CN117919155A - 一种用于护肤的益生菌复苏系统 - Google Patents
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Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
提供了一种外用于非粘膜皮肤的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒。从内向外,该核壳微粒具有以下结构:具有作为益生菌营养源的载体颗粒核;包括用于影响非粘膜的外部表皮上生物菌落的的休眠益生菌物种和作为益生菌食物源的至少一种益生元的第一层;位于第一层上的聚合物层;以及用于保护益生菌核壳微粒免受氧化、热和潮湿的可溶性保护层。通过与释放介质共同施用,可溶性保护层和聚合物层会被溶解,暴露含有休眠益生菌的第一层;此外,释放介质还能够在施用的非粘膜外部表皮上将休眠的益生菌激活并重建为活的益生菌。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年10月25日提交的美国临时专利申请序列号63/419,295及2023年10月24日提交的美国专利申请序列号18/493,751的优先权,其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及益生菌领域。更具体地,本发明涉及包封的休眠状态益生菌核壳微粒和重新激活休眠益生菌以用于体外应用的技术。
背景技术
益生菌是活的生物体,在被人体摄入一定数量后,可对人体健康起到超出一般营养的有益作用。自过去十年以来,对益生菌及其对人类健康影响的研究和商业利润一直在上升,近年来,益生菌在医学上的应用也迅速增加,并证实了其作为人类健康调节剂的安全性。越来越多的研究表明,益生菌对人体除消化系统外的其他部位(如皮肤健康)具有促进健康的作用。作为一种在人体内自然定植的“好细菌”,不论是在健康和炎症情况下(如特应性皮炎和皮肤痤疮),益生菌用作维持皮肤健康的潜在用途在制药、护肤和医疗保健行业备受关注。通过粪便移植以调节肠道微生物组已被证明是治疗如艰难梭菌感染等疾病的有效策略,因此,调节皮肤微生物组也可能是改善皮肤状况的的治疗方法。然而,目前大多数研究都显示益生菌在处理有状况的皮肤方面是有效的,仅有少数研究是针对益生菌在健康受试者中对皮肤健康的作用,且大多数研究中都使用来自益生菌的失活细菌产品或代谢裂解物,而不是适当配方的活益生菌;此外,益生菌的组合/制剂及其作用机制,如健康和有问题皮肤上微生物群组成或功能的改变(微生态失调),仍有待充分阐明。
此外,益生菌在皮肤表面的定植程度会影响活益生菌提供的实际和长期有益效果,因为益生菌对其生长环境高度敏感,尤其是皮肤微环境的高度多变性,皮肤微环境会因为内源性宿主因素和外源性环境因素而变动,因此,如果不采取适当的措施,例如创造一个合适区域或富含营养/水分的环境,任何新引入的活益生菌都很难在皮肤表面存活,也影响了它们在皮肤上定植。因此,提高益生菌的定植率是另一个挑战。
最近,含有细菌裂解物的护肤品在益生菌相关化妆品行业中占据主导地位,主要原因是常见的护肤品中含有防腐剂且富含水分,不利于益生菌的生存,且一般来说,活益生菌需要冷藏以延长其保质期,这阻碍了其运销和储存。因此,市场上仍然缺乏活益生菌护肤品/化妆品,而本发明解决了此需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种活益生菌形式的护肤/化妆品添加剂,其可在微生态失调的皮肤上保持长期的有益效果,并在不需要额外的特定储存条件下,仍可在不利条件下以及护肤品中生存。
根据本发明的第一方面,本发明提供了一种外用于非粘膜皮肤的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒,该微粒包括可作为益生菌营养源的载体微粒核、围绕该载体微粒核并具有可用于影响非粘膜的外部表皮上生物菌落的至少一种休眠益生菌种和作为该益生菌食物源的至少一种益生元的第一层、位在该第一层上的聚合物层、以及用于避免该益生菌核壳微粒受氧化、热和潮湿影响的可溶保护层。值得注意的是,在非粘膜表皮表面上时,该微粒与相应的释放介质混合后,该可溶保护层会被溶解,并激活微粒中的休眠益生菌还原为活益生菌。
根据本发明的一实施例,该载体微粒核包括蔗糖、乳清蛋白、淀粉和纤维素中的一种或多种。
根据本发明的一实施例,该至少一种休眠益生菌种包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、酿酒酵母(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)及其变异株。
根据本发明的一实施例,该至少一种益生元选自蛋白质或糖类。在一些实施例中,该糖包括多糖、单糖或二糖。
根据本发明的一实施例,该蛋白质选自乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、牛奶蛋白、豌豆蛋白、大米蛋白、玉米醇溶蛋白或牛血清白蛋白。
根据本发明的一实施例,该糖选自葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、糊精、麦芽糊精、环糊精、木糖醇、纤维素、几丁质、壳聚糖、普鲁兰、果胶、藻酸盐或阿拉伯木聚糖。
根据本发明的一实施例,该聚合物层选自虫胶、二棕榈酰羟基脯氨酸、基于甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物、甘油酯或聚-L-乳酸。
根据本发明的一实施例,该可溶保护层包括聚合物、表面活性剂、脂肪酸和矿物。在一些实施例中,该表面活性剂选自阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。在一些实施例中,该脂肪酸选自棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。在一些实施例中,该矿物选自滑石、高岭土、氧化锌、二氧化钛或二氧化硅。
根据本发明的一实施例,该不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒中包括67.2%至92.19%的载体微粒核、0.01%至0.1%的益生菌、0%至14.7%的聚合物、7.8%至11.5%的糖类、0%至2.2%的蛋白质、0%至1%的脂肪酸、0%至1.3%的表面活性剂和0%至2.1%的矿物质。
