CN117929584A - 一种超高效液相色谱-串联质谱分离和测定异菌脲及其异构体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于烟草及烟草制品中农药残留检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱‑串联质谱分离和测定异菌脲及其异构体的方法。该测定方法包括以下步骤：(1)将待测样品用乙腈萃取、分离，得萃取液；(2)使用滤过式固相萃取柱将萃取液净化，得待测样品溶液；(3)使用超高效液相色谱‑串联质谱对待测样品溶液中的异菌脲及其异构体进行测定；其中，所述超高效液相色谱的流动相由流动相A和流动相B组成，其中流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液。本发明的测定方法具有溶剂消耗少，分离度好，灵敏度高及重复性好的优点，能够为相关农药残留量的测定方法等技术的开发提供诸多借鉴。
Description
技术领域
本发明涉及一种超高效液相色谱-串联质谱分离和测定异菌脲及其异构体的方法，属于色谱分离和测定技术领域。
背景技术
异菌脲是一种高效广谱的二甲酰亚胺类杀菌剂，对多种果蔬真菌性病害具有较好的防治效果，该药使用范围较为广泛。异菌脲对水生动物具有较高毒性，对植物、鸟类具有中等毒性，异菌脲属于高风险农药品种。加拿大、美国、日本和欧盟都制定了较为严格的水果、蔬菜和粮食中异菌脲的最大残留限量值(0.01-25mg/kg)，并对其残留量进行持续风险监测。我国新制定的《GB2763-2019食品中农药最大残留限量》规定异菌脲在蔬菜、水果和谷物中的最大残留限量值分别为0.2-10、5-30、0.1-10mg/kg。目前关于异菌脲的检测方法较多，常见的有液相色谱串联质谱法【刘柏林等.同位素内标-超高效液相色谱-串联质谱法测定水果和蔬菜中4种杀菌剂残留量.理化检验(化学分册),2019,55(10):1143-1150】、气相色谱串联质谱法【朱文霞.快速溶剂提取-GC-MS/MS法测定土壤中三唑磷、螺螨酯、异菌脲、氰氟草酯和多效唑.化学分析计量,2020,29(06):71-74】，但是未见异菌脲异构体(异丙二酮代谢物)的检测报道。
异菌脲(CAS：36734-19-7)
异菌脲异构体(异丙二酮代谢物)(CAS：63637-89-8)
发明内容
本发明的目的是提供一种烟草及烟草制品中异菌脲及其异构体的测定方法，以解决目前的测定方法不能同时定量检测该两种物质并且待测样品溶液净化效果差，测定干扰多，测定结果不准确的问题。
为实现上述目的，本发明的烟草及烟草制品中异菌脲及其异构体的测定方法的具体技术方案为：
一种超高效液相色谱-串联质谱分离和测定异菌脲及其异构体的方法，包括以下步骤：(1)将待测样品用乙腈萃取、分离，得萃取液；(2)使用滤过式固相萃取柱将萃取液净化并过滤，得待测样品溶液，滤过式固相萃取柱的填料为N-丙基乙二胺(PSA)、C18、EMRLipid、Carbon S的混合；(3)使用超高效液相色谱-串联质谱对待测样品溶液中的异菌脲及其异构体进行测定；其中，所述超高效液相色谱的流动相由流动相A和流动相B组成，其中流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液。
为提高萃取效率，先用水将待测样品润湿，再加入乙腈萃取，然后加入盐析试剂，促使液体分层，所得上清液即为萃取液。
进一步的，每1.5～2.5g待测样品对应使用8～12mL的水、8～12mL的乙腈、4～6g盐析试剂。
盐析试剂可以是无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠的混合物。
步骤(2)中所述使用滤过式固相萃取柱将萃取液净化并过滤具体为：将滤膜连接于注射式滤过式固相萃取柱底部，然后将萃取液上样，并推动注射器推杆使萃取液依次经过滤过式固相萃取柱以及滤膜。该过程集固相萃取净化和过滤于一体，能够保证萃取液净化充分，快速、简单。
为使萃取液得到充分净化，萃取液经过滤过式固相萃取柱的速度为每分钟30～40滴。
为充分截留萃取液中的干扰物质，步骤(2)中所述滤过式固相萃取柱的填料为N-丙基乙二胺(PSA)(225mg),C18(90mg)，EMR Lipid(250mg),Carbon S(5mg)。
为使目标物最大程度地从色谱柱上洗脱下来，进一步提高测定结果的准确性，步骤(3)中所述超高效液相色谱的梯度洗脱程序为：0min，10％A，90％B；0.5min，10％A，90％B；9min，100％A，0％B；12min，100％A，0％B；12.1min，10％A，90％B；15min，10％A，90％B，以上百分数均为体积百分数。
进一步的，所述超高效液相色谱-串联质谱中所用色谱柱为ACQUITY UPLC BEHC18(2.1*100mm,1.7μm)，柱温为35～45℃。
进一步的，所述超高效液相色谱-串联质谱中所用串联质谱的条件为：扫描方式：正/负离子扫描；电喷雾离子源；离子源温度为120～150℃；多反应监测扫描模式采集；异菌脲监测离子对为330.01/244.7，去簇电压及碰撞能量分别为21V和16V；异菌脲异构体监测离子对为328.01/141.1，去簇电压及碰撞能量分别为-10V和-12V.
