CN117925434B - 粪肠球菌mnh 22871及其应用 - Google Patents

粪肠球菌mnh 22871及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117925434B
CN117925434B CN202211339821.9A CN202211339821A CN117925434B CN 117925434 B CN117925434 B CN 117925434B CN 202211339821 A CN202211339821 A CN 202211339821A CN 117925434 B CN117925434 B CN 117925434B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
liver cancer
drug
mnh
tumor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202211339821.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117925434A (zh
Inventor
赵莹莹
贤一博
肖晨
邓由声
赵国振
林诠盛
常曌
张倩
张东亚
蒋先芝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Moon Guangzhou Biotech Co Ltd
Original Assignee
Moon Guangzhou Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Moon Guangzhou Biotech Co Ltd filed Critical Moon Guangzhou Biotech Co Ltd
Priority to CN202211339821.9A priority Critical patent/CN117925434B/zh
Publication of CN117925434A publication Critical patent/CN117925434A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117925434B publication Critical patent/CN117925434B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种粪肠球菌MNH 22871及其应用，涉及微生物技术领域，本发明提供的粪肠球菌MNH 22871，菌种保藏号为GDMCC NO：62663，通过实验证实，粪肠球菌菌株MNH 22871通过菌株自身的特点，能够有效抑制肝癌肿瘤的生长速度和生长体积，在一定的给药剂量下其抑瘤率不低于40％，具有较佳的应答性抗肿瘤药效，具备肝癌单药治疗药效，有望解决现阶段肝癌“多药耐药”的治疗难题。

Description

粪肠球菌MNH 22871及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种粪肠球菌MNH 22871及其应用。
背景技术
原发性肝癌是我国第四位的常见恶性肿瘤，每年约有38.3万人死于肝癌，超过全球肝癌死亡病例数的一半。我国肝癌在发病原因，分子生物学特征和流行病学特点，临床表现与分期，甚至治疗的策略与手段上，都与国外不同，是具有中国特色的肿瘤之一。
此外，肝脏是最常见的癌转移靶器官，肝脏细胞和免疫细胞共同组成“促转移微环境”。肝癌发生发展均与微环境密切相关：微环境紊乱会促进肝癌的发生，而微环境免疫炎症反应的失衡是微环境紊乱最关键机制之一。肝脏微环境还决定了肝癌病理类型。在凋亡微环境下，通过免疫炎症表观调控最终形成肝细胞癌；坏死微环境下，通过免疫炎症表观调控最终形成胆管细胞癌。
然而，肝癌细胞作为一种先天性耐药的肿瘤细胞，普遍对放化疗不敏感，其耐药机制更是复杂多样；谷胱甘肽巯基转移酶(glutathionine S-transferase，GST)、DNA拓扑异构酶(Topo)及蛋白激酶C(PKC)是造成肝癌细胞产生多药耐药的主要酶类。且肝癌患者早期症状缺乏典型性，多数患者确诊已为晚期，生存期短，复发率高，随之而来的对化疗药物敏感性降低，继之“多药耐药”成为原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)治疗失败的重要原因之一。如何有效治疗肝癌成为亟待解决的技术问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一株特定的粪肠球菌，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了粪肠球菌MNH 22871，所述粪肠球菌MNH 22871菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC NO：62663。