根据本发明的第二方面,本发明提供了一种局部用的试剂盒,用于调节非粘膜表皮区域的微生物组,该试剂盒包括多个如上所述的包封休眠状态益生菌的核壳微粒和用于还原包封休眠状态益生菌的核壳微粒的释放介质。该释放介质能够降解包封休眠状态益生菌的核壳微粒的保护层和聚合物层,以将休眠的益生菌转化为活化的活益生菌,并进一步在非粘膜表皮上形成包括活化的活益生菌的合成生物膜,为益生菌定植提供适合的微环境。
根据本发明的一实施例,释放介质包括水、盐、有机酸、表面活性剂、油和成膜营养物。在一些实施例中,盐选自氯化钠或氯化钙。在一些实施例中,有机酸选自乙酸、乳酸或柠檬酸。在一些实施例中,表面活性剂选自阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。在一些实施例中,油选自角鲨烷、白芒花籽油、大豆油、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯,石蜡油、杏仁油或大豆油。在一些实施例中,成膜营养物选自透明质酸或细胞外多糖。
根据本发明的一个实施例,该释放介质包括95%至99.98%的水、0%至0.9%的盐、0%至0.02%的有机酸、0.01%至2%的表面活性剂、0.01%至1%的油和0%至0.9%成膜营养素。
根据本发明的另一实施例,该释放介质选自乳液形式、乳霜形式、精华液形式或溶液形式。
根据本发明的一实施例,该释放介质还包括具有抗菌作用和抗炎特性的后生元制剂。
根据本发明的另一个实施例,该后生元制剂包括与微粒中的同种益生菌的裂解物或发酵物,其包含益生菌细胞壁碎片、生长代谢产物和死益生菌细胞。
根据本发明的一实施例,该后生元制剂包括0.01%至0.1%的后生元材料和99.8%至99.99%的糖。
根据本发明的第三方面,本发明提供了一种通过调节皮肤微生物组来维持皮肤健康的方法,其中该方法包括将上述试剂盒局部施用于有需要的非粘膜表皮区域。
根据本发明的一实施例,有需要的非粘膜表皮区域出现炎症、脱水、痤疮、感染和发红。
根据本发明的第四方面,本发明提供了一种制备外用于非粘膜皮肤的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒的方法。具体地,该方法包括以下步骤:
制备载体微粒核,该载体微粒核包括供益生菌利用的一种或多种营养源;
在该载体微粒核上涂覆包括休眠状态益生菌和至少一种益生元的第一层,形成核壳结构;
在该第一层上添加聚合物层;
在该聚合物层上涂覆可溶性保护层;和
干燥和调适所得到的微粒以产生不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒。
附图说明
下文将参照附图以更详细地描述本发明的实施例,其中:
图1显示通过评估抑制区来评估益生菌的抗菌效果;
图2A-2C显示乳酸杆菌益生菌对人皮肤角质形成细胞系的抗炎效果;图2A显示了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,JCM 6651)的抗炎作用;图2B显示了约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii,JCM 1101)的抗炎作用;并且图2C显示了罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri,JCM 1084)的抗炎作用;
图3显示了乳酸杆菌益生菌对人体3D皮肤模型的抗炎作用;
图4A-4D显示了不同浓度的不同益生元补充剂对乳酸杆菌益生菌的增殖作用;图4A显示补充乳清蛋白使植物乳杆菌(JCM 6651)的生长增加21862%;图4B描述了补充木糖醇使约氏乳杆菌(JCM 1101)的生长增加496%;图4C显示乳清蛋白在1%时具有最佳效果;并且图4D显示木糖醇在1%时具有最佳效果;
图5显示包封休眠状态益生菌的核壳微粒的制备过程;
图6A-6D显示微粒在每个制备步骤中的SEM形态;图6A描绘了载体微粒核的SEM影像;图6B显示涂覆有第一层的载体微粒核的SEM影像;图6C显示第一层表面上涂覆聚合物层的SEM影像;以及图6D显示了在聚合物层上涂覆可溶性保护层后的包封休眠状态益生菌的核壳微粒的SEM影像;
图7显示DP17于24周后的益生菌活力和水活性;
图8显示DP18于24周后的益生菌活力和水活性;
图9显示DP19于24周后的益生菌活力和水活性;
图10显示DP20于24周后的益生菌活力和水活性;
图11显示了益生元的抗菌效果;
图12显示益生菌定植情况和皮肤含水量的评估过程;
图13显示在给予PRS之前和之后,皮肤上的益生菌总量;以及
图14显示在给予PRS之前和之后,皮肤的含水量。
具体实施方式
在以下描述中,外用于非粘膜皮肤的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒作为优选实例。对本领域技术人员来说显而易见的是,在不脱离本发明的范围和精神的情况下,可以进行包括添加和/或替换的修改,可以省略具体细节,以免混淆本发明;然而,编写本文是为了使本领域技术人员能够在没有过度实验的情况下实践本文的教导。
为了制备包封休眠状态益生菌的核壳微粒,进行了益生菌物种的精细挑选过程。与粘膜表面不同,皮肤独特的环境条件限制了能够在恶劣环境中生长的微生物类型的范围,通常是有利于革兰氏阳性菌。皮肤中既有常驻的微生物族群,也有过渡的微生物种群。“常驻”物种表示其在皮肤上有生存能力、自我维持能力的族群,而“过渡物种”通常是在皮肤环境中的污染物,仅具有有限长期生长和繁殖能力,或甚至无法生长和繁殖。常驻微生物种类包括丙酸杆菌(包括痤疮假单胞菌、阿维杜姆假单胞菌和微粒假单胞菌)、凝固酶阴性葡萄球菌(如表皮葡萄球菌)、微球菌、棒状杆菌、不动杆菌、马拉色菌酵母和各种噬菌体;相比之下,常见的过渡物种包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和芽孢杆菌。常驻物种通常作为共生物种,不会对宿主造成伤害,同时通过抗微生物因子或阻碍定植效果,对抗过渡和致病细菌。然而,皮肤微生物组的破坏会为过渡和机会致病性物种提供生长的机会,而导致疾病,因此,引入局部应用的有效益生菌可能会直接影响皮肤的微生物组。鉴于益生菌的功能具有高度的菌株特异性,检视了益生菌物种的安全性和评估其促进皮肤健康效果(如抗菌和抗炎作用),避免引入任何与严重健康问题相关的物种。
