CN117924451A - 转录因子cib3及其编码基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了转录因子CIB3及其编码基因的应用，所述转录因子CIB3为：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的广金钱草转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人参转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的三七转录因子CIB3或氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的黑果枸杞转录因子CIB3。黑果枸杞本发明首次发现了广金钱草、人参、三七、黑果枸杞4种植物中的一类转录因子CIB3可以促进植物毛状根生长和膨大，可以用于促进植物毛状根生长和膨大的分子育种中，对培育高产高质广金钱草或甘草等植物的新种质具有重要意义，为植物毛状根的应用提供了可行的方法。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，更具体地，本发明涉及一类转录因子CIB3及其编码基因在促进毛状根膨大中的应用。
背景技术
毛状根遗传性质稳定，在药用植物领域，利用毛状根可以实现药用植物的关键药用成分次生代谢产物的大量生产。到目前为止，已经报道了许多种药用植物建立了毛状根体系，并获得了高产量的次生代谢产物，例如喜树碱、长春碱、类黄酮、丹参酮类、人参皂苷、姜黄素等，其中长春花、紫草、胡萝卜等植物毛状根已经达到了工业化生产水平。
目前人们主要通过改变培养毛状根的外在条件，如光照、温度、培养基的pH值、培养基成分、及外源激素等方法来提高毛状根中次生代谢产物的含量。但通过改变这些传统的外在生长环境的方法往往受限于药用植物本身的遗传因素，导致许多药用植物毛状根中次生代谢产物含量提升效果有限。
目前植物毛状根次生代谢产物合成调控机制主要分为3部分内容，分别是：(1)、调控毛状根目标药效成分合成关键酶的研究；(2)、调控毛状根目标药效成分合成的重要转录因子研究；(3)、调控毛状根目标药效成分合成的新颖分子调控因子研究。但是目前对促进植物毛状根膨大的研究较少。
bHLH转录因子中CIB转录因子的主要功能是调控植物的开花、生长发育和胁迫响应等等。据报道，CIB家族的CIB1、CIB2、CIB3、CIB4及CIB5可以调控拟南芥的开花和胁迫。其中有研究表明，CIB3在光调节的生长发育过程中起作用，如在苗期叶片感知光周期诱导和光信号输出途径中发挥作用。此外，有研究人员通过构建CIB3共表达基因网络，发现CIB3与信号转导、泛素化、光合作用及植物的生长发育等相关基因表达呈明显的相关性，推测CIB3可能参与相应的生命过程。
由此，应用植物转录因子调控植物毛状根生长过程具有重要的意义，然而，利用转录因子调控药用植物毛状根膨大的研究至今未见报道，这限制了药用植物毛状根的工业化发展及在次生代谢产物合成和改良植物品种的发展。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供转录因子CIB3及其编码基因的应用，所述转录因子CIB3及其编码基因可以显著促进植物毛状根的膨大。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了转录因子CIB3在促进植物毛状根膨大或植物毛状根分子育种中的应用，所述转录因子CIB3为：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的广金钱草转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人参转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的三七转录因子CIB3或氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的黑果枸杞转录因子CIB3。
本发明的第二方面，提供了转录因子CIB3的编码基因在促进植物毛状根膨大或植物毛状根分子育种中的应用，所述转录因子CIB3的编码基因为：核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的广金钱草转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的人参转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的三七转录因子CIB3的编码基因或核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因。
本发明的第三方面，提供了过表达载体在促进植物毛状根膨大或植物毛状根分子育种中的应用，所述过表达载体为：广金钱草转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、人参转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、三七转录因子CIB3的编码基因的过表达载体或黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的过表达载体。
本发明的第四方面，提供了转化有过表达载体的工程菌在促进植物毛状根膨大或植物毛状根分子育种中的应用，所述过表达载体为：广金钱草转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、人参转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、三七转录因子CIB3的编码基因的过表达载体或黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的过表达载体。
本发明的第五方面，提供了一种促进植物毛状根膨大的方法，包括以下步骤：提高植物中的转录因子CIB3或转录因子CIB3的编码基因表达。