进一步地，所述粪肠球菌MNH 22871低产丁酸和/或戊酸。
本发明还提供了菌剂，所述菌剂包括上述的粪肠球菌MNH 22871。
本发明还提供了上述的粪肠球菌MNH 22871或菌剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。
此外，本发明还提供了治疗肝癌的药物，包括上述的粪肠球菌MNH 22871或菌剂。
进一步的，所述药物通过减小肿瘤体积实现治疗肝癌。
进一步的，所述药物的抑瘤率≥40％。
进一步的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
进一步的，所述药物的剂型包括口服制剂。
进一步的，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
进一步的，当所述药物为液体剂型时，有效给药剂量为活菌数8.0×109～2.5×1010CFU/mL。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的发明人通过大量的实验验证，粪肠球菌菌株MNH 22871通过菌株自身的特点，能够有效抑制肝癌肿瘤的生长速度和生长体积，在一定的给药剂量下其抑瘤率不低于40％，具有较佳的应答性抗肿瘤药效，具备肝癌单药治疗药效，有望解决现阶段肝癌“多药耐药”的治疗难题。
基于粪肠球菌菌株MNH 22871的上述性能，本发明提供的包含其的菌剂或药物，以及对粪肠球菌菌株MNH 22871的应用，也具有上述的有益效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的菌株MNH 22871菌落形态；
图2为本发明实施例提供的菌株MNH 22871革兰氏染色结果；
图3为本发明实施例提供的菌株MNH 22871显微形态照片；
图4为本发明实施例提供的菌株MNH22871 API 20A测试结果；
图5A为本发明实施例提供的菌株MNH22871 pH耐受性结果图；
图5B为本发明实施例提供的菌株MNH22871 NaCl耐受性结果图；
图5C为本发明实施例提供的菌株MNH22871胆盐耐受性结果图；
图6为本发明实施例提供的菌株MNH22871系统发育树；
图7为本发明实施例提供的菌株MNH22871在肝癌治疗模型中的实验结果；其中，A为Control组与MNH22871活菌药物治疗组在不同时间点的肿瘤体积大小变化曲线；B为Control组与MNH22871活菌药物治疗组在终点肿瘤大小；C为Control组与MNH22871活菌药物治疗组在终点肿瘤质量；D为Control组与MNH22871活菌药物治疗组在终点肿瘤抑瘤率；
图8A为本发明实施例提供的同种不同株在肝癌治疗模型中抑制肿瘤生长体积曲线；
图8B为本发明实施例提供的同种不同株在肝癌治疗模型中治疗终点的肿瘤体积；
图8C为本发明实施例提供的同种不同株在肝癌治疗模型中治疗终点的平均抑瘤率。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，提供了一株粪肠球菌MNH 22871，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为Enterococcus sp.MNH 22871，保藏编号为GDMCC NO：62663，保藏时间2022年7月28日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所，提议的分类名称为Enterococcus sp.。
粪肠球菌属于动物肠道内的正常菌群，一般认为粪肠球菌对动物或人的机体无害，是一种共生菌。目前研究已经证实，粪肠球菌可在肠道上皮细胞上形成生物膜，保护肠上皮细胞免受有害物质侵袭；同时，粪肠球菌菌体含多种小肽，能促进氨基酸及残基的吸收，提高组织蛋白的合成；此外，粪肠球菌与结直肠癌的发生、发展和治疗都具有紧密联系。肝癌作为是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤，其在病因、症状、治疗方案和预后上均与结直肠癌不同，粪肠球菌作为肠道微生物在肠道定植后并不能直接与肝癌组织结构接触，并且，活菌药物进入肠道之后，在肠道内面临着极其复杂的肠道环境，与其他菌群之间的稳态关联等。本发明通过筛选粪便样本，得到一株对肝癌具有治疗功能的菌株——粪肠球菌MNH 22871，通过活体动物实验证实在目标活菌药物不与肿瘤组织直接接触的情况下，仍然能够有效作用于肝癌肿瘤组织，抑制肝癌肿瘤生长速度，具有较高的抑瘤率并且具有较佳的应答性抗肿瘤药效。
