉液中加入氯化钙溶液，在2-8℃的条件下冷冻处理，再中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉氯化钙溶液，得到氯化钙脱蛋白后的骨粉；氯化钙溶液的浓度为1.8～2.2mol/L；
一次水洗：用双蒸水洗涤所述氯化钙脱蛋白后的骨粉，得到一次洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉；
EDTA脱蛋白：向所述一次洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉加入EDTA溶液继续脱蛋白，中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉EDTA溶液，得到EDTA脱蛋白后的骨粉；
二次水洗：用双蒸水洗涤所述EDTA脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉；
氯化锂脱蛋白：向所述洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉加入浓度为6～10mol/L的氯化锂继续脱蛋白，中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉氯化锂溶液，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
一次水浴：用双蒸水洗涤所述氯化锂脱蛋白后的骨粉后，50-55℃下水浴加热2～6h，得到水浴加热后脱蛋白后的骨粉；
尿素抽提：对所述水浴加热后脱蛋白后的骨粉进行空干悬浮水分处理后，加入浓度为3～9mol/L尿素溶液，强力持续搅拌不大于40h，并冷冻处理，得到尿素抽提处理后的骨粉液；
超滤浓缩：对所述尿素抽提处理后的骨粉液进行过滤，并拧干过滤后的尿素抽提处理后的骨粉的水分，对上清液反复过筛，直至无残存骨粒，取上清液进行超滤浓缩工艺；
一次透析：将S3-10中的浓缩液装入透析膜内，并在双蒸水中透析；S3-12、二次水浴：透析结束后，将透析包放入37-40℃恒温水浴锅内水浴0.8～1.2h；
离心处理：二次水浴结束后，将透析包中的液体装入离心管中进行离心分离处理，弃去上清，得到离心处理后的骨粉；离心分离处理的条件为：2～6℃，30000～50000g，30～40min；
二次纯化：离心处理后的骨粉用浓度为4～8mol/L的尿素重新溶解，待完全溶解后，在15～25℃、转速为3000～4000r/min的条件下离心30～40min离心，弃去沉淀，得到二次纯化后的上清液；
二次透析：对二次纯化后的上清液进行过滤，并装入透析膜内，在柠檬酸缓冲液中透析至少24h，得到二次透析后的骨粉液；
二次离心处理：对二次透析后的骨粉液进行离心分离处理，弃上清液，得到二次离心处理后的骨粉液；离心分离的条件为：15～25℃，30000～50000g离心1～2h；
干燥：对二次离心处理后的骨粉液依次进行自然挥发水分、干燥处理，得到天然提取的骨形态发生蛋白。
进一步地，所述S3-3中，所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40～60mg/ml；所述天然提取的骨形态发生蛋白含量为30～50mg。
进一步地，所述S3-3中，所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40～60mg/ml；所述基因重组的骨形态发生蛋白含量为3～8mg。
本发明的另一个技术方案是这样实现的：一种可注射凝胶样骨诱导修复材料，采用上述的制备方法制得。
与现有技术相比，通过采用本发明方法，不仅避免了通过添加非天然骨成分的合成高分子材料或其他有机材料或无机材料来实现可注射、可塑形、可固化的问题，而且还解决了仅具有骨传导能力且无骨诱导或者骨诱导能力极弱的问题，同时还避免了使用时需要临时调制的问题，从而有效的提升修复材料的便捷性；此外，本发明制备方法得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料成分高度天然仿生、单一相佳且具备高效骨诱导能力。
附图说明
图1为本发明实施例1得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备过程示意图；
图2为本发明实施例1得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料的SEM电镜扫描图；
图3为本发明实施例1得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料的EDS检测图；
图4为本发明实施例1得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料在不同温度下，体外PBS溶液中7天时仍保持最初注射形态示意图；
图5为本发明实施例1得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料流变性检测结果示意图；
图6为本发明实施例1得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料中rh-BMP2的体外释放结果示意图；
图7为本发明实施例1得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料中细胞相容性检测结果示意图；
图8为本发明实施例1得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料修复骨缺损效果示意图，其中：
图8A为micro-CT显示图；
图8B为Goldner染色结果显示图；
图8C为Masson染色结果显示图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，该方法具体通过以下步骤实现：
S1、脱细胞去抗原冻干骨粉的制备
将新鲜天然骨碎成200-500μm的骨粉，并对所述骨粉进行脱细胞去抗原处理，得到脱细胞去抗原冻干骨粉；
本实施例在具体的实施过程中，所述S1中进行脱细胞去抗原处理的具体方法为：
S1-1、清洗：用水浸泡所述骨粉，间隔搅拌8～12min换水一次进行洗涤去血污，得到清洗后的骨粉；所述骨粉的重量与所述水的体积比为1：(8～12)；
