CN117919399A - 毛兰素联合斯妥尤单抗在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用 - Google Patents
毛兰素联合斯妥尤单抗在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体公开了毛兰素联合斯妥尤单抗在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用。本发明选择毛兰素和斯妥尤单抗联用来治疗葡萄膜黑色素瘤，毛兰素能够通过调控葡萄膜黑色素瘤的RNA甲基化修饰，达到治疗葡萄膜黑色素瘤的作用，毛兰素处理后的葡萄膜黑色素瘤中SLITRK6高表达，不利于逆转肿瘤恶性表型，采用毛兰素联合斯妥尤单抗治疗，能够有效抑制SLITRK6表达，可以在毛兰素作用基础上进一步杀伤肿瘤细胞。本发明为葡萄膜黑色素瘤提供新了的临床治疗药物，提高治疗有效性，延长患者生命，提高生存质量，开拓了葡萄膜黑色素瘤治疗的一个新领域。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及毛兰素联合斯妥尤单抗在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用。
背景技术
葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤，占所有类型黑色素瘤的3％～5％，占眼黑色素瘤的83％。它不仅严重影响患者的视觉功能，还易导致肿瘤转移及患者死亡，约50％的葡萄膜黑色素瘤患者最终发生血行转移，多累及肝脏，一旦发生远处转移，患者中位生存期不足8个月。
葡萄膜黑色素瘤的发病机制与分子遗传、表观遗传密切相关。葡萄膜黑色素瘤的染色体异常包括3号染色体缺失、6和8号染色体长臂扩增。主要的致癌基因突变包括GNAQ或GNA11功能获得性突变、抑癌基因组蛋白去泛素化酶BAP1缺失等。此外，表观遗传失衡在葡萄膜黑色素瘤的发生和发展中起着重要作用，包括RNA修饰、组蛋白修饰、长链非编码RNA等。
在葡萄膜黑色素瘤的临床治疗方面，传统的PDT、激光光凝、敷贴放射和眼球摘除等手段的治疗效果并不尽如人意，而对葡萄膜黑色素瘤化疗的作用也非常有限。随着临床治疗研究的深入，以靶向药物为主的治疗手段越来越被寄予厚望。然而，这些药物的研发仍主要针对于已发现的突变靶点和机制，目前以Trametinib为代表的MEK抑制剂和以Nivolumab为代表的免疫疗法对于葡萄膜黑色素瘤存在不敏感、耐药性、副作用明显等局限，即使药物联合治疗也无法摆脱这一困境。总的来说，葡萄膜黑色素瘤的高转移率和高死亡率仍是亟待解决的临床窘境。因此，进一步寻找更多的有效治疗药物，深入研究其分子机制，对完善临床治疗方案、突破葡萄膜黑色素瘤治疗瓶颈具有十分重要且迫切的现实意义。
毛兰素(Erianin)是石斛属(Dendrobium)植物的成分之一。石斛属是兰科植物中的第二大属，很多石斛属植物是传统的名贵药用植物，具有良好的抗肿瘤作用。相关抗癌活性成分包括多糖、生物碱、菲类、联苄类、芴酮类化合物等，抗肿瘤作用机制主要有增强机体免疫力、抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡、调控或阻滞癌细胞周期、抗氧化和清除自由基、改变信号通路传导等。值得注意的是，毛兰素作为一种广谱的治疗药物分子，能够通过调控RNA甲基化等多种机制抑制肿瘤的进展。然而，目前没有关于毛兰素与葡萄膜黑色素瘤之间的关系的报道。
多项免疫组化研究表明，SLITRK6在多种上皮性肿瘤中表达，包括肺癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌，并与肿瘤恶性程度相关。斯妥尤单抗(Sirtratumab)是一种靶向SLITRK6的抑制性单抗，可靶向抑制细胞中SLITRK6的表达。目前，尚没有关于斯妥尤单抗对葡萄膜黑色素瘤作用的报道。
发明内容
为解决传统治疗方式疗效有限的问题，本发明的目的是提供毛兰素联合斯妥尤单抗在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供毛兰素联合斯妥尤单抗在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用，具体是将毛兰素与斯妥尤单抗联用，来抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖能力，并诱导葡萄膜黑色素瘤细胞的凋亡。