为了克服上述困难,本发明提供一种休眠益生菌的新技术,开发出了益生菌复苏系统(probiotic revitalizing system,PRS),该系统由不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒和释放介质组成,可以保护益生菌免受不利条件的影响,并提升其在商业产品中的生存能力。休眠益生菌技术通过将益生菌保持在休眠状态,直到实际应用时才会发挥作用,即当这些休眠的益生菌与皮肤上的兼容释放介质接触并与合成生物膜结合时,就会被激活,从而确保适当的定殖。常见的以促进皮肤健康而闻名的益生菌经过了仔细评估,特别是针对其抗菌和抗炎特性,然后使用生物聚合物和/或益生元将最有效的益生菌包封,以保持其活力,从而形成包封的休眠状态益生菌核壳微粒。而针对释放介质的相应配方,可促进益生菌的释放和生长,同时形成保护层。这些益生菌配方也经过合格的第三方机构严格评估,检测其安全性和性能。另外,这些配方可以集成到各种化妆品中,包括面霜、精华液和乳液,即使在恶劣的环境条件下也能有效发挥作用。
如本文所用,术语“休眠益生菌”是指活的有益微生物,通常是乳杆菌物种,通过将其封装在保护结构(如核壳微粒)内,而使其变得不活跃或休眠。在这种状态下,益生菌仍为活体,但没有活性,直到条件适合时才会被重新激活。
如本文所用,术语“益生元”是指一种用作益生菌的食物或营养的物质,通常是碳水化合物,如麦芽糊精、木糖醇或糖类,于配方中添加益生元,可促进益生菌的生长和活性。
如本文所用,术语“可溶性保护层”是指围绕核壳微粒内休眠益生菌的涂层,在接触释放介质时会溶解,从而使益生菌变得活跃并可供使用。
如本文所用,术语“释放介质”是指用于溶解核壳微粒的保护层并重新激活休眠益生菌的配制溶液,通常含有有机酸、成膜营养素、表面活性剂、油和其他成分,以促进益生菌在皮肤上的释放和定植。
如本文所用,术语“合成生物膜”是指由多糖、蛋白质和保水成分(如纤维素、壳聚糖、普鲁兰、乳清蛋白、酪蛋白、氨基酸、透明质酸和糖异构酶)的组合所产生的结构,用作益生菌在皮肤上粘附和定植的基质,并模拟益生菌生存的自然条件。
如本文所用,术语“后生元制剂”是指由益生菌的细胞裂解物、生长代谢产物和细胞碎片组成的后生元制剂,这些组成通常来源于已经裂解或分解的益生菌,后生元制剂也可以包括益生元,后生元制剂在没有活益生菌时,对皮肤的具有有益作用(如抗炎和抗菌特性),因而被广泛使用。
根据本发明的第一方面,提供了一种外用于非粘膜皮肤的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒。益生菌在产品中的存活受到几个因素的影响,如pH、产品发酵过程中的后酸化、过氧化氢的产生、氧气和储存温度,即使益生菌在营养丰富或生态位环境中,这些因素的微小变化都会导致益生菌失去生存能力。因此,本发明提供的休眠益生菌技术来制备包封的休眠状态益生菌核壳微粒,用于在不利于支持微生物的生长的护肤品中递送具有增强的粘附性能的活性的活益生菌。
包封休眠状态益生菌的核壳微粒包括用作益生菌营养源的载体微粒核、围绕该载体微粒核并具具有可用于影响非粘膜的外部表皮上生物菌落的至少一种休眠益生菌种和作为该益生菌食物源的至少一种益生元的第一层、位在该第一层上的聚合物层、以及用于避免该益生菌核壳微粒受氧化、热和潮湿影响的可溶保护层。通过将休眠的益生菌封装在核壳微粒中,益生菌可以在这些保护涂层(包括聚合物层和可溶性保护层)中存活,以保护益生菌免受水分、氧气和有害物质的侵害。微粒的制备是先通过筛选不同类型的生物聚合物、多糖、脂质或蛋白质来进行的,例如聚-L-乳酸、聚甲基丙烯酸甲酯、果胶、藻酸钠、壳聚糖、玉米醇溶蛋白、牛血清白蛋白、硬脂酸和石蜡油,为益生菌提供保护层。
在本发明提供的配方中,载体微粒核的选用包括蔗糖、乳清蛋白、淀粉和纤维素球中的一种或多种,并且益生菌物种可以是双歧杆菌、乳酸杆菌、乳球菌、明串珠菌、链球菌、肠球菌、葡萄球菌、酿酒酵母、克鲁维酵母或其变异菌株;此外,聚合物层的成分可包括虫胶、二棕榈酰羟基脯氨酸、基于甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物、甘油酯或聚-L-乳酸;可溶性保护层包括聚合物、表面活性剂、脂肪酸和矿物。示例性的表面活性剂包括阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂,而示例性脂肪酸包括棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸;此外,选自滑石、高岭土、氧化锌、二氧化钛或二氧化硅。
益生元也是形成保护涂层的封装材料的一部分,保护涂层能够承受水分、pH值,并将益生菌包含在微粒中,从而使益生菌能够在长期储存后仍维持存活。益生元曾被定义为“通过选择性刺激肠道中一种或有限数量细菌的生长和/或活性而对宿主产生有益影响的不易消化食物成分”,但由于其在肠道健康之外的广泛应用,最近被重新定义为“宿主微生物群所选择性利用以产生有益健康的效果的基质”。益生元不仅对胃肠系统有保护作用,而且对身体的其他部位,包括皮肤,也有保护作用。益生元包括蛋白质和糖类,其中蛋白质包括乳清蛋白、酪蛋白蛋白、大豆蛋白、牛奶蛋白、豌豆蛋白、大米蛋白、玉米醇溶蛋白或牛血清白蛋白;而糖包括多糖、单糖和双糖,例如葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、糊精、麦芽糊精、环糊精,木糖醇、纤维素、甲壳素、壳聚糖、支链淀粉、褐藻酸盐和阿拉伯木聚糖。
制备微粒时,选择以冷冻干燥程序来处理活的益生菌,并将其转化为休眠状态。冷冻干燥,也称为冻干法或冷冻升华干燥,是一种包括冷冻产品、降低压力、然后通过升华去除冰的低温脱水过程。对益生菌进行冷冻干燥可诱导益生菌进入休眠状态,在这种状态下,细胞代谢完全停止,而生理和遗传特征没有变化。冻干之前会先进行冷冻保存程序,将益生菌置于低温(-80℃)下,此时,悬浮培养基和细胞内部会形成冰晶,而导致冷冻损伤,因此可使用冷冻保护剂(如甘油)保护益生菌在冷冻保存过程中发生冷冻损伤。在冷冻保存过程中,益生菌的生物化学和生理活性基本上会停止,细胞可以得到长时间的保护,直到复苏。该方法也同样可用于生产含有温度敏感的益生菌或温度敏感的蛋白质的益生菌或益生元后制剂的粉末。简言之,在-80℃的冰箱或液氮中冷冻益生菌或后益生元配方的溶液,然后将冷冻样品转移到冷冻干燥器中的真空环境中,通过升华去除冰水,最后得到的冻干休眠状态益生菌呈粉末状。
