CN117916573A - 用于保藏细胞的溶液 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于保存或保藏在血液样品或其他体液中、细胞培养物或在组织样品中的细胞的溶液。该溶液是包含可透过细胞膜的质子载体，并且基本上不含离液物质、醇或清洁剂。此外，根据本发明的溶液具有的pH值产生小于6的所述细胞的细胞内pH。此类溶液有利地用在样品管、采血注射器或采血管中。
Description
技术领域
本发明总体上涉及血液样品的稳定化，特别是在血液样品或其他体液中的细胞、尤其是循环肿瘤细胞的保藏。本发明在此特别涉及一种保藏溶液以及一种用于快速、永久中断细胞代谢以使基因表达状态、特别是转录组稳定化并同时维持形态的用途，这使得能够对转录组进行后续分子分析。本发明还涉及保藏溶液的用途以及其中存在根据本发明的溶液的样品管或采血管或采血注射器的用途。
背景技术
生物分子在完整的代谢细胞中经历不断的更新。例如根据环境条件或分化阶段或其他影响新陈代谢的情况，分子的这种更新通过新合成和降解而发生。生物分子构型的变化在细胞内以特异性、受控和有针对性的方式发生。然而，在细胞外，生物分子会遭受非特异性、不受控和随机的降解。为了理解细胞中的分子的生物学功能，理解其在同时存在的其他生物分子的背景下的功能至关重要。特别是通过单细胞转录组分析(RNASeq)，最近人们已经清楚，同一类型的细胞可以具有完全不同的基因表达模式。特别地，在肿瘤细胞的分析中清楚地表明，实体瘤的基因表达可能存在异质性。因此，单独细胞的转录组的分析受到普遍关注。
细胞的基因表达状态的分析因各种情况而变困难。这包括许多生物分子、特别是RNA在它们存在于细胞外时的不稳定性。但在分析之前储存完整的细胞也会对基因表达产生重大影响。通常常见的做法是例如在收获时将来自细胞培养物的细胞在4℃下暂时储存，除去培养基和生长因子，并通过用于准备的反复离心不仅引起明显的温度变化，还振荡改变细胞密度。在此已知的是，细胞密度对分化和细胞分裂具有显著影响。这同样适用于采集组织或肿瘤后。该准备改变营养供应、氧气和CO2分压以及微环境。这导致细胞以改变的表达模式的形式快速响应，这在转录组水平上最快被注意到。因此，尽可能维持转录组处于当前状态并保护其免受操作引起的变化非常重要。
以生物样本库为例，转录组分析的困难变得显而易见。例如，手术后送往生物样本库的人类肿瘤样本通常在采集后立即用10％福尔马林固定。然而，这有一个显著的缺点，即对于分析所述当前状态而言重要的转录组是交联的。因此使得分子分析变得困难，并且通常不再可能分离出完整分子。因此，新鲜样品通常在室温下储存，直到专业人员能够对其进行进一步处理。所述进一步处理通常是通过专业地分割样品以冷冻一部分用于后续分子分析来进行的，并准备另一部分用于福尔马林固定后的形态学分析。采集和进一步处理之间的储存时间有时可能为数小时，这对生物样本库或保藏的样本的有效性构成相当大的风险。后续用于分子分析的样品解冻还会导致引发RNA降解过程，因此导致转录组的变化。
近年来，肿瘤生物学已经可以证明肿瘤内细胞的分子组成存在巨大的异质性。在这种情况下，循环肿瘤细胞(CTC)尤为重要，因为对这些细胞的分析使得能够确定治疗方案以及监测疾病和治疗进展。循环肿瘤细胞是从原发肿瘤脱落的细胞。它们可以存在于淋巴系统中或在血液中循环。至少在某些类型的循环肿瘤细胞中，它们有可能定居在其他器官或组织中并形成新的肿瘤或转移。大多数与癌症相关的死亡例不是由于原发肿瘤，而是由于由其衍生的转移和继发肿瘤。
能够分析CTC的诊断方法可以为选择个性化且有效的治疗方法做出重大贡献。此外，CTC分析可以有助于早期确定患者的预后，因为当时已知这些循环细胞已经在疾病的早期阶段存在并且可以检测到。CTC分析对于研究药物的有效性也非常重要。
