CN117916600A - 阿尔茨海默病的检测方法和检测试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及：提供简便地检测阿尔茨海默病(AD)的方法和对AD病理阶段简便地进行分层的方法、以及可用于上述方法的试剂。本发明中，细胞外分泌囊泡包含蛋白的测定可进行阿尔茨海默病的检测和AD病理阶段的分层，因此提供简便地检测阿尔茨海默病(AD)的方法和对AD病理阶段简便地进行分层的方法、以及可用于上述方法的试剂。
Description
技术领域
本发明涉及以细胞外分泌囊泡包含蛋白为测定对象的阿尔茨海默病的检测方法和检测试剂。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是患者人数最多的痴呆症。关于AD的发病机理，从发病前开始，从早期病理即淀粉样蛋白β(Aβ)累积起，经由tau病理即神经原纤维变化而阶段性地进展到神经变性，最终发展为AD。目前，作为用于对该病理阶段进行分层的生物标志物，利用以Aβ和tau蛋白的浓度为指标的脊髓液检查、PET成像，但是脊髓液Aβ测定不在保险范围内且脊髓液采集有侵入性高的问题，昂贵的PET检查仅少数机构能实施等，问题较多。因此，需要开发用于在生物的脑部对AD病理阶段进行分层的生物标志物，以用于旨在治疗/预防AD的临床和基础研究。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供简便地检测阿尔茨海默病(AD)的方法、和在AD发病前在生物的脑部简便地对AD病理阶段进行分层的方法。另外，课题在于提供可用于上述方法的试剂。
用于解决问题的方案
本发明人们进行了深入研究，发现细胞外分泌囊泡中的特定蛋白质组在以异常蛋白质(β淀粉样蛋白、tau)为指标的AD分子病理阶段内发生改变，并且鉴定了该在病理阶段内发生改变的细胞外分泌囊泡包含蛋白。由此想到，细胞外分泌囊泡包含蛋白的测定可进行阿尔茨海默病的检测和AD病理阶段的分层，从而完成了本发明。
即，本发明包括以下方式。
[1]一种检测阿尔茨海默病的方法，其包括下述步骤：测定从检体采集的试样中的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量。
[2]根据[1]的方法，其中，上述细胞外分泌囊泡包含蛋白为在阿尔茨海默病的检体中的量相对于正常的检体中的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量有变动的细胞外分泌囊泡包含蛋白。
[3]根据[2]的方法，其中，上述变动为2倍以上或0.5倍以下。
[4]根据[1]～[3]中任一项的方法，其包括下述步骤：从检体采集的试样中回收细胞外分泌囊泡级分，测定该细胞外分泌囊泡级分中的细胞外分泌囊泡包含蛋白。
[5]根据[1]～[4]中任一项的方法，其中，上述细胞外分泌囊泡包含蛋白为选自由下述蛋白组成的组中的1种以上：外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3、α-1,3-岩藻糖基转移酶10、排斥导向分子A、蛋白激酶cAMP依赖性I型调节亚基β、ATP依赖性DNA复制解旋酶/核酸酶DNA2、接触蛋白6、组蛋白H4、外泌素1、BCL6辅阻遏物样蛋白1、免疫球蛋白μ重链、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子28、组织蛋白酶B、推定的角蛋白87蛋白、多重剪接RNA结合蛋白、丝酶抑制蛋白B3、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1、钙结合蛋白39、细胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP]、黑素瘤结合抗体B10、Nodal修饰因子1、Nodal修饰因子2、Nodal修饰因子3、含有磷酸核糖转移酶结构域的蛋白1、furry同系物样蛋白、肌球蛋白10、senataxin解旋酶、FAM227B蛋白、丝酶抑制蛋白B4、胆碱酯酶、中心粒周蛋白、Unc13同源物C蛋白、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基1、亲神经素(neurexophilin)1、DNA结合蛋白RFX5、妊娠特异性β1糖蛋白8、β淀粉样蛋白A4前体蛋白结合家族B成员2、激肽释放酶(kallikrein)11、钙黏合素11、钠通道蛋白4型亚基α和跨膜蛋白62。
[6]根据[1]～[5]中任一项的方法，其中，上述细胞外分泌囊泡包含蛋白包含组织蛋白酶B。
[7]一种检测阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期的方法，其包括下述步骤；测定从检体采集的试样中的细胞外分泌囊泡包含蛋白。
[8]根据[7]的方法，其中，上述细胞外分泌囊泡包含蛋白为选自由下述蛋白组成的组中的1种以上：外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3、α-1,3-岩藻糖基转移酶10、排斥导向分子A、蛋白激酶cAMP依赖性I型调节亚基β、ATP依赖性DNA复制解旋酶/核酸酶DNA2、接触蛋白6、组蛋白H4、外泌素1、BCL6辅阻遏物样蛋白1、免疫球蛋白μ重链、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子28、组织蛋白酶B、推定的角蛋白87蛋白、多重剪接RNA结合蛋白、丝酶抑制蛋白B3、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1、钙结合蛋白39、细胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP]、黑素瘤结合抗体B10、Nodal修饰因子1、Nodal修饰因子2、Nodal修饰因子3、含有磷酸核糖转移酶结构域的蛋白1、furry同系物样蛋白、肌球蛋白10、senataxin解旋酶、FAM227B蛋白和丝酶抑制蛋白B4。
[9]根据[7]或[8]的方法，其中，上述细胞外分泌囊泡包含蛋白包含组织蛋白酶B。
[10]一种检测阿尔茨海默病的tau病理形成期和/或神经变性期的方法，其包括下述步骤：测定从检体采集的试样中的细胞外分泌囊泡包含蛋白。
[11]根据[10]的方法，其中，上述细胞外分泌囊泡包含蛋白为选自由下述蛋白组成的组中的1种以上：胆碱酯酶、中心粒周蛋白、Unc13同源物C蛋白、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基1、α-1,3-岩藻糖基转移酶10、亲神经素1、DNA结合蛋白RFX5、妊娠特异性β1糖蛋白8、β淀粉样蛋白A4前体蛋白结合家族B成员2、激肽释放酶11、钙黏合素11、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1、钠通道蛋白4型亚基α、FAM227B蛋白Protein和跨膜蛋白62。
