CN117941678A - 一种间充质干细胞的冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞的冻存方法，涉及细胞冻存领域。本发明的间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：(1)采用海藻酸钠和Ca‑EDTA制备装载间充质干细胞的凝胶球；(2)将所述装载间充质干细胞的凝胶球和冷冻保护剂混合，然后孵育；孵育完成后吸除冷冻保护剂，冷冻保存。本发明的方法通过海藻酸钠与Ca2+相反电荷之间的强静电相互作用，对间充质干细胞进行凝胶化包裹并冷冻保藏；并在冷冻保护剂中添加葡聚糖等大分子物质；该方法可以有效保护细胞表型，降低细胞损伤，能够提高复苏后细胞存活率，保持了细胞复苏后的生理功能和生物学功能。
Description
技术领域
本发明涉及细胞冻存领域，具体涉及的是一种间充质干细胞的冻存方法。
背景技术
目前，胚胎干细胞、生殖细胞、神经细胞、肝细胞等多种活细胞已在细胞治疗、再生医学、干细胞研究、器官移植和濒危物种研究等领域得到开发。对于这些基于细胞的应用，在整个过程中有足够数量的具有高活性和相应集成功能的细胞存活是特别重要的。
然而，活细胞，尤其是生殖细胞和胚胎干细胞，很难在体外存活。细胞冻存是一种在-80℃以下的低温环境储存生物活细胞和组织的技术。利用这种技术，细胞的生物活性可以被抑制，在生理温度下将细胞解冻后，细胞的功能也可以恢复。因此，细胞的低温保存已成为目前广泛使用的方法，也用于活细胞和供体组织的长期储存。但是，如何抑制解冻过程中溶液损伤、冰损伤、再结晶和渗透损伤等对细胞的损伤，以及低温保护剂的细胞毒性，仍然是冷冻生物学面临的一个重要挑战。
现有技术中，由于间充质干细胞在冻存过程中，利用程序化降温的方法容易导致细胞内产生冰晶，对细胞造成伤害；而采用玻璃化急速降温，需要添加高浓度渗透性冷冻保护液(如DMSO)，则会造成干细胞中毒。因此，亟需研发一种抑制冰核形成、限制冰晶生长、增加细胞通透性和有效降低细胞封装系统中渗透冲击变化率的间充质干细胞冻存方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种间充质干细胞的冻存方法，该方法通过海藻酸钠与Ca2+相反电荷之间的强静电相互作用，对间充质干细胞进行凝胶化包裹并冷冻保藏；并在冷冻保护剂中添加葡聚糖等大分子物质；该方法可以有效保护细胞表型，降低细胞损伤，能够提高复苏后细胞存活率，保持了细胞复苏后的生理功能和生物学功能。
本发明首先提供了一种间充质干细胞冷冻保护剂，其由如下组分组成：以各组份在冷冻保护剂中的终浓度计，体积百分浓度5％～20％乙二醇、0.5～1.0mol/L海藻糖、0.05～0.2mmol/L葡聚糖、体积百分浓度5％～20％胎牛血清；溶剂为Dulbecco's ModifiedEagle's Medium。
具体的，所述冷冻保护剂由如下组分组成：以各组份在冷冻保护剂中的终浓度计，体积百分浓度7.5％乙二醇、0.5mol/L海藻糖、0.1mmol/L葡聚糖、体积百分浓度15％胎牛血清；溶剂为Dulbecco's Modified Eagle's Medium。
进一步的，本发明还提供了所述间充质干细胞冷冻保护剂在冻存间充质干细胞中的应用。
上述的应用中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
最后，本发明提供了一种间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
(1)采用海藻酸钠和Ca-EDTA制备装载间充质干细胞的凝胶球；
(2)将所述装载间充质干细胞的凝胶球和所述冷冻保护剂混合，然后孵育；孵育完成后吸除冷冻保护剂，冷冻保存。
上述的冻存方法，步骤(2)中，所述冷冻保护剂的体积是所述装载间充质干细胞的凝胶球体积的1～10倍；具体可为3倍；
所述孵育的温度为2～6℃，具体可为4℃；所述孵育的时间为2～10min；
所述冷冻保存在-196℃～-80℃下冷冻保存；具体的，所述冷冻保存在-80℃冰箱或-196℃的液氮中进行冷冻保存。
上述的冻存方法中，所述制备装载间充质干细胞的凝胶球的方法，包括如下步骤：
将海藻酸钠、Ca-EDTA和充质干细胞分散在溶剂中作为分散相，含表面活性剂的氟化油作为连续相1，含乙酸的氟化油作为连续相2，含全氟辛醇的氟化油作为连续相3，采用微流控装置制备装载间充质干细胞的凝胶球。
上述的冻存方法中，所述分散相中，海藻酸钠含量为5～20mg/mL；所述Ca-EDTA的浓度为50～100mmol/L；所述间充质干细胞的浓度为105～108个/mL；