S1-2、脱脂：采用三氯甲烷和甲醇的混合液对所述清洗后的骨粉脱脂处理2～6h，弃去液体，得到脱脂后的骨粉；所述三氯甲烷和甲醇的重量比为1：(0.8～1.2)；所述混合液与所述洗后的骨粉的重量比为1:(4～8)；
S1-3、脱细胞：所述脱脂后的骨粉用脱细胞溶液浸泡，并在35～40℃下搅拌1～3h，得到脱细胞后的骨粉；所述搅拌速率为100～300rpm；所述脱细胞溶液为包含0.03～0.08％胰蛋白酶、3.5～4.5mM碳酸氢钠及0.2～0.7mM依地酸四钠EDTA的Hank’s平衡盐溶液；
S1-4、对所述脱细胞后的骨粉进行洗涤直至PH值为7.3～7.5，再预冻冻干处理。
S2、骨胶原的提取
称取一定量的所述脱细胞去抗原冻干骨粉，并采用“酸+酶”法提取出骨胶原；
本实施例在具体的实施过程中，所述S2的具体方法为：
S2-1、称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，按1g干骨粉：90～120ml盐酸：80～120mg胃蛋白酶的比例搅拌混合90～100h，得到胃蛋白酶处理后的骨粉；所述盐酸的浓度为0.008～0.012M；
S2-2、向所述胃蛋白酶处理后的骨粉加入氯化钠，搅拌至白色沉淀析出，离心分离，弃去上清液收集沉淀，并用醋酸溶解沉淀，得到酸酶处理后的骨粉；所述离心分离时的转速为10000～15000r/min，离心分离的时间为15min；所述醋酸的浓度为0.008～0.015M；
S2-3、对所述酸酶处理后的骨粉进行透析处理，得到骨胶原；
S3、可注射凝胶骨的制备
称取一定量的S2得到的骨胶原，依次加入盐酸、氢氧化钠和PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；
称取一定量的S1得到的所述脱细胞去抗原冻干骨粉加入至所述胶原溶液中，再向所述胶原溶液中加入天然提取的骨形态发生蛋白或基因重组的骨形态发生蛋白混合均匀，得到骨粉混合物；
对所述骨粉混合物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到可注射凝胶骨，即可注射凝胶样骨诱导修复材料。
本实施例在具体的实施过程中，所述S3的具体方法为：
S3-1、称取一定量S2得到的骨胶原，加入浓度为0.008～0.012M的盐酸，得到胶原含量为80～120mg/ml的骨胶酸液；
S3-2、向S3-1得到的骨胶酸液中浓度为0.008～0.012M的氢氧化钠和PH＝7.4的PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40～60mg/ml；骨形态发生蛋白含量为30～50mg；
S3-3、向S3-2得到的骨胶原溶液中加入S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，再加天然提取的骨形态发生蛋白或基因重组的骨形态发生蛋白混合均匀，得到凝胶骨；所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40～60mg/ml；此外，当选用天然提取的骨形态发生蛋白时，所述凝胶骨中，所述天然提取的骨形态发生蛋白含量为30～50mg；当选用基因重组的骨形态发生蛋白时，所述凝胶骨中，所述基因重组的骨形态发生蛋白含量为3～8mg。S3-4、对所述凝胶骨依次进行冷冻、干燥、灭菌处理，得到可注射凝胶骨。
在具体的实施过程中，S3-3中所述的天然提取的骨形态发生蛋白是通过以下方法获得：
称取一定量的所述脱细胞去抗原冻干骨粉，依次采用水洗、脱钙、脱蛋白的工艺提取出骨形态发生蛋白，具体方法为：
叠氮钠水洗：称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，加入浓度为2～5mM的叠氮钠水溶液，搅拌混合8～12min，重复上述工序至少三次，得到叠氮钠水洗的骨粉液；
盐酸脱钙：向所述叠氮钠水洗的骨粉液加入浓度为0.4～0.8mol/L的盐酸，搅拌混合均匀，并在2-8℃的条件下冷冻处理，将结块骨粒打碎，加入浓度为0.4～0.8mol/L的盐酸溶液搅拌20～25h，再加入浓度为2～5mM的叠氮钠水溶液搅拌1～3min，更换等量叠氮钠水溶液再次搅拌，如此反复至少三遍，得到盐酸脱钙后的骨粉液；
氯化钙脱蛋白：向所述盐酸脱钙后的骨粉液中加入氯化钙溶液，在2-8℃的条件下冷冻处理，再中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉氯化钙溶液，得到氯化钙脱蛋白后的骨粉；氯化钙溶液的浓度为1.8～2.2mol/L；
一次水洗：用双蒸水洗涤所述氯化钙脱蛋白后的骨粉，得到一次洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉；
EDTA脱蛋白：向所述一次洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉加入EDTA溶液继续脱蛋白，中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉EDTA溶液，得到EDTA脱蛋白后的骨粉；
二次水洗：用双蒸水洗涤所述EDTA脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉；
氯化锂脱蛋白：向所述洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉加入浓度为6～10mol/L的氯化锂继续脱蛋白，中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉氯化锂溶液，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
一次水浴：用双蒸水洗涤所述氯化锂脱蛋白后的骨粉后，50-55℃下水浴加热2～6h，得到水浴加热后脱蛋白后的骨粉；
尿素抽提：对所述水浴加热后脱蛋白后的骨粉进行空干悬浮水分处理后，加入浓度为3～9mol/L尿素溶液，强力持续搅拌不大于40h，并冷冻处理，得到尿素抽提处理后的骨粉液；
超滤浓缩：对所述尿素抽提处理后的骨粉液进行过滤，并拧干过滤后的尿素抽提处理后的骨粉的水分，对上清液反复过筛，直至无残存骨粒，取上清液进行超滤浓缩工艺；