[12]根据[10]或[11]的方法，其中，上述细胞外分泌囊泡包含蛋白包含组织蛋白酶B。
[13]根据[1]～[12]中任一项的方法，其中，上述试样为脊髓液或血浆。
[14]一种阿尔茨海默病诊断试剂盒，其包含测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂。
发明的效果
根据本发明，提供简便地检测阿尔茨海默病(AD)的方法和在AD发病前在生物的脑部简便地对AD病理阶段进行分层的方法、以及可以用于这些方法的试剂。
附图说明
图1为示出各ATN分类的受试者中，脊髓液的细胞外囊泡级分中的组织蛋白酶B浓度的图。***：p＜0.001。
图2A为示出有无淀粉样物质病理(A+组或A-组的受试者)情况下，脊髓液的细胞外囊泡级分中的组织蛋白酶B浓度的图。***：p＜0.001。
图2B为示出各受试者的脊髓液Aβ42浓度与脊髓液的细胞外囊泡级分中的组织蛋白酶B浓度的相关性的图。r表示相关系数。
图3A为示出有无淀粉样物质病理(A+组或A-组的受试者)中，血浆的细胞外囊泡级分中的组织蛋白酶B浓度的图。***：p＜0.001。
图3B为示出各受试者的脊髓液Aβ42浓度与血浆的细胞外囊泡级分中的组织蛋白酶B浓度的相关性的图。r表示相关系数。
具体实施方式
本发明的第1方式为检测阿尔茨海默病的方法，其包括下述步骤：测定从检体采集的试样中的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量。
检体只要为存在发生阿尔茨海默病的可能性的动物则没有特别限定，优选为哺乳动物，进一步优选为人。
另外，本发明的检测方法通常以体外方式实施。
试样包括从检体采集的体液、细胞、组织等。另外，体液包括脊髓液、血液、淋巴液、组织液等，血液包括血浆和血细胞成分。优选试样为脊髓液或血浆，更优选为脊髓液。
从检体采集试样时，根据所采集的试样和成为采集对象的检体采用包括公知方法在内的适当的方法即可。例如，脊髓液可以进行腰椎穿刺并通过直接滴落采集来进行采集，血浆可以从所采集的血液中通过离心分离来采集，但是不限于此。另外，采集的试样可以根据需要进行离心分离、冷冻保存等。
细胞外分泌囊泡是指从细胞分泌出的细胞外囊泡。细胞外分泌囊泡典型情况下在其表面包含产生源细胞的细胞膜成分且在内部包含产生源细胞内的物质。
细胞外分泌囊泡包含蛋白可以为细胞外分泌囊泡的内部所包含的蛋白，也可以为存在于细胞外分泌囊泡的表面的蛋白，另外还可以为细胞外分泌囊泡的跨膜蛋白，只要是与细胞外分泌囊泡一起回收则没有特别限定。细胞外分泌囊泡包含蛋白优选为细胞外分泌囊泡级分中包含的蛋白。
细胞外分泌囊泡包含蛋白的测定可以用试样整体来进行，也可以用试样的细胞外分泌囊泡级分进行。因此，本发明可以包括从检体采集的试样中回收细胞外分泌囊泡级分的步骤。
细胞外分泌囊泡级分是指富含试样中的细胞外分泌囊泡的级分，例如，可以利用超速离心沉降法、密度梯度超速离心分级法、尺寸排阻层析、针对表面抗原的抗体、捕捉细胞外分泌囊泡膜表面所特异性存在的脂质的方法等来进行分级。
细胞外分泌囊泡级分可以通过超速离心法、柱纯化等来回收，另外也可以通过使用市售制品来进行回收。作为这样的制品，可列举例如尺寸排阻层析柱EV-Second L70(GLSciences Inc.制)，但是不限于此。
细胞外分泌囊泡包含蛋白的测定可以使用公知的蛋白质测定方法。优选地，可以使用利用基于液相色谱质谱联用(LC-MS)的质谱分析的测定、或利用针对细胞外分泌囊泡包含蛋白的抗体的免疫测定法。免疫测定法可列举例如基于酶免疫定量法进行定量检测的方法以及通过荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等进行测定的方法等。酶免疫定量法是标记免疫测定法中使用酶作为标记物质的检测方法。另外，作为酶免疫定量法，可列举例如ELISA法。
ELISA法可例示直接法、间接法和夹心法，任一方法均可使用。ELISA法的直接法可以是作为该领域周知的方法的如下方法：使经标记化的抗体与固定化于固相的生物体试样中的蛋白质结合，对标记物质进行检测。ELISA法的间接法可以是作为该领域周知的方法的如下方法：使一抗与固定化于固相的生物体试样中的蛋白质结合而在固相表面上形成免疫复合体后，再使用可识别一抗的标记化二抗来检测标记物质。ELISA法的夹心法可以是作为该领域周知的方法的如下方法：将蛋白质捕捉到固定化于固相的固定化抗体(一抗)，再使经标记化的二抗与被捕捉的蛋白质结合，在固相表面上形成结合有上述两种抗体的免疫复合体后检测标记物质。
LC-MS为将高效液相色谱(HPLC)和任意的质谱仪(MS)组合而成的装置。使用基于LC-MS的质谱分析的测定可以对蛋白质进行鉴定和定量。作为LC-MS中使用的MS，可列举例如Orbitrap Fusion Lumos(Thermo Scientific公司)，但是不限于此。
关于蛋白质的鉴定，可以通过各种适合于蛋白质测定方法的方法来进行鉴定，没有特别限定，例如，在使用基于LC-MS的质谱分析的测定中，可以通过针对蛋白质数据库检索在基于LC-MS的分析中得到的产物离子谱数据来进行。作为蛋白质数据库，可列举例如公共蛋白质数据库SwissProt。
关于蛋白质的定量，可以通过各种适合于蛋白质测定方法的方法来进行定量，没有特别限定，例如，在使用基于LC-MS的质谱分析的测定中，可以由在基于LC-MS的分析中得到的前体离子谱数据的峰面积来计算。蛋白质的鉴定和定量可以使用软件来进行。作为这样的软件，可列举例如Proteome Discoverer 2.4software(Thermo Fischer Scientific公司制)，但是没有特别限定。
可以从蛋白质的测定中所使用的试样中纯化蛋白质。蛋白质的纯化方法可列举例如使用聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)的纯化方法，但是不限于此，可以根据所使用的试样、蛋白质测定方法等来适当选择。也可以不纯化蛋白质，而是将试样用于蛋白质的测定中。另外，也可以将试样适当稀释。
将细胞外分泌囊泡包含蛋白的大规模分析称为细胞外分泌囊泡蛋白质组学。细胞外分泌囊泡蛋白质组学可以为细胞外分泌囊泡内所存在的蛋白质的总括性分析。作为细胞外分泌囊泡蛋白质组学的一个方式，可列举例如通过基于LC-MS的质谱分析来总括性地分析细胞外分泌囊泡中包含的蛋白质分子种类的浓度。
细胞外分泌囊泡蛋白质组学例如可以通过将试样的细胞外分泌囊泡级分供于基于LC-MS的质谱分析、并且由分析数据来进行蛋白质的鉴定和定量来实施。
也将列举了通过蛋白质组学分析得到的、所鉴定出的蛋白质各自的定量数据的数据称为蛋白谱。因此，也将列举了通过细胞外分泌囊泡蛋白质组学得到的、所鉴定出的细胞外分泌囊泡包含蛋白各自的定量数据的数据称为细胞外分泌囊泡包含蛋白谱。
根据细胞外分泌囊泡蛋白质组学，正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱与阿尔茨海默病的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱是不同的。因此，本发明中所测定的细胞外分泌囊泡包含蛋白优选为在阿尔茨海默病的检体中的量相对于正常的检体中的量有变动的细胞外分泌囊泡包含蛋白。