然而，CTC仅以极少量存在于各自的体液中，并且还对分析过程中的操作敏感。如上所述，完整的代谢细胞中的所有生物分子也会不断更新。根据不同的影响因素，例如环境条件或分化阶段或影响新陈代谢的其他条件，分子的这种更新通过新合成和降解而发生。细胞内的生物分子组成的变化以特异性、受控和有针对性的方式发生。为了理解细胞中的分子的生物学功能，观察在同时存在其他生物分子的背景下的各自功能至关重要。为此需要保存细胞并使其代谢和形态学状态稳定化。
尽管CTC的存在原则上早已为人所知，但直到几年前，为了改进肿瘤患者的治疗可能性，它们才受到研究关注。几十年来，一些保存血液的方法已经成为世界范围内的标准。EDTA、柠檬酸盐或肝素添加剂防止血液凝结并允许分析血液成分。然而，在这些添加剂的帮助下，CTC不能很好地稳定化，因为即使在采血、即离体后，许多正常的血液功能也维持完整。例如，免疫系统做出反应并试图消除CTC，或已经受到化疗攻击的CTC发生坏死或凋亡。
血液样本的采集和进一步处理之间的储存时间也可能为数小时，并带来明显的额外风险。CTC的表达状态会随着温度和环境条件而变，CTC以改变的基因表达来对此做出反应。这导致后续分析中的分子图像发生不希望的变化。
此外已知，正常血细胞由于储存也会发生显著变化。另一方面，血液储存属于诊断常规，因为医院日常中规定了特定的程序和时间。与储存相关的变化不仅包括血细胞的表达状态的变化，还包括例如细胞的一种崩解，这引起所谓的碎片，即周围细胞物质的聚集体，这不仅使细胞的分析变得困难，而且还会导致分析无效(也参见US 7,863,012 B2)。由此可见，不仅细胞完整性的维持，而且在较长时间段内细胞表达状态的维持对于CTC分析至关重要。RNA稳定性尤其重要，因为可以获得由转录组决定的关于肿瘤生物学和治疗选项的见解。
“转录组的分子分析”被理解为是指使用分子生物学方法研究细胞RNA。这些包括例如光谱定量、Northern杂交、有或没有生物芯片杂交的逆转录或通过聚合酶链式反应以及RNASeq方法(总RNA测序、mRNA测序、扩增子测序)扩增单独的转录物。这种分子生物学分析方法是众所周知的并且本身不是本发明的主题。这里的“形态学分析”被理解为是指在自然背景或自然环境中分析单个或多个细胞直至分析细胞群，并且涉及大小、形状、粒度等。这里的“形态测量学分析”是指分析单个或多个细胞的一个或多个细胞特性，例如分析特定细胞标记物的表达。
现有技术
文献中已经提出了能够维持细胞完整性的各种方法。通常，它们基于交联剂，例如甲醛、低聚甲醛、戊二醛(例如EP 0214 613 A2、DE 40 39 716 A1)。US 4971783 A描述了组织准备方法。美国专利US 5976829 A描述了基于福尔马林的固定剂，其也适用于DNA/RNA分析。
参考文献显示了另一种方法，其中羟甲基衍生物能够固定血液成分。羟甲基还在化妆品工业中用作防腐剂。确切的作用机制尚不清楚，但甲醛似乎在此发挥着重要作用。然而，这些固定溶液的交联性质，尤其是核酸的交联，使得在分子水平上分析细胞变得困难。尤其US 5976829 A试图用包含醛、醇、螯合剂和不含氨基的缓冲剂的固定剂来解决这个问题。
在科学领域，还使用其他方法来固定细胞或分子。例如，这些包括低温冷冻、使用含醇的固定剂(例如甲醇、乙醇、乙二醇)或离液剂(例如异硫氰酸盐)，其能够使分子稳定化并同时破坏形态学关联。
现有技术中还可以使用各种溶液，以使组织固定而不交联并同时维持结构。EP 2126 542 B1、FR 2 852 392 A1、WO 2013/131816 A1和WO 03/029783 A1描述了通过使用有机溶剂来使组织固定的混合物。同样，可以使用溶液以使生物分子稳定化而不保留形态学背景。用于保存细胞和组织的非交联方法通常基于通过在有机溶液(例如乙醇或丙酮，优选与强酸一起、例如甲醇/冰乙酸的组合)中温育而脱水。核酸受到相对好的保护。相比之下，丙酮/冰乙酸的固定效果稍更温和。然而，如果不进行再水化，则无法在细胞水平上在醇或丙酮固定后对分子进行分析。由于通过再水化对区室化造成破坏，即对细胞膜体系(例如溶酶体)造成损害，核酸、特别是RNA受到不受阻的降解。