值得注意的是，目前已经公开了肠道菌群影响癌症免疫治疗效果是依赖于其自身代谢物丁酸和戊酸，然而本发明的粪肠球菌菌株通过SCFA的测量结果表明，本发明的菌株低产丁酸和戊酸，由此可以推断菌株MNH22871是利用了自身的个性实现抗肿瘤的效果。其中，“低产”指的是丁酸产量不高于0.65μg/g，戊酸产量不高于0.07μg/g。
本发明提供的粪肠球菌MNH 22871的16sDNA部分序列如SEQ ID NO.1所示，通过将SEQ ID NO.1和NCBI 16S ribosomal RNA sequences数据库进行比对，最接近的物种为Enterococcus faecium，相似度为99.92％。
菌株MNH 22871的菌落特征为：MYPG固体平板培养基，37℃厌氧培养36h后，平板培养基上形成可见菌落，菌落圆形，边缘规则且光滑，直径约2mm，乳白色，不透明，菌落周边无分泌物形成；菌株革兰氏阳性；显微形态观察发现菌株无芽孢，无鞭毛，不运动，球形，直径约5～8μm。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种包含上述粪肠球菌MNH 22871的菌剂，所述菌剂由于包含上述粪肠球菌MNH 22871，因此具有粪肠球菌MNH 22871的所有有益效果，在此不再赘述。可以理解的是，所述菌剂可以只含有粪肠球菌MNH 22871，以使菌剂具有粪肠球菌MNH 22871的功能；所述菌剂也可以含有其他种类的微生物，粪肠球菌MNH22871可以作为菌剂中的主要活性成分或辅助活性成分。
基于粪肠球菌MNH 22871的抑制肝癌能力，本发明还提供了上述粪肠球菌MNH22871或菌剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。应用粪肠球菌MNH 22871作为活性成分治疗肝癌，能够有效抑制肝癌肿瘤的生长速度和生长体积，在一定的给药剂量下其抑瘤率不低于40％。
此外，基于上述应用，本发明还提供了一种治疗肝癌的药物，该药物包含了粪肠球菌MNH 22871。所述药物具有较佳的应答性抗肿瘤药效，具备肝癌单药治疗药效，有望解决现阶段肝癌“多药耐药”的治疗难题。
在一些实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
药学上可接受的辅料是指生产药品和调配处方时，使用的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。在本发明提供的药物中添加的药学上可接受的辅料，能够起到赋型、充当载体或提高稳定性的作用，此外，还具有增溶、助溶或缓控释等重要功能。典型但非限制性的药学上可接受的辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、pH调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂或释放阻滞剂中的一种或多种。
在一些可选的实施方式中，所述药物的剂型包括口服制剂。上述药物可制成任意口服可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。
为了保证所述药物对肝癌的治疗效果，优选当所述药物为液体剂型时，有效给药剂量为活菌数8.0×109～2.5×1010CFU/mL，例如可以为，但不限于8.0×109CFU/mL、9.0×109CFU/mL、1.0×1010CFU/mL、2.0×1010CFU/mL或2.5×1010CFU/mL。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1菌株分离
本发明涉及到的肠道菌株MNH 22871分离自云南省大理市的一位健康自愿者的粪便样本。
捐赠者自取新鲜粪便2-5克，放入样本收集保存管中，震荡匀质后将处理好的粪便样本置于冰盒中，并于24小时内送达实验室进行菌株分离。
生物安全柜中分装生理盐水，9ml/管；准备菌株分离培养基--厌氧血琼脂平板、哥伦比亚血琼脂平板、巧克力琼脂平板等，并提前24h将其转入厌氧工作站内，标记样品信息，培养基类型，分离日期等。
取新鲜粪便样本置于厌氧操作站(Don Whitley Scientific A95)使用漩涡振荡器震荡1min，混匀，吸取1mL样本到9mL生理盐水中，混匀为10-1稀释液，然后梯度稀释至10-6稀释液，备用。
取10-6稀释液滴于分离培养基--厌氧血琼脂平板、哥伦比亚血琼脂平板、巧克力琼脂平板中，滴加量为100μL/皿，涂布均匀，待平板表面干燥后，平板倒置，37℃培养3--5天。
观察分离培养基菌株生长状况并用灭菌牙签挑取单菌落，进行菌株纯化，纯化菌株置于37℃，厌氧培养。
将纯培养菌株制备成20％甘油/水-菌液，-86℃低温保存。
采用基于菌株16S rRNA基因序列鉴定方法进行菌株鉴定。
实施例2菌株形态特征及生理生化特征
1、菌株形态特征：