一次透析：将S3-10中的浓缩液装入透析膜内，并在双蒸水中透析；透析的具体参数为：透析第一日，下午4：00第一次更换透析水，换水量为6000ml，晚上8：00-9：00第二次更换等量透析水；透析第二日，透析水量为10000ml，换水时间分别为：8:00，12:00，16:00和21:00；透析第三日透析水量为20000ml，换水时间同第二日；透析第四日，透析水量和换水时间同第三日；
二次水浴：透析结束后，将透析包放入37-40℃恒温水浴锅内水浴0.8～1.2h；
离心处理：二次水浴结束后，将透析包中的液体装入离心管中进行离心分离处理，弃去上清，得到离心处理后的骨粉；离心分离处理的条件为：2～6℃，30000～50000g，30～40min；
二次纯化：离心处理后的骨粉用浓度为4～8mol/L的尿素重新溶解，待完全溶解后，在15～25℃、转速为3000～4000r/min的条件下离心30～40min离心，弃去沉淀，得到二次纯化后的上清液；
二次透析：对S3-14得到的二次纯化后的上清液进行过滤，并装入透析膜内，在柠檬酸缓冲液中透析至少24h，得到二次透析后的骨粉液；
二次离心处理：对S3-15得到的二次透析后的骨粉液进行离心分离处理，弃上清液，得到二次离心处理后的骨粉液；离心分离的条件为：15～25℃，30000～50000g离心1～2h；
干燥：对S3-16得到的二次离心处理后的骨粉液依次进行自然挥发水分、干燥处理，得到骨形态发生蛋白。
采用上述方案后，不仅避免了通过添加非天然骨成分的合成高分子材料或其他有机材料或无机材料来实现可注射、可塑形、可固化的问题，而且还解决了仅具有骨传导能力且无骨诱导或者骨诱导能力极弱的问题，同时还避免了使用时需要临时调制的问题，从而有效的提升修复材料的便捷性；此外，本发明制备方法得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料成分高度天然仿生、单一相佳且具备高效骨诱导能力。
以下为具体实施例
以下实施中均选用天然提取的骨形态发生蛋白来制备可注射凝胶样骨诱导修复材料。
实施例1
本发明实施例1提供的可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，该方法具体通过以下步骤实现：
S1、脱细胞去抗原冻干骨粉的制备，具体方法如下：
取同种异体/新鲜小牛/猪四肢皮质骨，刮除骨膜、软组织，去掉骨髓；低温粉碎，过筛，选取300-500μm的骨粉，备用；
S1-1、清洗：用水浸泡所述骨粉，间隔搅拌10min换水一次进行洗涤去血污，得到清洗后的骨粉；所述骨粉的重量与所述水的体积比为1：10；
S1-2、脱脂：采用三氯甲烷和甲醇的混合液对所述清洗后的骨粉脱脂处理4h，弃去液体，得到脱脂后的骨粉；所述三氯甲烷和甲醇的重量比为1：1；所述混合液与所述洗后的骨粉的重量比为1:6；
S1-3、脱细胞：所述脱脂后的骨粉用脱细胞溶液浸泡，并在37℃下搅拌2h，得到脱细胞后的骨粉；所述搅拌速率为200rpm；所述脱细胞溶液为包含0.05％胰蛋白酶、4.0mM碳酸氢钠及0.5mM依地酸四钠EDTA的Hank’s平衡盐溶液；
S1-4、对所述脱细胞后的骨粉进行洗涤直至PH值为7.4，控干水放入-40℃冰箱预冻4h，移入冷冻干燥机冻干密封保存。
S2、骨胶原的提取，具体方法为：
S2-1、称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，按1g干骨粉：100ml0.01M盐酸：100mg胃蛋白酶的比例搅拌混合96h，得到胃蛋白酶处理后的骨粉；
S2-2、向所述胃蛋白酶处理后的骨粉加入1/10体积的氯化钠，搅拌至白色沉淀析出，沉淀溶液倒入离心管低温高速离心，12000r/min，15min，弃去上清收集沉淀，用0.01M醋酸溶解酸酶处理后的骨粉，得到酸酶处理后的骨粉；
S2-3、将酸酶处理后的骨粉装入透析袋透析，20倍去离子水8h换一次，透析48h，透析后的溶液收集到容器内-40℃预冻，低温冷冻干燥机冻干24h，获得骨胶原密封保存；
S3、可注射凝胶骨的制备，具体方法为：
S3-1、称取一定量S2得到的骨胶原，加入浓度为0.01M的盐酸，得到胶原含量为100mg/ml的骨胶酸液；
S3-2、向S3-1得到的骨胶酸液中浓度为0.01M的氢氧化钠和PH＝7.4的PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为50mg/ml；骨形态发生蛋白含量为40mg；
S3-3、向S3-2得到的骨胶原溶液中加入S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，再加入天然提取的骨形态发生蛋白混合均匀，得到凝胶骨；
S3-4、对所述凝胶骨依次进行冷冻、干燥、灭菌处理，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。
S3-5、复水：使用前按5mL冻干产品加入4mL生理盐水的比例复水，填入无菌注射器内注射或根据实际需要塑形植入缺损部位。
本实施例1中在具体的实施过程中，天然提取的骨形态发生蛋白具体通过如下方法获得：
叠氮钠水洗：称取3Kg S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，加入6000ml浓度为3mM的叠氮钠水溶液，搅拌混合10min，更换等量溶液再次搅拌，重复上述工序三次，得到叠氮钠水洗的骨粉液；
盐酸脱钙：向所述叠氮钠水洗的骨粉液加入10000ml浓度为0.6mol/L的盐酸，强力搅拌机持续搅拌，晚间停止搅拌，放置于2-8℃的冷库中过夜，次日上午，从冷库中取出，因骨粒结块，需仔细将结块骨粒打碎，再接通搅拌机电源开始搅拌；满24h时更换脱钙液，加入6000ml浓度为3mM的叠氮钠水溶液，强力搅拌机持续搅拌2min，更换等量溶液再次搅拌，如此反复三遍；每24小时更换脱钙液(盐酸)一次，得到盐酸脱钙后的骨粉液；
氯化钙脱蛋白：向所述盐酸脱钙后的骨粉液中加入9000ml浓度为2.0mol/L氯化钙溶液，放置于2-8℃的冷库中，搅拌机中速间隔30min持续搅拌，倒掉氯化钙溶液，得到氯化钙脱蛋白后的骨粉；
一次水洗：用20000ml双蒸水分三次洗涤所述氯化钙脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉；
EDTA脱蛋白：向所述洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉加入9000ml EDTA溶液继续脱蛋白，中速间隔30min持续搅拌，本步骤总时间为4h倒掉EDTA溶液，得到EDTA脱蛋白后的骨粉；