其他公开文献描述了通过不同机制使细胞固定的其他溶液。WO 2012/150479 A1中公开的相应溶液包含卤代氰基乙酰胺，US 2015/0050689 A1描述了聚酰胺和酸的组合，其反应释放醛，特别是甲醛。
在实践中，生物制剂通常被冷冻以保存RNA。为了获得RNA，然后将样品以冷冻状态在高度变性或离液条件下裂解。以这种方式分离出的RNA虽然通常具有令人满意的品质，但是不可能通过形态学或形态测量学分析来对研究所需的细胞进行定性，尽管在实践中特别需要对亚群进行分子分析。然而，在冷冻前对此类子集进行形态学或形态测量学选择需要交联福尔马林固定以维持表达状态，这导致分子分析变得困难或不可能。用非交联、脱水的固定来分离细胞子集的替代方案也是不利的，因为在随后再水化状态下对子群的后续选择会导致RNA快速降解。
CN202011616524教导了在中性或几乎中性pH下使用抗凝血剂和固定剂的复杂混合物来使全血中的DNA稳定化。
现有技术中对于细胞和组织的非交联固定的另一个建议是Hepes介导的谷氨酸保护(DE10021390C2)。在此，建议使用含氨基酸的溶液，以通过脱水石蜡包埋来保存组织形态作为长期保存。尽管丙酮的脱水固定相对温和，但由于缺乏交联，组织会发生结构变化。尽管处理在低温下进行，该体系在使转录组稳定化方面相对无效。
Ringwald等人(Transfusion Medicine Reviews,20(2),2006)用各种盐和酸的混合物使血小板稳定化。特别地，使用乙酸以在中性pH下在用于输血目的的储存时维持血小板代谢。作为没有细胞核的“细胞”，血小板的转录不活跃。
在最近发表的RNAseq转录组分析方法中，使用水、甲醇、乙酸和甘油(ACME)的混合物来固定细胞。该方法改变了细胞结构和细胞形态，并且不能排除由于所用醇试剂使RNA分子和蛋白质标记物从细胞中滤出。此外，再水化会导致RNA转录物的降解。PCT/EP2015/061678(WO 2015/181220 A1)的教导遵循类似的方法。
为了使RNA稳定化并破坏形态学关联，可以购买各种离液试剂(例如RNALater,Ambion；ProtectAII,Qiagen)。
US 5,432,056 A中描述了不使用有机溶剂但使用亚硫酸氢盐的改性。在这里，建议使用含亚硫酸氢盐的酸性体系来固定组织切片或其他薄层样品。US 6,337,189 B1又描述了脲化合物与醇结合用于细胞学制剂的非交联固定。然而，所有这些方法中，对细胞结构的形态学维持都是有限的。
此类方法不适合于保存用于CTC分析的全血，因为它们不适合于常规诊断、破坏细胞完整性或不确保有效的分子稳定化。
然而，US10,091,984B2教导了释放甲醛的脲化合物在同时通过甘氨酸捕获甲醛的情况下适合于对CTC进行形态学稳定化。即使如果该公开内容没有假设CTC分子的任何共价修饰，但甲醛的作用尚不清楚。
现有技术对于将完整细胞的转录组维持在现状以在稍后的时间点进行分子分析的溶液可能性而言具有局限性。特别是当要对特定细胞的转录组进行分子分析时，现有技术具有局限性：(A)交联剂根据试剂的扩散速率相对慢地保持表达状态，并使分子分析变困难；(B)通过有机溶液的非交联固定需要再水化，并通过不受控的分子降解迫使转录组发生变化；(C)使用离液试剂裂解细胞组不允许单独细胞进行分化。单独细胞的离液裂解在理论上是可能的。然而，在分离之前，它们的背景会被破坏，这将导致转录组变化。
要实现的目的是开发一种溶液，其使得能够在待由实验者决定的时间点中断培养物或组织的细胞中的新陈代谢，以特别是使转录组在当前时间点稳定化并同时保持细胞和细胞区室化完整，以防止RNA不受控的降解。在此，针对保藏或进行细胞定性的形态学或形态测量学分析，该溶液旨在实现延时的转录组分析。
要实现的目的还在于开发一种方法和合适的手段，其使得能够中断血液、特别是CTC或其他体液的细胞的新陈代谢或生物分子更新，以确保暂时地、高度稳定化地、非交联地维持基因组、转录组和蛋白质组的当前状态并防止分子不受控的降解，在此同时保持细胞形态完整并防止血液凝结。在此，该目的的实现方式旨在使得能够实现CTC分离的延时处理和对CTC或其他细胞进行的分子分析和可能的形态学分析。