检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定以上的变动时、高于或低于正常的检体中的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量时、或者高于或低于所设定的阈值时，检测阿尔茨海默病或阿尔茨海默病发病风险。需要说明的是，本说明书中的“阿尔茨海默病发病风险”是指在测定时间点未发病但是不久的将来发病的概率高。
理想的是，关于阿尔茨海默病的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比处于高水准的细胞外分泌囊泡包含蛋白，检体的该细胞外分泌囊泡包含蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定量以上的上升变动时、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量相比处于高水准时、或显示所设定的阈值以上时，检测阿尔茨海默病或阿尔茨海默病发病风险。
作为具体的检测基准的例子，例如，可以是显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的1.05倍以上，可以是显示1.5倍以上，可以是显示2.0倍以上，可以是显示3.0倍以上，可以是显示5.0倍以上。优选显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的2.0倍以上。
理想的是，关于阿尔茨海默病的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比处于低水准的细胞外分泌囊泡包含蛋白，检体的该细胞外分泌囊泡包含蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定量以上的下降变动时、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量相比处于低水准时、或显示所设定的阈值以下时，检测阿尔茨海默病或阿尔茨海默病发病风险。
作为具体的检测基准的例子，例如，可以是显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的0.95倍以下，可以是显示0.75倍以下，可以是显示0.5倍以下，可以是显示0.3倍以下，可以是显示0.2倍以下。优选显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的0.5倍以下。
阿尔茨海默病是具有定向障碍、短时记忆损伤(日语：遅延再生障害)、视觉空间认知障碍、执行功能障碍等症状的痴呆症，是指致病基因、β淀粉样蛋白等致病蛋白已得到鉴定、得到诊断的疾病，将未经基因、蛋白诊断而仅通过临床症状而诊断者称为阿尔茨海默型痴呆症。另外，阿尔茨海默病(阿尔茨海默型痴呆症)的前驱状态为健忘型轻度认知功能障碍(amnestic MCI：MCI)。
阿尔茨海默病典型情况下以神经细胞外、大脑皮质、脑血管中的β淀粉样蛋白累积、神经细胞内的磷酸化tau的累积、和神经变性的病理为特征。
阿尔茨海默病更典型情况下首先观察到上述β淀粉样蛋白累积、接着发生上述磷酸化tau累积并逐渐过渡到神经原纤维变化、神经变性、大脑萎缩、认知功能障碍。将这些所代表的阿尔茨海默病的各阶段称为阿尔茨海默病病理阶段(AD病理阶段)。
AD病理阶段中，观察到β淀粉样蛋白累积的阶段也称为淀粉样物质累积期。另外，观察到磷酸化tau累积的阶段也称为tau病理形成期。另外，观察到神经变性的阶段也称为神经变性期。
作为以往对AD病理阶段进行生物体分层的方法，可列举例如以下的ATN分类法：通过淀粉样物质累积、tau病理、神经变性的有无对检体进行区分，以在生物的脑部进行捕捉的方式主要通过有变动的异常蛋白对其阶段进行分类。即，ATN分类法的情况下，AD病理阶段可分层为淀粉样物质累积期、tau病理形成期和神经变性期。
ATN分类法的情况下，测定生存患者的检体的β淀粉样蛋白、磷酸化tau和总tau。β淀粉样蛋白、磷酸化tau和总tau的测定可以通过ELISA法等公知方法进行测定。基于测定值分类为β淀粉样蛋白(A)、磷酸化tau(T)、总tau(N)。分类例如可以基于比较关于A、T或N各自的测定值与截止值而得的阳性(+)或阴性(-)来进行。具体而言，例如，β淀粉样蛋白小于截止值时可判断为A+，磷酸化tau大于截止值时可判断为T+，总tau大于截止值时可判断为N+，A、T、N各自在上述以外时可判断为阴性(-)。另外，ATN分类中，例如A-T-N-分类为正常、A+T-N-分类为淀粉样物质累积期、A+T+N+分类为tau病理形成/神经变性期。需要说明的是，用于ATN分类的截止值不限于此，例如，可以基于临床诊断在正常与MCI组和AD组之间进行ROC分析来设定。
通过将以往的AD病理阶段分层的方法与细胞外分泌囊泡蛋白质组学组合，可以阐明各AD病理阶段的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱。例如，通过ATN分类法进行分类后的检体中，A-T-N-、A+T-N-或A+T+N+的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱分别反映了正常、淀粉样物质累积期或tau病理形成/神经变性期的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱。
与阿尔茨海默病的各AD病理阶段相当的生存患者的检体在细胞外分泌囊泡蛋白质组学中显示出不同的蛋白谱。
因此，检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定以上的变动时、高于或低于正常的检体中的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量时、或者高于或低于所设定的阈值时，可以检测各AD病理阶段。
将阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比测定值有变动的蛋白质作为淀粉样物质累积期标志物蛋白。优选地，淀粉样物质累积期标志物蛋白为阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比测定值以2倍以上或0.5倍以下的方式变动的蛋白。更优选地，淀粉样物质累积期标志物蛋白为选自由下述蛋白组成的组中的蛋白：外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(Ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family member 3)、α-1,3-岩藻糖基转移酶10(Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 10)、排斥导向分子A(Repulsiveguidance molecule A)、蛋白激酶cAMP依赖性I型调节亚基β(cAMP-dependent proteinkinase type I-beta regulatory subunit)、ATP依赖性DNA复制解旋酶/核酸酶DNA2(DNAreplication ATP-dependent helicase/nuclease DNA2)、接触蛋白6(Contactin-6)、组蛋白H4(Histone H4)、外泌素1(Exostosin-1)、BCL6辅阻遏物样蛋白1(BCL-6corepressor-like protein1)、免疫球蛋白μ重链(Immunoglobulin mu heavy chain)、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子28(Rho guanine nucleotide exchange factor 28)、组织蛋白酶B(CathepsinB)、推定的角蛋白87蛋白(Putative keratin-87protein)、多重剪接RNA结合蛋白(RNA-binding protein with multiple splicing)、丝酶抑制蛋白B3(Serpin B3)、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase 1)、钙结合蛋白39(Calcium-binding protein 39)、细胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP](Isocitratedehydrogenase[NADP]cytoplasmic)、黑素瘤结合抗体B10(Melanoma-associated antigenB10)、Nodal修饰因子1(Nodal modulator 1)、Nodal修饰因子2(Nodal modulator 2)、Nodal修饰因子3(Nodal modulator 3)、含有磷酸核糖转移酶结构域的蛋白1(Phosphoribosyltransferase domain-containing protein 1)、furry同系物样蛋白(Protein furry homolog-like)、肌球蛋白10(Myosin-10)、senataxin解旋酶(Helicasesenataxin)、FAM227B蛋白(Protein FAM227B)和丝酶抑制蛋白B4(Serpin B4)。
进而，更优选淀粉样物质累积期标志物蛋白包含组织蛋白酶B。需要说明的是，组织蛋白酶B在作为淀粉样物质累积期标志物蛋白的同时，还可以为tau病理形成/神经变性期标志物蛋白。
检体的淀粉样物质累积期标志物蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定以上的变动时、高于或低于正常的检体中的淀粉样物质累积期标志物蛋白的量时、或者高于或低于所设定的阈值时，可以检测淀粉样物质累积期。
具体而言，理想的是，在阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中，关于与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比处于高水准的淀粉样物质累积期标志物蛋白，检体的该淀粉样物质累积期标志物蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定量以上的上升变动时、与正常的检体的该淀粉样物质累积期标志物蛋白的量相比处于高水准时、或者显示所设定的阈值以上时，检测阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期、阿尔茨海默病、MCI、或阿尔茨海默病发病风险。
作为更具体的检测基准的例子，例如，可以为显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的1.05倍以上，可以为显示1.5倍以上，可以为显示2.0倍以上，可以为显示3.0倍以上，可以为显示5.0倍以上。优选显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的2.0倍以上。
作为上述的阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比处于高水准的淀粉样物质累积期标志物蛋白，可列举例如组织蛋白酶B，但是不限于此。
理想的是，关于阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比处于低水准的淀粉样物质累积期标志物蛋白，检体的该淀粉样物质累积期标志物蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定量以上的下降变动时、与正常的检体的该淀粉样物质累积期标志物蛋白的量相比处于低水准时、或者显示所设定的阈值以下时，检测阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期、阿尔茨海默病、MCI、或阿尔茨海默病发病风险。
作为更具体的检测基准的例子，例如，可以为显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的0.95倍以下，可以为显示0.75倍以下，可以为显示0.5倍以下，可以为显示0.3倍以下，可以为显示0.2倍以下。优选显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的0.5倍以下。
将阿尔茨海默病的tau病理形成/神经变性期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比测定值有变动的蛋白质作为tau病理形成/神经变性期标志物蛋白。优选地，tau病理形成/神经变性期标志物蛋白为阿尔茨海默病的tau病理形成/神经变性期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比测定值以2倍以上或0.5倍以下方式变动的蛋白质。更优选地，tau病理形成/神经变性期标志物蛋白为选自由下述蛋白组成的组中的蛋白：胆碱酯酶(Cholinesterase)、中心粒周蛋白(Pericentrin)、Unc13同源物C蛋白(Protein unc-13homolog C)、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基1(26S proteasome non-ATPase regulatorysubunit 1)、α-1,3-岩藻糖基转移酶10、亲神经素1(Neurexophilin-1)、DNA结合蛋白RFX5(DNA-binding protein RFX5)、妊娠特异性β1糖蛋白8(Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 8)、β淀粉样蛋白A4前体蛋白结合家族B成员2(Amyloid-beta A4 precursorprotein-binding family B member 2)、激肽释放酶11(Kallikrein-11)、钙黏合素11(Cadherin-11)、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1、钠通道蛋白4型亚基α(Sodium channelprotein type 4subunit alpha)、FAM227B蛋白和跨膜蛋白62(Transmembrane protein62)。
