CN117924396A - 一种胞磷胆碱钠杂质及其制备方法、分离检测方法和应用 - Google Patents

一种胞磷胆碱钠杂质及其制备方法、分离检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胞磷胆碱钠杂质及其制备方法、分离检测方法和应用。本发明完成了对该杂质的结构确认、制备、分离检测及其应用研究，其能够为胞磷胆碱钠的质量控制提供合格的对照品，为胞磷胆碱钠的安全用药提供重要的指导意义。

Description

一种胞磷胆碱钠杂质及其制备方法、分离检测方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种胞磷胆碱钠杂质及其制备方法、分离检测方法和应用。
背景技术
胞磷胆碱(英文名：Citicoline)，也称胞苷二磷酸胆碱，它是磷脂酰胆碱生物合成的中间产物，在磷脂合成过程中起至关重要的作用。磷脂是细胞膜结构的主要组成成分。在中枢神经系统中，绝大部分的磷脂合成受到胞磷胆碱浓度的调控。脑缺血后，外源性给予胞磷胆碱，能够加快磷脂的合成，促进受损细胞表面和线粒体膜的迅速修复，从而维持细胞膜的完整性和细胞能量代谢。在临床上，胞磷胆碱常以钠盐形式作为药用活性成分，其制剂包括注射剂、片剂和胶囊剂等剂型，广泛应用于治疗颅脑损伤或脑血管意外引起的意识障碍和神经系统失调。
目前，胞磷胆碱钠的生产一般以5’-胞苷酸和磷酸胆碱作为起始原料，合成工艺路线如下：
由于上述反应中存在大量的磷酸二酯键和氨基基团，在适宜的pH和反应温度下，可能发生不定向的聚合反应，形成一系列与胞磷胆碱钠结构相近、化学性质相似的化合物。在现有的分离技术中，这些化合物与胞磷胆碱钠极性相近，难以被识别出来，可能作为杂质被带入到最终的产物及后续的制剂中。鉴于杂质与药品的质量、安全和稳定性密切相关，因此，对胞磷胆碱钠合成过程中潜在的未知杂质进行研究，明确其结构，建立检测方法，成为一个亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：本发明提供一种胞磷胆碱钠杂质及其制备方法、分离检测方法和应用，可用于胞磷胆碱钠制备过程及最终产品的质量控制，为胞磷胆碱钠未知杂质的研究奠定了良好的基础。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种胞磷胆碱钠杂质，其结构式如下：
本发明提出的一种胞磷胆碱钠杂质，其与胞磷胆碱钠性质相近，但至今仍未有其结构确认和检测的研究报道。结合胞磷胆碱钠的合成路线，该杂质的产生可能归因于反应后期大量的胞磷胆碱钠在酸性pH值下发生磷酸二酯键和氨基的缩合反应。本发明的胞磷胆碱钠杂质能够为胞磷胆碱钠的质量控制提供合格的对照品，为胞磷胆碱钠的安全用药提供重要的指导意义。
第二方面，本发明提供一种上述胞磷胆碱钠杂质的制备方法，包括以下步骤：将含三磷酸胞苷二钠、磷酸胆碱和叔丁醇钠的水溶液混合配制成反应液，再加入催化剂进行反应，过滤，所得混合液经后处理，制得胞磷胆碱钠杂质。
可选地，所述反应液中所述三磷酸胞苷二钠的摩尔浓度为80mmol/L，所述磷酸胆碱的摩尔浓度为400mmol/L，所述叔丁醇钠的摩尔浓度为10～50mmol/L，所述反应液的pH为6.0～9.0，反应时间为36～48h，反应温度为50℃。
可选地，所述催化剂为固定化胞苷磷酸转移酶，所述催化剂与所述反应液的质量体积比为30g/L。
可选地，所述后处理包括层析分离和结晶干燥。
本发明提出的一种胞磷胆碱钠杂质的制备方法，具有反应路线短且环保的特点，对该制备方法反应条件的优化有利于指导胞磷胆碱钠生产过程中的条件控制。
第三方面，本发明提供一种上述胞磷胆碱钠杂质的分离检测方法，采用高效液相色谱梯度法进行分离检测，分离检测条件为：色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相由流动相A和B组成，梯度洗脱，其中，流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为甲醇溶液，检测波长为276nm，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL；