菌株MNH 22871，接种于MYPG固体平板培养基，37℃厌氧培养36h后，平板培养基上形成可见菌落，菌落圆形，边缘规则且光滑，直径约2mm，乳白色，不透明，菌落周边无分泌物形成(图1)；菌株革兰氏阳性(图2)；显微形态观察发现菌株无芽孢，无鞭毛，不运动，球形，直径约5-8μm(图3)。
2、菌株生理生化特征：
(1)API 20A测试菌株生理生化特征
API试剂条(本研究使用API 20A)，具体实验操作见API试剂操作指引。培养条件：37℃，厌氧。
菌株MNH22871 API 20A测试结果(图4)
(2)菌株PH、NaCl、胆盐耐受性：
菌株MNH 22871，温度生长范围30～42℃，最适生长是37℃；在pH 5.0～10.0的范围内可以生长，最适生长pH为7.0～9.0(见图5A)；最高可耐受6％ NaCl(见图5B)；菌株MNH22871能在胆盐浓度为0～0.40％范围内存活生长，在胆盐浓度大于等于0.2％时不能生长(见图5C)。菌株MNH 22871在有氧的条件或厌氧条件下均生长良好，属于兼性厌氧细菌。
3、菌株MNH22871抗生素敏感性测试：
使用纸片扩散法进行菌株MNH 22871抗生素敏感性测试。测试结果见表1。菌株MNH22871对氯霉素、四环素、青霉素、复方新诺明、氨苄西林、林可霉素和头孢曲松等抗生素敏感；菌株MNH 22871对红霉素、环丙沙星、庆大霉素等抗生素出现抗性。
表1菌株MNH 22871抗生素敏感性测试结果
实施例3菌株的鉴定
1、菌株MNH22871的16S序列：
SEQ ID NO.1：
CCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCAAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGT。
2、菌株MNH22871的16S鉴定结果：
(1)菌株MNH22871的鉴定
对分离菌株(菌株命名为MNH22871)进行16S rRNA分析，初步确定其分类地位。对菌株进行基因组DNA提取，利用提取的基因组DNA模板进行16S rRNA的扩增，扩增引物是1492R(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)(SEQ ID NO.2)和27F(5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)(SEQ ID NO.3)，将扩增的PCR产物进行纯化，然后进行ABI3730XL测序，从而获得1194bp的16S rRNA序列，其序列见SEQ ID NO.1所示。
将此序列和NCBI 16S ribosomal RNA sequences数据库进行比对，最接近的物种为Enterococcus faecium，相似度为99.92％，初步确定此菌株的物种分类信息，即初步判定MNH22871属于Enterococcus faecium。
(2)菌株MNH22871的系统发育树
使用MEGA-X软件，首先从LPSN数据库中调取MNH22871所在Enterococcus菌属下的所有菌株的16S rRNA基因序列，然后使用MUSCLE方法对上述16S序列及MNH22871的16S序列进行多序列比对，最后采用最大似然法，进行1000次的相似度重复计算，构建系统发育树(图6)。
(3)菌株MNH22871的ANI比对结果
本实施例对实施例1分离获得的MNH22871原始菌株进行基因组的制备、测序，组装和分析。
MNH22871原始菌株的基因组通过超声波法进行序列片段化，片段化长度范围～350bp，然后利用标准DNA建库试剂盒(NEB UltraTM)构建Illumina测序文库。将构建好的测序文库利用NovaSeq(Illumina)进行双端150bp测序。测序得到2.01Gbp数据，其中Q20占比为：97.54％。
基因组原始测序数据使用fastp(版本：0.20.0)进行数据过滤，过滤参数：“--poly_g_min_len 10--poly_x_min_len 10-q 15-u 40-n 5-l 50”。过滤后的原始数据使用SPAdes(版本：v3.14.0)进行基因组组装，组装参数“--isolate--cov-cutoff 10”。基因组组装得到基因总长度2.44Mbp，N50长度为1.11kbp，GC含量为38.11％。基因组相似度最高的菌株为：Enterococcus faecium，其中平均核苷酸相似度(ANI)为99.16％，基因覆盖度为91.47％。综上，可以确定本申请的菌株为Enterococcus faecium。
实施例4菌株的基因组分析
1、耐药基因分析
基因组基因使用原核分析软件基因组注释流程prokka(版本：1.14.5)进行基因组基因预测分析，参数“--gcode 11--evalue 1e-09”。总共预测得到2291条CDS序列，其中平均CDS序列长度为912bp。