本发明选择毛兰素(Erianin)和斯妥尤单抗联用，以治疗葡萄膜黑色素瘤。毛兰素能够通过调控葡萄膜黑色素瘤的RNA甲基化修饰，达到治疗葡萄膜黑色素瘤的作用。值得注意的是，毛兰素处理后的葡萄膜黑色素瘤中SLITRK6高表达，不利于逆转肿瘤恶性表型，可采用毛兰素联合斯妥尤单抗治疗，斯妥尤单抗能够有效抑制SLITRK6表达，可以在毛兰素作用基础上进一步杀伤肿瘤细胞。
另一方面，本发明提供一种治疗葡萄膜黑色素瘤的药物，是以毛兰素联合斯妥尤单抗作为活性成分。
所述药物还包括药学上可接受的载体，如填充剂、粘合剂、崩解剂、润湿剂等。“药学上可接受的”是指当分子本体和载体适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
所述药物的剂型并无特别限定，可以被制成片剂、粉剂、注射剂、胶囊、混悬剂、糊剂、凝胶、药膜剂、缓释剂或微球等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
本发明具有以下有益效果：
本发明发现毛兰素联合斯妥尤单抗可显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖并诱导葡萄膜黑色素瘤细胞的凋亡。本发明能够为葡萄膜黑色素瘤提供新的临床治疗药物，提高治疗有效性，延长患者生命，提高生存质量，开拓了毛兰素联合斯妥尤单抗用于葡萄膜黑色素瘤治疗的一个新领域。
附图说明
图1为实施例1中空白对照组、毛兰素处理组、毛兰素联合斯妥尤单抗处理组中葡萄膜黑色素瘤细胞中SLITRK6的rt-PCR结果图(**p<0.01)。
图2为实施例2中毛兰素联合斯妥尤单抗显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞增殖能力的CCK8结果图(**p<0.01)。
图3为实施例3中毛兰素联合斯妥尤单抗诱导葡萄膜黑色素瘤细胞死亡的流式实验结果统计图(*p<0.05,**p<0.01)。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1：rt-PCR实验
实验材料：人葡萄膜黑色素瘤细胞系OMM2.3。毛兰素购自Selleck(中国)，斯妥尤单抗购自MedChemExpress(中国)，引物购自生工生物工程(中国)。
实验步骤：
(1)设置两组药物组和一组对照组：两组药物组分别为毛兰素处理的OMM2.3细胞系、毛兰素联合斯妥尤单抗处理的OMM2.3细胞系，对照组为未经药物处理的OMM2.3细胞系。将细胞铺于6孔板中，去除培养基后使用PBS轻柔地清洗3次。每孔中加入1mL Trizol试剂，待吹打混匀、充分裂解细胞后将混合液转移至新的1.5mL EP(Eppendorf)管中，每管加入三氯甲烷200μl，涡旋振荡13s后，冰上放置5min，使用低温离心机4℃12000rpm离心20分钟。离心后吸取上层水样透明液体置于新的1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀后于-20℃静置2小时或过夜。
(2)使用低温离心机4℃12000rpm离心20分钟后小心地弃去上清，注意不要遗失沉淀。RNA沉淀中加入1mL预冷的75％乙醇，吹打混匀。低温离心机于4℃1200rpm离心4分钟后小心地弃去上清，加入1mL预冷的95％乙醇吹打混匀。再利用低温离心机于4℃1200rpm离心4分钟后小心地丢弃上清，通风橱内晾干管壁，管口朝下置于风口。加入20μl的焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)水溶解RNA沉淀，利用Nanodrop 2000测定RNA浓度。
(3)针对SLITRK6基因片段设计逆转录和PCR引物，用于加入到后续反应体系。在进行逆转录的过程中，需4μgRNA作为模板，使用cDNA的逆转录试剂盒于20μl的体系中进行逆转录反应，以获取cDNA。逆转录后向cDNA中加入180μl的DEPC水，将cDNA稀释至200μl，可置于-20℃保存或立即使用。后续利用SYBR进行实时定量PCR反应，需配置10μl的反应体系，滴加至384孔板上。