二次水洗：20000ml双蒸水分三次洗涤所述EDTA脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉；
氯化锂脱蛋白：向所述洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉加入9000ml8mol/L氯化锂继续脱蛋白，中速间隔30min持续搅拌，本步骤总时间为4h倒掉氯化锂溶液，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
一次水浴：用20000ml双蒸水分三次洗涤所述氯化锂脱蛋白后的骨粉后，50-55℃下水浴加热4h，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
尿素抽提：对所述水浴加热后脱蛋白后的骨粉进行空干悬浮水分处理后，加入6000ml浓度为6mol/L尿素溶液，强力持续搅拌不大于40h，夜间静置于冷库内，得到尿素抽提处理后的骨粉液；
超滤浓缩：对所述尿素抽提处理后的骨粉液进行过滤，过滤时采用100目筛网过滤，并拧干过滤后的尿素抽提处理后的骨粉的水分，对上清液反复过筛，直至无残存骨粒，取上清液进行超滤浓缩工艺；超滤浓缩仪用20000ml双蒸水循环洗涤残存于管道和膜包上的碱液，pH试纸检测滤过液与双蒸水一致时开始抽提液浓缩，浓缩至液体量为原液1/4时停止；
一次透析：将浓缩液装入透析膜内，并在双蒸水中透析；透析的具体参数为：透析第一日，下午4：00第一次更换透析水，换水量为6000ml，晚上8：00-9：00第二次更换等量透析水；透析第二日，透析水量为10000ml，换水时间分别为：8:00，12:00，16:00和21:00；透析第三日透析水量为20000ml，换水时间同第二日；透析第四日，透析水量和换水时间同第三日；
二次水浴：透析结束后，将透析包放入37-40℃恒温水浴锅内水浴1h；
离心处理：二次水浴结束后，将透析包中的液体装入100ml的离心管中进行离心分离处理，弃去上清，得到离心处理后的骨粉；离心分离处理的条件为：4℃，40000g，35min；
二次纯化：离心处理后的骨粉用1200ml浓度为6mol/L的尿素重新溶解，待完全溶解后，在20℃、转速为3500r/min的条件下离心35min离心，弃去沉淀，得到二次纯化后的上清液；
二次透析：对二次纯化后的上清液进行过滤，并装入大于等于5KD的透析膜内，在10000ml柠檬酸缓冲液中透析至少24h，得到二次透析后的骨粉液；
二次离心处理：对二次透析后的骨粉液进行离心分离处理，弃上清液，得到二次离心处理后的骨粉液；离心分离的条件为：20℃，40000离心1.5h；
干燥：对二次离心处理后的骨粉液依次进行自然挥发水分约2h、冷冻干燥或2-8℃下干燥塔内自然干燥，得到骨形态发生蛋白。
实施例2
本发明实施例2提供的可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，该方法具体通过以下步骤实现：
S1、脱细胞去抗原冻干骨粉的制备，具体方法如下：
取同种异体/新鲜小牛/猪四肢皮质骨，刮除骨膜、软组织，去掉骨髓；低温粉碎，过筛，选取300-500μm的骨粉，备用；
S1-1、清洗：用水浸泡所述骨粉，间隔搅拌10min换水一次进行洗涤去血污，得到清洗后的骨粉；所述骨粉的重量与所述水的体积比为1：8；
S1-2、脱脂：采用三氯甲烷和甲醇的混合液对所述清洗后的骨粉脱脂处理2h，弃去液体，得到脱脂后的骨粉；所述三氯甲烷和甲醇的重量比为1：0.8；所述混合液与所述洗后的骨粉的重量比为1：4；
S1-3、脱细胞：所述脱脂后的骨粉用脱细胞溶液浸泡，并在35℃下搅拌1h，得到脱细胞后的骨粉；所述搅拌速率为100rpm；所述脱细胞溶液为包含0.03％胰蛋白酶、3.5mM碳酸氢钠及0.2mM依地酸四钠EDTA的Hank’s平衡盐溶液；
S1-4、对所述脱细胞后的骨粉进行洗涤直至PH值为7.3，控干水放入-40℃冰箱预冻4h，移入冷冻干燥机冻干密封保存。
S2、骨胶原的提取，具体方法为：
S2-1、称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，按1g干骨粉：90ml0.008M盐酸：80mg胃蛋白酶的比例搅拌混合90h，得到胃蛋白酶处理后的骨粉；
S2-2、向所述胃蛋白酶处理后的骨粉加入1/10体积的氯化钠，搅拌至白色沉淀析出，沉淀溶液倒入离心管低温高速离心，10000r/min，15min，弃去上清收集沉淀，用0.008M醋酸溶解酸酶处理后的骨粉，得到酸酶处理后的骨粉；
S2-3、将酸酶处理后的骨粉装入透析袋透析，20倍去离子水8h换一次，透析48h，透析后的溶液收集到容器内-40℃预冻，低温冷冻干燥机冻干24h，获得骨胶原密封保存；
S3、可注射凝胶骨的制备，具体方法为：
S3-1、称取一定量S2得到的骨胶原，加入浓度为0.008M的盐酸，得到胶原含量为80mg/ml的骨胶酸液；
S3-2、向S3-1得到的骨胶酸液中浓度为0.008M的氢氧化钠和PH＝7.4的PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40mg/ml；骨形态发生蛋白含量为30mg；
S3-3、向S3-2得到的骨胶原溶液中加入S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，再加入天然提取的骨形态发生蛋白混合均匀，得到凝胶骨；
S3-4、对所述凝胶骨依次进行冷冻、干燥、灭菌处理，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。
S3-5、复水：使用前按5mL冻干产品加入4mL生理盐水的比例复水，填入无菌注射器内注射或根据实际需要塑形植入缺损部位。
本实施例2中在具体的实施过程中，天然提取的骨形态发生蛋白具体通过如下方法获得：
叠氮钠水洗：称取3Kg S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，加入6000ml浓度为3mM的叠氮钠水溶液，搅拌混合10min，更换等量溶液再次搅拌，重复上述工序三次，得到叠氮钠水洗的骨粉液；
