PT2705345E - Utilização de halogeno-cianoacetamidas para fixação e preservação de amostras biológicas - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "Utilização de halogeno-cianoacetamidas para fixação e preservação de amostras biológicas" A invenção refere-se à utilização de uma solução que compreende uma halogeno-acetamida ou misturas destas para fixação e preservação de materiais biológicos tal como definido na reivindicação 1.
Com isso, a amostra é ajustada intacta e fixa até processamento ulterior e as proteínas e os outros componentes da amostra não são fortemente alterados pela solução, permitindo a detecção dos fatores bioquímicos que seriam destruídos numa solução fixadora convencional. Típico para formaldeído, ácido crómico, ácido ósmico e outros componentes anexáveis, é a desnaturação irreversível das proteínas, que tem uma influência decisiva sobre a composição de proteínas da amostra.
Na determinação bioquímica das enzimas, proteínas e imunológicos e outros exames específicos para proteínas, estas substâncias fixadoras convencionais não podem ser utilizadas.
Até aos dias de hoje, o formaldeído (formalina) é a substância fixadora mais utilizada, que tem excelentes propriedades fixadoras, mesmo durante períodos de tempo mais longos.
Os aldeídos, especialmente formaldeído, são considerados altamente tóxicos.
Foi classificado com um potencial cancerígeno químico justificado e pode causar alergias e irritações dérmicas, respiratórias e dos olhos. No caso de exposição a altas doses, pode até mesmo resultar em risco de morte. 0 mesmo também tem um odor característico forte e desagradável.
Por razões de proteção ambiental e segurança do trabalho, a utilização da formalina é legalmente restrita.
TÉCNICA ANTERIOR
Soluções fixadoras sem formaldeído são conhecidas a partir das patentes EP 1 455 174 Bi, US 6 531 317 B2, WO 03/029 783 Al, DE 699 17 779 T2, US 5 422 277 A. US 2005/0084924 Al e DE 26 30 823 Al.
Existem várias ideias para criar uma solução fixadora sem formaldeído, tal como descrito no documento DE 38 22 183 Al, onde o ácido tânico é sugerido como o componente principal da solução. Para obter uma fixação rápida a patente DE 38 24 936 Al sugere a utilização da ação de água quente, com o auxilio do Ácido Tânico e um Bi álcool na água. A patente DE 44 04 544 Al rejeita totalmente meios químicos de fixação, tais como formalina, sugerindo uma desnaturação das proteínas a partir da amostra pela ação do calor através de banhos de água quente. Este procedimento tem a desvantagem, no entanto, de que as estruturas do material que é fixo podem sofrer alterações morfológicas. As proteínas, por exemplo, podem coagular. Por esta razão, este procedimento não é adequado para todos os tipos de materiais.
Outras soluções fixadoras são conhecidas na literatura. Quase todas elas, com poucas exceções, contêm substâncias muito perigosas e são um grande risco potencial para os seres vivos e para o ambiente.
Entre as mais conhecidas podemos incluir:
Fixador de Schaudinn (o mesmo contém sais de mercúrio), SAF (o mesmo contém formaldeído), MIF (o mesmo contém formaldeído e sais de mercúrio), ácido ósmico (o mesmo é cancerígeno, tóxico, cáustico), ácido crómico (cancerígeno, tóxico, cáustico), FA (formaldeído e álcool) e outros que são mencionados na literatura.
Em geral, uma solução fixadora deve manter materiais biológicos tais como tecidos biológicos, células, agrupamentos de células, vírus, bactérias, parasitas, leveduras, fezes e outros num estado estável por um período de tempo relativamente longo após retirar a amostra. O estado original da amostra imediatamente após a recolha deve ser fixo para um exame adicional no laboratório (por exemplo, um exame microscópico) para que o estado morfológico presente na recolha da amostra possa ser encontrado. Importante, a estrutura morfológica da amostra deve ser preservada. Não deve haver processos ou proliferação de bactérias, leveduras ou processos de fermentação ou decomposição ou outros processos de degradação química, física ou microbiológica, que possam afetar adversamente a amostra.
Em resumo, a solução fixadora deve manter qualquer tipo de material biológico num estado estável adequado para a preparação ou fins analíticos.