所述梯度洗脱的条件为：以体积比计：0min，流动相A为98％，流动相B为2％，5.5min，流动相A为95％，流动相B为5％，8min，流动相A为98％，流动相B为2％。
可选地，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾水溶液和四丁基铵水溶液按体积比50:50的混合液，其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH为4.5。
本发明提出的一种胞磷胆碱钠杂质的分离检测方法，通过优化色谱条件和洗脱条件，能够有效检测出胞磷胆碱钠杂质，为该杂质的监控提供有效手段，为胞磷胆碱钠生产工艺的进一步优化打下了基础。
第四方面，本发明提供一种上述制备方法在胞磷胆碱钠合成方法优化中的应用。
本发明提出的一种胞磷胆碱钠杂质的制备方法在胞磷胆碱钠合成方法优化中的应用，能够有效降低胞磷胆碱钠最终产物中胞磷胆碱钠杂质的含量至0.007％，从而提高胞磷胆碱钠及其制剂的用药安全。
第五方面，本发明提供一种上述胞磷胆碱钠杂质或上述分离检测方法在胞磷胆碱钠及其制剂质量控制方面的应用。
附图说明
图1为实施例4得到的胞磷胆碱钠杂质B的色谱图；
图2为实施例4得到的胞磷胆碱钠的色谱图；
图3为实施例5得到的优化胞磷胆碱钠(配方8)的色谱图；
图4为实施例6得到的大鼠毒性试验体重变化率图；
图5为对比例1得到的胞磷胆碱钠杂质B的色谱图。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案，下面将参照附图更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然附图中显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
本发明实施例提供一种胞磷胆碱钠杂质，其结构式如下：
其通过下述方法制得，包括以下步骤：将含三磷酸胞苷二钠、磷酸胆碱和叔丁醇钠的水溶液混合配制成反应液，再加入催化剂进行反应，过滤，所得混合液经后处理，制得胞磷胆碱钠杂质。
所述反应液中所述三磷酸胞苷二钠的摩尔浓度为80mmol/L，所述磷酸胆碱的摩尔浓度为400mmol/L，所述叔丁醇钠的摩尔浓度为10～50mmol/L，所述反应液的pH为6.0～9.0，反应时间为36～48h，反应温度为50℃。
所述催化剂为固定化胞苷磷酸转移酶，所述催化剂与所述反应液的质量体积比为30g/L。
所述后处理包括层析分离和结晶干燥。
在本发明优选的一些实施方式中，所述层析分离和结晶干燥包括以下步骤：
(1)采用大孔离子交换树脂柱，将所得胞磷胆碱钠和胞磷胆碱钠杂质的混合液上柱，用纯水冲洗后，再用1％ NaCl洗脱下来，并收集；
(2)将洗脱液经汽化浓缩后，调节浓缩液温度至50℃，过分子量5000的超滤器除杂；
(3)加入乙醇搅拌至白色晶体析出后，继续搅拌2.5h，自然冷却后离心去除上清液，真空干燥，得胞磷胆碱钠杂质的干品。
其通过下述方法进行分离检测，采用高效液相色谱梯度法进行分离检测，分离检测条件为：色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相由流动相A和B组成，梯度洗脱，其中，流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为甲醇溶液，检测波长为276nm，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL；
所述梯度洗脱的条件为：以体积比计：0min，流动相A为98％，流动相B为2％，5.5min，流动相A为95％，流动相B为5％，8min，流动相A为98％，流动相B为2％。
所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾水溶液和四丁基铵水溶液按体积比50:50的混合液，其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH为4.5。