基因组中潜在的抗生素耐药基因使用RGI流程分析(版本：4.2.2)，其中抗生素耐药基因数据库为CARD(版本：3.0.0，https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi)。详细对比信息参照表2所示。
表2耐药基因信息列表
菌株基因 抗性基因 基因名称 比对一致性(％)
MNH22871_01250 ARO:3003954 efmA 99.77
MNH22871_02162 ARO:3002556 AAC(6')-Ii 99.45
MNH22871_01567 ARO:3003761 eatAv 98.4
2、潜在毒性基因分析
对基因组中潜在的毒力因子及相关基因的分析采用的是NCBI blastp(版本为：2.7.1+)比对毒力因子数据库VFDB(virulence factor database，http://www.mgc.ac.cn/cgi bin/VFs/v5/main.cgi，更新日期为2019年9月19日)。详细比对结果见表3。
表3MNH22871潜在毒性基因列表
菌株基因 VFDB基因 基因名称 比对一致性(％)
MNH22871_00042 VFG048797 ugd 65.206
MNH22871_00044 VFG002182 cpsI 60.882
MNH22871_00088 VFG000964 hasC 75.427
MNH22871_00571 VFG002189 cpsB 73.585
MNH22871_00572 VFG002190 cpsA 78.277
MNH22871_00609 VFG002162 bsh 75.617
MNH22871_00733 VFG002158 lplA1 62.09
MNH22871_00782 VFG000077 clpP 81.122
MNH22871_00990 VFG006717 lap 69.641
MNH22871_01045 VFG037100 msrA/B(pilB) 66.406
MNH22871_01119 VFG002197 bopD 87.463
MNH22871_01172 VFG042979 srtC 68.86
MNH22871_01173 VFG042978 ebpC 74.157
MNH22871_01175 VFG042976 ebpA 63.581
MNH22871_01823 VFG000080 clpE 61.821
MNH22871_01868 VFG048830 gnd 72.281
MNH22871_01915 VFG000079 clpC 62.255
MNH22871_01998 VFG002165 efaA 62.987
MNH22871_02074 VFG000964 hasC 70.408
MNH22871_02338 VFG002162 bsh 77.778
3、潜在初级代谢基因簇分析
对基因组中潜在的初级代谢基因簇的分析采用的是gutSMASH5(版本为：1.0.0)。详细比对结果见表4。
表4MNH22871潜在初级代谢基因簇列表
4、潜在次级代谢基因簇
对基因组中潜在的次级代谢基因簇的分析采用的是antiSMASH6(版本为：6.0.1)。详细比对结果见表5。
表5MNH22871潜在次级代谢基因簇列表
基因簇范围 类型 从 到 最类似的已知基因簇 相似性
Region 7.1 cyclic-lactone-autoinducer 102773 118399 - -
Region 14.1 T3PKS 1 37667 - -
Region 39.1 RiPP-like 1 1539 - -
实施例5菌株的短链脂肪酸(SCFA)测定
1.菌体制备
将菌株MNH22871接种在液体培养基中，37℃厌氧培养48小时，离心收集菌体，收集物置于-86℃低温保存，待用。
2.标准品配制
称量乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸标准品，用乙酸乙酯配制成0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL和100μg/mL八个混合标准浓度梯度。
取600μL标准品，加入25μL终浓度为500μM的4-甲基戊酸作为内标，混匀加入进样瓶，进入GC-MS检测，进样量1μL，分流比10:1，分流进样。
3.代谢物提取
将样品冰上解冻，取80mg样品于2mL玻璃离心管中，加入900μL0.5％的磷酸重悬，震荡混匀2min，14000g离心10min，取上清液800μL，加入等量的乙酸乙酯提取，震荡混匀2min，14000g离心10min，取600μL上层有机相，加入终浓度为500μM的4-甲基戊酸作为内标，混匀加入进样瓶，进入GC-MS检测，进样量1μL，分流比10:1，分流进样。
4.样本检测分析