在制备休眠状态益生菌粉末后,进一步以流化床涂覆制备核壳微粒,其是一种在微粒或颗粒上形成涂层的方法,可用于在休眠状态益生菌核壳微粒中形成保护层,例如聚合物层和可溶性保护层。在流化床涂覆中,首先将休眠状态益生菌粉末和益生元溶液制成的混合物喷涂在载体微粒核上形成第一层;之后,以系统底部的分配板的垂直气流流化具有第一层的载体微粒核,将溶化物、悬浮液或溶液的涂层材料喷涂到流化的微粒上,在流化微粒处,单个液滴冲击微粒表面并扩散,而溶剂不断蒸发,剩余的固体成分沉积在微粒表面并形成一层外壳,产生壳核微粒。此处理的目的是在单个微粒上和整个微粒群上均匀沉积液滴,以实现均匀的涂层厚度。在将混合物干燥并形成第一保护层后,再喷涂制备第二保护层,即聚合物层,以及喷涂另一溶液来形成可溶性保护层。经过适当的干燥后,可得到了不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒。
根据本发明的第二个方面,进一步提供了一种局部用的试剂盒,用于调节非粘膜表皮区域的微生物组,该试剂盒包括多个如上所述的包封休眠状态益生菌的核壳微粒和用于还原包封休眠状态益生菌的核壳微粒的释放介质。该释放介质能够降解包封休眠状态益生菌的核壳微粒的保护层和聚合物层,以将休眠的益生菌转化为活化的活益生菌,并进一步在非粘膜表皮上形成包括活化的活益生菌的合成生物膜,为益生菌定植提供适合的微环境。
包封休眠状态益生菌的核壳微粒和释放介质之间的协同作用在释放被聚合物层和可溶性保护层包覆的益生菌方面发挥着关键作用,因此释放介质的组成会针对保护层的材料进行选择,使其能够溶解微粒外壳并释放其中的益生菌;此外,也可以透过释放介质的配方来精心控制益生菌从微粒中释放的速率。上述的这些微粒和释放介质的合并应用仅发生在皮肤表面,以确保活益生菌的递送。
除了将活益生菌从休眠状态益生菌核壳微粒中释放出来以外,释放介质还为益生菌在皮肤上的定植提供了有利的微环境。传统的益生菌(如乳酸杆菌)并不是皮肤上的天然共生微生物,因此,非共生益生菌在皮肤表面定植具有一定的挑战,为了解决这个问题,于释放介质中进一步引入成膜营养物,以利于形成合成生物膜,这种生物膜以细胞外聚合糖的形式提供必需营养素、水分和粘附处,帮帮助生菌适应新环境,无疑的,合成生物膜提供的环境加速益生菌的定植和适应。重要的是,该配方包含天然生物膜材料,这些材料不会伤害皮肤表面上的微生物,而是为益生菌的重新激活、定植和繁殖创造了一个新鲜合适的微环境。益生菌释放介质还可以进一步开发成各种产品形式,包括乳液、乳霜和精华液。
通过筛选不同的表面活性剂、酸、碱和溶剂来配制释放介质,如Tween 20、Tween60、Span 20、Span 60、Brij 30、Brij 35、柠檬酸、乙酸、乳酸、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺、醇、丁二醇和聚乙二醇,以形成纳米至微米尺寸的乳剂,溶解核壳微粒的保护涂层并释放内部益生菌。释放介质的配方包括水、盐、有机酸、表面活性剂、油和成膜营养物;其中,示例性的表面活性剂包括阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂;盐的实施例包括氯化钠和氯化钙;示例性的有机酸包括乙酸、乳酸和柠檬酸;示例性的油包括角鲨烷、白芒花籽油、大豆油、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯,石蜡油、杏仁油和大豆油;示例性的成膜营养物包括透明质酸和胞外多糖。
通过益生菌释放特性测试来评估释放介质的益生菌释放能力。筛选了各种成膜营养素配方,包括不同组合的多糖、蛋白质和保湿成分,如纤维素、壳聚糖、普鲁兰、乳清蛋白、酪蛋白、氨基酸、透明质酸和糖异构酶。这些配方旨在创造一种有利于益生菌的利用和定植的合成生物膜,并使用人造皮肤或猪皮进行评估,定量在指定时间内成功定植并存活在测试表面上的益生菌数量。
此外,释放介质中还包括后生元制剂。鉴于细菌裂解物和/或发酵物含有细菌素和有机酸等病原体抑制物质,因此统称为后生元,而以细菌裂解物和/或发酵物为特征的护肤品已成功在益生菌相关化妆品行业中成为主流。本发明利用具有最有效的抗菌和抗炎特性的益生菌菌株的细胞裂解物/发酵物来产生后生元制剂,其中通过对发酵培养物进行热处理或超声处理使细胞膜破裂来取得益生菌细胞裂解物。这些细胞裂解物和发酵物含有益生菌细胞壁的残余物、生长代谢产物和与载体相同的益生菌菌株的死益生菌。
根据本发明的第三方面,提供了一种通过调节皮肤微生物组来维持皮肤健康的方法。该方法包括将上述试剂盒局部应用于患有炎症、脱水、痤疮、感染和发红的非粘膜外表皮区域。
特应性皮炎和寻常痤疮等皮肤病的发生被认为与正常微生物群被破坏有关。因此,通过重新建立有益细菌微生物组来调节皮肤微生物组,能够缓解这些疾病,从而促进皮肤健康。据研究显示,益生菌具有细菌抑制能力,能通过几种潜在机制,如产生细菌素和有机酸等抑制物质以及结合位点竞争,促进对皮肤微环境平衡的积极影响。因此,应用益生菌和/或其代谢产物抑制病原体定植有助于重新建立平衡的皮肤微生物组。
根据本发明的第四个方面,提供了一种制备外用于非粘膜皮肤的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒的方法。
该方法从制备载体微粒核开始,载体微粒核可提供维持益生菌生存的丰富营养来源。以该微粒核作为益生菌微粒构建的基础结构,以含有休眠益生菌的第一层包裹该载体微粒核,第一层不仅提供益生菌保护屏障,也是提供益生菌滋养环境,其中除了休眠益生菌外,还结合了至少一种益生元,形成一种协同的核壳结构,以促进益生菌的健康和活性。在形成核-壳结构之后,在第一层上添加聚合物层,该聚合物层作为额外的保护屏障,保护益生菌免受外部环境因素(包括湿度和氧化)的影响。最后,为了确保益生菌的最佳保存和释放,在聚合物层上提供了一层可溶性保护层,以再活化益生菌前起到保护作用,而当遇到合适的释放介质时,保护会溶解,释放与激活益生菌。该制备过程的最后一步包括对所得微粒进行干燥和处理,以最终得到不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒,这些微粒适用于外部非粘膜的皮肤应用,不仅可保持益生菌在保存期间的活力和功效,更确保涂抹在皮肤外表面时仍能保持有效。
实施例
实施例1、益生菌筛选:筛选具有最佳有益效果的益生菌
益生菌的制备
将包含单一纯菌株的冷冻益生菌原液与促进生长的培养基一起转移到生物反应发酵器中,並以连接到生物反应器发酵器的冷藏循环器来保持温度控制,將培养温度小心地保持在30℃至37℃的范围内,而培养过程的持续时间为24至72小时,取决于益生菌的类型和菌株,培養的需氧或厌氧环境也是基于益生菌的特性。
在发酵过程之后,通过离心收集益生菌,从而形成益生菌沉淀物,仔细的取得该沉淀物,以进行抗菌测试。为了最大限度地降低污染风险,所有样本都在生物安全柜或层流室中仔细处理。