在一些优选的实施方式中，所述分离检测方法还包括配制样品溶液。
本发明实施例还提供了上述制备方法在胞磷胆碱钠合成方法优化中的应用。
在一些优选的实施方式中，优化的胞磷胆碱钠合成方法包括以下步骤：
(a)将含5’-胞苷酸80mmol/L、磷酸胆碱400mmol/L和乙酸镁50mmol/L的水溶液混合配制成反应液，调节反应液的pH为6.5～8.0，再按催化剂与反应液质量体积比为30g/L加入固定化胞苷磷酸转移酶，在50℃的水浴温度下搅拌反应6～10h；
(b)在距离反应结束1h时，按稳定剂与反应液质量体积比为0～2g/L加入稳定剂碳酸氢铵；
(c)反应结束后，过滤，所得胞磷胆碱钠清液经层析分离和结晶干燥后，得到胞磷胆碱钠干品。
其中，步骤(c)中，所述层析分离和结晶干燥与上述胞磷胆碱钠杂质的制备方法中的后处理步骤的区别在于，采用乙醇-NaOH替代NaCl进行洗脱。
本发明实施例还提供了上述胞磷胆碱钠杂质或分离检测方法在胞磷胆碱钠及其制剂质量控制方面的应用。
在以下实施例中，本发明将如上述结构式所示的物质命名为杂质B，因此，本发明实施例以胞磷胆碱钠杂质B进行说明。
实施例1
一种胞磷胆碱钠杂质B的制备方法，包括以下步骤：将含三磷酸胞苷二钠80mmol/L、磷酸胆碱400mmol/L和叔丁醇钠10mmol/L的水溶液混合配制成反应液，调节反应液的pH为9.0，再按催化剂与反应液质量体积比为30g/L加入固定化胞苷磷酸转移酶，在50℃的水浴温度下搅拌反应36h，过滤，所得胞磷胆碱钠和胞磷胆碱钠杂质B的混合液经层析分离和结晶干燥，制得胞磷胆碱钠杂质B。
其中，所述层析分离和结晶干燥包括以下步骤：
(1)采用大孔离子交换树脂柱，将所得胞磷胆碱钠和胞磷胆碱钠杂质B的混合液上柱，用纯水冲洗后，再用1％ NaCl洗脱下来，并收集；
(2)将洗脱液经汽化浓缩后，调节浓缩液温度至50℃，过分子量5000的超滤器除杂；
(3)加入乙醇搅拌至白色晶体析出后，继续搅拌2.5h，自然冷却后离心去除上清液，真空干燥，得胞磷胆碱钠杂质B的干品。
本实施例所得胞磷胆碱钠杂质B的收率为20％。
利用核磁共振氢谱分析所得胞磷胆碱钠杂质B，核磁共振氢谱结果如下：
1H NMR：δ＝7.82(2H)，6.06(1H)，5.80(1H)，5.79(2H)，5.41(4H)，4.39(2H)，4.35(2H)，4.14(2H)，4.11(2H)，4.09(4H)，4.02(14H)。
结合合成工艺推断该杂质B的分子式为C24H38N7O21P4 -Na+，分子量为884.488，化学名称为单(钠(1+))单(P-({1-[(3R,4S)-3,4-二羟基-5-{[(氧根离子基{[氧根离子基(氧亚基){[2-(三甲基氮正离子基自由基)乙基]氧基}-λ5-甲磷基]氧基}(氧亚基)-λ5-甲磷基)氧基]甲基}四氢呋喃-2-基]-2-氧亚基嘧啶-4-基}氨基)-P-{[({[(3S,4R)-5-(4-氨基-2-氧亚基嘧啶-1-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基]甲基}氧基)氧根离子基(氧亚基)-λ5-甲磷基]氧基}次膦酸根离子)，结构式如下：
实施例2
一种胞磷胆碱钠杂质B的制备方法，包括以下步骤：将含三磷酸胞苷二钠80mmol/L、磷酸胆碱400mmol/L和叔丁醇钠10mmol/L的水溶液混合配制成反应液，调节反应液的pH为6.0，再按催化剂与反应液质量体积比为30g/L加入固定化胞苷磷酸转移酶，在50℃的水浴温度下搅拌反应36h，过滤，所得胞磷胆碱钠和胞磷胆碱钠杂质B的混合液经层析分离和结晶干燥，制得胞磷胆碱钠杂质B。
本实施例中的层析分离和结晶干燥的具体步骤同实施例1。
本实施例所得胞磷胆碱钠杂质B的收率为25％。
实施例3