采用Agilent DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm ID×0.25μm)气相色谱系统对样本进行分离。程序升温：初始温度90℃，以10℃/min升温至120℃，再以5℃/min升温至150℃，最后以25℃/min升温至250℃，并维持2min。载气为氦气载气流速1.0mL/min。
采用Agilent 7890A/5975C气质联用仪进行质谱分析。进样口温度250℃，离子源温度230℃，传输线温度250℃，四极杆温度150℃。电子轰击电离(EI)源，全扫及SIM扫描方式，电子能量70eV。
采用MSD ChemStation软件提取色谱峰面积及保留时间。绘制标曲曲线，计算样品中短链脂肪酸的含量。
表6.菌株MNH22871短链脂肪酸(SCFA)产量结果
由检测结果可见，菌株MNH22871在生长过程中低产丁酸和戊酸。虽然丁酸和戊酸在现有技术中被证明是CD8+CTL的抗肿瘤活性的代谢产物；也是抑制HDAC活性、实现抗肿瘤的重要代谢产物，然而本发明的粪肠球菌菌株通过SCFA的测量结果表明，本发明的菌株低产丁酸和戊酸，对于肝癌的治疗效果并不是依赖于已知的丁酸，戊酸等代谢产物实现抗肿瘤的效果。
实施例6菌株对肿瘤的治疗效果验证实验
1、实验方法
透过于BALB/C小鼠H22同源性皮下移植瘤治疗性肝癌模型，动物饲养在独立通气笼(IVC)中，笼盒材质为聚亚苯基砜树脂(PPSU)，笼盒规格为372mm×205mm×172mm，每笼3-4只。屏障环境动物房通风良好，最小换气次数不低于15次/小时，相通区域最小静压差≥10Pa。环境条件控制在温度20.0℃～26.0℃，相对湿度控制在40％～70％，照明采用12h/12h昼夜明暗交替，动物自由摄食合格的SPF级大小鼠维持饲料(生产单位：江苏省协同医药生物工程有限责任公司)。雄性BALB/C小鼠检疫结束后，进行H22小鼠肝癌细胞右肩胛骨处以皮下注射接种(2×105cells/只)，当肿瘤生长至平均体积80-100mm3时，剔除肿瘤生长异常的小鼠并进行肿瘤体积随机分层分组。分组当天开始给药，Control组与MNH22871组各自每天口服灌胃给予200μL对照品(PBS-Cys(甘))或MNH22871细菌重悬液(1～5×109CFU)，一天一次，任意一组小鼠肿瘤平均体积超过2000mm3为整体试验终点，试验过程进行一般临床观察、体重监测、肿瘤体积(mm3)测量，到达试验终点后对全部存活小鼠进行解剖取材，量测肿瘤重量与计算肿瘤体积，最后进行肿瘤体积曲线变化(Tumor volume)、终点肿瘤体积(Tumor volume at endpoint)、终点肿瘤质量(Tumor weight at endpoint)与终点肿瘤抑瘤率(Tumor inhibition rate at endpoint)等统计分析与比较，抑瘤率:(对照组平均体积-实验组体积)/对照组平均体积×100％，评价标准：抑瘤率<40％代表低/未应答抗肿瘤药效；抑瘤率≥40％代表应答性抗肿瘤药效，所有数据采用mean±SD形式表示，用GraphPadPrism 8.0.2软件绘图和统计分析。对于两两比较，采用t检验(Student’s t test)分析方法，对于双因素考察则透过双因素方差搭配Sidak多重比较进行分析，差异显著性用*表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
供试菌株：MNH22871活菌悬液(8.0×109CFU/mL≤活菌数≤2.5×1010CFU/mL)。
肿瘤细胞：H22小鼠肝癌细胞。
2、菌株MNH22871对肿瘤治疗的实验结果
于H22肝癌治疗型模型中，于肿瘤约80-100mm3介入干预，MNH22871可以展现抑制肿瘤生长体积曲线(图7中的A)，达到统计显著差异，并且可以降低终点的肿瘤体积大小(图7中的B)与肿瘤质量(图7中的C)，进一步分析终点肿瘤抑瘤率，MNH22871的终点平均抑瘤率接近40％(图7中的D)，并且有42.86％(3/7)为抑瘤率(抑瘤率<40％代表低/未应答抗肿瘤药效；抑瘤率≥40％代表应答性抗肿瘤药效)；提示MNH22871较佳的应答性抗肿瘤药效，具备有肝癌单药治疗药效。以上所有数据采用mean±SD形式表示，用GraphPad Prism 8.0.2软件绘图和统计分析。对于双因素考察则透过双因素方差搭配Sidak多重比较进行分析(A)；对于两两比较(B-D)，采用t检验(Student’s t test)分析方法，差异显著性用*表示，***p＜0.001。
3、Enterococcus faecium不同菌株在肝癌治疗模型中的实验比较结果
发明人还分离得到同种的另一菌株C(MNH09296)，本实验通过比较MNH22871(B)和同种的另一菌株C在肝癌治疗模型中治疗效果，采用的实验方法同上；H22小鼠肝癌细胞右肩胛骨处以皮下注射接种(2×105cells/只)，当肿瘤生长至平均体积80-100mm3时，剔除肿瘤生长异常的小鼠并进行肿瘤体积随机分层分组。利用H22肝癌治疗型模型中，于肿瘤约80-100mm3介入干预。