盐酸脱钙：向所述叠氮钠水洗的骨粉液加入10000ml浓度为0.4mol/L的盐酸，强力搅拌机持续搅拌，晚间停止搅拌，放置于2-8℃的冷库中过夜，次日上午，从冷库中取出，因骨粒结块，需仔细将结块骨粒打碎，再接通搅拌机电源开始搅拌；满24h时更换脱钙液，加入6000ml浓度为2mM的叠氮钠水溶液，强力搅拌机持续搅拌1min，更换等量溶液再次搅拌，如此反复三遍；每24小时更换脱钙液(盐酸)一次，得到盐酸脱钙后的骨粉液；
氯化钙脱蛋白：向所述盐酸脱钙后的骨粉液中加入9000ml浓度为1.8mol/L氯化钙溶液，放置于2-8℃的冷库中，搅拌机中速间隔20min持续搅拌，倒掉氯化钙溶液，得到氯化钙脱蛋白后的骨粉；
一次水洗：用20000ml双蒸水分三次洗涤所述氯化钙脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉；
EDTA脱蛋白：向所述洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉加入9000ml EDTA溶液继续脱蛋白，中速间隔20min持续搅拌，本步骤总时间为4h倒掉EDTA溶液，得到EDTA脱蛋白后的骨粉；
二次水洗：20000ml双蒸水分三次洗涤所述EDTA脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉；
氯化锂脱蛋白：向所述洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉加入9000ml6mol/L氯化锂继续脱蛋白，中速间隔20min持续搅拌，本步骤总时间为4h倒掉氯化锂溶液，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
一次水浴：用20000ml双蒸水分三次洗涤所述氯化锂脱蛋白后的骨粉后，50-55℃下水浴加热2h，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
尿素抽提：对所述水浴加热后脱蛋白后的骨粉进行空干悬浮水分处理后，加入6000ml浓度为3mol/L尿素溶液，强力持续搅拌不大于40h，夜间静置于冷库内，得到尿素抽提处理后的骨粉液；
超滤浓缩：对所述尿素抽提处理后的骨粉液进行过滤，过滤时采用100目筛网过滤，并拧干过滤后的尿素抽提处理后的骨粉的水分，对上清液反复过筛，直至无残存骨粒，取上清液进行超滤浓缩工艺；超滤浓缩仪用20000ml双蒸水循环洗涤残存于管道和膜包上的碱液，pH试纸检测滤过液与双蒸水一致时开始抽提液浓缩，浓缩至液体量为原液1/4时停止；
一次透析：将S3-10中的浓缩液装入透析膜内，并在双蒸水中透析；透析的具体参数为：透析第一日，下午4：00第一次更换透析水，换水量为6000ml，晚上8：00-9：00第二次更换等量透析水；透析第二日，透析水量为10000ml，换水时间分别为：8:00，12:00，16:00和21:00；透析第三日透析水量为20000ml，换水时间同第二日；透析第四日，透析水量和换水时间同第三日；
二次水浴：透析结束后，将透析包放入37-40℃恒温水浴锅内水浴1h；
离心处理：二次水浴结束后，将透析包中的液体装入100ml的离心管中进行离心分离处理，弃去上清，得到离心处理后的骨粉；离心分离处理的条件为：2℃，30000g，30min；
二次纯化：离心处理后的骨粉用1200ml浓度为4mol/L的尿素重新溶解，待完全溶解后，在15℃、转速为3000r/min的条件下离心30min离心，弃去沉淀，得到二次纯化后的上清液；
二次透析：对二次纯化后的上清液进行过滤，并装入大于等于5KD的透析膜内，在10000ml柠檬酸缓冲液中透析至少24h，得到二次透析后的骨粉液；
二次离心处理：对二次透析后的骨粉液进行离心分离处理，弃上清液，得到二次离心处理后的骨粉液；离心分离的条件为：15℃，30000离心1.0h；
干燥：对二次离心处理后的骨粉液依次进行自然挥发水分约2h、冷冻干燥或2-8℃下干燥塔内自然干燥，得到骨形态发生蛋白。
实施例3
本发明实施例3提供的可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，该方法具体通过以下步骤实现：
S1、脱细胞去抗原冻干骨粉的制备，具体方法如下：
取同种异体/新鲜小牛/猪四肢皮质骨，刮除骨膜、软组织，去掉骨髓；低温粉碎，过筛，选取300-500μm的骨粉，备用；
S1-1、清洗：用水浸泡所述骨粉，间隔搅拌10min换水一次进行洗涤去血污，得到清洗后的骨粉；所述骨粉的重量与所述水的体积比为1：12；
S1-2、脱脂：采用三氯甲烷和甲醇的混合液对所述清洗后的骨粉脱脂处理6h，弃去液体，得到脱脂后的骨粉；所述三氯甲烷和甲醇的重量比为1：1.2；所述混合液与所述洗后的骨粉的重量比为1：8；
S1-3、脱细胞：所述脱脂后的骨粉用脱细胞溶液浸泡，并在35℃下搅拌1h，得到脱细胞后的骨粉；所述搅拌速率为300rpm；所述脱细胞溶液为包含0.08％胰蛋白酶、4.5mM碳酸氢钠及0.7mM依地酸四钠EDTA的Hank’s平衡盐溶液；
S1-4、对所述脱细胞后的骨粉进行洗涤直至PH值为7.5，控干水放入-40℃冰箱预冻4h，移入冷冻干燥机冻干密封保存。
S2、骨胶原的提取，具体方法为：
S2-1、称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，按1g干骨粉：120ml0.012M盐酸：120mg胃蛋白酶的比例搅拌混合100h，得到胃蛋白酶处理后的骨粉；
S2-2、向所述胃蛋白酶处理后的骨粉加入1/10体积的氯化钠，搅拌至白色沉淀析出，沉淀溶液倒入离心管低温高速离心，15000r/min，15min，弃去上清收集沉淀，用0.015M醋酸溶解酸酶处理后的骨粉，得到酸酶处理后的骨粉；
S2-3、将酸酶处理后的骨粉装入透析袋透析，20倍去离子水8h换一次，透析48h，透析后的溶液收集到容器内-40℃预冻，低温冷冻干燥机冻干24h，获得骨胶原密封保存；
S3、可注射凝胶骨的制备，具体方法为：
S3-1、称取一定量S2得到的骨胶原，加入浓度为0.008M的盐酸，得到胶原含量为120mg/ml的骨胶酸液；
S3-2、向S3-1得到的骨胶酸液中浓度为0.012M的氢氧化钠和PH＝7.4的PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为60mg/ml；骨形态发生蛋白含量为50mg；