另外，tau病理形成/神经变性期标志物蛋白可以包含组织蛋白酶B。此时，tau病理形成/神经变性期标志物蛋白可以为仅组织蛋白酶B，也可以为组织蛋白酶B与其它tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的组合。需要说明的是，组织蛋白酶B在为tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的同时，也可以为淀粉样物质累积期标志物蛋白。
检体的tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定以上的变动时、高于或低于正常的检体中的tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的量时、或者高于或低于所设定的阈值时，可以检测tau病理形成/神经变性期。
具体而言，理想的是，关于阿尔茨海默病的tau病理形成/神经变性期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比处于高水准的tau病理形成/神经变性期标志物蛋白，检体的该tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定量的上升变动时、与正常的检体的该tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的量相比处于高水准时、或者显示所设定的阈值以上时，检测阿尔茨海默病的tau病理形成/神经变性期、或阿尔茨海默病。
作为具体的检测基准的例子，例如，可以为显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的1.05倍以上，可以为显示1.5倍以上，可以为显示2.0倍以上，可以为显示3.0倍以上，可以为显示5.0倍以上。优选显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的2.0倍以上。
作为上述的阿尔茨海默病的tau病理形成/神经变性期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比处于高水准的淀粉样物质累积期标志物蛋白，可列举例如组织蛋白酶B，但是不限于此。
理想的是，关于阿尔茨海默病的tau病理形成/神经变性期的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的、与正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱相比处于低水准的tau病理形成/神经变性期标志物蛋白，检体的该tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的量在规定期内的测定值中显示一定量的下降变动时、与正常的检体的该tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的量相比处于低水准时、或显示所设定的阈值以下时，检测阿尔茨海默病的tau病理形成/神经变性期、或阿尔茨海默病。
作为具体的检测基准的例子，例如，可以为显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的0.95倍以下，可以为显示0.75倍以下，可以为显示0.5倍以下，可以为显示0.3倍以下，可以为显示0.2倍以下。优选显示正常的检体的细胞外分泌囊泡包含蛋白谱中的蛋白质的量的0.5倍以下。
需要说明的是，本发明的第1方式的方法包括至检测阿尔茨海默病的阶段为止，不包括与阿尔茨海默病的诊断相关的最终的判断行为。医生可参照基于本发明的方法的检测结果等进行阿尔茨海默病的诊断和治疗方针的确定。
本发明的第2方式为阿尔茨海默病诊断试剂盒，其包含测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂。
利用测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂进行的、细胞外分泌囊泡包含蛋白的测定可以援引上述记载。
测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂只要为能够对细胞外分泌囊泡包含蛋白进行检测和/或定量的试剂则没有特别限定，优选能够对细胞外分泌囊泡包含蛋白进行定量。
试剂盒中，可以包含用于从检体中分离试样的手段中使用的试剂、器具等。该手段可以包括用于从检体分离脊髓液或血液的手段，进而可以包括用于从血液分离血浆的手段。也可以包括用于从试样中回收细胞外分泌囊泡级分的手段。
本发明的诊断试剂盒可以使用测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂来制造。即，本发明的另一方式包括：测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂的用于制备阿尔茨海默病诊断试剂盒的应用。
作为测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂，可以援引上述记载，可列举例如识别细胞外分泌囊泡包含蛋白的抗体，但是不限于此。测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂不限于此，优选包含识别淀粉样物质累积期标志物蛋白或tau病理形成/神经变性期标志物蛋白的抗体，更优选包含识别组织蛋白酶B的抗体。
本发明的第3方式为治疗患者的阿尔茨海默病的方法，其包括下述工序：
(i)作为标志物的测定值超过了预先设定的基准值者，鉴定出患者的工序；和
(ii)对上述鉴定出的患者实施治疗的工序。
上述工序(i)的鉴定中，标志物的测定可以使用特异性识别该标志物的抗体来进行，也可以使用质谱分析法来进行。
需要说明的是，超过基准值是指高于或者低于，优选根据标志物来进行设定。
标志物优选为细胞外分泌囊泡包含蛋白，更优选为淀粉样物质累积期标志物蛋白或tau病理形成/神经变性期标志物蛋白，进一步更优选为组织蛋白酶B。