本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人首先克隆得到广金钱草(Grona styracifolia(Osbeck)H.Ohashi&K.Ohashi)、人参(Panax ginseng C.A.Mey.)、三七(Panax notoginseng(Burkill)F.H.Chen ex C.H.Chow)、黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murray)四种植物的转录因子CIB3的编码基因；进一步构建过表达广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3编码基因的载体，分别转入发根农杆菌K599感受态得到过表达载体的工程菌；再使用这4种工程菌诱导广金钱草和甘草无菌苗长出毛根，与对照相比，毛状根显著膨大。本发明首次发现了广金钱草、人参、三七、黑果枸杞4种植物中的一类转录因子CIB3可以促进植物毛状根生长和膨大，可以用于促进植物毛状根生长和膨大的分子育种中，对培育高产高质广金钱草或甘草以及其他药用植物等的新种质具有重要意义，并为植物毛状根的应用提供了可行的方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中克隆得到的广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因与其他CIB家族成员的系统发育关系图。
图2为本发明实施例3中PCR鉴定广金钱草毛状根的图谱。
图3为本发明实施例3中诱导广金钱草毛状根2个月的形态特征。
图4为本发明实施例4中PCR鉴定甘草毛状根的图谱。
图5为本发明实施例4中诱导甘草毛状根2个月的形态特征。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
在本发明的其中一些实施例中，公开了转录因子CIB3在促进植物毛状根膨大能力中的应用，所述转录因子CIB3为：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的广金钱草转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人参转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的三七转录因子CIB3或氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的黑果枸杞转录因子CIB3。
SEQ ID NO.1
MMENQFFLNAGVPPQLHFEASQHNPCPPSSWQSLSSAMDVQVTVLNCSNEQTQDCFYPPTWEKSTDHGLQFDSALSSMVSSPAASNSNMSSENFVIRELIGKLGNIGGGGVGDEISPHSQPLVAASSYINGNNNNSTNTSCYSTPLSSPPKVNNNMNKIPTSVLNHLVREGMPPSLGTSLNSSVAEFSTDPGFAERAAKFSCFGSRSFNGRTTQLGLNNAELSHRSSSPLMENGKLPRVSSSPSLKVLGSQMGTQDNKNSHSPLQDVMEVANSQEESTISEQTPNGVDNGVKPSPYVNSRKRKGSSKGKAKETPTSTNPPMANEASEDSNAKRSKPNEGERNENGQVKAEEESKGGTSNANDEKQNKSNSKPPEPPKDYIHVRARRGQATDSHSLAERVRREKISERMKLLQDLVPGCNKVTGKALMLDEIINYVQSLQRQVEFLSMKLASVNTRLDFSIESLISKDIFQSNNSLAHPIFPIDSSAPSFYGQQHPQPNPAIHNNIPNGTVTHSTSVDPLDSGLCQNLGMHLPLLNGFNEGTSQYPITFSEDDLHTIVQMGFGQTANRKSPLQSQSFNGSNQVPL*
SEQ ID NO.2
MPNNFHNPNFEKSTEHYSQFETALSSMVTSPAPSNSATDAFAIRELIGKLGTICNAGEIAPELMPRTTYNNSPNTSSCYNTPLGSPPKLQVPIMNHLVKENLPNLGNPMPMNSALPALSTDPGFADRAAKFSCFGSRSFKGRTSPIGMNNAEFQYRSSGLLMGNGNLTRVASSPSLKAAGSPMGIQQNKNSVQTQMEMRSSNGTVSASDRKFSNLSGSVANSTEESSVSGQNPSGENGLRTPNELSSRKRKVVSRGKAKETAVKEGEGDDDSSVKRSKMTGCSGNNNGGVKTEEETNRGASDEDQKQANNNQKPPEPPKDYIHVRARRGQATDSHSLAERVRREKIGERMKLLQDLVPGCNKVTGKALMLDEIINYVQSLQRQVEFLSMKLATVNPRLDVNMDSLLSKDTFQSNGTMPHQIYPVDATASASAYYGNQGLRNPQVHKSVEPLDATLCRNLCMPLDGFGEGLPQFPAFSEEDDLQSIVQMGFAPNQTSHMKIEL
SEQ ID NO.3
MEKEYFFNAGIPPPLHFQPSLSPLQLPNNFHNPNFEKSTEHYSQFETALSSMVTSPAPSNSATDAFAIRELIGKLGTICNAGEISPELMPRTTYVSGGNNSPNTSSCYNTPLGSPPKLQVPIMNHLVNSALPALSTDPGFAERAAKFSCFGSRSFNGRASPIGMNNAEFQYRSSGLLMGIGNLTRVASSPSLKAAGSPMGIQQNKNSVQTQMEMRSSNGTVSASDRKFCNLSGSVANSTEESSVSGQNPSGENGLRTPNELGSRKRRVISRGKAKETAVKVKEAEGDDDSSGKRSKMTGCSGNNNGGVETEEETNRGASDKDQKQENNNQKPPEPPKDYIHVRARRGQATDSHSLAERVRREKIGERMKLLQDLVPGCNKVTGKALMLDEIINYVQSLQRQVEFLSMKLATVNPRLDVNMDSLLSKDTFQSNGTMPHQIYPVDATASAYYGNQGLQNSQVHKSAEPLDATLCRNLCVPLDGFGEGLPQFPAFSEEDDLQSIVQMGFAPNQTSHMKIEL