As ideias previamente descritas que estão no estado atual da técnica são orientadas para evitar completamente a utilização da formalina, substituindo-a por substâncias não tóxicas ou menos perigosas, embora as mesmas mostrem tanto quanto possível as mesmas características que mostra a fixação de formalina. A fixação baseia-se em mecanismos químicos diferentes, alguns dos quais ainda não estão totalmente elucidados. Um mecanismo principal é o chamado "Crossing Over" (recombinação cruzada). Neste processo, há uma ligação química da molécula no fixador que pode ser do tipo covalente, interação Van-der-Waals ou até mesmo iónica para uma posição correspondente numa molécula de proteína numa amostra. É possível que existam diferentes tipos de ligação ao mesmo tempo. Com o aumento das ligações químicas no material biológico há um aumento na estabilidade mecânica das estruturas biológicas e, ao mesmo tempo, os microrganismos na amostra são destruídos.
Até agora, as soluções fixadoras eram projetadas para maximizar estes processos. Com isso, há sempre um excesso de substância fixadora na solução, o que não é sempre necessário ou mesmo conveniente. (Se há excesso de substâncias tóxicas no local de trabalho, haverá reação excessiva com a amostra).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Na presente invenção são utilizadas halogeno-acetamidas para a fixação e preservação dos materiais biológicos. As halogeno-acetamidas por si só não são parte da presente invenção. - Está de acordo com as regras válidas (neste caso regras da Comunidade Europeia) a solução não é perigosa ou apenas pouco perigosa para o utilizador e o ambiente. (Em qualquer caso menos perigosa do que as soluções de fixação tradicionais). - Não apresenta outras formas de perigo (inflamável, explosiva, corrosiva, cumulativa no ambiente ou altamente volátil). - Reage de um modo suave com a amostra e as proteínas de amostra, sem causar deformações na estrutura morfológica da amostra ("retração") e mantém intactos mais parâmetros biológicos e bioquímicos do que soluções tradicionais. - Não perturba processos de modo significante nos quais a amostra tenha que sofrer após a fixação (como reações indesejadas, impedindo a coloração e outros).
Duas substâncias básicas foram escolhidas para produzir o efeito desejado: - Halogéneo cianoacetamida 2,2-dibromo-2-cianoacetamida ou 2,2-Dibromo-3 nitrilopropionamida ou resumido DBNPA.
De forma a simplificar, nós iremos chamar a substância mencionada como DBNPA.
Estas substâncias são escolhidas por causa do seguinte:
As halogéneo cianoacetamidas e DBNPA tem fortes propriedades biocidas e interrompem completamente as atividades biológicas e microbiológicas na amostra.
Por causa da estrutura molecular destas substâncias, o efeito do cruzamento pode ocorrer porque estes átomos de halogéneo produzem a polarização molecular necessária para a ocorrência de interações van-der-Waals entre a molécula de fixação e as moléculas de proteína da amostra, assegurando desse modo a estabilização da estrutura e, assim, a fixação. Devido às altas propriedades biocidas da substância, a concentração mínima pode ser aplicada, evitando excessos desnecessários. A atividade biológica da amostra cessa rapidamente, evitando a degeneração microbiológica da amostra. A ação ótima da solução ocorre em pH ácido ou em torno do ponto neutro, mas dependendo de outros componentes da solução e dos resultados desejados, pode ser necessário ajustar o pH para um intervalo de 3-9. A solução fixadora que é usada na presente invenção pode ser preparada na forma liquida pronta. Entretanto, também é possível apresenta-la numa forma concentrada que proporciona uma solução pronta, após a adição de um solvente adequado, que no caso mais simples é água. Isto (concentrado) pode ser uma solução concentrada, uma mistura em pó, um gel solúvel, um comprimido, uma cápsula solúvel, um verniz solúvel que cobre o recipiente com a solução ou de outra forma semelhante.
Com isto, o transporte, a armazenagem e os custos de embalagem podem ser reduzidos, além de outras vantagens de ordem económica e logísticas como o solvente, água na maioria dos casos, pode ser adicionado ao destino final pelo utilizador.