本发明的治疗阿尔茨海默病的方法可以应用本发明的检测阿尔茨海默病的方法。即，可提供基于上述的本发明的第1方式的、本发明的第3方式的方法。具体而言，例如，在上述工序(i)的鉴定中，可以通过利用本发明的第1方式的方法来检测阿尔茨海默病而由此鉴定患者，也可以通过本发明的第1方式的方法检测阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期而由此鉴定患者，或者也可以通过本发明的第1方式的方法检测阿尔茨海默病的tau病理形成期和/或神经变性期而由此鉴定患者。
治疗没有特别限定，可以通过医生的判断来适当选择。
实施例
(实施例1)
脊髓液细胞外分泌囊泡蛋白质组学
受试者的详细情况
脊髓液细胞外分泌囊泡蛋白质组学中，使用了下述的受试者检体(n＝16)(表1)。
【表1】
(表1)
| No | ATN分类 | 临床诊断分类 | 检体数 |
| 1 | A+T+N+ | AD | 4 |
| 2 | A+T-N- | AD/MCI/正常 | 8 |
| 3 | A-T-N- | AD | 4 |
| 总计 | 16 |
脊髓液的采集
脊髓液检查的适应患者满足下述条件。
·40岁至80岁，未服用抗血小板剂、抗凝制剂
·采集时间的前一晚，在21点之前结束晚餐，未摄入酒精且睡眠为6小时以上
·可饮水，禁止茶和咖啡，不吃早餐，能够在空腹下在9：00AM至10：00AM采集脊髓液
脊髓液采集方法
以左侧卧位从第3、4腰椎间或第4、5腰椎间进行腰椎穿刺。
穿刺中使用的腰椎穿刺针使用了针管为不锈钢、针座为聚丙烯制的TOP腰椎穿刺针22G。完全不使用通常所用的聚苯乙烯制腰椎穿刺针、压棒、三通活塞、延长管，直接采集从腰椎穿刺针的针座滴落的脊髓液检体。
首先，在15cc聚丙烯制的灭菌管中直接滴落采集脊髓液约500μl，之后改变容器，在聚丙烯制微型管(1.5ml)中直接从针座滴落采集脊髓液500μl。之后再次向该15cc灭菌管中直接滴落采集，之后向其它聚丙烯制微型管1.5ml中各滴落采集脊髓液500μl，重复该操作。结果直至采集15cc灭菌管1根(约4-5cc)、微型管合计10-12根(各500μl)为止。
过程中，在肉眼确认到出血时中止操作。
各微型管内的500μl脊髓液在采集开始起1小时内直接冷冻保存在-80℃(细胞外分泌囊泡分析用检体)
丙烯制微型管中所收集的脊髓液检体在经3500转下7分钟的离心分离(2200×g)后，用聚丙烯制分注枪头将上清向聚丙烯制微型管(1.5ml)中分别分注500μl，立即在-80℃下冷冻保存(Aβ40，Aβ42、pTau、tTau各ELISA测定用检体)。
由同一操作者在同一时间段使用相同材质的器具进行上述全部工序。
ATN分类
通过ELISA测定从受试者采集的脊髓液检体的Aβ(Aβ1-42)、磷酸化tau(p-Tau181)、总tau(t-Tau)，基于测定值对受试者进行ATN分类，以Aβ(A)、磷酸化tau(T)、神经变性(N)来进行区分。截止值基于全部受试者的临床诊断在正常与MCI相对于AD的组间进行ROC分析而设定，本实施例中设为Aβ：680pg/mL、磷酸化tau：76.5pg/mL、总tau：598pg/mL。需要说明的是，即使用下述实施例2中设定的截止值即Aβ：747.2pg/mL、磷酸化tau：58.4pg/mL、总tau：756.6pg/mL进行再次计算，本实施例中的受试者的ATN分类依然如表1所记载，没有变化。
细胞外分泌囊泡级分的制备
从脊髓液0.5mL制备细胞外分泌囊泡级分。细胞外分泌囊泡级分的制备使用细胞外分泌囊泡纯化柱(EV-Second L70、GL Sciences Inc.制)来进行。
蛋白质组学分析(LC-MS)
细胞外分泌囊泡级分中的蛋白质的总括性鉴定、定量通过LC-MS分析来进行。具体而言如下进行。
(1)样品制备
将细胞外分泌囊泡级分溶解于30μl Laemmli’s样品缓冲液，以10mM TCEP、100℃、10分钟的条件还原后，用50mM碘乙酰胺进行烷基化。进行SDS-PAGE，从凝胶中切出蛋白质的条带，用胰蛋白酶/Lys-C-Mix消化后供于LC-MS分析。
(2)LC-MS分析
使用具备Ultimate 3000RSLC nano-flow HPLC system(DIONEX公司制、美国)的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(Thermo Scientific公司制)进行分析。
使用Proteome Discoverer 2.4软件(Thermo Scientific公司制)对SwissProt人蛋白质数据库进行检索，尝试进行蛋白质的鉴定。
(3)无标签定量分析
将LC-MS的数据组供于使用Proteome Discoverer 2.4软件(Thermo Scientific公司制)的无标签定量分析，进行总检测蛋白的相对定量化。
(4)结果
由脊髓液细胞外分泌囊泡级分得到1758种蛋白的定量数据。将在2组(A+T-N-组)的细胞外分泌囊泡级分中的量的平均值中3组(A-T-N-组)的细胞外分泌囊泡级分中的量的平均值的比率为2倍以上或0.5倍以下的蛋白、以及仅能在1组或2组中的一者中确认到表达的蛋白判定为作为检验淀粉样物质累积期的生物标志物有一定程度的有效性，并选择了以下的分子种类(表2)。外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3(Ectonucleotidepyrophosphatase/phosphodiesterase family member 3)、α-1,3-岩藻糖基转移酶10(Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 10)、排斥导向分子A(Repulsive guidance moleculeA)、蛋白激酶cAMP依赖性I型调节亚基β(cAMP-dependent protein kinase type I-betaregulatory subunit)、ATP依赖性DNA复制解旋酶/核酸酶DNA2(DNA replication ATP-dependent helicase/nuclease DNA2)、接触蛋白6(Contactin-6)、组蛋白H4(HistoneH4)、外泌素1(Exostosin-1)、BCL6辅阻遏物样蛋白1(BCL-6corepressor-like protein1)、免疫球蛋白μ重链(Immunoglobulin mu heavy chain)、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子28(Rho guanine nucleotide exchange factor 28)、组织蛋白酶B(Cathepsin B)、推定的角蛋白87蛋白(Putative keratin-87protein)、多重剪接RNA结合蛋白(RNA-bindingprotein with multiple splicing)、丝酶抑制蛋白B3(Serpin B3)、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1(Beta-galactoside