发明内容
本发明实现了所述目的。本发明的第一方面是用于保藏在血液样品或其他体液中的细胞，特别是至少一种真核细胞且特别是肿瘤细胞和循环肿瘤细胞，来自细胞培养物的细胞或在组织中的细胞的溶液，其特征在于，其
a)包含可透过膜的质子载体，
b)基本上不含离液物质、醇和清洁剂，以及
c)具有的pH值产生小于6的所述一种细胞或多种细胞的细胞内pH。
此外，本发明的另一方面在于，特别是针对基因组、转录组和蛋白质组的分子分析，根据本发明第一方面的这种溶液用于保存、保藏和/或固定在血液样本或其他体液中的细胞，特别是至少一种真核细胞，特别是肿瘤细胞或循环肿瘤，或用于在很大程度上维持细胞形态的情况下保存、保藏和/或固定来自细胞培养物的细胞或在组织中的细胞的用途。
本发明的第三方面涉及包含根据本发明第一方面的溶液的样品管、采血注射器或采血管。
本发明的优点和细节从权利要求书、下面的详细描述和实施例中显现出来。
发明详述
完整的细胞膜对于被动质子传输而言是不可透过的，并且跨细胞膜的质子传输受到很强的控制。本发明基于以下知识：细胞内的pH值的突然且快速的变化(降低)导致用于分子合成和降解的细胞机器的功能丧失，并且通过酶活性的失活，导致新陈代谢停止，而不干扰细胞区室化。根据本发明的溶液的基本特征因此是通过降低pH值来非常快速地关闭代谢过程，从而避免表达状态的与环境依相关的变化。
根据本发明，细胞内pH的这种变化通过溶液中所含的可透过膜的质子载体来实现。质子载体被理解为是指能够在合适的条件下以质子化形式优选被动地克服细胞膜并且在细胞内分解成阴离子和质子的分子。在此，例如通过在酸性环境中将细胞与pKa在酸性范围内的质子载体混合来创造合适的条件。在此，质子载体的质子化形式穿过细胞膜并由于细胞内的较高pH值而在细胞内解离。作为离子，质子载体不可能离开细胞，使得在平衡状态下细胞内pH由细胞外pH决定。
此外，在本发明的范围内，发生核酸的很大程度的电荷中和。特别是在RNA的情况下，这导致从水环境中部分沉淀，从而导致抵抗酶水解的和抵抗碱水解的稳定化。
在本发明的范围内，特别是对于维持细胞的形态而言还重要的是基本上完全不存在离液物质，这些离液物质存在于现有技术中的许多相应的保存溶液中。离液物质，例如高氯酸盐，例如高氯酸钠，硫氰酸盐，例如硫氰酸胍，以及盐酸胍和钡盐是破解水中的有序氢键、破坏水结构并确保熵增加的物质。它们干扰生物分子的水合壳，导致其变性并在相应的浓度下导致细胞完全溶解。
在本发明的范围内，术语“基本上完全不存在”是指物质只能以不破坏细胞形态完整性的最大量存在。在优选的实施方案中，根据本发明的溶液完全不含离液物质。
与不存在离液物质类似，根据本发明的溶液的特征还在于基本上完全不存在醇和清洁剂。在优选的实施方案中，这些物质也被完全排除在根据本发明的溶液之外。
最后，根据本发明的溶液的特征还在于其具有的pH值产生小于6的所述一种细胞或多种细胞的细胞内pH。
在本发明的范围内，可透过膜的羧酸有利地用作质子载体，即特别是C2至C5羧酸。如上所述，本发明的特征是快速停止新陈代谢，同时维持细胞，特别是在血液中的细胞的形态。在血液中的细胞被理解为是指含细胞核的细胞。这种代谢停止在下文中也称为固定或保藏，尽管本发明的作用机制不同于已知的交联、脱水或变性固定。优选通过溶解的羧酸与低pH相结合来实现代谢停止。在此，羧酸的质子化形式穿过细胞膜并在细胞内解离。然而，此外可以使用其他的质子化形式的可透过膜的酸。
根据本发明的溶液中的酸优选以羧酸缓冲体系或酸/碱体系的形式存在，其形成在所需酸性范围内的pH并使其稳定。这些缓冲体系优选包含弱酸及其相应的碱。血液具有非常高的缓冲能力。根据本发明，用溶液中所含的缓冲体系将该缓冲能力滴定出(austritiert)，以在混合物中且特别是在细胞内提供酸性环境，其又基本上关闭代谢活动。根据本发明，提供足够量的质子化羧酸用于穿过膜并同时在细胞内释放足够的H+离子的缓冲体系是合适的。