表1、测试的益生菌
抗菌效果
通过检测益生菌与皮肤上常见的感染细菌(如金黄色葡萄球菌)之间的相互作用来评估益生菌的抗菌效果。简而言之,采用琼脂覆盖技术来研究益生菌抑制细菌生长的能力,首先,在MRS琼脂培养皿表面点接种2μL的经过夜培养的受检益生菌(如乳酸杆菌),该培养物的光密度(OD)为1.0±0.02(550nm),每个培养皿须接种三次。
然后将琼脂培养皿在37℃下培养24小时,以促进斑点状的菌落的发育。随后,将与待检测的皮肤病原体(在本实施例中为金黄色葡萄球菌)预混合的Muller-Hinton流体琼脂(含0.8%的琼脂)覆盖在琼脂培养皿上,其中金黄色葡萄球菌培养物的光密度也调整为1.0±0.02(550nm);在此之后,在37℃下将培养皿置于粘合培养箱中再培养48小时,在此期间覆盖的琼脂培养基会产生固化。
如图1所示,益生菌菌落(例如乳酸杆菌)周围形成的透明区域被记录为产生抑制的阳性反应,并且记录。该抑制区的直径(以毫米为单位测量)。与阳性对照的抑制区相比的结果记载于表2。
表2、益生菌的抗菌效果(针对金黄色葡萄球菌)
/>
于人体皮肤细胞中的抗炎效果
在进行3D皮肤模型研究之前,先为了进行了皮肤细胞试验评估益生菌的抗炎能力。简而言之,将皮肤细胞(包括角质形成细胞和成纤维细胞)与病原细菌或真菌一起培养,藉此引发炎症反应;接着再接种不同的益生菌共同接种,以筛选与皮肤细胞相互作用有关的候选菌或组合。
评估的重点是促炎细胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18,以及角质形成细胞或成纤维细胞内的蛋白质和胶原蛋白水平。在这种特定情况下,使用角质形成细胞系HaCaT评估乳酸杆菌益生菌的抗炎作用,引起HaCaT细胞炎症的病原菌是金黄色葡萄球菌。
如图2A-2B所示,与对照组(仅HaCaT细胞)相比,将HaCaT细胞与金黄色葡萄球菌培养会显着提高其IL-6水平;相反地,植物乳杆菌(JCM 6651)和约氏乳杆菌(JCM 1101)并不会诱发炎症。值得注意的是,当HaCaT细胞与金黄色葡萄球菌和植物乳杆菌共同培养时,与单独暴露于金黄色葡萄杆菌的细胞相比,IL-6水平显着降低了88-95%。
相反地,如图2C所示,与对照组(仅HaCaT细胞)相比,金黄色葡萄球菌的培养导致IL-6水平显着增加;有趣的是,路氏乳杆菌单独在HaCaT细胞中也会诱导显着的炎症,其炎症程度与金黄色葡萄球菌诱导的炎症程度相当;然而,当HaCaT细胞与金黄色葡萄球菌和路氏乳杆菌共同培养时,与单独暴露于金黄色葡萄杆菌的细胞相比,IL-6水平降低了53±12%。
对3D皮肤模型的抗炎作用
3D表皮皮肤模型,也称为重建的人类表皮(reconstructed human epidermis,RHE),用于评估益生菌的抗炎效果。为了模拟产生由细菌诱导的炎症所影响的皮肤状况,将活的致病菌(如金黄色葡萄球菌)引入3D皮肤模型的表面并共同培养,并进行优化以控制细菌与模型之间的粘附。
随后,于细菌诱导炎症的3D皮肤模型上给予选择的益生菌,再以ELISA试剂盒定量炎症相关细胞因子的水平,包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18,以及胶原蛋白水平。这些测量结果是评估益生菌对皮肤保护作用的重要指标。
根据结果,确认出具有最显着抗菌和抗炎作用的益生菌菌株,并以该菌株进行后续的核壳微粒制备;此外,其相应的裂解物被用于后生元制剂。
实验结果如图3所示,与没有金黄色葡萄菌感染的对照组相比,金黄色葡萄球菌的存在会导致IL-1α水平显着升高;相反,植物乳杆菌(JCM 6651)、约氏乳杆菌(JCM 1101)和路氏乳杆菌(JCM 1084)没有导致炎症反应。当3D皮肤模型与金黄色葡萄球菌和植物乳杆菌(JCM 6651)或约翰氏乳杆菌(JCM 1101)共同培养时,与仅存在金黄色葡萄杆菌的情况相比,可观察到IL-1α水平分别显着降低25%和36%;相反,将3D皮肤模型与金黄色葡萄球菌和路氏乳杆菌(JCM 1084)共同培养会引发显着的炎症反应,导致IL-1α水平增加165%,详细的乳酸杆菌益生菌对人类3D皮肤模型的抗炎作用的结果如表3所示。
表3、乳酸杆菌益生菌对人体3D皮肤模型的抗炎效果
乳酸杆菌 | 第1批 | 第2批 | 第3批 | 平均抗炎效果 |
植物乳植物杆菌JCM6651 | 25% | 34% | 33% | 31% |
约氏乳杆菌JCM1101 | 36% | 42% | 29% | 36% |
路氏乳杆菌JCM1084 | - | 4% | 28% | 11% |
研究结果显示,益生菌约氏乳杆菌JCM 1101和植物乳杆菌JCM6651表现出抗炎效果,可透过观察到显着减少感染金黄色葡萄球菌的3D皮肤模型中皮肤细胞释放的炎症细胞因子IL-1α来证实。平均而言,植物乳杆菌JCM 6651和约翰氏乳酸杆菌JCM 1101的IL-1α水平分别降低了31%和36%。
实施例2
待检测的益生元包括低聚糖碳水化合物,其中包括但不限于抗性淀粉、抗性糊精、果胶、β-葡聚糖、低聚果糖、菊粉、木质素和壳聚糖。这些益生元在核壳微粒配方中发挥着至关重要的作用,可显着增强所选益生菌菌株的生长。
如图4A所示,与未添加乳清蛋白的对照组相比,很明显,添加乳清蛋白使植物乳杆菌(JCM 6651)的生长显着增加21862%,反观其他选定的益生元,仅表现出与对照组相似的效果。在图4B中,与未添加木糖醇的对照组相比,木糖醇添加可促进约氏乳杆菌(JCM 1101)提升496%的生长,而其他的益生元与对照组的效果相当。此外,如图4C所示,在所有测试剂量中,乳清蛋白在1%的浓度下表现最佳,相似地,如图4D所示,木糖醇在1%浓度下表现出其最佳性能。
实施例3、休眠状态益生菌核壳微粒的制备及配方
图5显示了包封休眠状态的益生菌核壳微粒100的制备过程概述。在流化床涂布方法中,载体颗粒核101用作涂布益生菌的初始基质,其中活益生菌经过离心以消除培养基,然后与含有单糖和多糖的溶液混合以保护其生存能力,将该混合物喷涂在载体颗粒核101上,形成第一层102;接着,对涂层进行30分钟的干燥处理,一旦第一层完全干燥后,在其上喷涂聚合物溶液,并且使用暖空气来促进聚合物层103的形成,此外,同样通过喷涂包括聚合物、表面活性剂、脂肪酸和矿物质的溶液来生成可溶性保护层104。具体的涂层条件,如空气流量、温度和涂层持续时间,取决于所需的涂层厚度和层的数量。