具体的，所述分散相中，海藻酸钠含量为10mg/mL；所述Ca-EDTA的浓度为50mmol/L；
所述表面活性剂为山梨醇酐油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯或Krytox-PEG-Krytox中的至少一种；
所述连续相1中，所述表面活性剂的浓度为5～20mg/mL；具体可为10mg/mL；
所述连续相2中，所述乙酸的体积百分浓度为0.05％～0.1％；具体可为0.05％；
所述连续相3中，所述全氟辛醇体积百分的浓度为15～25％，具体可为20％。
上述的冻存方法中，所述分散相流速为600～800μL/h；所述连续相1流速为2.0～3.0mL/h；所述连续相2流速为1.0～2.0mL/h；所述连续相3流速为1.0～2.0mL/h。
上述的冻存方法中，所述分散相中添加明胶、黄原胶、透明质酸和多肽中的至少一种，其在分散相中的浓度为5～20mg/mL。
上述的冻存方法中，所述分散相的溶剂为含体积分数5％～20％胎牛血清的Dulbecco's modified eagle medium、含体积分数5％～20％胎牛血清的RPMI 1640或含体积分数5％～20％胎牛血清的PBS缓冲液。
具体的，所述溶剂中，胎牛血清的体积分数为15％。
上述的冻存方法中，采用微流控装置制备装载间充质干细胞的凝胶球后，采用含含体积分数5％～20％胎牛血清的Dulbecco's modified eagle medium洗涤凝胶球，然后加入所述冷冻保护剂孵育。本发明具有如下有益效果：
1)本发明通过海藻酸钠与Ca2+相反电荷之间的强静电相互作用形成了具有协同性质的交联，形成了装载细胞的凝胶球，对间充质干细胞进行凝胶化包裹并冷冻保藏；这样可以有效保护细胞表型，能够提高复苏后细胞存活率，保持了细胞复苏后的生理功能和生物学功能；
2)本发明在冷冻保护剂中添加葡聚糖，其可以优先同溶液中的水分子结合，降低了细胞外自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶形成；同时，由于分子量大，使溶液中电解质浓度降低，减轻了溶质损伤；
3)本发明采用凝胶封装细胞制成的外部屏障可以减少低温环境对细胞造成的损伤；此外，该凝胶球还允许营养物质和废物扩散；在复温过程中，还可以吸附在冰晶界上，阻碍冰畴间水分子的扩散，从而抑制冰晶重结晶，保护细胞免受冻伤；
4)本发明的方法操作简单，细胞存活率比常规方法提高了9％；通过增加细胞浓度和/或微流体流速以提高通量；此外，平行/多个微通道可以被制造，以扩大微流体方法的细胞微胶囊化。
附图说明
图1为实施例1所用的微流控芯片结构示意图；
图2为实施例1制备的装载细胞的凝胶微胶囊荧光染色图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。、
下述实施例所用Krytox-PEG-Krytox表面活性剂购自RAN Biotechnologies，货号008-FluoroSurfactant。
下述实施例所用脂肪间充质干细胞购自海星生物，货号为ADHX-C106。
实施例1
本发明使用的微流控芯片结构示意图如图1所示，该微流控芯片包括微流道、四个流道入口(1、2、3和4)，以及一个流道出口(5)；其中流道入口1作为分散相入口，流道入口2、3和4分别作为连续相1、2、3入口；微流道芯片的基底为普通玻璃片。
流道入口1与微流道a连接；流道入口2分成两条微流道和微流道a交汇形成一条微流道b，流道入口2分成的两条微流道和微流道a交汇口夹角分别为90°；流道入口3分成两条微流道和微流道b交汇形成一条微流道c，流道入口3分成的两条微流道和微流道b交汇口夹角分别为70°；流道入口4分成两条微流道和微流道c交汇形成一条微流道d；流道入口4分成的两条微流道和微流道c交汇口夹角分别为70°；其中流道入口4分成的两条微流道在接近与微流道c交汇口的位置处设有弯道缓冲区；微流道d连通弯道汇集区再连接流道出口5，其中弯道汇集区宽度依次递增。
所述与流道入口之间相连的微流道宽为200μm，微流道a、b、c、d宽度依次为300、300、550、560μm，长度为3500、4500、17600、3140μm；弯道汇集区分为三段，其宽度依次为600、900、1200μm，长度依次为6000、12000、14200μm；且微流道的高均为200μm，微流道均在同一水平面上。
本实施例的微流道材质具体为聚二甲基硅氧烷；
所述微流道的内壁表面均进行疏水处理；具体步骤如下：
(1)用注射器吸入疏水剂(Pico-Glide、Aquapel、TurtleWax都是可以的，本实施例具体用的是Aquapel)，然后接上一根针头，连接好聚四氟乙烯管；