MNH22871与同种的另一菌株C在抑制肿瘤生长体积曲线比较(图8A)，达到统计显著差异，并且可以降低终点的肿瘤体积大小(图8B)，进一步分析终点肿瘤抑瘤率，MNH22871的终点平均抑瘤率大于同种的另一菌株C(图8C)，同种菌株中，本发明的MNH22871相对另一菌株具有更好的应答性抗肿瘤药效。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.粪肠球菌(Enterococcus faecium)，其特征在于，所述粪肠球菌菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC NO：62663。
2.菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的粪肠球菌。
3.权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的菌剂在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。
4.治疗肝癌的药物，其特征在于，包括权利要求1所述的粪肠球菌或权利要求2所述的菌剂。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求4或5所述的药物在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。
7.如权利要求3或6所述的应用，其特征在于，所述药物通过减小肿瘤体积或抑制肿瘤生长实现治疗或预防肝癌。
8.根据权利要求3或6所述的应用，其特征在于，所述药物的抑瘤率≥40％。
9.根据权利要求3或6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括口服制剂。
10.根据权利要求3或6所述的应用，其特征在于，当所述药物为液体剂型时，有效给药剂量为活菌数8.0×109～2.5×1010CFU/mL。
CN202211339821.9A 2022-10-26 2022-10-26 粪肠球菌mnh 22871及其应用 Active CN117925434B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211339821.9A CN117925434B (zh) 2022-10-26 2022-10-26 粪肠球菌mnh 22871及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211339821.9A CN117925434B (zh) 2022-10-26 2022-10-26 粪肠球菌mnh 22871及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117925434A CN117925434A (zh) 2024-04-26
CN117925434B true CN117925434B (zh) 2025-02-14

Family

ID=90761589

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211339821.9A Active CN117925434B (zh) 2022-10-26 2022-10-26 粪肠球菌mnh 22871及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117925434B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107133A (zh) * 2021-12-22 2022-03-01 苏州普瑞森生物科技有限公司 一种抗结直肠肿瘤的屎肠球菌及其应用
CN115044504A (zh) * 2022-06-02 2022-09-13 郑州大学 一株粪肠球菌yz-1及其益生性应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6783247B2 (ja) * 2015-01-23 2020-11-11 テンプル ユニヴァーシティ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイアー エデュケーション ガン予防における短鎖脂肪酸の使用
WO2021015514A1 (ko) * 2019-07-19 2021-01-28 한국 한의학 연구원 엔테로코쿠스 락티스를 유효성분으로 포함하는 지방간 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