根据所用研究材料，可能需要另外添加强酸来调节根据本发明的溶液的细胞内pH值，以使得研究材料的缓冲能力被滴定出。合适的强酸特别是盐酸或其他无机酸。然而，这些酸是不可透过膜的，因此在本发明的范围内不是质子载体。
特别地，以这样的方式选择质子载体并调节根据本发明的溶液的pH值，即与细胞、血液样本或其他体液或组织样本混合后产生pH为4至6的混合物。本领域技术人员可以容易地进行相应的调节，因为其知道作为研究对象的细胞培养基、血液样本或其他体液或组织样本的pH值和缓冲能力，因此可以根据需要的混合比预调溶液的pH值。待分析的血液样品和保存溶液的通常混合比也是本领域技术人员已知的，并且例如对于柠檬酸盐血液为1:10。对于其他研究对象，可以相应地调整混合比，并且通常在相同的范围内。
在本发明的范围内，特别使用乙酸作为羧酸。然后乙酸优选作为乙酸/乙酸盐体系存在于根据本发明的溶液中，并且溶液的pH值被调节成其在任何情况下都小于6。在另一个优选的实施方案中，选择根据本发明的溶液的pH值和缓冲能力，以使得与样品混合后所得的pH值小于6。特别地，混合物的pH值甚至为2至6，更优选4.8至5.8，特别优选5.0至5.5，或5.1至5.3。特别地，为此将考虑pH值小于6，优选小于5.8，特别是等于或小于5.3的根据本发明的溶液。取决于预期的混合比和待保存的体液，此类溶液根据本发明具有酸性范围内的pH值，特别是1至5，优选1.8至4.5，并且如果例如为了与血液混合以1:5，优选2至3的比例。本发明的范围内的pH值的数据涉及20℃的温度。如上所述，还基于细胞所在溶液的pH和研究材料的缓冲能力来调节细胞内pH值。
本发明的质子载体的酸/碱体系通常以1至300mM的浓度存在，这取决于它是否是经过血液样品和其他水溶液稀释的浓溶液，或它是否是过量的，例如以10倍体积添加到分离出的细胞中的即用型溶液。根据本发明的溶液的特征在此在于可以将其设计为(多倍)浓缩物，以在不过度稀释的情况下固定血液。为此，特别设想了根据本发明的溶液，在其中针对血液或其他体液的保藏，质子载体及其抗凝血成分的酸/碱系统被设计为2至20倍，优选5至10倍浓缩物，以实现如上所述的所需细胞内pH。
在本发明的优选实施方案中，酸/碱体系，优选乙酸/乙酸盐体系以10mM至300mM，优选25mM至200mM，特别优选50mM至150mM的浓度存在于根据本发明的浓缩溶液中。相反，特别是对于即用型溶液而言优选的是，该溶液具有浓度为1mM至100mM，优选5mM至50mM，特别优选10mM至20mM的酸/碱体系。
除了所提到的或其他质子载体之外，根据本发明的溶液还可以包含另外的物质，特别是缓冲物质或常规助剂。特别地，根据本发明的溶液可以包含咪唑和/或二甲基亚砜(DMSO)。咪唑具有微酸性pKa，可以以质子化或非质子化形式克服细胞膜。咪唑最初可以支持H+离子传输到细胞内部。咪唑的合适浓度为例如50mM。为了将根据本发明的溶液用于研究对象的冷冻储存，其优选包含最终浓度为5％至15％，特别优选10％的DMSO。
在本发明的范围内可以用作保藏溶液的成分的其他合适质子载体是环肽，例如缬氨霉素或尼日利亚菌素。另外，根据本发明的溶液可以包含另外的离子，特别是Cl-离子。
根据本发明的溶液还可以包含有助于保存的其他物质。例如，添加β-巯基乙醇或二硫苏糖醇或类似试剂可以进一步降低核糖核酸酶的活性。对于本领域技术人员显而易见的是，添加其他酶抑制剂，例如磷酸酶抑制剂，也可以对根据本发明的溶液的保存效果具有积极影响。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的溶液还包含至少一种氨基酸。特别地，它是组织或细胞中天然存在的氨基酸。在此，本发明的缓冲体系利用氨基酸的保护效果。当以总共或分别0.1M至1M的浓度，优选以100mM至300mM的总浓度包含这些氨基酸时，该效果特别显著。所述氨基酸优选是包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸和天冬氨酸组成的组中的一者或多者。