使用JEM-IT200扫描电子显微镜(SEM)观察包封休眠状态益生菌的核壳微粒100的形态,利用SEM的刻度测量粉末的尺寸,并评估粉末的均匀性。简言之,使用胶带将待检查的样品牢固地固定在金属桩上,并通过金溅射镀膜方法使其导电,随后,便可使用SEM观察样品。制备过程中的各阶段微粒皆进行SEM影像撷取,SEM图像呈现在图6A-6D中。图6A显示载体颗粒核(蔗糖球)的SEM图像,而图6B提供了涂覆有第一层的载体颗粒核的影像,此外,图6C展示了第一层表面上的聚合物层的SEM形态,并且图6D显示添加可溶性保护层到聚合物层上之后的包封休眠状态益生菌的核壳微粒的SEM图像。
基于上述实施例的结果,以乳杆菌作为本实施例中的核壳微粒配方,配方中包含所选益生菌与以下化学物质,以可获得高活性、稳定且易于释放的配方,配方列于表4中。
保护活益生菌的核壳微粒的配方包含几个关键成分。首先,核材料是选自糖类,包括单糖、双糖和多糖,每种都有不同的形状和大小;益生菌涂层由至少一种来自乳杆菌属的活益生菌和至少一种益生元组成,益生元选自蛋白质(如乳清蛋白)和糖类(如麦芽糊精、木糖醇和蔗糖)。
此外,保护层包括至少一种聚合物组分,其选自二棕榈酰羟基脯氨酸、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和甲基丙烯酸甲酯共聚物。此外,配方中还包括一种或多种表面活性剂(如十二烷基硫酸钠),且为了增强其性能,该配方还整合了至少一种脂肪酸(如硬脂酸)和至少一种矿物(如滑石),这些成分共同有助于核壳微粒在保存和递送益生菌方面的有效性。
表4、包封休眠状态益生菌核壳微粒的组成
在不同的时间间隔内评估配方的稳定性,并检查受保护的活益生菌的生存能力。将配方置于稀释至适当浓度的释放介质中,随后接种在MRS琼脂上24-48小时,以记录菌落形成单位(CFU),并将其与配方的初始时间点进行比较。结果如表5所示。
表5、24周后的益生菌活性
实施例4、包封休眠状态益生菌的核壳微粒配方的稳定性评估
表6中显示DP17配方的内容与摘要。通过在不同时间间隔监测在室温下储存的DP17的益生菌活性来评估其稳定性,此外,还监测水活动随时间的变化。DP017的稳定性如图7所示。
表6、DP17配方
表7中显示DP18配方的内容与摘要。通过在不同时间间隔监测在室温下储存的DP18的益生菌活性来评估其稳定性,此外,还监测水活动随时间的变化。DP018的稳定性如图8所示。
表7、DP18配方
表8中显示DP19配方的内容与摘要。通过在不同时间间隔监测在室温下储存的DP19的益生菌活性来评估其稳定性,此外,还监测水活动随时间的变化。DP019的稳定性如图9所示。
表8、DP19配方
表9中显示DP20配方的内容与摘要。通过在不同时间间隔监测在室温下储存的DP20的益生菌活性来评估其稳定性,此外,还监测水活动随时间的变化。DP020的稳定性如图10所示。
表9、DP20配方
实施例5、释放介质配方
释放介质配方可促进休眠益生菌从核壳微粒中被释放并再激活,该配方包括用于溶解保护层(包括可溶性保护层和聚合物层)的特定化学成分,还有助于益生菌在施用部位的定植。为了实现这一点,选择有机酸来调节pH值,促进保护层材料的溶解,同时,包括透明质酸和细胞外多糖等成膜营养物质来促进益生菌菌落在皮肤上的定植,另外,添加表面活性剂和油以增强保护层的溶解,并在施用过程中提供更佳的延展性。释放介质配方的详细组成总结在表10中。
表10、释放介质的配方
成分 | RM09a | RM09b | RM10a | RM10b | RM10c | RM11a | RM11b | RM12 |
消毒水 | 98.1% | 98.1% | 98.1% | 98.1% | 98.1% | 97.6% | 97.6% | 96.7% |
氯化钠 | - | - | - | - | - | - | - | 0.90% |
乳酸 | - | - | 0.02% | 0.02% | 0.02% | 0.02% | 0.02% | 0.01% |
透明质酸 | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% |
细胞外多糖 | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% | 0.20% |
Tween 80 | 1% | 1% | 1% | 1% | 1% | 1% | 1% | 1% |
白芒花籽油 | - | 0.50% | - | - | - | 0.50% | 0.50% | 0.50% |
椰子油 | 0.50% | - | - | - | - | - | - | - |
角鲨烷 | - | - | - | 0.50% | - | - | 0.50% | 0.50% |
水杨酸 | - | - | - | - | 0.50% | - | - | - |
尿囊素 | - | - | 0.50% | - | - | 0.50% | - | - |
释放的益生菌总量 | 99% | 100% | 100% | 100% | 42% | 91% | 96% | 96% |
释放介质的制备是个简单的过程,通过简单的搅拌混合或均质混合方法即可完成。簡言之,在烧杯中测量96.7克水,然后加入0.9克氯化钠,然后将其溶解在水中;随后,加入0.01克乳酸、0.2克透明质酸和0.2克细胞外多糖,并同样将其溶解在水中;然后,添加1克Tween 80到混合物中,将其在500rpm下搅拌30分钟;然后,将0.5克白芒花籽油和0.5克角鲨烷引入混合物中,将其在1000rpm下进一步搅拌至少30分钟,或在5000rpm下均匀化5分钟,得到释放介质。
实施例6、受保护的后生元配方
受保护的后生元的配方中包括先前评估鉴定的益生菌细胞裂解物和益生元的组合。益生菌细胞裂解物是通过对发酵培养物进行热处理或超声处理以使细胞破裂而获得,细胞裂解物中包括来自益生菌细胞壁的碎片、生长代谢产物和死亡的益生菌,且将细胞裂解物与糖类混合,以保护其生物功能免受微生物活性的影响。表11中概述了该配方中使用的材料。
表11、后生元配方
采用冷冻干燥法处理受保护的后生元的配方以生成粉末形式,此方法有效地保存了对温度敏感的蛋白质和其他具生物功能物质。简言之,从益生菌培养液中提取后生元,然后以膜过滤器过滤掉较大的碎屑和不需要的成分,所得溶液中添加麦芽糊精、木糖醇和海藻糖,经充分混合30分钟后,立即将溶液冷冻在-80℃的冰箱中或使用液氮。随后,将冷冻样品转移到冷冻干燥器内的真空环境中升华去除冰水,最终得到冷冻干燥的粉末形式后生元。