一种胞磷胆碱钠杂质B的制备方法，包括以下步骤：将含三磷酸胞苷二钠80mmol/L、磷酸胆碱400mmol/L和叔丁醇钠50mmol/L的水溶液混合配制成反应液，调节反应液的pH为9.0，再按催化剂与反应液质量体积比为30g/L加入固定化胞苷磷酸转移酶，在50℃的水浴温度下搅拌反应48h，过滤，所得胞磷胆碱钠和胞磷胆碱钠杂质B的混合液经层析分离和结晶干燥，制得胞磷胆碱钠杂质B。
本实施例中的层析分离和结晶干燥的具体步骤同实施例1。
本实施例所得胞磷胆碱钠杂质B的收率为27％。
实施例4
采用高效液相色谱梯度法对实施例1所制得的胞磷胆碱钠杂质B进行分离检测，具体为：
(一)分离检测条件：
色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相由流动相A和B组成，梯度洗脱，其中，流动相A为磷酸盐缓冲液(0.1mol/L磷酸二氢钾水溶液和四丁基铵水溶液(取0.01mol/L四丁基氢氧化铵溶液用磷酸调节pH至4.5)等量混合)，流动相B为甲醇溶液，检测波长为276nm，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL；
所述梯度洗脱的条件为：以体积比计：0min，流动相A为98％，流动相B为2％，5.5min，流动相A为95％，流动相B为5％，8min，流动相A为98％，流动相B为2％。
(二)配制样品溶液：
胞磷胆碱钠溶液：取胞磷胆碱钠干品(采用实施例5中的配方3所得)，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含2.5mg的溶液。
胞磷胆碱钠对照品溶液：取胞磷胆碱钠对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.25mg的溶液。
胞磷胆碱钠杂质B溶液：取实施例1所制得的胞磷胆碱钠杂质B，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含2.5mg的溶液。
系统适用性溶液：取5’-胞苷酸对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中约含0.25mg的溶液，取适量，与胞磷胆碱钠对照品溶液等量混合，摇匀。
(三)测定：
精密量取上述溶液，分别注入高效液相色谱仪，按照分离检测条件进行测定，记录色谱图(图1-2)至主成分峰保留时间的2.5倍。
从图1-2中可以看出，采用本发明的高效液相色谱梯度法，能够有效分离测定胞磷胆碱钠和胞磷胆碱钠杂质B，其中，胞磷胆碱钠杂质B的出峰时间为6.243min(图1)，胞磷胆碱钠和5’-胞苷酸的出峰时间分别为5.030min和7.480min(图2)。此外，上述结果也进一步表明胞磷胆碱钠合成过程中确会产生胞磷胆碱钠杂质B。
实施例5
一种胞磷胆碱钠杂质B的制备方法在胞磷胆碱钠合成方法优化中的应用，优化的胞磷胆碱钠合成方法包括以下步骤：
(a)将含5’-胞苷酸80mmol/L、磷酸胆碱400mmol/L和乙酸镁50mmol/L的水溶液混合配制成反应液，调节反应液的pH为6.5～8.0，再按催化剂与反应液质量体积比为30g/L加入固定化胞苷磷酸转移酶，在50℃的水浴温度下搅拌反应6～10h；
(b)在距离反应结束1h时，按稳定剂与反应液质量体积比为0～2g/L加入稳定剂碳酸氢铵；
(c)反应结束后，过滤，所得胞磷胆碱钠清液经层析分离和结晶干燥后，得到胞磷胆碱钠干品。
其中，步骤(c)中，所述层析分离和结晶干燥与上述胞磷胆碱钠杂质的制备方法中的区别在于，采用乙醇-NaOH替代NaCl进行洗脱。
按上述方法将不同配方所制得的胞磷胆碱钠干品精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含2.5mg的溶液，按照实施例4中的高效液相色谱梯度法上样检测。通过胞磷胆碱钠和胞磷胆碱钠杂质B的峰面积比值，计算胞磷胆碱钠杂质B的含量：(胞磷胆碱钠杂质B峰面积/胞磷胆碱钠峰面积)*100％，结果记录于表1和图3。
表1不同胞磷胆碱钠合成方法下的胞磷胆碱钠杂质B含量