本发明的另一个实施方案是与pH相关的快速固定与选自由甲醛供体组成的组的具有附加保存作用的有效成分的组合。此类有效成分可以是例如重氮烷基脲或咪唑烷基脲。
此外，根据本发明的溶液的组成优选地设计成，使得渗透浓度不超过1渗摩。该溶液的渗透浓度优选超过100且低于500毫渗摩，优选为250至350毫渗摩。特别优选地，溶液是等渗的或形成用于待保藏的一种细胞或多种细胞的等渗环境。
在本发明的一些实施方案中，通过根据本发明的溶液的配制，没有完全防止血液凝结。本领域技术人员已知，可以通过添加络合剂、抗凝血剂或抑制抗体来防止这些凝血现象。因此，根据本发明的溶液中此类络合剂、抗凝血剂或抗体的存在导致本发明的进一步优选的实施方案。在优选的实施方案中，MgSO4、达比加群酯和/或纤溶酶原激活剂(t-PA)作为抗凝血剂存在于根据本发明的溶液中。
本发明的另一方面是根据本发明的溶液用于保存、保藏和/或固定在血液样品或其他体液中的至少一种真核细胞，特别是肿瘤细胞和循环肿瘤细胞，或来自细胞培养物的细胞或在组织样品中的细胞的用途，优选包括后续或延时的分子分析。
根据本发明的该用途的特征在于，将该溶液与血液样品或其他体液、来自在相应培养基中的细胞培养物的细胞或与含细胞的组织优选在采集后直接混合。
分子分析可以涉及细胞中存在的各种物质或物质组，特别是基因组、转录组和蛋白质组。优选地，在用根据本发明的溶液处理后，对所述至少一种细胞进行转录组分析作为分子分析。
本发明的一个特别特征是可以借助特征来对很大程度上完整的细胞进行定性并利用该定性以进行分子分析。优选地将用根据本发明的溶液处理的由不同细胞构成的混合物分析为标记物。这优选是形态学标记物(例如在流式细胞术中的FSC/SSC分析)或形态测量学标记物(例如用于结合至表面蛋白的标记抗体)。在此，该混合物可以由两种、三种或更多种不同的细胞群组成。该标记物优选用于对用于分析细胞成分，特别优选转录组的分析的至少一种细胞进行定性。
可能优选的是，向根据本发明的溶液中添加至少一种用于组织消化的酶，以从组织联合体中溶解出单独细胞。优选地，所述至少一种酶是胶原酶、分散酶或其组合。
可能优选的是，储存用根据本发明的溶液处理的所述至少一种细胞。可能优选的是将其在2-8℃下储存。替代地，可能优选的是以冷冻状态进行该储存。
根据本发明的用途优选至少包括：输入步骤a)用适合于该用途的溶液处理细胞或组织，以及输出步骤f)对至少一种细胞的转录组进行分子分析。
该用途优选地包括其他步骤，所述其他步骤可以在输入步骤和输出步骤之间根据研究对象和研究目的以单独或组合的方式进行，即下列步骤中的一个或多个：b)通过形态学或形态测量学选择来转录组分析对至少一种细胞进行定性，c)以冷冻状态储存细胞，d)在2至8℃下储存细胞，e)对组织进行蛋白酶消化以产生单独细胞。
在本发明的这些用途方面的范围内，特别有利的是，溶液已经放置在样品管或采血管或采血注射器或另一合适的容器，例如采血注射器中。特别地，这使得能够将采集后的体液与根据本发明的溶液直接混合，从而可以抵消例如由酶活性造成的分析失真。包含根据本发明的溶液的相应样品管或采血管或采血注射器或其他反应容器也是本发明的进一步主题。
在此，又特别优选的是，以浓缩形式提供根据本发明的溶液，以避免样品的严重稀释。作为在样品管等中提供溶液的替代方案，也可以在采集血液样品或体液后立即进行混合。
包含根据本发明的溶液的样品管、采血管或采血注射器以及其他容器可以在根据本发明的用途的范围内使用。与根据本发明的溶液本身一样，这些主题也适合于执行其他方法，例如无细胞DNA/RNA的分析。用于此类目的的用途也涵盖在本发明的范围内。
上面对根据本发明的溶液给出的所有解释也适用于根据本发明的该溶液的用途，并且也适用于包含根据本发明的溶液的预制样品管或采血管。
附图说明
下面的实施例结合附图对本发明作进一步说明。