SEQ ID NO.4
MEKDYFINGAIPNPPLQFEQLTMQFPSWNSLHWDHSTDQFNQFDSTLNSLVNNNLPNHPYIGNNNSNNTNTPVNSPPKLHIPNLVNSLPPPLPALSTDPGFAQRAAKFSCFGSRSFNGRTSPLPLELSHRSAQPLGNGKLPRVSSSPSLKQGGSPLQIKNSGQTRMEIMSGKISGQATKFIESLSEPSGETGSKPPTTELNNSRKRKTASRGKTKEDSPMGGEADDSARAKRCKQVEGNNGSENGTVNMEESKENEENQKAPEPLKDYIHVRARRGQATDSHSLAERVRREKISERMKLLQDLVPGCNKVTGKALMLDEIINYVQSLQRQVEFLSMKLSSVNPSLDDICQPNGSLPQPVFSVDKTSSALPSYQHNDIPNGALSQCSVETSLCRSLGMQLPPLDGFADYLNQFPTMCEDDLQSIVQMGFSQNTNKDLTLQSQGFPGPHQTSHMKIEM*
在本发明的另一些实施例中，公开了转录因子CIB3的编码基因在促进植物毛状根膨大能力中的应用，所述转录因子CIB3的编码基因为：核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的广金钱草转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的人参转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的三七转录因子CIB3的编码基因或核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因。
SEQ ID NO:5
ATGATGGAAAACCAATTCTTTCTCAATGCTGGTGTGCCCCCTCAGCTGCATTTTGAGGCTTCACAACACAATCCTTGTCCACCATCCTCTTGGCAATCCCTTTCTTCTGCCATGGATGTTCAAGTCACAGTTTTGAATTGTTCAAATGAACAAACACAGGATTGTTTCTATCCACCAACTTGGGAAAAGTCAACGGATCATGGTCTTCAGTTTGATTCAGCTCTTAGTTCAATGGTTTCTTCTCCTGCAGCTTCTAATTCCAACATGTCAAGTGAGAATTTTGTCATAAGGGAATTGATTGGGAAATTGGGAAACATTGGCGGTGGTGGTGTTGGTGATGAGATCTCACCTCATTCTCAACCTTTGGTTGCTGCATCATCCTACATCAATGGCAATAATAATAACAGCACCAATACTTCATGTTATAGCACCCCTTTGAGTTCTCCTCCAAAGGTGAACAACAACATGAACAAGATCCCCACCTCAGTGCTGAACCACTTGGTGAGAGAGGGTATGCCCCCTAGTTTAGGGACATCCTTGAATTCAAGTGTTGCTGAATTCTCTACTGATCCTGGCTTTGCTGAGAGAGCTGCAAAGTTTTCTTGCTTTGGCAGTAGAAGTTTCAATGGAAGGACCACTCAATTGGGCCTCAACAATGCTGAATTGTCTCATAGATCTTCTTCTCCATTGATGGAAAATGGCAAACTCCCTAGAGTCTCAAGTAGTCCATCACTCAAAGTGCTTGGATCTCAAATGGGTACACAGGACAACAAGAATTCTCATTCTCCATTACAAGACGTCATGGAAGTGGCAAATTCTCAAGAGGAATCAACAATCTCTGAACAAACACCAAATGGGGTAGACAATGGGGTGAAACCTTCCCCTTATGTGAATTCTAGGAAGAGAAAAGGTTCATCCAAAGGAAAAGCCAAGGAAACTCCAACCTCTACCAACCCCCCCATGGCTAATGAAGCTAGTGAAGACTCGAATGCGAAGCGAAGCAAGCCTAATGAAGGTGAAAGGAATGAAAATGGCCAAGTTAAGGCAGAGGAAGAGTCCAAAGGAGGTACTAGTAATGCAAATGATGAGAAACAGAACAAGAGTAACTCAAAACCTCCTGAGCCTCCAAAGGATTACATTCATGTCAGAGCAAGAAGAGGCCAAGCCACTGATAGTCATAGTCTTGCAGAAAGAGTTAGGAGGGAGAAAATCAGTGAAAGAATGAAGCTTCTCCAAGATCTTGTTCCAGGCTGCAATAAGGTAACGGGAAAAGCACTAATGCTTGATGAAATTATAAACTATGTTCAGTCATTGCAGCGTCAGGTTGAGTTTCTGTCTATGAAGTTGGCTTCTGTTAACACCAGGCTGGATTTTAGCATTGAGAGTCTAATCTCAAAAGATATATTTCAATCAAATAATTCTTTAGCACACCCAATATTCCCAATAGATTCCTCAGCACCATCCTTTTATGGGCAACAACATCCTCAGCCAAACCCAGCAATCCACAATAACATTCCTAATGGAACTGTGACCCACAGCACCTCAGTGGACCCATTAGATTCTGGTTTGTGCCAAAACCTTGGCATGCATTTACCTCTTCTAAATGGGTTCAATGAAGGTACCTCTCAGTATCCAATAACATTCTCTGAAGATGACCTCCACACAATTGTTCAGATGGGATTTGGCCAAACTGCAAATAGGAAATCACCACTACAATCTCAGAGTTTCAACGGTTCAAATCAAGTACCCCTATGA