alpha-2,6-sialyltransferase1)、钙结合蛋白39(Calcium-binding protein 39)、细胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP](Isocitratedehydrogenase[NADP]cytoplasmic)、黑素瘤结合抗体B10(Melanoma-associated antigenB10)、Nodal修饰因子1(Nodal modulator1)、Nodal修饰因子2(Nodal modulator 2)、Nodal修饰因子3(Nodal modulator3)、含有磷酸核糖转移酶结构域的蛋白1(Phosphoribosyltransferase domain-containing protein 1)、furry同系物样蛋白(Protein furry homolog-like)、肌球蛋白10(Myosin-10)、senataxin解旋酶(Helicasesenataxin)、FAM227B蛋白(Protein FAM227B)和丝酶抑制蛋白B4(Serpin B4)。另外，这些分子种类也可能为治疗·预防药的靶标。
【表2】
(表2)A+T-N-/A-T-N-
另外，将在1组(A+T+N+组)的细胞外分泌囊泡级分中的量的平均值中2组(A-T-N-组)的细胞外分泌囊泡级分中的量的平均值的比率为2倍以上或0.5倍以下的蛋白质、以及仅能在1组或2组中的一者中确认表达的蛋白质判定为作为检验tau病理形成、神经变性期的生物标志物有一定程度的有效性，并选择了以下分子种类(表3)。胆碱酯酶(Cholinesterase)、中心粒周蛋白(Pericentrin)、Unc13同源物C蛋白(Protein unc-13homolog C)、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基1(26S proteasome non-ATPase regulatorysubunit 1)、α-1，3-岩藻糖基转移酶10、亲神经素1(Neurexophilin-1)、DNA结合蛋白RFX5(DNA-binding protein RFX5)、妊娠特异性β1糖蛋白8(Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 8)、β淀粉样蛋白A4前体蛋白结合家族B成员2(Amyloid-beta A4 precursorprotein-binding family B member 2)、激肽释放酶11(Kallikrein-11)、钙黏合素11(Cadherin-11)、β-半乳糖苷a-2，6-唾液酸转移酶1、钠通道蛋白4型亚基α(Sodium channelprotein type 4subunit alpha)、FAM227B蛋白和跨膜蛋白62(Transmembrane protein62)。另外，这些分子种类也可能为治疗·预防药的靶标。
【表3】
(表3)A+T+N+/A-T-N-
(实施例2)
组织蛋白酶B(Cathepsin B)测定
对于上述作为淀粉样物质累积期标志物选择出的分子种类中的组织蛋白酶B，使用ELISA测定脊髓液检体和血浆检体的细胞外分泌囊泡级分中的浓度。
受试者的详细情况
组织蛋白酶B测定中，使用下述的受试者检体(表4)。从各受试者检体中采集脊髓液检体和血浆检体。需要说明的是，对于这些受试者检体，将全部受试者基于临床诊断分为正常组、MCI组或AD组(数据未示出)。基于使用从各受试者检体中采集的脊髓液检体中的下述Aβ1-42/p-Tau181/t-Tau ELISA测定用脊髓液检体通过ELISA测定而得的Aβ、磷酸化tau、总tau的测定值，基于全部受试者的临床诊断在正常与MCI相对于AD的组间进行ROC分析并设定截止值(Aβ：747.2pg/mL、磷酸化tau：58.4pg/mL、总tau：756.6pg/mL)，进行ATN分类。
【表4】
(表4)
| ATN分类 | 检体数 |
| A-T-N- | 36 |
| A-T+N- | 24 |
| A-T-N+ | 12 |
| A-T+N+ | 11 |
| A+T-N- | 7 |
| A+T+N- | 16 |
| A+T+N+ | 23 |
| A+T-N+ | 7 |
| 合计 | 136 |
脊髓液的采集、脊髓液采集方法
腰椎穿刺的对象者为40～80岁且未服用抗血小板药、抗凝药的无血液疾病者。参加者在前一晚的21点之前结束晚餐，未摄入酒精且睡眠为6小时以上。断食一晚，在午前9时至午前10时进行腰椎穿刺。使用具有不锈钢针和聚丙烯制基部的22G TOP腰椎穿刺针采集脑脊液。之后，Aβ1-42/p-Tau181/t-Tau ELISA测定用的脊髓液检体通过供于下述1.的工序而回收，EV分析用的脊髓液检体通过供于下述2.的工序而回收。对于全部检体，由经验丰富的一名医生通过相同方法、相同器具材质在同一时刻采集。
1.Aβ1-42/p-Tau181/t-Tau ELISA测定用脊髓液检体
将上述采集过程中从腰椎穿刺针滴落的脑脊液回收到灭菌后的15cc聚丙烯制管。之后在室温下以3500RPM离心分离(2200g)7分钟，使细胞和其它不溶性物质沉淀。接着将上清用ELISA测定用聚丙烯性分配枪头分别以500μl分注到聚丙烯微型管(1.5ml)中。在采集起1小时以内于-80℃冷冻保存，保存至下次分析为止。冷冻融化循环仅进行1次。
2.EV分析用的脊髓液检体
从上述采集过程的腰椎穿刺针中，向聚丙烯微型管(1.5ml)中直接各滴加500μl，在采集起1小时以内于-80℃冷冻保存，保存至下次分析为止。冷冻融化循环仅进行1次。
血浆的采集
在通过上述方法采集脊髓液后，从同一患者的左上臂采集全血至装有EDTA2Na的真空管。之后，在2200g、4℃下进行15分钟离心分离，回收血浆，向灭菌后的15cc聚丙烯制管中各分注约0.5ml。全部样品在采集后1小时以内在-80℃下冷冻，保存至下次分析为止。冷冻融解循环仅进行1次。
细胞外分泌囊泡级分
由EV分析用的脊髓液检体0.1mL或血浆检体0.4mL制备细胞外分泌囊泡级分。细胞外分泌囊泡级分的制备使用超速离心法来进行。超速离心中，进行3次下述的系列操作：2000g下10分钟、10000g下30分钟、接着100000g下70分钟。
组织蛋白酶B的ELISA测定
将回收的细胞外分泌囊泡级分溶解于0.1％SDS/PBS，使用人组织蛋白酶B ELISA试剂盒(ABCAM：#ab119584)按照建议规程测定组织蛋白酶B的浓度。
结果
将脊髓液检体的细胞外分泌囊泡级分中的组织蛋白酶B的ELISA测定结果示于图1和图2。
根据图1所示的各ATN分类和组织蛋白酶B的浓度的结果，A+T-N-组与A-T-N-组相比组织蛋白酶B的浓度显著上升，与上述的脊髓液细胞外分泌囊泡蛋白质组学结果一致地，可确认组织蛋白酶B作为检验淀粉样物质累积期的生物标志物有效。进而，在A+T+N+组、A+T-N+组和A+T-N-组的各个组中，A-T+N+组、A-T-N+组和A-T-N-组的组织蛋白酶B的浓度均显著上升。这表明，组织蛋白酶B作为检测tau病理形成/神经变性期的标志物也有用。