图1显示了如实施例1中所述的固定的血液，向其中加入培养的肿瘤细胞并在24小时后以流式细胞术进行检查。肿瘤细胞群清晰可辨。
图2显示了示例性单细胞分析。向如实施例1中所述的固定的血液中加入培养的肿瘤细胞并在40小时后用针对EpCam的抗体进行标记，并在图像流中以流式细胞术进行检查。细胞形态得以维持(2a)。通过抗体的荧光染色如图2b所示，并且形态和荧光的叠加如图2C所示。
图3显示了在如实施例2所述地处理细胞后基于电泳cDNA分析的在应用不同细胞固定方法后的转录组完整性的比较。用根据本发明的溶液处理的细胞在表达状态方面等同于新鲜的、未处理的细胞。
具体实施方式
实施例1
在该实施例中，使用具有以下组成的根据本发明的溶液：
在该实施例中，根据本发明的溶液组成如下：
23mM葡萄糖、53mM咪唑、11mM Hepes、5mM天冬氨酸、40mM谷氨酸、12mM脯氨酸、24mM丝氨酸、3.5mM苏氨酸、32mM丙氨酸、56mM甘氨酸、10mM MgSO4、0.09％叠氮化钠、150mM乙酸、HCl添加pH 2.2
溶液在20℃温度下的pH值为2.2。
在采血注射器中提供2ml该溶液。使用以此方式制备的注射器，以从测试对象抽取8ml血液并同时制备根据本发明的混合物。以这种方式固定的血液可以在4℃至20℃下储存，以随后，例如在24小时内通过显微镜或流式细胞术分析来分析混合物中CTC的存在。也可以例如通过表面标记物对抗体的亲和力直接分离出可能存在的CTC。
实施例2
使用胰蛋白酶溶液将来自细胞培养物的HEK293细胞从底物上分离出来并收获。将细胞与活/死染料一起温育，随后分离出活细胞。然后将细胞在过量的不同溶液，即FACS缓冲液(鞘液，BDBiosciences)、根据本发明的溶液、4％低聚甲醛PFA溶液、3％乙二醛溶液、DSP溶液(二硫代-双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，可逆交联剂)或ACME溶液(ACetic-甲醇：水、甲醇、冰乙酸、甘油，比率为13:3:2:2)中在4℃下保存5小时，直至进一步分析。然后使细胞裂解并分离出mRNA。为了比较，收获后直接使新鲜细胞裂解。
在该实施例中，根据本发明的溶液组成如下：23mM葡萄糖、53mM咪唑、11mM Hepes、5mM天冬氨酸、40mM谷氨酸、12mM脯氨酸、24mM丝氨酸、3.5mM苏氨酸、32mM丙氨酸、56mM甘氨酸、0.09％叠氮化钠、乙酸(15mM)添加pH 5.3。
通过逆转录产生来自不同处理的细胞的全细胞mRNA的cDNA并测序。
不同样品的cDNA的比较表明，观察到储存在根据本发明的溶液中的细胞的极高cDNA完整性，而其他储存溶液或缓冲液验证了细胞转录组的明显不利的保存。图3以图示的方式显示了结果，其中具有最高峰值的cDNA曲线是新鲜收获的细胞的结果。具有第二高峰值的cDNA曲线是根据本发明的溶液并且非常高度等同于新鲜细胞的cDNA曲线，相比而言最强，而其他溶液的曲线走向差异很大或根本不等同于新鲜细胞的曲线走向。
Claims (20)
1.用于保存或保藏在血液样品或其他体液中的细胞，优选至少一种真核细胞，特别是肿瘤细胞和循环肿瘤细胞，来自细胞培养物的细胞或在组织样品中的细胞的溶液，其特征在于，所述溶液是水溶液，所述水溶液
a)包含可透过细胞膜的质子载体，
b)基本上不含离液物质、醇或清洁剂，并且
c)具有的pH值产生小于6的一种所述细胞或多种所述细胞的细胞内pH。
2.根据权利要求1所述的溶液，其特征在于，所述质子载体选自C2-C5羧酸或此类羧酸的混合物或其他的以质子化形式可透过膜的酸,并且作为酸/碱体系，优选作为乙酸/乙酸盐体系存在以及形成酸性范围内的pH。
3.根据权利要求2所述的溶液，其特征在于，所述酸/碱体系以1mM至100mM，优选5mM至50mM，特别优选10mM至20mM的浓度存在。
4.根据权利要求3所述的溶液，其特征在于，所述酸/碱体系被设计为2-20倍的多倍浓缩物，特别优选5倍的浓缩物。