由表3可得，配方8中通过控制反应液pH为8.0，反应时间为6h，并加入与反应液比例为2g/L的碳酸氢铵作为稳定剂，能够有效降低胞磷胆碱钠干品中胞磷胆碱钠杂质B的含量至0.007％(其色谱图参见图3)，从而降低胞磷胆碱钠杂质B的毒性，有利于胞磷胆碱钠的质量控制和安全用药。
实施例6
对实施例1所制备的胞磷胆碱钠杂质B进行毒理实验：观察连续14天灌胃给予含有不同含量胞磷胆碱钠杂质B的胞磷胆碱钠对大鼠产生的毒性作用，具体方法如下：
1.实验动物：24只SD雄鼠随机分为3组，每组8只动物。
2.实验药物：采用加标法进行样品配置：样品1(胞磷胆碱钠杂质B含量为0.09％的胞磷胆碱钠)，样品2(胞磷胆碱钠杂质B含量为0.36％的胞磷胆碱钠)，样品3(胞磷胆碱钠杂质B含量为0.72％的胞磷胆碱钠)；各样品的有关物质检测方法如下，测试结果见表2。
有关物质检测方法，具体为：
(一)分离检测条件同实施例4。
(二)配制样品溶液：
供试品溶液：取上述样品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含2.5mg的溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液1mL，置500mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。
5’-胞苷酸对照品溶液：取5’-胞苷酸对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1mL中约含7.5μ.的溶液。
胞磷胆碱钠对照品溶液：取胞磷胆碱钠对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.25mg的溶液。
系统适用性溶液：取5’-胞苷酸对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中约含0.25mg的溶液，取适量，与胞磷胆碱钠对照品溶液等量混合，摇匀。
(三)测定：
精密量取上述溶液，分别注入高效液相色谱仪，按照分离检测条件进行测定，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。
表2有关物质检测结果
3.实验方法
分组及给药：实验设3组，分别为低含量组(样品1，20mg/kg)、中含量组(样品2，20mg/kg)、高含量组(样品3，20mg/kg)，每组8只大鼠。
给药方式：经口灌胃，一日一次，给药体积10mL/kg。
给药周期：连续给药14天，每天一次。
检查指标：给药期间进行一般观察、体重检查和摄食量检查；给药结束后进行大体解剖检查。
(1)一般观察：
观察动物：给药期间各组全部动物；
观察内容：包括外观体征、行为活动、腺体分泌和呼吸等；
观察频率：给药周期内每次给药后持续观察时间不少于1h，给药后期观察时间不少于0.5h；
观察方法：观察各组大鼠与正常大鼠不同的异常反应并记录。
(2)体重检查：
检查动物：给药期间各组全部动物；
检查频率：给药14天，每周检查2次；
检查方法：使用E3000-0.5型电子天平，以1g为最小记录单位，记录并计算体重变化率：体重变化率＝100％*(测量当天体重-试验初始体重)/试验初始体重。
(3)摄食量检查：
检查动物：给药期间各组全部动物，以组为单位进行检查；
检查频率：给药14天，每周检查1次；
检查项目：检查正常情况下各组动物24h的平均摄食量；
检查方法：使用E3000-0.5型电子天平，以1g为最小记录单位。在加料日每组称取大鼠饲料300g，次日同一时间称量剩余饲料，并记录。计算每只大鼠24h的平均摄食量：平均摄食量＝(加料重-余料重)/每组动物数。
(4)大体解剖检查：
检查动物及频率：给药期结束后，所有动物均安乐死并进行病理分析；
检查项目：体表及皮下检查、颈部检查、胸腔及胸腔脏器检查、盆腔及盆腔脏器检查、腹腔及腹腔脏器检查、头部检查、淋巴检查、乳腺、脊髓和坐骨神经检查；
检查方法：动物经禁食5h以上，麻醉并放血处死后，进行肉眼解剖检查。
4.实验结果
(1)一般观察：低含量组受试动物未见明显异常；中含量组受试动物活动增多；高含量组受试动物活动明显增多、胡须颤抖，偶见撕咬鼠笼现象。