SEQ ID NO:6ATGCCAAACAACTTTCACAATCCCAATTTTGAAAAGTCAACGGAGCACTATTCCCAATTCGAGACAGCTCTGAGCTCAATGGTCACATCCCCTGCACCCTCCAATTCTGCCACTGATGCTTTTGCAATCCGGGAATTGATCGGGAAATTGGGCACCATTTGCAACGCCGGCGAGATCGCGCCAGAGCTCATGCCGAGGACTACTTACAATAACAGTCCTAACACCTCTTCGTGTTACAACACACCCTTGGGGTCTCCACCAAAGTTACAAGTGCCAATTATGAATCATTTGGTGAAAGAAAACTTACCCAATTTAGGCAACCCAATGCCCATGAATTCAGCTTTGCCGGCGCTCTCTACTGATCCTGGGTTTGCCGATAGGGCTGCTAAGTTTTCTTGCTTTGGGAGCCGCAGTTTTAAAGGTAGAACAAGCCCAATTGGAATGAATAATGCCGAATTTCAATATAGATCTAGTGGCTTATTAATGGGAAATGGAAACTTAACTAGAGTTGCTAGTAGTCCTTCTCTTAAGGCAGCTGGATCTCCAATGGGTATACAGCAAAACAAGAATTCTGTTCAAACCCAGATGGAAATGAGGTCTAGTAATGGCACTGTTTCAGCTTCTGATAGAAAATTCAGTAATTTATCAGGCTCTGTTGCCAATTCCACTGAGGAATCCTCTGTTTCTGGACAAAACCCAAGTGGGGAAAATGGATTGAGAACTCCAAATGAATTAAGTTCAAGAAAAAGGAAAGTAGTTTCAAGAGGAAAAGCTAAGGAAACTGCAGTAAAGGAAGGAGAAGGTGATGATGATTCAAGTGTAAAGAGATCAAAGATGACAGGCTGCAGTGGAAACAATAATGGTGGAGTTAAAACGGAGGAGGAAACCAACAGAGGTGCTTCAGATGAGGATCAGAAACAAGCAAATAACAACCAAAAGCCTCCTGAGCCACCAAAGGACTATATACATGTCAGAGCAAGAAGAGGTCAAGCCACTGATAGCCATAGTTTAGCAGAAAGAGTTCGAAGAGAAAAGATTGGTGAAAGAATGAAGCTTCTTCAAGATCTTGTACCAGGTTGCAATAAGGTGACCGGAAAAGCACTTATGCTTGACGAAATCATAAATTATGTACAGTCATTGCAGCGCCAGGTCGAGTTTCTTTCTATGAAGTTGGCTACAGTGAATCCTAGACTGGATGTTAACATGGACAGTCTTCTGTCAAAGGATACATTTCAATCAAATGGCACTATGCCGCATCAAATTTACCCGGTAGATGCCACAGCCTCGGCCTCAGCTTACTATGGCAACCAGGGCCTCCGAAACCCACAGGTTCATAAATCAGTGGAGCCGTTAGATGCCACATTGTGCCGCAACCTGTGCATGCCATTAGATGGATTTGGTGAAGGTCTTCCTCAGTTTCCTGCATTCTCTGAGGAGGATGATCTGCAAAGCATTGTTCAAATGGGTTTTGCCCCAAACCAGACATCCCACATGAAAATTGAGCTC
SEQ ID NO:7
ATGGAAAAAGAGTATTTTTTCAATGCTGGAATTCCACCACCACTCCACTTCCAACCTTCACTGTCGCCATTACAATTGCCAAACAACTTTCACAATCCCAATTTTGAAAAGTCAACGGAGCACTATTCCCAATTCGAGACTGCTCTGAGCTCAATGGTCACATCCCCTGCACCCTCCAATTCTGCCACTGATGCTTTTGCAATCCGGGAATTGATCGGGAAATTGGGCACCATTTGCAACGCCGGCGAGATCTCGCCAGAGCTCATGCCGAGGACTACTTACGTAAGTGGTGGAAATAACAGTCCTAACACTTCTTCATGTTACAACACACCCTTGGGGTCTCCACCAAAGTTACAAGTGCCAATTATGAATCATTTGGTGAATTCTGCTTTGCCAGCGCTCTCTACTGATCCTGGGTTTGCCGAGAGGGCTGCTAAGTTTTCTTGCTTTGGGAGCCGCAGTTTTAACGGCAGAGCAAGCCCGATTGGAATGAATAATGCCGAATTTCAATATAGATCTAGTGGCTTATTAATGGGAATTGGAAACTTAACTAGAGTTGCTAGTAGTCCTTCTCTTAAGGCAGCTGGATCTCCAATGGGTATACAGCAAAACAAGAATTCTGTTCAAACCCAGATGGAAATGAGGTCTAGTAATGGCACTGTTTCAGCTTCTGATAGAAAATTCTGTAATTTATCAGGCTCTGTTGCCAATTCCACTGAGGAATCCTCTGTTTCTGGACAAAACCCAAGTGGGGAAAATGGATTGAGAACTCCAAATGAATTAGGTTCAAGAAAAAGAAGAGTAATTTCGAGAGGAAAAGCAAAGGAAACTGCAGTAAAAGTAAAGGAAGCAGAAGGTGATGATGATTCAAGTGGAAAGAGATCAAAGATGACAGGCTGCAGTGGAAACAATAATGGTGGAGTTGAAACGGAGGAAGAAACCAACAGAGGTGCTTCAGATAAGGACCAGAAACAAGAAAATAACAACCAAAAGCCTCCCGAGCCACCAAAGGACTATATACATGTCAGAGCAAGAAGAGGCCAAGCCACTGATAGCCATAGTTTAGCAGAAAGAGTTCGAAGAGAAAAGATTGGTGAAAGAATGAAGCTTCTTCAAGATCTTGTACCAGGTTGCAATAAGGTGACCGGAAAAGCACTTATGCTTGACGAAATCATAAATTATGTACAGTCATTGCAGCGCCAGGTCGAGTTTCTTTCTATGAAGTTAGCTACAGTGAATCCTAGACTGGATGTTAACATGGACAGTCTTCTGTCAAAGGATACATTTCAATCAAACGGCACTATGCCGCATCAAATTTACCCGGTAGATGCCACAGCCTCAGCTTACTATGGCAACCAGGGCCTCCAAAACTCACAGGTTCATAAATCAGCCGAGCCGTTAGATGCCACATTGTGCCGCAACCTGTGCGTGCCATTAGATGGATTTGGTGAAGGTCTTCCTCAGTTTCCTGCGTTCTCTGAGGAGGATGATCTGCAAAGCATTGTTCAAATGGGTTTTGCCCCAAACCAGACATCCCACATGAAAATTGAGCTC
SEQ ID NO:8
ATGGAAAAAGATTACTTCATCAACGGTGCAATTCCTAATCCACCCCTCCAATTTGAACAACTCACTATGCAATTCCCTTCTTGGAATTCACTACATTGGGATCATTCTACTGATCAATTTAACCAATTTGACTCAACTTTGAACTCATTAGTAAACAACAATTTACCAAATCATCCTTACATTGGGAACAATAATAGTAATAATACTAATACACCTGTTAACTCTCCACCTAAGTTACACATACCCAATTTAGTAAATTCACTTCCTCCTCCATTACCAGCTCTTTCAACTGATCCTGGTTTTGCACAAAGAGCTGCTAAATTTTCTTGTTTTGGTAGCCGTAGTTTTAACGGTAGAACGAGTCCGTTACCGTTAGAATTGTCACATAGATCTGCTCAACCATTGGGAAATGGAAAGTTGCCTAGAGTTTCGAGTAGCCCTTCTCTCAAGCAAGGTGGATCGCCTTTACAAATCAAGAATTCAGGTCAAACCCGTATGGAAATAATGTCAGGCAAAATATCTGGACAGGCCACTAAATTTATTGAATCACTTTCAGAGCCAAGTGGAGAAACAGGGTCGAAACCTCCAACAACTGAACTGAATAATTCTAGGAAAAGAAAAACTGCTTCAAGAGGGAAAACAAAAGAAGATTCACCTATGGGAGGTGAAGCTGATGATAGTGCAAGAGCAAAGCGATGTAAACAAGTAGAAGGTAATAATGGGAGTGAAAACGGAACAGTTAACATGGAAGAATCAAAGGAAAATGAAGAAAATCAAAAGGCTCCTGAACCATTAAAGGATTATATTCATGTTAGAGCAAGAAGAGGACAAGCTACTGATAGCCATAGTTTAGCAGAAAGAGTGCGAAGAGAGAAGATTAGTGAAAGGATGAAGCTTTTACAAGATCTTGTACCAGGGTGTAATAAGGTGACAGGAAAAGCACTAATGCTTGACGAAATAATAAATTATGTACAGTCACTCCAACGGCAAGTCGAGTTTCTATCCATGAAGTTGAGTTCAGTGAACCCAAGTTTGGATGATATATGTCAACCAAATGGCTCTCTGCCTCAACCTGTTTTTTCAGTAGATAAAACATCATCGGCTTTACCTTCTTACCAACATAACGATATTCCAAATGGGGCATTAAGTCAATGCTCAGTGGAGACTTCACTATGCCGCAGCCTAGGAATGCAATTACCTCCTCTTGATGGATTTGCTGATTATCTTAATCAGTTCCCTACAATGTGTGAGGATGATCTGCAAAGCATTGTGCAGATGGGATTTAGCCAAAATACCAACAAAGATCTGACACTACAATCACAAGGTTTTCCTGGGCCTCATCAAACGTCTCACATGAAAATTGAGATGTAA
在本发明的另一些实施例中，公开了转录因子CIB3在植物毛状根分子育种中的应用，所述转录因子CIB3为：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的广金钱草转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人参转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的三七转录因子CIB3或氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的黑果枸杞转录因子CIB3。
在本发明的另一些实施例中，公开了转录因子CIB3的编码基因在植物毛状根分子育种中的应用，所述转录因子CIB3的编码基因为：核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的广金钱草转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的人参转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的三七转录因子CIB3的编码基因或核苷酸序列如SEQID NO:8所示的黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因。
在本发明的另一些实施例中，公开了过表达载体在促进植物毛状根膨大能力中的应用，所述过表达载体为：广金钱草转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、人参转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、三七转录因子CIB3的编码基因的过表达载体或黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的过表达载体。