Um exemplo concreto é uma solução que utiliza 2% em peso de DBNPA, e outras substâncias como um ácido adicional para ajustar o pH para ligeiramente ácido. Ácidos orgânicos ou inorgânicos podem ser utilizados tais como ácido cítrico. Em seguida pode ser adicionado um hidratante, tal como Etilenoglicol, Glicerina, Propilenoglicol, Sorbitol, Eritriol ou semelhante, que também servem como mediadores para a fase de lipídios da amostra, o que facilita a sua disseminação. Outra componente a ser adicionado seria um tensioactivo iónico ou aniónico, ou uma mistura de ambos, a fim de diminuir a tensão superficial da solução, melhorando as características dispersivas. A partir destas substâncias podemos listar polietilenoglicol etoxilato, sorbatos etoxilatos (comercialmente TWEEN), dodecil sulfato de sódio, sulfonato aquilbenzeno e outros sulfatos Aquil e sulfonatos, assim como produtos comerciais nas séries TRITON, ETHOMEEN, e outras semelhantes. Álcoois gordos (N 8) tais como mono ou poli-álcoois, de cadeia linear ou ramificada, podem ser aplicados como auxiliares do processo e mediadores dos agentes tensioactivos utilizados.
Para a melhoria da solução para fins de comercialização, serão adicionados aromatizantes e corantes que não entram em conflito com outros componentes.
Para fins de ajustamento dos isotónicos sais de metais alcalinos ou alcalino-terroso, tais como cloretos, sulfatos, nitratos, citratos, acetatos de litio, sódio, potássio, magnésio, cálcio, estrôncio ou outros.
Para fins de ajuste de pH em certas aplicações, pode ser necessária a utilização de soluções tampão, tais como tampão citrato, acetato ou outros conhecidos na literatura. ADITIVOS DE SOLUÇÃO DE ESTABILIZAÇÃO: É sabido, a partir da literatura, que halogéneo cianoacetamidas, especialmente DBPNA sofrem hidrólise alcalina quando em solução. Para a solução garantir mais tempo de operação, devem ser adicionadas pequenas quantidades de antioxidantes específicos à solução para evitar uma deterioração precoce. A solução assim tratada mantém a sua atividade durante um período de cerca de dois anos. A possibilidade de degradação da solução quando descartada não é afetada, mantendo a sua característica ecológica.
Como podemos ver no diagrama abaixo, os produtos da decomposição final de DBPNA não são cumulativos no ambiente:
A fotodecomposição é atrasada com a utilização de um corante de tinta na solução e as recomendações de armazenagem em local escuro e fresco. A hidrólise é amplamente reduzida com a utilização de antioxidantes comerciais tais como 4,4 -bis (2,6-di-tert-butilfenol) ou 2,6-di-tert-butil-p-cresol ou semelhantes, que são praticados comercialmente. É importante destacar que o formaldeido é um dos produtos de decomposição de DBPNA, é inibido, devido a estabilização por antioxidantes. Para os utilizadores que precisam que a sua amostra biológica seja fixa para um processamento que, por regra, demora apenas algumas semanas, a solução não apresenta niveis de formaldeido que possam afetar a fixação suave.
As soluções biocidas comerciais de DBPNA utilizadas na indústria do papel e têxtil, assim estabilizadas, mostram uma degradação de DBPNA menor do que 10% em 20 meses, assegurando uma ação ideal do componente. EXEMPLO DE FORMULAÇÃO SIMPLES: DPNA 2%
Propilenoglicol 5% TWEEN 80 1%
Corante alimentício 0,01%
Mistura de fragrâncias 0,01%
Antioxidante 0,05% Água para fabrico 100%
Esta solução foi testada e avaliada com amostras de fezes humanas e de animais a partir do ponto de vista parasitológico; tendo sido detectados principalmente ovos de parasitas. As amostras histológicas de músculo bovino também foram fixadas, mostrando excelente qualidade da fixação e preservação. Durante o período de observação de 30 dias não foram observadas alterações em qualquer uma das amostras analisadas. Numa avaliação posterior, amostras de fezes humanas foram encontradas contaminadas com protozoários. O relatório para esta Avaliação está anexado a este documento. Os protozoários em fezes são extremamente suscetíveis a degradação e podem degenerar em poucas horas. Nos testes foi demonstrada uma preservação e fixação para um período superior a sete dias. Em comparação com uma solução padrão de formaldeído, a qualidade da preservação foi igual, se não melhor. EXEMPLO DA FORMULAÇÃO SIMPLES DE COMPRIMIDO SOLÚVEL: DBPNA 100g
Sorbitol pó 41 g TWEEN 8 0 2,5g Ácido Cítrico 2,0g
Corante alimentício l,0g
Mistura de fragrâncias l,0g
Antioxidante 2,5g
Goma arábica 50g
Massa total 200g
Um comprimido de 40g desta massa contém 20g de DBPNA que se utiliza para produzir um litro de solução a 2% pronta para utilização.