(2)体重检查：由图4可知，低含量组受试动物未见明显异常；中含量组受试动物体重下降；高含量组受试动物体重下降明显。
(3)摄食量：通过表3可以看出，低含量组摄食量平稳；中含量组摄食量略增加；高含量组摄食量明显增加。
表3大鼠摄食量检查表(g)
(4)大体解剖检查：未见异常。
综上所述，胞磷胆碱钠杂质B含量为0.09％的胞磷胆碱钠对受试动物无明显毒性作用；胞磷胆碱钠杂质B含量为0.36％的胞磷胆碱钠与胞磷胆碱钠杂质B含量为0.72％的胞磷胆碱钠对受试动物的日常活动、体重、摄食量有一定的不良影响，受试动物表现出活动增多、精神亢奋，偶见胡须颤抖、撕咬鼠笼现象，食量增多反而体重下降明显，提示胞磷胆碱钠杂质B具有中枢神经系统毒性，且毒性作用随其含量的增加而增大。
对比例1
本对比例与实施例4的区别在于，采用《中国药典》2020版胞磷胆碱钠有关物质的检验方法对实施例1所制得的胞磷胆碱钠杂质B进行检测，结果记录于图5。
如图5所示，胞磷胆碱钠杂质B的出峰时间与胞磷胆碱钠对照品一致，该结果表明胞磷胆碱钠中可能存在胞磷胆碱钠杂质B，但由于二者极性相近故无法通过现有检测方法分离检出，这也进一步说明了本发明的分离检测方法能够使主峰保留时间合适，与胞磷胆碱钠杂质B能良好分离。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种胞磷胆碱钠杂质，其结构式如下：
2.一种如权利要求1所述的胞磷胆碱钠杂质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含三磷酸胞苷二钠、磷酸胆碱和叔丁醇钠的水溶液混合配制成反应液，再加入催化剂进行反应，过滤，所得混合液经后处理，制得胞磷胆碱钠杂质。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述反应液中所述三磷酸胞苷二钠的摩尔浓度为80mmol/L，所述磷酸胆碱的摩尔浓度为400mmol/L，所述叔丁醇钠的摩尔浓度为10～50mmol/L，所述反应液的pH为6.0～9.0，反应时间为36～48h，反应温度为50℃。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为固定化胞苷磷酸转移酶，所述催化剂与所述反应液的质量体积比为30g/L。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述后处理包括层析分离和结晶干燥。
6.一种如权利要求1所述的胞磷胆碱钠杂质的分离检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱梯度法进行分离检测，分离检测条件为：色谱柱固定相以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相由流动相A和B组成，梯度洗脱，其中，流动相A为磷酸盐缓冲液，流动相B为甲醇溶液，检测波长为276nm，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL；
所述梯度洗脱的条件为：以体积比计：0min，流动相A为98％，流动相B为2％，5.5min，流动相A为95％，流动相B为5％，8min，流动相A为98％，流动相B为2％。
7.如权利要求6所述的分离检测方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾水溶液和四丁基铵水溶液按体积比50:50的混合液，其中，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L，所述磷酸盐缓冲液的pH为4.5。
8.一种如权利要求2-5中任一项所述的制备方法在胞磷胆碱钠合成方法优化中的应用。
9.一种如权利要求1所述的胞磷胆碱钠杂质或如权利要求6-7中任一项所述的分离检测方法在胞磷胆碱钠及其制剂质量控制方面的应用。
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