S3-3、向S3-2得到的骨胶原溶液中加入S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，再加入S3得到的骨形态发生蛋白混合均匀，得到凝胶骨；
S3-4、对所述凝胶骨依次进行冷冻、干燥、灭菌处理，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。
S3-5、复水：使用前按5mL冻干产品加入4mL生理盐水的比例复水，填入无菌注射器内注射或根据实际需要塑形植入缺损部位。
本实施例3中在具体的实施过程中，天然提取的骨形态发生蛋白具体通过如下方法获得：
叠氮钠水洗：称取3Kg S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，加入6000ml浓度为5mM的叠氮钠水溶液，搅拌混合12min，更换等量溶液再次搅拌，重复上述工序三次，得到叠氮钠水洗的骨粉液；
盐酸脱钙：向所述叠氮钠水洗的骨粉液加入10000ml浓度为0.8mol/L的盐酸，强力搅拌机持续搅拌，晚间停止搅拌，放置于2-8℃的冷库中过夜，次日上午，从冷库中取出，因骨粒结块，需仔细将结块骨粒打碎，再接通搅拌机电源开始搅拌；满25h时更换脱钙液，加入6000ml浓度为3mM的叠氮钠水溶液，强力搅拌机持续搅拌1min，更换等量溶液再次搅拌，如此反复三遍；每24小时更换脱钙液(盐酸)一次，得到盐酸脱钙后的骨粉液；
氯化钙脱蛋白：向所述盐酸脱钙后的骨粉液中加入9000ml浓度为2.2mol/L氯化钙溶液，放置于2-8℃的冷库中，搅拌机中速间隔40min持续搅拌，倒掉氯化钙溶液，得到氯化钙脱蛋白后的骨粉；
一次水洗：用20000ml双蒸水分三次洗涤所述氯化钙脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉；
EDTA脱蛋白：向所述洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉加入9000ml EDTA溶液继续脱蛋白，中速间隔40min持续搅拌，本步骤总时间为4h倒掉EDTA溶液，得到EDTA脱蛋白后的骨粉；
二次水洗：20000ml双蒸水分三次洗涤所述EDTA脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉；
氯化锂脱蛋白：向所述洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉加入9000ml10mol/L氯化锂继续脱蛋白，中速间隔40min持续搅拌，本步骤总时间为4h倒掉氯化锂溶液，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
一次水浴：用20000ml双蒸水分三次洗涤所述氯化锂脱蛋白后的骨粉后，50-55℃下水浴加热2h，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
尿素抽提：对所述水浴加热后脱蛋白后的骨粉进行空干悬浮水分处理后，加入6000ml浓度为9mol/L尿素溶液，强力持续搅拌不大于40h，夜间静置于冷库内，得到尿素抽提处理后的骨粉液；
超滤浓缩：对所述尿素抽提处理后的骨粉液进行过滤，过滤时采用100目筛网过滤，并拧干过滤后的尿素抽提处理后的骨粉的水分，对上清液反复过筛，直至无残存骨粒，取上清液进行超滤浓缩工艺；超滤浓缩仪用20000ml双蒸水循环洗涤残存于管道和膜包上的碱液，pH试纸检测滤过液与双蒸水一致时开始抽提液浓缩，浓缩至液体量为原液1/4时停止；
一次透析：将S3-10中的浓缩液装入透析膜内，并在双蒸水中透析；透析的具体参数为：透析第一日，下午4：00第一次更换透析水，换水量为6000ml，晚上8：00-9：00第二次更换等量透析水；透析第二日，透析水量为10000ml，换水时间分别为：8:00，12:00，16:00和21:00；透析第三日透析水量为20000ml，换水时间同第二日；透析第四日，透析水量和换水时间同第三日；
二次水浴：透析结束后，将透析包放入37-40℃恒温水浴锅内水浴1.2h；
离心处理：二次水浴结束后，将透析包中的液体装入100ml的离心管中进行离心分离处理，弃去上清，得到离心处理后的骨粉；离心分离处理的条件为：6℃，50000g，40min；
二次纯化：离心处理后的骨粉用1200ml浓度为8mol/L的尿素重新溶解，待完全溶解后，在15℃、转速为3000r/min的条件下离心30min离心，弃去沉淀，得到二次纯化后的上清液；
二次透析：对二次纯化后的上清液进行过滤，并装入大于等于5KD的透析膜内，在10000ml柠檬酸缓冲液中透析至少24h，得到二次透析后的骨粉液；
二次离心处理：对二次透析后的骨粉液进行离心分离处理，弃上清液，得到二次离心处理后的骨粉液；离心分离的条件为：25℃，50000离心2h；
干燥：对二次离心处理后的骨粉液依次进行自然挥发水分约2h、冷冻干燥或2-8℃下干燥塔内自然干燥，得到骨形态发生蛋白。为了验证本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料的具体性能如何，现对实施例1获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料分别进行SEM电镜扫描检测、EDS检测、在不同温度下体外PBS溶液中7天时仍保持最初注射形态观察、流变性检测、rh-BMP2的体外释放结果检测以及细胞相容性检测，具体检测结果详见图2-图8。
此外，SEM的EDS检测具体为：
取冻干后的微量样品(0.1mg)直接粘到导电胶上，并使用溅射镀膜仪喷金；随后使用使用扫描电镜(ZEISS Sigma 300，德国)对材料的形貌结构和孔隙进行分析；使用能谱仪(EDS，OXFORD Xplore O，英国)分析材料主要成分及元素。
在不同温度下体外PBS溶液中7天时仍保持最初注射形态观察的具体方法为：
为测定不同温度对材料内聚性(抗冲洗能力)的影响，取0.2mg样品放入到60mm的培养皿中，并加入适量生理盐水(0.9wt％NaCl)淹没材料，将培养皿分别放置于4℃、25℃、37℃的水浴锅内，并在24h、48h、72h、7d的时间点观察材料形态特征。如果膏体在观察期内保持挤压形状，则认为膏体具有良好的内聚性。材料的初始温度均为4℃。
流变性检测的具体方法为：