Na concentração de 2% de DBPNA na solução deve trazer somente a frase de risco 43, indicando o risco de sensibilização através de contato com a pele. Em solução de concentrações abaixo de 1% não há necessidade de indicar o produto como perigoso. 0 mesmo não é inflamável, corrosivo, não produz emanações tóxicas ou perigosas, não é teratogénico ou cancerígeno, não é agressivo para o ambiente e não requer precauções especiais para trabalho seguro, trazendo uma melhoria extraordinária na segurança do trabalho para o utilizador assim como uma simplificação notável nos processos de gestão ambiental no laboratório no qual está a ser utilizado. É conveniente indicar aqui que, além da água, podem ser utilizados outros solventes, dependendo da aplicação desejada. Com os avanços nas técnicas de diagnóstico, são discutidos álcool e outros solventes, tais como metilo, etilo, propilo, butilo, cetonas, ésteres, éteres, glicerina e outros materiais orgânicos. 0 fixador descrito pode ser obtido com a utilização de solventes orgânicos e misturas de solventes orgânicos ou misturas de solventes orgânicos com água.
Lisboa, 2015-05-18
Claims (12)
- REIVINDICAÇÕES 1 - Utilização de uma composição que inclui um ou mais halogeno-cianoacetamidas para fixar amostras biológicas.
- 2 - Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o halogeno-acetamida é 2,2-dibromo-2-cianoacetamida.
- 3 - Utilização de acordo com as reivindicações 1 e 2, em que a composição compreende um solvente escolhido a partir de solventes orgânicos ou água ou suas misturas.
- 4 - Utilização de uma composição de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, compreendendo adicionalmente um regulador de pH.
- 5 - Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 4, em que o ajustador de pH é selecionado dentro do grupo: ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido fórmico e seus sistemas tampão correspondentes.
- 6 - Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 4, que compreende adicionalmente o pH ajustado para um intervalo entre pH 3,0 e pH 6,0.
- 7 - Utilização de uma composição de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4 que compreende adicionalmente: - um humectante; - um tensioactivo; - um sal de metais alcalinos ou alcalino-terroso; e - um antioxidante.
- 8 - Utilizar uma composição de acordo com a reivindicação 7, onde o humectante é selecionado a partir do seguinte grupo de humectantes: - etilenoglicol; - propilenoglicol; - glicerina; - eritritol - sorbitol e misturas dos mesmos.
- 9 - Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 7, onde o tensioactivo é selecionado a partir de TWEEN 80 ou dodecil sulfato de sódio e suas misturas
- 10 - Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 7, onde os sais alcalinos e alcalinos terrosos são selecionados a partir do grupo a seguir: citratos, acetatos, fosfatos, cloretos, sulfatos, formiatos, nitratos, a partir de litio, sódio, potássio, césio, magnésio, cálcio, estrôncio e bário e misturas destes.
- 11 - Utilização de uma composição de acordo com a reivindicação 7, onde o antioxidante é selecionado a partir do grupo a seguir: - 4,4-bis (2,6-di-terc-butilfenol); 4,4-bis (2,6-di-terc-butil-p-cresol) e misturas destes.
- 12 - Utilização de uma composição concentrada de acordo com as reivindicações 1-7, onde os componentes estão presentes sem o solvente sob a forma de pó, comprimido, cápsula, gel ou verniz ou com pouco solvente, sob a forma de um concentrado para produzir uma solução completa por adição da quantidade necessária de solvente. Lisboa, 2015-05-18
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