通过将受保护的后生元粉末溶解在5%浓度的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并对其进行抗金黄色葡萄球菌测试,来评估这些受保护的后生元配方的抗菌效果。具体而言,将106CFU/ml的金黄色葡萄球菌引入5%受保护的后生元制剂中,并在在两个不同的时间点进行检测,分别释接种后15分钟和24小时,结果如图11所示。
在表12中,显示了受保护的后生元的稳定性。在加速条件下培养(40℃,75%RH)3个月后,其仍能对金黄色葡萄球菌产生抗菌效果(大于5的对数减少),其粉末的外观为淡黄色,并且在整个稳定性评估中仅出现轻微变化。
表12、受保护的后生元配方的稳定性评估
实施例7、益生菌复苏系统和受保护的受保护的后生元的安全性评估
将本发明的益生菌复苏系统和受保护的后生元交给经认可的第三方实验室进行生物安全性的全面评估,结果如表13所示。分别对益生菌复苏系统和后生元进行了接触性急性毒性测试、重复接触和人体贴片测试,这些检测提供了关于通过皮肤途径短期和反复接触化学物质所产生的潜在健康危害的关键信息,重要的是,未观察到或仅出现可忽略的接触性急性毒性,证实了益生菌复苏系统和后生元的安全性。
表13、安全评估总结
急性皮肤毒性测试 | 重复皮肤刺激试验 | 人体皮肤贴片试验 | |
益生菌复苏系统 | 通过 | 通过 | 通过 |
后生元 | 通过 | 通过 | 通过 |
在SGS中进行了急性皮肤毒性、重复皮肤刺激试验和人体皮肤贴片试验。
此外,益生菌复苏系统和受保护的后生元还通过皮肤科医生的临床评估,结果如表14所示,同样未观察到不良事件。
表14、皮肤科医生对益生菌复苏系统和后生元的安全性所进行的临床评估
项目: | 不良事件 |
皮肤科医生观察到的不良事件 | 0%(0/60) |
经皮肤科医生评估的与研究样本相关的不良事件 | 0%(0/60) |
经皮肤科医生评估的与研究样本相关的严重不良事件 | 0%(0/60) |
实施例8、益生菌复苏系统中的核壳微粒和释放介质共同作用下的益生菌定植和保湿作用
通过将核壳微粒与释放介质混合,评估益生菌复苏系统所释放出的益生菌在人类皮肤上的定植能力,并评估其皮肤保湿效果。如图12所示,共两名受试者参与了这项评测,受试者的一只手使用益生菌复苏系统治疗,另一只手用PBS处理作为对照,于益生菌复苏系统中,将0.1g核壳微粒与0.9g释放介质充分混合,并使用0.4g的混合物处理两块3公分x6公分的区域,以用于在两个时间点采集样品;另一方面,以PBS来复制该处理过程,其中时间点分别为1小时和2小时的间隔收集益生菌样品,并将其接种到琼脂培养皿上。如图13所示,用益生菌复苏系统处理的手部皮肤上的益生菌数量增加;此外,如图14所示,在不同时间点测量的皮肤保湿程度显示益生菌复苏系统处理的手部的含水量水平有所提升。
同时也由认可的第三方测试实验室进行随机、双盲、分侧研究进行益生菌皮肤定植的评估。首先,先对11名候选人进行了初步研究,以确定可行性并确定必要的测试参数;随后,进行一项至少30名参与者的标准检测,受试者会被要求在前额、脸颊和前臂皮肤的左侧或右侧涂抹标准量的益生菌复苏系统样品(例如,1g核壳微粒和1ml益生菌释放介质),每天两次。
在作为基线的第0天记录益生菌在皮肤表面的初始计数,之后分别在第14天、第28天和第56天从受试者收集样本以评估益生菌定植。该研究的结果如表15所示,比较和证明益生菌定植。
表15、30名受试者的益生菌定植
*复苏率(Q2/Q1*100%),**复苏率(Q3/Q1*1000%),#复苏率(Q4/Q1*100100%),##复苏率(Q5/Q1*100%)
此外,通过认可的第三方实验室进行的随机、双盲、分侧研究评估局部施用益生菌复苏系统后,对皮肤微生物组的影响。共挑选了30名受试者参与本试验,受试者被要求每天两次在前额、面颊和前臂皮肤的左侧或右侧涂抹标准量的益生菌复苏系统样本,持续56天。
在不同的时间点收集皮肤上存在的微生物:第0天(施用前,作为基线)、第14天、第28天和第56天。通过16S rRNA测序进行评估采集的样本,以分析和比较不同时间点的皮肤微生物组比率和变化。
表16、人类皮肤微生物组评估
1类:γ-变形杆菌,2类:杆菌,3类:拟杆菌,4类:放线菌,5类:蓝杆菌,6类:α-变形菌,7类:梭菌,8类:梭杆菌,9类:阴性菌门,10类:嗜热菌,11类:其他A:前额,B:脸颊,C:手臂(内侧),0:施用前,0h:施用后立即,2h:施用2小时后,14d:施用14天后,28d:施用28天后,56d:施用56天后。
在皮肤上施用益生菌复苏系统后,皮肤微生物组发生变化。在使用之前,皮肤的微生物组主要由伽马射线菌(占90%以上的皮肤微生物)组成;施用益生菌复苏系统后,皮肤微生物组变为以芽孢杆菌为主,而且从立即采集的样品到第56天获得的最后一个样品中都观察到了这种现象。
实施例9、使用包括益生菌复苏系统和受保护的后生元的试剂盒的有益效果
益生菌复苏系统和受保护的后生物素在经认可的第三方测试实验室进行评估,以确定其对健康、敏感和有问题皮肤的疗效。至少30名受试者进行随机、双盲、分侧研究,以评估每种原型(益生菌复苏系统和益生素+释放介质)和每种皮肤状况。评估原型对以下情况的影响:
1.健康肌肤,注重肌肤弹性和保湿效果。
2.敏感肌肤,强调舒缓皮肤刺激和保湿能力。
3.有问题的皮肤,特别是对评估痤疮皮肤的改善情况。
每个受试者被随机分配在前额、面部和前臂的左侧或右侧涂抹测试样本,每天两次,持续28天。在第0天、第14天和第28天时,透过肌肤检测仪和皮肤科医生的诊断来评估皮肤状况;此外,通过问卷调查受试者,以提供反馈,做为评估他们的使用经验和原型的性能。详细结果如表17至表22所示。
表17、益生菌复苏系统对健康皮肤的弹性作用
表18、益生菌复苏系统对敏感皮肤的舒缓作用
/>
表19、益生菌复苏系统对问题(痤疮)皮肤的抗痤疮作用
/>
表20、受保护的后生元对健康皮肤的皮肤弹性作用
表21、受保护的后生元对敏感皮肤的舒缓作用
/>
表22、受保护的后生元对问题(痤疮)皮肤的抗痤疮作用
总体而言,健康皮肤对益生菌复苏系统和受保护的后生元的满意度分别为87.9%和96.9%、敏感皮肤为100%和100%、问题(痤疮)皮肤为86.7%和90.3%。在人体试验测试中,透过仪器和皮肤科医生进行了评估,所有疗效试验均显示益生菌复苏系统和后生元对不同类型皮肤具有正面效果。
本发明的上述描述是为了说明和描述的目的而提供的。其并非旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式。许多修改和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。