在其中一些实施例中，所述过表达载体包括psuper启动子；或，所述过表达载体为psuper1300载体。
在本发明的另一些实施例中，公开了过表达载体在植物毛状根分子育种中的应用，所述过表达载体为：广金钱草转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、人参转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、三七转录因子CIB3的编码基因的过表达载体或黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的过表达载体。
在其中一些实施例中，所述过表达载体包括psuper启动子；或，所述过表达载体为psuper1300载体。
在本发明的另一些实施例中，公开了转化有过表达载体的工程菌在促进植物毛状根膨大能力中的应用，所述过表达载体为：广金钱草转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、人参转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、三七转录因子CIB3的编码基因的过表达载体或黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的过表达载体。
在其中一些实施例中，所述工程菌为发根农杆菌。
在本发明的另一些实施例中，公开了转化有过表达载体的工程菌在植物毛状根分子育种中的应用，所述过表达载体为：广金钱草转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、人参转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、三七转录因子CIB3的编码基因的过表达载体或黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的过表达载体。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种促进植物毛状根膨大的方法，包括以下步骤：提高植物中转录因子CIB3的表达，所述转录因子CIB3为：广金钱草转录因子CIB3、人参转录因子CIB3、三七转录因子CIB3或黑果枸杞转录因子CIB3。
扩增转录因子CIB3的编码基因的引物对在促进植物毛状根膨大中的应用，所述引物对包括：扩增广金钱草转录因子CIB3的编码基因的引物对SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:10、扩增人参转录因子CIB3的编码基因的引物对SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:12、扩增三七转录因子CIB3的编码基因的引物对SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:14、或扩增黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的引物对SEQ ID NO:15～SEQ ID NO:16。
在其中一些实施例中，所述植物为广金钱草、甘草、三七、黑果枸杞或人参。尽管本申请实施例中仅例举了转录因子CIB3可促进广金钱草和甘草毛状根膨大，然而本领域技术人员应该都知道，其也可以促进三七、人参、茄科枸杞等药用植物毛状根的膨大。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1转录因子CIB3的编码基因的克隆及过表达载体的构建
包括以下步骤：
1、取保存在-80℃的广金钱草、人参、三七、黑果枸杞的根茎叶全组织样品，液氮研磨成粉末后利用植物RNA双柱试剂盒提取RNA(货号：R4151-03C，品牌：Magen/美基生物)。
2、按照PrimeScriptTMII 1st Strand cDNASynthesis Kit反转录试剂盒(货号：6210A，品牌：Takara/宝生物)说明书的步骤进行cDNA第一链的合成。
3、设计引物如SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:16，利用Max DNAPolymerase高保真酶(货号：R045B，品牌：TaKaRa)，分别对广金钱草、人参、三七、黑果枸杞的转录因子CIB3的编码基因的cDNA序列进行扩增。
引物F(SEQ ID NO:9)：
CGGTCtgccgaaaagCCCGGGATGATGGAAAACCAATTCTTTC
引物R(SEQ ID NO:10)：
CCTCGCCCTTGCTCATACTAGTTAGGGGTACTTGATTTGAACC
引物F(SEQ ID NO:11)：
CGGTCtgccgaaaagCCCGGGCCTCGCCCTTGCTCATACTAGT
引物R(SEQ ID NO:12)：
CCTCGCCCTTGCTCATACTAGTGAGCTCAATTTTCATGTGGGATGT
引物F(SEQ ID NO:13)：
CGGTCtgccgaaaagCCCGGGATGGAAAAAGAGTATTTTTTCAATGCTG
引物R(SEQ ID NO:14)：
CCTCGCCCTTGCTCATACTAGTGAGCTCAATTTTCATGTGGGATGT
引物F(SEQ ID NO:15)：
CGGTCtgccgaaaagCCCGGGATGGAAAAAGATTACTTCATCAACGGT
引物R(SEQ ID NO:16)：
CCTCGCCCTTGCTCATACTAGTCATCTCAATTTTCATGTGAGACGTTTG
PCR反应体系：PrimestarMix 25μL、引物F 2μL、引物R2μL、模板1μL，无菌水20μL。
PCR反应程序：98℃预变性5min；98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共33个循环；72℃延伸5min。