(4)每个样本设置3个复孔，以GAPDH作为内参，逆转录反应程序设置为：50℃2分钟；95℃10分钟；35个循环：95℃15秒，60℃1分钟；溶解曲线：95℃15秒，60℃1分钟，95℃15秒。以GAPDH作为内参校正。
实验结果：如图1所示，相比于对照组，葡萄膜黑色素瘤细胞OMM2.3在用毛兰素处理后，肿瘤细胞中SLITRK6表达明显上调，而用毛兰素和斯妥尤单抗处理后，SLITRK6表达明显受到抑制。
实施例2：CCK8细胞增殖实验
实验材料：人葡萄膜黑色素瘤细胞系OMM2.3。毛兰素购自Selleck(中国)，斯妥尤单抗购自MedChemExpress(中国)，CCK8购自同仁化学(日本)。
实验步骤：
(1)将OMM2.3细胞在37℃，5％CO2培养箱中常规培养，用20％FBS的1640培液培养。
(2)利用细胞计数板对细胞进行计数，在96孔板汇总接种每孔3000个细胞，每孔中加入100μl的完全培养基。设置三组药物组和一组对照组，药物组分别为每孔加入毛兰素；斯妥尤单抗；毛兰素联合斯妥尤单抗；毛兰素药物浓度为150μM，斯妥尤单抗药物浓度为100μM。对照组加入等量PBS。
(3)接种细胞铺板后放置在培养箱中孵育培养约6小时，待细胞生长稳定后，向每个孔中加入10μL CCK8溶液，在培养箱中孵育4小时后，使用酶标仪测定样品在450nm处的吸光度。每隔24h进行一次检测，根据0天，1天，2天，3天，4天检测结果来绘制细胞的生长曲线。
实验结果：如图2所示，葡萄膜黑色素瘤细胞OMM2.3在用毛兰素联合斯妥尤单抗处理后，肿瘤细胞的增殖能力显著低于对照组、单用毛兰素及单用斯妥尤单抗处理组，可见毛兰素联合斯妥尤单抗能够显著抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖。
实施例3：细胞凋亡实验
实验材料：人葡萄膜黑色素瘤细胞系OMM2.3，92.1。毛兰素购自Selleck(中国)，斯妥尤单抗购自MedChemExpress(中国)，碘化丙啶和RNase A购于碧云天(中国)。
实验步骤：
(1)取对数生长期的细胞，按1×106cells/mL以1mL接种24孔板或2mL接种于6孔板内，设置三组药物组和一组对照组，药物组分别为每孔加入毛兰素；斯妥尤单抗；毛兰素联合斯妥尤单抗；毛兰素药物浓度为150μM，斯妥尤单抗药物浓度为100μM。对照组加入等量PBS，特定时间后终止培养，进行下一步的实验。
(2)800rpm离心5min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤两次，加入预冷75％乙醇，于4℃固定4h以上。
(3)1500rpm离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤一次，加入400uL碘化丙啶(PI，50ug/mL)，100ul RNase A(100ug/mL)，4℃避光孵育30min。
(4)以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2～3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件FlowJ分析，并用柱状图统计细胞死亡率。
实验结果：如图3所示，毛兰素联用斯妥尤单抗情况下细胞死亡率比单独使用明显要高，可见毛兰素联合斯妥尤单抗能够有效诱导葡萄膜黑色素瘤的死亡。
本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在本发明权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。
Claims (4)
1.毛兰素联合斯妥尤单抗在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述毛兰素与斯妥尤单抗联用，可抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖能力，并诱导葡萄膜黑色素瘤细胞的凋亡。
3.一种治疗葡萄膜黑色素瘤的药物，其特征在于：是以毛兰素联合斯妥尤单抗作为活性成分。
4.根据权利要求3所述的治疗葡萄膜黑色素瘤的药物，其特征在于：还包括药学上可接受的载体。
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