另外，在着眼于淀粉样物质病理而将各检体分为A+组(A+T+N+组、A+T-N+组和A+T-N-组)或A-组(A-T+N+组、A-T-N+组和A-T-N-组)这两者并进行比较的结果(图2A)中，可确认A+组的组织蛋白酶B的浓度显著上升，还确认成为淀粉样物质病理的指标的脊髓液Aβ42浓度与脊髓液检体的细胞外分泌囊泡级分中的组织蛋白酶B的浓度为逆相关(图2B)，因此再次确认了组织蛋白酶B作为检验淀粉样物质累积期的生物标志物很有利。
将血浆检体的细胞外分泌囊泡级分中的组织蛋白酶B的ELISA测定的结果示于图3。
根据图3A所示的结果，确认血浆检体也与脊髓液检体同样地，A+组与A-组相比组织蛋白酶B的浓度显著上升。另外，可以确认血浆检体的细胞外分泌囊泡级分中的组织蛋白酶B的浓度也与脊髓液检体的结果同样，与脊髓液Aβ42浓度逆相关(图3B)。
由这些结果可以说，在使用血浆作为检体时，组织蛋白酶B作为检验淀粉样物质累积期的生物标志物是有效的。
综上，可知细胞外分泌囊泡级分中包含的组织蛋白酶B还能够评价包括淀粉样物质累积期在内的潜伏期/早期阿尔茨海默病，是阿尔茨海默病的有利的脊髓液/血液生物标志物。
Claims (14)
1.一种检测阿尔茨海默病的方法，其包括下述步骤：测定从检体采集的试样中的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞外分泌囊泡包含蛋白为阿尔茨海默病的检体中的量相对于正常的检体中的细胞外分泌囊泡包含蛋白的量有变动的细胞外分泌囊泡包含蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述变动为2倍以上或0.5倍以下。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其包括下述步骤：从检体采集的试样中回收细胞外分泌囊泡级分，测定该细胞外分泌囊泡级分中的细胞外分泌囊泡包含蛋白。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述细胞外分泌囊泡包含蛋白为选自由下述蛋白组成的组中的1种以上：外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3、α-1,3-岩藻糖基转移酶10、排斥导向分子A、蛋白激酶cAMP依赖性I型调节亚基β、ATP依赖性DNA复制解旋酶/核酸酶DNA2、接触蛋白6、组蛋白H4、外泌素1、BCL6辅阻遏物样蛋白1、免疫球蛋白μ重链、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子28、组织蛋白酶B、推定的角蛋白87蛋白、多重剪接RNA结合蛋白、丝酶抑制蛋白B3、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1、钙结合蛋白39、细胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP]、黑素瘤结合抗体B10、Nodal修饰因子1、Nodal修饰因子2、Nodal修饰因子3、含有磷酸核糖转移酶结构域的蛋白1、furry同系物样蛋白、肌球蛋白10、senataxin解旋酶、FAM227B蛋白、丝酶抑制蛋白B4、胆碱酯酶、中心粒周蛋白、Unc13同源物C蛋白、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基1、亲神经素1、DNA结合蛋白RFX5、妊娠特异性β1糖蛋白8、β淀粉样蛋白A4前体蛋白结合家族B成员2、激肽释放酶11、钙黏合素11、钠通道蛋白4型亚基α和跨膜蛋白62。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述细胞外分泌囊泡包含蛋白包含组织蛋白酶B。
7.一种检测阿尔茨海默病的淀粉样物质累积期的方法，其包括下述步骤：测定从检体采集的试样中的细胞外分泌囊泡包含蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述细胞外分泌囊泡包含蛋白为选自由下述蛋白组成的组中的1种以上：外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员3、α-1,3-岩藻糖基转移酶10、排斥导向分子A、蛋白激酶cAMP依赖性I型调节亚基β、ATP依赖性DNA复制解旋酶/核酸酶DNA2、接触蛋白6、组蛋白H4、外泌素1、BCL6辅阻遏物样蛋白1、免疫球蛋白μ重链、Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子28、组织蛋白酶B、推定的角蛋白87蛋白、多重剪接RNA结合蛋白、丝酶抑制蛋白B3、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1、钙结合蛋白39、细胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP]、黑素瘤结合抗体B10、Nodal修饰因子1、Nodal修饰因子2、Nodal修饰因子3、含有磷酸核糖转移酶结构域的蛋白1、furry同系物样蛋白、肌球蛋白10、senataxin解旋酶、FAM227B蛋白和丝酶抑制蛋白B4。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述细胞外分泌囊泡包含蛋白包含组织蛋白酶B。
10.一种检测阿尔茨海默病的tau病理形成期和/或神经变性期的方法，其包括下述步骤：测定从检体采集的试样中的细胞外分泌囊泡包含蛋白的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述细胞外分泌囊泡包含蛋白为选自由下述蛋白组成的组中的1种以上：胆碱酯酶、中心粒周蛋白、Unc13同源物C蛋白、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基1、α-1,3-岩藻糖基转移酶10、亲神经素1、DNA结合蛋白RFX5、妊娠特异性β1糖蛋白8、β淀粉样蛋白A4前体蛋白结合家族B成员2、激肽释放酶11、钙黏合素11、β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1、钠通道蛋白4型亚基α、FAM227B蛋白Protein和跨膜蛋白62。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述细胞外分泌囊泡包含蛋白包含组织蛋白酶B。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述试样为脊髓液或血浆。
14.一种阿尔茨海默病诊断试剂盒，其包含测定细胞外分泌囊泡包含蛋白的试剂。
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