使用流变仪(HAAKE MARS60德国)分析了水凝胶的流变力学性能。本测试采用直径为20mm的平行板，将样品的直径和厚度调整为20mm和1mm。流变学性能测试采用动力学粘度测试(旋转模式)，在25℃下进行频率扫描测试，频率范围：0.1-100rad/s,测定不同剪切速率下材料的粘度变化数据并记录。
Rh-BMP2的体外释放结果检测的具体方法为：
将样品0.1mg浸泡在含有50mL的PBS的培养瓶中；将培养瓶置于恒温摇床上(37℃，50rpm)；分别在2h、6h、18h、1d、3d、7d、14d、21d各时间点，吸出10μL溶液至Ep管中，-80℃冻存；将收集的PBS适当稀释1000倍，制成测试的样本；按照Elisa试剂盒(博士德)说明书操作，试剂盒检测范围：31.2pg/mL—2000pg/mL。
细胞相容性检测的具体方法为：
将样品添加至12孔板中，并将骨髓间充质干细胞(BMSCs)以3X104个的密度接种到每个样品中，孵育7天，以使用a-MEM培养基培养的BMSCs作为对照组。每组3个样品。培养7d后，去除培养液，用PBS洗涤3次。将1μL钙黄绿素AM和1μL核酸红色荧光染料碘化丙啶(PI)分别加入1mL PBS,配制成活/死细胞染色溶液(碧云天)。将200μL活/死细胞染色溶液加入每孔中，室温避光孵育30min,去除染色溶液，PBS洗涤2次，用荧光显微镜采集图像。
通过观察图2可知：本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料具有良好的孔隙率；
通过观察图3可知：本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料中除含有钙磷元素外，还有镁及硅等天然骨所有的微量元素。
通过观察图4可知：本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料在不同温度下，体外PBS溶液中7天时仍保持最初注射形态，未见塌陷。
通过观察图5可知：本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料具有良好的剪切变稀行为。
通过观察图6可知：本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料中的生长因子可持续释放21天。
通过观察图7可知：共培养3天，活死染色结果显示，本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料的细胞相容性良好。
通过观察图8A可知：本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料修复效果良好。
通过观察图8B可知：本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料骨矿化良好.
通过观察图8C可知：本发明获得的可注射凝胶样骨诱导修复材料的骨效果显著。
综上所述，通过采用本发明方法，不仅避免了通过添加非天然骨成分的合成高分子材料或其他有机材料或无机材料来实现可注射、可塑形、可固化的问题，而且还解决了仅具有骨传导能力且无骨诱导或者骨诱导能力极弱的问题，同时还避免了使用时需要临时调制的问题，从而有效的提升修复材料的便捷性；此外，本发明制备方法得到的可注射凝胶样骨诱导修复材料成分高度天然仿生、单一相佳且具备高效骨诱导能力。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (11)
1.一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，该方法具体通过以下步骤实现：
S1、脱细胞去抗原冻干骨粉的制备
将新鲜天然骨碎成200-500μm的骨粉，并对所述骨粉进行脱细胞去抗原处理，得到脱细胞去抗原冻干骨粉；
S2、骨胶原的提取
称取一定量的所述脱细胞去抗原冻干骨粉，并采用“酸+酶”法提取出骨胶原；
S3、可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备
称取一定量的S2得到的骨胶原，依次加入盐酸、氢氧化钠和PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；
称取一定量的S1得到的所述脱细胞去抗原冻干骨粉加入至所述胶原溶液中，再向所述胶原溶液中加入天然提取的骨形态发生蛋白或基因重组的骨形态发生蛋白混合均匀，得到骨粉混合物；
对所述骨粉混合物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。
2.根据权利要求1所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S1中进行脱细胞去抗原处理的具体方法为：
S1-1、清洗：用水浸泡所述骨粉，间隔搅拌8～12min换水一次进行洗涤去血污，得到清洗后的骨粉；
S1-2、脱脂：采用三氯甲烷和甲醇的混合液对所述清洗后的骨粉脱脂处理2～6h，弃去液体，得到脱脂后的骨粉；
S1-3、脱细胞：所述脱脂后的骨粉用脱细胞溶液浸泡，并在35～40℃下搅拌1～3h，得到脱细胞后的骨粉；所述搅拌速率为100～300rpm；
S1-4、对所述脱细胞后的骨粉进行洗涤直至PH值为7.3～7.5，再预冻冻干处理。
3.根据权利要求2所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S1-1中，所述骨粉的重量与所述水的体积比为1：(8～12)。
4.根据权利要求2所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S1-2中，所述三氯甲烷和甲醇的重量比为1：(0.8～1.2)；所述混合液与所述洗后的骨粉的重量比为1:(4～8)。
5.根据权利要求2所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S1-3中，所述脱细胞溶液为包含0.03～0.08％胰蛋白酶、3.5～4.5mM碳酸氢钠及0.2～0.7mM依地酸四钠EDTA的Hank’s平衡盐溶液。
6.根据权利要求1所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S2的具体方法为：