(2)用注射器将疏水剂填充到微流道中，当所有微流道都充满疏水剂后，用胶带覆盖微流控芯片，以防止蒸发；
(3)将微流控芯片置于室温下5分钟；
(4)通入氟化油，在微流道中取代疏水剂。
采用上述微流控芯片进行干细胞冻存，方法如下：
步骤S1：将海藻酸钠、Ca-EDTA和脂肪间充质干细胞分散在溶剂中混合均匀作为分散相，其中海藻酸钠的含量为10mg/mL，Ca-EDTA的浓度为50mmol/L，脂肪间充质干细胞的细胞浓度为7.0×107个/mL，溶剂为含15％(v/v)胎牛血清的Dulbecco'smodified eaglemedium(杜氏改良培养基，购自Gibco，货号为11995-065)；将含10mg/mLKrytox-PEG-Krytox的氟化油作为连续相1，含有0.05％(v/v)乙酸的氟化油作为连续相2，含有20％(v/v)全氟辛醇的氟化油作为连续相3。利用微流控装置在微流控芯片中通入各相制备单分散装载细胞的凝胶球，其中，分散相流入速度为700μL/h，连续相1流入速度为2.5mL/h，连续相2流入速度为1.0mL/h，连续相3流入速度为1.0mL/h。将含有已装载细胞的凝胶球溶液收集在离心管中；在离心管中加入1mL含15％(v/v)胎牛血清的Dulbecco's modified eagle medium细胞培养液，此时溶液会分成两层，上层为含有装载细胞的凝胶球的细胞培养液，下层为连续相废液，将下层吸除。
步骤S2：将上述培养液静置30s，装载细胞的凝胶球聚沉到离心管的底部，吸走大部分培养液，加入3倍凝胶球体积的冷冻保护剂，然后在4℃下孵育10min，其中冷冻保护剂的成分为7.5％(v/v)乙二醇，0.5M海藻糖，0.1mmol/L葡聚糖和15％(v/v)胎牛血清，溶剂为Dulbecco's modified eagle medium；然后将孵育完成后的上述体系全部用移液器加入到低温冻存管中，吸除冷冻保护剂后，将低温冻存管放入-80℃低温冰箱中进行冷冻保存。
通过钙黄绿素/碘化丙啶双染色法对步骤S1得到的凝胶球进行染色，通过荧光显微镜拍摄明场和荧光图，并利用imagej软件处理图像得到图2，由图2可以得出，细胞已经装载到凝胶球中，并且染成绿色，证明细胞仍保持着高活性。
实施例2
步骤S1：将海藻酸钠、明胶、Ca-EDTA和脂肪间充质干细胞悬液混合均匀作为分散相，其中海藻酸钠的含量为10mg/mL，明胶的含量为10mg/mL，Ca-EDTA的浓度为50mmol/L，脂肪间充质干细胞的细胞浓度为6.5×107个/mL，溶剂为含15％(v/v)胎牛血清的Dulbecco'smodified eagle medium；将含10mg/mL Krytox-PEG-Krytox的氟化油作为连续相1，含有0.05％(v/v)乙酸的氟化油作为连续相2，含有20％(v/v)全氟辛醇的氟化油作为连续相3；利用微流控装置在实施例1的疏水处理后的微流控芯片中通入各相制备单分散装载细胞的凝胶球，其中，分散相流入速度为700μL/h，连续相1流入速度为2.0mL/h，连续相2流入速度为1.0mL/h，连续相3流入速度为1.0mL/h。将含有已装载细胞的凝胶球溶液收集在离心管中；在离心管中加入1mL含15％(v/v)胎牛血清的Dulbecco's modified eagle medium细胞培养液，此时溶液会分成两层，上层为含有装载细胞的凝胶球的细胞培养液，下层为连续相废液，将下层吸除。
步骤S2与实施例1相同。
实施例3
该实施例的方法与实施例2相同，不同的是将实施例2中的明胶替换为黄原胶。
对比例1
采用常规方法对细胞进行冻存。具体步骤为：将1.0mL脂肪间充质干细胞(浓度为6.8×107个/mL)分散在2mL含有10％(v/v)二甲基亚砜和15％(v/v)胎牛血清的溶液中，其溶剂为Dulbecco's modified eagle medium。先在-20℃放置30min预冷，再转移到-80℃低温冰箱中进行冷冻保存。
对比例2
步骤S1与实施例1相同，不同的是将连续相1的流入速度调整为2.0mL/h。
步骤S2：将S1中得到的含有凝胶球的培养液静置30s，装载细胞的凝胶球聚沉到离心管的底部，吸走大部分培养液，加入3倍凝胶球体积的冷冻保护剂，然后在4℃下孵育10min，其中冷冻保护剂的成分为7.5％(v/v)乙二醇，0.5M海藻糖和15％(v/v)胎牛血清，溶剂为Dulbecco's modified eagle medium；然后将孵育完成后的上述体系全部用移液器加入到低温冻存管中，吸除冷冻保护剂后，将低温冻存管放入-80℃低温冰箱中进行冷冻保存。