本发明的测定方法样品前处理过程简单，萃取液经滤过式固相萃取柱净化后，能够对烟草中的色素及烟草植物组织的其他共萃物(脂肪酸、叶绿素等)起到很好的吸附净化作用，避免了样品浓缩、净化过程造成的待测农药组分损失，能够同时检测烟草及烟草制品中异菌脲及其异构体，且该测定方法灵敏度高、准确度高、重复性好。另外，本发明的测定方法实验操作简单、快捷，简单的前处理过程大大缩短了待测样品的萃取及净化时间。
附图说明
图1为本发明实施例的测定方法流程图；
图2为本发明实验例的加标离子色谱图；
图3为本发明对比例的加标离子色谱图；
具体实施方式
下面结合具体实施例具体说明本发明所述方法的应用。特别需要指出的是，本发明说明书所举实施例只是为了帮助理解本发明，它们不具任何限制作用，即本发明除说明书所举实施例外，还可以有其他实施方式。因此，凡是采用等同替换或等效变换形式形成的任何技术方案，均落在本发明要求的保护范围中。
实施例中涉及的仪器与试剂规格/型号如下：
农药：异菌脲(CAS：63637-89-8)、异菌脲异构体(CAS：36734-19-7)，均为标准品；乙腈为农残级；
Waters TQS四极杆串联质谱仪；Sigma 3-30K离心机(德国Sigma公司)；AE 163电子天平(感量：0.0001g)和AE 166电子天平(感量：0.01g)(瑞士Mettler公司)。
一、实施例
本实施例的烟草及烟草制品中异菌脲及其异构体的测定方法，以烘烤后的烤烟样品为待测样品，测定流程如图1所示，具体包括以下步骤：
(1)将待测样品干燥粉碎，过2mm的筛子，取筛下物；
(2)准确称取2g筛下物(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，加入10mL水，静置10min直至样品被水充分浸润；移取10mL乙腈至离心管中，并以2000rpm速率涡旋振荡3min；然后向离心管中加入盐析试剂(4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠)，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡2min，静置5min，取上清液即为萃取液；
(3)移取萃取液2.0mL于5mL的滤过式固相萃取柱中(N-丙基乙二胺(PSA)(225mg),C18(90mg)，EMR Lipid(250mg),Carbon S(5mg))，并在该柱的底部接上0.45μm的有机相滤膜，推动注射器推杆使得萃取液经过滤过式固相萃取柱并经过滤膜从而得到待测样品溶液；
(4)待测样品溶液用色谱瓶接收，移取200μL，加入800μL乙腈稀释，获得待测液，然后进行测定，具体包括以下过程：
①.制备单一标准储备液：分别称取0.01g目标物(异菌脲及其异构体)标准品(精确至0.0001g)至不同的10mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，制得1.0mg/mL的单一标准工作液；
②.制备混合标准储备液：分别移取两种农药单一标准储备液1.0mL于100mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，配得10μg/mL的混合标准储备液；
③.制备不同浓度的混合标准工作液：分别移取一定体积的混合标准储备液于10mL容量瓶中，用乙腈稀释定容，即配制成不同浓度的混合标准工作液，浓度序列为：0.1μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1.0μg/mL，2.0μg/mL；
④.制备不同浓度的基质混合标准工作液：分别移取上述混合标准工作液200μL和200μL空白样品基质溶液混合，然后加入600μL乙腈，即配制成不同浓度的基质混合标准工作液，浓度序列为：0.02μg/mL，0.05μg/mL，0.1μg/mL，0.2μg/mL，0.4μg/mL；
其中，空白样品基质溶液的制备方法如下：准确称取2g研磨后的空白烟叶样品(不含异菌脲及其异构体)于50mL具盖离心管中，加入10mL水，静置10min直至样品被水充分浸润；移取10mL乙腈至离心管中，并以2
000rpm速率涡旋振荡3min；然后向离心管中加入盐析试剂(4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠)，立即于漩涡混合振荡仪上，以2000rpm速率振荡2min，静置5min，取上清液即为萃取液；移取萃取液2.0mL于5mL的注射式滤过式固相萃取柱中(N-丙基乙二胺(PSA)(225mg),C18(90
mg)，EMR Lipid(250mg),Carbon S(5mg))，并在该柱的底部接上0.45μm的有机相滤膜，推动注射器推杆使得萃取液经过滤过式固相萃取柱并经过滤膜，所得滤液即空白样品基质溶液。
⑤.分别对上述不同浓度的基质混合标准工作液注入超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)，并对各标样峰面积(y)和其浓度(x)进行线性回归分析，得到标准曲线，相关系数在0.999以上；
⑥.对待测液进行测定，测得农药的色谱峰面积，代入标准曲线，即可计算得到样品中的异菌脲及其异构体含量。
测定时采用的色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1*100mm,1.7μm,美国waters公司)；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为H2O(0.1％甲酸)；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL；梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
测定时采用的质谱条件：扫描方式：正/负离子扫描；电喷雾离子源(ESI)；离子源温度150℃；锥孔气流量：55L/hour；脱溶剂气流量：800L/hour；脱溶剂气温度：350℃；多反应监测扫描模式采集(MRM模式采集)，MRM参数见表2。