4、PCR产物经琼脂糖凝胶后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。
5、利用Fast DNAAssemblyMix(货号：E0201S，品牌：CISTRO)构建过表达载体。将步骤4纯化后的目的片段与过表达载体进行连接，得到连接产物。
同源重组体系：纯化后目的片段(100ng/μL)1μL，酶切后载体(100ng/μL)1μL，AssemblyMix 2μL，反应条件为50℃连接15分钟。
大肠杆菌感受态DH5α冰浴加样，冰浴静置5min至感受态融化。取连接产物加至100μL处于冰水混合物状态的大肠杆菌DH5α感受态，轻弹混匀，然后冰浴20min；42℃热激60s；冰上静置3min；加700μL无抗生素的LB液体培养基；200rpm，37℃振荡培养1h；10,000×g离心1min；弃上清，剩余50μL悬浮菌体后取适量菌液涂布于含有50mg/LKan的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜至长出单菌落。
7、挑取步骤6获得的阳性克隆进行检测和测序(擎科生物公司)，获得广金钱草转录因子CIB3的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)的过表达载体、人参转录因子CIB3的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)的过表达载体、三七转录因子CIB3的编码基因(核苷酸序列如SEQID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)的过表达载体、黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)的过表达载体(以下命名为OE-广金钱草CIB3、OE-人参CIB3、OE-三七CIB3、OE-黑果枸杞CIB3)。
使用clustalW对本发明克隆得到的广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3和其他CIB家族成员(5种拟南芥CIB转录因子、2种CIL转录因子)的序列进行了比对，使用NJ距离法获得的11条候选蛋白的系统发育树，结果如图1所示。结果表明广金钱草、人参、三七、黑果枸杞这4种CIB3转录因子可以和拟南芥转录因子CIB3聚类到一起，说明广金钱草、人参、三七、黑果枸杞的转录因子CIB3与拟南芥转录因子CIB3亲缘关系相近，同属于CIB3转录因子。
实施例2 OE-CIB3基因转入发根农杆菌K599感受态
发根农杆菌K599感受态冰浴加样，冰浴静置8min至农杆菌感受态融化。取实施例1步骤7得到的OE-广金钱草CIB3、OE-人参CIB3、OE-三七CIB3、OE-黑果枸杞CIB3加至100μL处于冰水混合物状态的发根农杆菌K599感受态，轻弹混匀，然后冰浴5min；液氮5min；37℃水浴5min，冰浴静置5min中。加700μL无抗生素的LB液体培养基；200rpm，28℃振荡培养3h；10,000xg离心1min；弃上清，剩余50μL悬浮菌体后取适量菌液涂布于含有50mg/LKan+50mg/LStr的LB固体培养基上，28℃倒置培养过夜至长出单菌落，并进行阳性克隆检测，分别得到含有广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3的工程菌。
实施例3 OE-CIB3诱导广金钱草毛状根膨大
挑取含有广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3的工程菌，培养至OD600为0.8后4000rpm离心10min收集菌体，分别用悬浮液(乙酰丁香酮100μmol·L-1，MgCl210 mM，MES10mM)重悬菌液，OD600调至0.8，室温静置1h，得得到农杆菌重悬液。
剪取广金钱草无菌苗的子叶，将子叶浸泡到上述准备好的农杆菌重悬液中1h后，取出，滤纸吸干残留的菌液，并置于1/2MS固体培养基上，暗培养3天。然后转移到1/2MS+200cefmg/L的固体培养基上，光照生长，每15天更换培养基。1个月后得到白色且膨大的毛状根，再移植到1/2MS+200cefmg/L继续生长。共计诱导2个月。
通过rolB和rolC分别对广金钱草的毛状根进行PCR鉴定(NC表示阴性对照，以无菌水做模板，PC表示阳性对照，以农杆菌阳性单克隆为模板)，结果如图2。从结果可知，得到了两条大小分别为750bp和500bp的条带，说明发根农杆菌将广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3携带入了广金钱草产生了毛状根。
图3为2个月龄的广金钱草毛状根的形态特征。从图3可知，与CK(未含有转录因子CIB3的空载质粒诱导的广金钱草毛状根)相比，过表达广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3后，广金钱草的毛状根明显膨大。
实施例4 OE-CIB3诱导甘草毛状根膨大
挑取含有广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3的工程菌，培养至OD600为0.8后4000rpm离心10min收集菌体。用悬浮液(乙酰丁香酮100μmol·L-1，MgCl210 mM，MES10mM)重悬菌液，OD600调至0.8，室温静置1h，得农杆菌重悬液。
剪取甘草无菌苗的子叶，将子叶浸泡到上述准备好的农杆菌重悬液中1h后，取出，滤纸吸干残留的菌液，并置于1/2MS固体培养基上，暗培养3天。然后转移到1/2MS+200cefmg/L的固体培养基上，光照生长，每15天更换培养基。1个月后得到白色且膨大的毛状根，移植到1/2MS+200cefmg/L继续生长，共计诱导2个月。
通过rolB和rolC分别对甘草的毛状根进行PCR鉴定(NC表示阴性对照，以无菌水做模板，PC表示阳性对照，以农杆菌阳性单克隆为模板)，结果如图4。从结果可知，得到了两条大小分别为750bp和500bp的条带，说明发根农杆菌将广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3携带入了甘草产生了毛状根。