对比例3
步骤S1与实施例2相同。
步骤S2与实施例1相同，不同的是将实施例1中的冷冻保护剂替换为“7.5％(v/v)乙二醇，0.25M海藻糖和15％(v/v)胎牛血清，溶剂为Dulbecco's modified eaglemedium”。
将实施例1-3和对比例2、3中冷冻保存1周、1个月或3个月的脂肪间充质干细胞进行细胞复温处理，将低温冻存管放置在37℃水浴中复温至全部融化，然后加入冻存体积两倍的含15％(v/v)胎牛血清的Dulbecco's modified eagle medium细胞培养液和冻存体积0.5倍的75mmol/L柠檬酸三钠溶液，通过用移液枪对溶液进行吹打使凝胶微胶囊破碎，将细胞释放出来。。复温完成后，用钙黄绿素/碘化丙啶双染色法进行细胞计数来检测复苏后的细胞活性。检测结果如表1所示。
将对比例1中冷冻保存1周、1个月或3个月的脂肪间充质干细胞进行细胞复温处理，将低温冻存管放置在37℃水浴中复温至全部融化，复温完成后用钙黄绿素/碘化丙啶双染色法进行细胞计数来检测复苏后的细胞活性。检测结果如表1所示。
表1脂肪间充质干细胞冻存1周、1个月、3个月后细胞的存活情况(n＝3)
由表1可以得出，通过凝胶球装载细胞的方法对脂肪间充质干细胞进行冻存，其细胞存活率要高于传统方法，并且通过实施例1和对比例2、3的数据可以得出，使用含有葡聚糖的冷冻保护剂效果最好。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞冷冻保护剂，其由如下组分组成：以各组份在冷冻保护剂中的终浓度计，体积百分浓度5％～20％乙二醇、0.5～1.0mol/L海藻糖、0.05～0.2mmol/L葡聚糖、体积百分浓度5％～20％胎牛血清；溶剂为Dulbecco's Modified Eagle's Medium。
2.权利要求1所述的间充质干细胞冷冻保护剂在冻存间充质干细胞中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。
4.一种间充质干细胞的冻存方法，包括如下步骤：
(1)采用海藻酸钠和Ca-EDTA制备装载间充质干细胞的凝胶球；
(2)将所述装载间充质干细胞的凝胶球和权利要求1所述冷冻保护剂混合，然后孵育；孵育完成后吸除冷冻保护剂，冷冻保存。
5.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于：步骤(2)中，所述冷冻保护剂的体积是所述装载间充质干细胞的凝胶球体积的1～10倍；
所述孵育的温度为2～6℃；所述孵育的时间为2～10min；
所述冷冻保存在-196℃～-80℃下冷冻保存。
6.根据权利要求4或5所述的冻存方法，其特征在于：所述制备装载间充质干细胞的凝胶球的方法，包括如下步骤：
将海藻酸钠、Ca-EDTA和充质干细胞分散在溶剂中作为分散相，含表面活性剂的氟化油作为连续相1，含乙酸的氟化油作为连续相2，含全氟辛醇的氟化油作为连续相3，采用微流控装置制备装载间充质干细胞的凝胶球。
7.根据权利要求6所述的冻存方法，其特征在于：所述分散相中，海藻酸钠含量为5～20mg/mL；所述Ca-EDTA的浓度为50～100mmol/L；所述间充质干细胞的浓度为105～108个/mL；
所述表面活性剂为山梨醇酐油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯或Krytox-PEG-Krytox中的至少一种；
所述连续相1中，所述表面活性剂的浓度为5～20mg/mL；
所述连续相2中，所述乙酸的体积百分浓度为0.05％～0.1％；
所述连续相3中，所述全氟辛醇的体积百分浓度为15～25％。
8.根据权利要求6或7所述的冻存方法，其特征在于：所述分散相流速为600～800μL/h；所述连续相1流速为2.0～3.0mL/h；所述连续相2流速为1.0～2.0mL/h；所述连续相3流速为1.0～2.0mL/h。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的冻存方法，其特征在于：所述分散相中添加明胶、黄原胶、透明质酸和多肽中的至少一种，其在分散相中的浓度为5～20mg/mL。
10.根据权利要求4-9中任一项所述的冻存方法，其特征在于：所述分散相的溶剂为含体积分数5％～20％胎牛血清的Dulbecco's modified eagle medium、含体积分数5％～20％胎牛血清的RPMI 1640或含体积分数5％～20％胎牛血清的PBS缓冲液。
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