表2MRM参数
二、实验例
按照实施例1中的测定方法，测得该样品中异菌脲的残留量为0.38mg/kg，异菌脲异构体未检出。
实验过程中，对本发明的测定方法的灵敏性、准确性和重复性进行了验证，具体结果如下。
1、灵敏性
将不同浓度的异菌脲及其异构体农药标准工作溶液注入UPLC-MS/MS，以3倍信噪比(S/N＝3)计算检测限(LOD)，检测限在0.09mg/kg-0.15mg/kg之间，即本发明的测定方法的灵敏度高。
2、准确性和重复性
为判断该测定方法的准确性，处理前，在待测烟叶样品中加入10μg/mL的异菌脲及其异构体标准溶液，使得烟叶样品中异菌脲及其异构体的含量为2.38mg/kg和2.0mg/kg，进行与实施例1中相同的样品前处理过程，以UPLC-MS测得异菌脲及其异构体选择离子峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中异菌脲及其异构体平均含量分别为2.30mg/kg和1.96mg/kg，即异菌脲及其异构体的平均加标回收率为96.6％和98.0％，重复测定6次，结果见表3，色谱图如图2所示。
表3两种化合物的加标回收率和重复性(n＝6)
由以上结果可知，采用本发明的测定方法对异菌脲及其异构体测定的平均相对标准偏差(RSD)小于6.0％，说明本发明方法的重复性好。对比图2与图3可知，本发明实施例所得的色谱图无杂峰干扰，说明净化效果优于对比文献，且本发明的回收率(91.6％-98.8％)也高于对比例中的测定方法的回收率(85.6％-92.3％)，说明本发明的测定方法干扰少、准确性高。
三、对比例
本对比例以烟草行业标准YC/T 405.1-2011《烟草及烟草制品多种农药残留量的测定第1部分：高效液相色谱-串联质谱法》的条件对实施例1中的加标烟叶样品(烟叶样品中异菌脲及其异构体的含量为2.38mg/kg和2.0mg/kg)进行处理，回收率在85.6％-92.3％之间，RSD在4.5％～7.4％，色谱图如同3所示。
Claims (10)
1.一种超高效液相色谱-串联质谱分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测样品用乙腈萃取、分离，得萃取液；
(2)使用滤过式固相萃取柱将萃取液净化并过滤，得待测样品溶液，滤过式固相萃取柱的填料为N-丙基乙二胺(PSA)、C18、EMR Lipid、Carbon S的混合；
(3)使用超高效液相色谱-串联质谱对待测样品溶液中的异菌脲及其异构体进行测定；所述超高效液相色谱的流动相由流动相A和流动相B组成，其中流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0.1％的甲酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，步骤(1)中所述萃取液的制备方法为：先用水将待测样品润湿，再加入乙腈萃取，然后加入盐析试剂，所得上清液即为萃取液。
3.根据权利要求2所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，每1.5～2.5g待测样品对应使用8～12mL的水、8～12mL的乙腈、4～6g盐析试剂。
4.根据权利要求2或3所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，所述盐析试剂为无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠的混合物。
5.根据权利要求1所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，步骤(2)中所述使用滤过式固相萃取柱将萃取液净化并过滤具体为：将滤膜连接于注射式滤过式固相萃取柱底部，然后将萃取液上样，并推动注射器推杆使萃取液依次经过滤过式固相萃取柱以及滤膜。
6.根据权利要求5所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，萃取液经过滤过式固相萃取柱的速度为每分钟30～45滴。
7.根据权利要求1所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，滤过式固相萃取柱的填料的具体配料为N-丙基乙二胺：225mg，C18：90mg，EMR Lipid：250mg，CarbonS：5mg。
8.根据权利要求1所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，步骤(3)中所述超高效液相色谱采用梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为：0min，10％A，90％B；0.5min，10％A，90％B；9min，100％A，0％B；12min，100％A，0％B；12.1min，10％A，90％B；15min，10％A，90％B，以上百分数均为体积百分数。
9.根据权利要求1或8中所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-串联质谱中所用色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1*100mm,1.7μm)，柱温为35～45℃。
10.根据权利要求1或8中所述的分离和测定异菌脲及其异构体的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱-串联质谱中所用串联质谱的条件为：扫描方式：正/负离子扫描；电喷雾离子源；离子源温度为120～150℃；多反应监测扫描模式采集；异菌脲监测离子对为330.01/244.7，去簇电压及碰撞能量分别为21V和16V；异菌脲异构体监测离子对为328.01/141.1，去簇电压及碰撞能量分别为-10V和-12V。
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