图5为2个月龄的甘草毛状根的形态特征。从图5可知，与CK(未含有转录因子CIB3的空载质粒诱导的甘草毛状根)相比，过表达广金钱草、人参、三七、黑果枸杞转录因子CIB3后，甘草的毛状根明显膨大。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.转录因子CIB3在促进植物毛状根膨大中的应用，所述转录因子CIB3为：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的广金钱草转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人参转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的三七转录因子CIB3或氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示的黑果枸杞转录因子CIB3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为广金钱草、三七、人参、黑果枸杞或甘草。
3.转录因子CIB3在植物毛状根分子育种中的应用，所述转录因子CIB3为：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的广金钱草转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人参转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的三七转录因子CIB3或氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示的黑果枸杞转录因子CIB3。
4.转录因子CIB3的编码基因在促进植物毛状根膨大中的应用，所述转录因子CIB3的编码基因为：核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的广金钱草转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的人参转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的三七转录因子CIB3的编码基因或核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因。
5.转录因子CIB3的编码基因在植物毛状根分子育种中的应用，所述转录因子CIB3的编码基因为：核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的广金钱草转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的人参转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的三七转录因子CIB3的编码基因或核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因。
6.过表达载体和/或表达盒在促进植物毛状根膨大或植物毛状根分子育种中的应用，所述过表达载体为：广金钱草转录因子CIB3的编码基因的过表达载体和/或表达盒、人参转录因子CIB3的编码基因的过表达载体和/或表达盒、三七转录因子CIB3的编码基因的过表达载体和/或表达盒或黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的过表达载体和/或表达盒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述过表达载体包括psuper启动子。
8.转化有过表达载体的工程菌和/或转基因细胞系在促进植物毛状根膨大或植物毛状根分子育种中的应用，所述过表达载体为：广金钱草转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、人参转录因子CIB3的编码基因的过表达载体、三七转录因子CIB3的编码基因的过表达载体或黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因的过表达载体。
9.一种促进植物毛状根膨大的方法，其特征在于，包括以下步骤：提高植物中转录因子CIB3或转录因子CIB3的编码基因的表达；
所述转录因子CIB3为：氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的广金钱草转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的人参转录因子CIB3、氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的三七转录因子CIB3或氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的黑果枸杞转录因子CIB3
所述转录因子CIB3的编码基因为：核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的广金钱草转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的人参转录因子CIB3的编码基因、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的三七转录因子CIB3的编码基因或核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的黑果枸杞转录因子CIB3的编码基因。
10.根据权利要求9所述的促进植物毛状根膨大的方法，其特征在于，所述植物为广金钱草、三七、人参、黑果枸杞或甘草。
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