5.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，所述溶液还包含强酸，优选盐酸或其他无机酸，以调节细胞内pH。
6.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，所述溶液在与细胞或其他生物材料混合后的pH值为酸性pH，优选4至6，特别优选4.5至5.5，最优选5.3，各自在20℃下测量。
7.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，所述溶液包含其他缓冲物质或质子载体。
8.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，所述溶液包含咪唑和/或DMSO。
9.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，所述溶液包含至少一种糖和/或至少一种氨基酸，所述糖优选选自由单糖或二糖组成的组，所述氨基酸优选选自包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酸、天冬氨酸的组。
10.根据权利要求9所述的溶液，其特征在于，以总共或各自0.1M至1M的浓度，优选100mM至300mM的总浓度包含所述一种或多种氨基酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，所述溶液还包含选自由甲醛供体组成的组的具有保存作用的有效成分，特别是重氮烷基脲或咪唑烷基脲。
12.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，渗透浓度不超过1渗摩，优选低于500毫渗摩，特别地形成用于待保藏的一个或多个真核细胞的等渗环境。
13.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，所述溶液包含络合剂或抗凝血剂或抑制性抗体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的溶液，其特征在于，所述抗凝血剂选自MgSO4、达比加群酯、纤溶酶原激活剂或这些物质的任何混合物。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的溶液用于保存、保藏和/或固定在血液样品或其他体液中的至少一种真核细胞，特别是肿瘤细胞和循环肿瘤细胞，或来自细胞培养物的细胞或在组织样品中的细胞的用途，其中特别是在采集后立即将所述溶液与所述血液样品或体液、细胞培养物样品或组织样品混合和/或在样品管、采血管或采血注射器中提供所述溶液，并将所述血液样品、体液、细胞培养物样品或组织样品添加到该容器中，其中所述溶液又优选以浓缩形式提供或添加。
16.根据权利要求15所述的用途，其中一种所述细胞或多种所述细胞保持基本上完整，并且来自至少一种细胞的RNA用于转录组分析。
17.根据权利要求15或16的用途，其中使用一种所述细胞或多种所述细胞的至少一种标记蛋白的形态学分析，以对用于所述转录组分析的至少一种细胞进行定性。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的用途，其包括输入步骤a)将液体或组织中的细胞与根据权利要求1至14中任一项所述的溶液混合，以及输出步骤f)对至少一种细胞的转录组进行分子分析。
19.根据权利要求18的用途，其包括选自以下的一个或多个中间步骤：b)通过形态学或形态测量学选择对用于所述转录组分析的至少一种细胞进行定量，c)以冷冻状态储存细胞，d)在2至8℃下储存细胞，e)对组织进行蛋白酶消化以产生单独细胞。
20.样品管、采血注射器或采血管，其特征在于，其包含根据权利要求1至14中任一项所述的溶液。
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