选择和描述实施例是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用,从而使本领域的其他技术人员能够理解本发明的各种实施例以及适用于预期特定用途的各种修改。
Claims (24)
1.一种外用于非粘膜皮肤的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒,其特征在于,包括:
载体微粒核,作为益生菌营养源;
第一层,其中所述第一层围绕所述载体微粒核并具有可用于影响非粘膜的外部表皮上生物菌落的至少一种处于休眠状态的益生菌和作为所述益生菌食物源的至少一种益生元,其中当所述休眠益生菌被非粘膜表皮表面上的释放介质激活时,所述休眠益生菌可复苏为活体益生菌;
聚合物层,所述聚合物层位在所述第一层上,以及
可溶性保护层,用于保护所述益生菌核壳颗粒免受氧化、热和潮湿,所述可溶性保护层可被所述释放介质溶解以释放所述第一层中的所述益生菌并激为活益生菌。
2.根据权利要求1所述的微粒,其中所述载体微粒核包括蔗糖、乳清蛋白、淀粉和纤维素中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的微粒,其中所述至少一种处于休眠状态的益生菌包括双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、酿酒酵母(Saccharomyces)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)及其变异株。
4.根据权利要求1所述的微粒,其中所述至少一种益生元选自蛋白质或糖类。
5.根据权利要求4所述的微粒,其中所述蛋白质选自乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、牛奶蛋白、豌豆蛋白、大米蛋白、玉米醇溶蛋白或牛血清白蛋白。
6.根据权利要求4所述的微粒,其中所述糖类选自葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳寡糖、糊精、麦芽糊精、环糊精、木糖醇、纤维素、几丁质、壳聚糖、普鲁兰、果胶、褐藻酸盐或阿拉伯木聚糖。
7.根据权利要求1所述的微粒,其中所述聚合物层选自虫胶、二棕榈酰羟基脯氨酸、基于甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物、甘油酯或聚-L-乳酸。
8.根据权利要求1所述的微粒,其中所述可溶性保护层包括聚合物、表面活性剂、脂肪酸和矿物。
9.根据权利要求8所述的微粒,其中所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。
10.根据权利要求8所述的微粒,其中所述脂肪酸选自棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸或二十二碳六烯酸。
11.根据权利要求8所述的微粒,其中所述矿物选自滑石、高岭土、氧化锌、二氧化钛或二氧化硅。
12.一种用于调节非粘膜表皮区域的微生物组的局部外用试剂盒,其特征在于,包括:
多个根据权利要求1所述的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒;以及
释放介质,所述释放介质用于重构所述的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒;
其中所述释放介质降解所述包封休眠状态益生菌的核壳微粒的所述保护层和所述聚合物层,以将所述的休眠益生菌转化为活化的活益生菌;以及
所述释放介质在非粘膜表皮上形成包括所述活化的活益生菌的合成生物膜,为益生菌定植提供适合的微环境。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述释放介质包括水、盐、有机酸、表面活性剂、油和成膜营养物。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述盐选自氯化钠或氯化钙。
15.根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述有机酸选自乙酸、乳酸或柠檬酸。
16.根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂。
17.根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述油选自角鲨烷、白芒花籽油、大豆油、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯,石蜡油、杏仁油或大豆油。
18.根据权利要求13所述的试剂盒,其中所述成膜营养物选自透明质酸或细胞外多糖。
19.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述释放介质选自乳液形式、乳霜形式、精华液形式或溶液形式。
20.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述释放介质还包括具有抗菌作用和抗炎特性的后生元制剂。
21.根据权利要求12所述的试剂盒,其中所述后生元制剂包括与所述微粒中的同种益生菌的裂解物或发酵物,其包含益生菌细胞壁碎片、生长代谢产物和死益生菌细胞。
22.一种通过调节皮肤微生物组来维持皮肤健康的方法,其特征在于,包括:
将根据权利要求12所述的试剂盒局部施用于有需要的非粘膜表皮区域。
23.根据权利要求22所述的方法,其中所述有需要的非粘膜表皮区域出现炎症、脱水、痤疮、感染和发红。
24.一种制备外用于非粘膜皮肤的不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒的方法,其特征在于,包括:
制备载体微粒核,所述载体微粒核包括供益生菌利用的一种或多种营养源;
在所述载体微粒核上涂覆包括休眠状态益生菌和至少一种益生元的第一层,形成核壳结构;
在所述第一层上添加聚合物层;
在所述聚合物层上涂覆可溶性保护层;和
干燥和调适所得到的微粒以产生不可食且干燥的包封休眠状态益生菌的核壳微粒。
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2023
- 2023-10-25 CN CN202311390849.XA patent/CN117919155A/zh active Pending
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