S2-1、称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，按1g干骨粉：90～120ml盐酸：80～120mg胃蛋白酶的比例搅拌混合90～100h，得到胃蛋白酶处理后的骨粉；所述盐酸的浓度为0.008～0.012M；
S2-2、向所述胃蛋白酶处理后的骨粉加入氯化钠，搅拌至白色沉淀析出，离心分离，弃去上清液收集沉淀，并用醋酸溶解沉淀，得到酸酶处理后的骨粉；
S2-3、对所述酸酶处理后的骨粉进行透析处理，得到骨胶原。
7.根据权利要求6所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S2-2中，所述离心分离时的转速为10000～15000r/min，离心分离的时间为15min；所述醋酸的浓度为0.008～0.015M。
8.根据权利要求1所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S3的具体方法为：
S3-1、称取一定量S2得到的骨胶原，加入浓度为0.008～0.012M的盐酸，得到胶原含量为80～120mg/ml的骨胶酸液；
S3-2、向S3-1得到的骨胶酸液中浓度为0.008～0.012M的氢氧化钠和PH＝7.4的PBS缓冲液，得到骨胶原溶液；
S3-3、向S3-2得到的骨胶原溶液中加入S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，再加入天然提取的骨形态发生蛋白或基因重组的骨形态发生蛋白混合均匀，得到凝胶骨；
S3-4、对所述凝胶骨依次进行冷冻、干燥、灭菌处理，得到可注射凝胶样骨诱导修复材料。
9.根据权利要求8所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S3-3中，所述天然提取的骨形态发生蛋白通过如下方法获得：
称取一定量的所述脱细胞去抗原冻干骨粉，依次采用水洗、脱钙、脱蛋白的工艺提取出骨形态发生蛋白，具体方法为：
叠氮钠水洗：称取一定量的S1得到的脱细胞去抗原冻干骨粉，加入浓度为2～5mM的叠氮钠水溶液，搅拌混合8～12min，重复上述工序至少三次，得到叠氮钠水洗的骨粉液；
盐酸脱钙：向所述叠氮钠水洗的骨粉液加入浓度为0.4～0.8mol/L的盐酸，搅拌混合均匀，并在2-8℃的条件下冷冻处理，将结块骨粒打碎，加入浓度为0.4～0.8mol/L的盐酸溶液搅拌20～25h，再加入浓度为2～5mM的叠氮钠水溶液搅拌1～3min，更换等量叠氮钠水溶液再次搅拌，如此反复至少三遍，得到盐酸脱钙后的骨粉液；
氯化钙脱蛋白：向所述盐酸脱钙后的骨粉液中加入氯化钙溶液，在2-8℃的条件下冷冻处理，再中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉氯化钙溶液，得到氯化钙脱蛋白后的骨粉；氯化钙溶液的浓度为1.8～2.2mol/L；
一次水洗：用双蒸水洗涤所述氯化钙脱蛋白后的骨粉，得到一次洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉；
EDTA脱蛋白：向所述一次洗涤后的氯化钙脱蛋白后的骨粉加入EDTA溶液继续脱蛋白，中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉EDTA溶液，得到EDTA脱蛋白后的骨粉；
二次水洗：用双蒸水洗涤所述EDTA脱蛋白后的骨粉，得到洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉；
氯化锂脱蛋白：向所述洗涤后放入EDTA脱蛋白后的骨粉加入浓度为6～10mol/L的氯化锂继续脱蛋白，中速间隔20～40min持续搅拌，倒掉氯化锂溶液，得到氯化锂脱蛋白后的骨粉；
一次水浴：用双蒸水洗涤所述氯化锂脱蛋白后的骨粉后，50-55℃下水浴加热2～6h，得到水浴加热后脱蛋白后的骨粉；
尿素抽提：对所述水浴加热后脱蛋白后的骨粉进行空干悬浮水分处理后，加入浓度为3～9mol/L尿素溶液，强力持续搅拌不大于40h，并冷冻处理，得到尿素抽提处理后的骨粉液；
超滤浓缩：对所述尿素抽提处理后的骨粉液进行过滤，并拧干过滤后的尿素抽提处理后的骨粉的水分，对上清液反复过筛，直至无残存骨粒，取上清液进行超滤浓缩工艺；
一次透析：将浓缩液装入透析膜内，并在双蒸水中透析；S3-12、二次水浴：透析结束后，将透析包放入37-40℃恒温水浴锅内水浴0.8～1.2h；
离心处理：二次水浴结束后，将透析包中的液体装入离心管中进行离心分离处理，弃去上清，得到离心处理后的骨粉；离心分离处理的条件为：2～6℃，30000～50000g，30～40min；
二次纯化：离心处理后的骨粉用浓度为4～8mol/L的尿素重新溶解，待完全溶解后，在15～25℃、转速为3000～4000r/min的条件下离心30～40min离心，弃去沉淀，得到二次纯化后的上清液；
二次透析：对二次纯化后的上清液进行过滤，并装入透析膜内，在柠檬酸缓冲液中透析至少24h，得到二次透析后的骨粉液；
二次离心处理：对二次透析后的骨粉液进行离心分离处理，弃上清液，得到二次离心处理后的骨粉液；离心分离的条件为：15～25℃，30000～50000g离心1～2h；
干燥：对二次离心处理后的骨粉液依次进行自然挥发水分、干燥处理，得到天然提取的骨形态发生蛋白。
10.根据权利要求8所述的一种可注射凝胶样骨诱导修复材料的制备方法，其特征在于，所述S3-3中，所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40～60mg/ml；所述天然提取的骨形态发生蛋白含量为30～50mg；
所述S3-3中，所述凝胶骨中，所述脱细胞去抗原冻干骨粉含量为40～60mg/ml；所述基因重组的骨形态发生蛋白含量为3～8mg。
11.一种可注射凝胶样骨诱导修复材料，其特征在于，采用权利要求1-10任意一项所述的制备方法制得。
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| CN202410085081.3A CN117942428A (zh) | 2024-01-20 | 2024-01-20 | 一种可注射凝胶样骨诱导修复材料及其制备方法 |
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2024
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