CN114917252A (zh) * 2021-12-29 2022-08-19 慕恩（广州）生物科技有限公司 毛螺菌科微生物菌株、预防和/或治疗肿瘤的药物及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114107133A (zh) * 2021-12-22 2022-03-01 苏州普瑞森生物科技有限公司 一种抗结直肠肿瘤的屎肠球菌及其应用
CN115044504A (zh) * 2022-06-02 2022-09-13 郑州大学 一株粪肠球菌yz-1及其益生性应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN117925434A (zh) 2024-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pang et al. Lactobacillus rhamnosus from human breast milk ameliorates ulcerative colitis in mice via gut microbiota modulation
CN113038957A (zh) 微生物群
Ser et al. Antioxidant and cytotoxic potentials of Streptomyces gilvigriseus MUSC 26T isolated from mangrove soil in Malaysia
CN104024430A (zh) 用于诊断和治疗心脏缺陷的方法
CN110938572B (zh) 一种减轻鼻咽癌放化疗副作用的益生菌组合物及制备方法
CN114917252A (zh) 毛螺菌科微生物菌株、预防和/或治疗肿瘤的药物及应用
CN117106672A (zh) 一种改善衰老相关的认知障碍的短双歧杆菌及其应用
CN113897302A (zh) 一种可缓解结肠炎的双歧杆菌及其应用
CN113186136B (zh) 一种多重耐药的幽门螺旋杆菌及其应用
Santos et al. Endophytes isolated from passion fruit plants: molecular identification, chemical characterization and antibacterial activity of secondary metabolites
CN116515666A (zh) 一株具有治疗痤疮作用的瑞士乳杆菌及其应用
Borkar Mucormycosis: a surge in mucorales fungal infection in post–covid patients in Indian States and insight into known and unknown factors
CN113337440A (zh) 一株唾液乳杆菌mg-587及其应用
CN114796284A (zh) 微生物菌株、预防或治疗肿瘤的药物及应用
Purwestri et al. Metabolic profiling of endophytic bacteria from Purwoceng (Pimpinella pruatjan Molkend) root and antibacterial activity against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa
CN117925434B (zh) 粪肠球菌mnh 22871及其应用
CN119055686A (zh) 嗜黏蛋白阿克曼氏菌yg2645在改善糖脂代谢中的应用
CN118909880A (zh) 一种动物双歧杆菌乳亚种及其在调节糖脂代谢和运动能力中的应用
TW202212564A (zh) 普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）菌株及其用途
CN117016673B (zh) 一种枯草芽孢杆菌在改善蛋鸡的肠道菌群或肠道健康或营养吸收中的应用
CN117887605B (zh) 埃氏巨球菌菌株及其应用以及包含其的预防或治疗肝部肿瘤的药物
Giri et al. Secreted microbial metabolites modulate gut immunity and inflammatory tone
Xu et al. Fermencin B2: A promising heat-stable cationic peptide for targeted inhibition of Staphylococcus aureus
EP4046643A1 (en) A method of treating or preventing colorectal cancer
CN114149942B (zh) 一株东洋芽孢杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant