CN117916236A - 取代的s-丙氨酸酯衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及取代的S‑丙氨酸酯衍生物及其制备方法，并涉及其用于制备治疗和/或预防疾病，特别是血管病症，优选血栓性或血栓栓塞性病症和/或血栓性或血栓栓塞性并发症的药物的用途。

Description

取代的S-丙氨酸酯衍生物

本发明涉及取代的S-丙氨酸酯衍生物及其制备方法，并涉及其用于制备治疗和/或预防疾病，特别是血管病症，优选血栓性或血栓栓塞性病症和/或血栓性或血栓栓塞性并发症的药物的用途。

止血是保护生物体在受伤后免于过度和可能危及生命的失血的关键机制，其以主要由纤维蛋白和血小板网形成的凝块快速且可靠地封闭动脉或静脉血管壁的渗漏。当内皮细胞损伤后内皮下层组织因子暴露于血液并触发复杂的酶促反应的瀑布式级联(waterfall cascade)时，在损伤部位开始形成纤维蛋白，其中活化的凝血因子将下一个酶原转化为其活性蛋白酶形式。传统上，级联的早期步骤分为外在(或组织因子)途径和内在(或接触激活)途径，这取决于触发物是与各种细胞类型结合的组织因子还是在带负电荷的表面上激活的XII因子。两种途径在X因子激活水平上汇合，其为凝血酶产生的关键酶。最后，通过多种底物的转化，凝血酶将级联中产生的信号转化为血液的凝固状态：凝血酶裂解纤维蛋白原，从而导致纤维蛋白网的产生，其将XIII因子激活为XIIIa因子，其是凝块稳定所需的。此外，凝血酶是血小板聚集的有效触发物(经由PAR-1激活)，其也非常有助于凝块形成。通过将TAFI(凝血酶可激活纤维蛋白溶解抑制剂)激活为在与凝血酶调节蛋白(thrombomodulin)的复合物中的TAFIa，凝血酶抑制凝块的溶解。在正反馈回路中，V、VIII和XI因子的激活增强凝血酶的产生并因此放大凝血反应。相反地，凝血酶/凝血酶调节蛋白复合物对蛋白质C的激活导致tenase复合物中VIIIa因子和凝血酶原酶复合物中Va因子的降解，从而进一步减少凝血酶的产生。

凝血因子通常以复合物的形式存在于表面上，例如Xa因子在凝血酶原酶复合物中与Va因子结合。在纤维蛋白凝块形成期间，凝血酶和凝血酶原酶发生整合并结合在纤维蛋白网中。这些酶分子保持活性并且难以被内源性抗凝血剂(例如抗凝血酶III)到达。

止血受凝块形成和溶解之间复杂的调节机制影响。虽然覆盖血管壁渗漏是预防出血的必要程序，但由血管壁病症(如动脉粥样硬化病变)、血液中持续的炎症过程(如感染过程中)或血流减少引起的过度凝块形成可导致血管闭塞，这导致对周围组织造成巨大危险的事件，因为营养物质的供应和潜在有害降解产物的清除受到阻碍。这些凝块可以阻塞生成部位的静脉、动脉或淋巴管，或可以作为栓塞穿过血管，直到它们被卡住。这些血栓中的许多是在局部血管病症(例如动脉粥样硬化斑块破裂或深静脉血流不足)后形成的。这些可导致严重事件，这些事件可能发生在任何血管中，包括中风、心肌梗死或肺栓塞，这些都是导致死亡的主要原因。在其他情况下，感染过程中组织因子暴露在血细胞上(例如在单核细胞上)或者带负电荷的表面或大分子暴露于XII因子(例如在细胞死亡后)可导致全身性高凝状态，造成微血栓病症与潜在的随后的器官损伤。这些高凝状态可由例如细菌感染、病毒感染或真菌感染或者创伤引起。

此外，在弥漫性血管内凝血病(DIC)的情况下，全身性高凝状态可导致消耗性凝血病。再者，在微血管病性溶血性贫血、体外循环程序(如血液透析)、心脏腔室中、人工心脏瓣膜和支架处以及移植过程中也会遇到血栓栓塞性并发症。

抗凝药物用于预防性环境中以防止血栓形成，并在急性血栓性/栓塞性事件中用于支持纤溶酶对已有纤维蛋白的溶解。因为这些化合物不仅可以抑制血栓的产生，还可以影响止血过程，因此可出现出血时间延长，这可能会限制对强抗凝功效的选择。因此，具有宽治疗窗口的化合物是有利的。

在急性预防性或介入性环境中，需要抗凝功效的快速起效和足够可控性，这可以通过具有短期药理作用的化合物的肠胃外给药来实现。因此，用于口服给药的抗凝化合物(其主要包括维生素K拮抗剂和直接口服抗凝血剂(DOAC))在此环境下不是优选的，因为它们的药理起效延迟，药理作用持久，这限制了治疗的可控性。此外，对于许多患者而言，口服药物的给药可能具有挑战性。为了能够静脉内施用这样的抗凝化合物，需要足够的溶解性。由于急性护理患者通常使用一种以上的药物进行治疗，因此较低的急性药物-药物相互作用可能性是优选的。

现有技术中已知的抗凝血剂(例如用于抑制或防止血液凝固的物质)具有各种缺点。因此，实际上，发现血栓性/血栓栓塞性病症的有效治疗方法或预防非常困难且不能令人满意。

在急性情况下，高凝状态可以通过内在或外在途径引发。因此，在这种适应症中用Xa因子和凝血酶来靶向共同途径是有益的。虽然单独的Xa因子抑制不会抑制已形成的凝块中预先存在的凝血酶，但单独的凝血酶抑制(例如用水蛭素(hirudin)、比伐卢定(bivalirudin)或阿加曲班(argatroban))可能对治疗窗口不利，这可能是因为仅在最后一步就需要大量的化合物来停止凝血系统的瀑布式级联。因此，在治疗高凝状态中，可能对通过Xa因子抑制来调节凝血酶生成并抑制已经存在的凝血酶的化合物感兴趣，因为它们存在于例如由细菌、病毒和真菌引起的传染病的过程中。此外，这类患者通常与体外系统有关，在其中血液暴露于促凝剂表面，并可从抗凝治疗中受益。

在急性血栓栓塞性病症的治疗和预防中，首先使用肝素，其通过静脉内或皮下给药。因为更有利的药代动力学和药效学性质，如今越来越优选低分子量肝素。然而，以这种方式无法避免下文所述的在肝素治疗中遇到的已知缺点。存在高的出血风险，特别是脑出血和胃肠道出血，且经过几天的治疗会增加肝素诱导的血小板减少症(HIT)发展的风险。肝素通过加速抗凝血酶-III(ATIII)与Xa因子和凝血酶的结合来间接抑制Xa因子与凝血酶，从而导致额外的ATIII消耗。鉴于其对内皮的保护作用，肝素诱导的ATIII消耗增加在消耗性凝血病期间也至关重要。此外，肝素对凝块结合的凝血酶和Xa因子的抑制作用很小。

近来，记载了小分子，其在一个分子内以不同的比例组合凝血酶和Xa因子抑制。这些方法已经在体外和体内进行了测试，并显示出显著的协同可能性。

EP42675组合了用于直接凝血酶抑制的拟肽部分和间接抑制Xa因子的类磺达肝素(Fondaparinux-like)部分。然而，这种分子依赖于ATIII的存在。他诺吉群(Tanogitran)是另一种小分子化合物，其在体外抑制凝血酶和Xa因子，但对凝血酶有更强的功效。在很大程度上，未代谢的他诺吉群经由肾脏消除，因此需要对肾功能不全的患者进行剂量调整和密切监测。

因此，本发明的目的是提供新的化合物，其作为Xa因子和凝血酶抑制剂用于治疗人和动物的心血管病症，特别是血栓性或血栓栓塞性病症和/或血栓性或血栓栓塞性并发症的，该化合物具有宽的治疗窗口，良好的溶解性和短期的药理作用，以实现足够的可控性。

WO2009/103440、WO2014/174102以及J.Meneyrol等人，J.Med.Chem.2013,56,9441-945特别记载了取代的氯噻吩-酰胺作为Xa因子和凝血酶的抑制剂。J.-M.Altenburger等人，Bioorg.Med.Chem.2004,12,1713-1730特别记载了取代的磺酰胺作为凝血酶的抑制剂。

本发明提供了式(I)的3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯

及其盐、其溶剂合物和其盐的溶剂合物。

本发明的化合物根据其结构可以以不同的立体异构形式存在，即以构型异构体的形式存在，或者如果合适，以构象异构体(对映异构体和/或非对映异构体，包括在旋转异构体和阻转异构体的情况下的那些)的形式存在。因此，本发明包括对映异构体和非对映异构体，及其各自的混合物。立体异构上相同的组分可以已知方式从这种对映异构体和/或非对映异构体的混合物中分离；色谱法优选用于此，尤其是在非手性或手性相上的HPLC色谱法。

如果本发明的化合物可以以互变异构的形式出现，则本发明包括所有的互变异构的形式。

本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体在本文中被理解为指本发明化合物中的至少一个原子已被另一个具有相同原子序数但原子质量与自然界中通常或主要存在的原子质量不同的原子交换的化合物。可掺入本发明化合物中的同位素的实例为氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素，例如²H(氘)、³H(氚)、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³²P、³³P、³³S、³⁴S、³⁵S、³⁶S、¹⁸F、³⁶Cl、⁸²Br、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁹I和¹³¹I。本发明化合物的特定同位素变体(尤其是其中掺入了一种或多种放射性同位素的那些)可有益于例如检查作用机制或活性成分在体内的分布；由于相对容易的制备性和可检测性，尤其是用³H或¹⁴C同位素标记的化合物适合于此目的。此外，掺入同位素(例如氘)可导致特定的治疗益处，这是由于化合物的代谢稳定性更高，例如延长体内半衰期或降低所需的活性剂量；因此，本发明化合物的这种变型在一些情况下也可以构成本发明的优选实施方案。本发明的化合物的同位素变体可以通过本领域技术人员已知的方法(例如通过下面进一步描述的方法和工作实施例中描述的程序)，通过使用相应的同位素对各试剂和/或起始化合物进行修饰而制备。

在本发明的上下文中优选的盐是本发明化合物的生理上可接受的盐。然而，本发明也包括本身不适合于药物应用，但可用于例如分离或纯化本发明化合物的盐。

本发明化合物的生理上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。本发明化合物的优选的生理上可接受的盐包括盐酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、甲苯磺酸、酒石酸、苹果酸和柠檬酸的酸加成盐。

本发明化合物的生理上可接受的盐也包括常规碱的盐，例如并优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)和衍生自氨或具有1至16个碳原子的有机胺(例如并优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己基胺、二甲氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、乙二胺、N-甲基哌啶和胆碱)的铵盐。

在本发明的上下文中，溶剂合物被描述为本发明化合物通过与溶剂分子配位形成固态或液态络合物的那些形式。水合物是溶剂合物的一种特殊形式，其中与水配位。

本发明另外还包括本发明化合物的前药。术语“前药”包括其本身可有生物活性或虽然无活性但在体内的停留期间被转化为本发明化合物(例如通过代谢或水解)的化合物。

在本发明的上下文中，术语“治疗(treatment或treating)”包括抑制、延缓、检查、缓解、衰减、限制、降低、压制、抵御或治愈疾病、病况、病症、损伤或健康问题，或这些状态和/或这些状态的症状的发展、过程或进展。术语“疗法(therapy)”在本文中理解为与术语“治疗”同义。

术语“防止(prevention)”、“预防(prophylaxis)”和“阻止(preclusion)”在本发明的上下文中同义地使用，并且意指避免或降低感染、经历、罹患或患有疾病、病况、病症、损伤或健康问题，或者这种状态和/或这种状态的症状的发展或进展的风险。

对疾病、病况、病症、损伤或健康问题的治疗或预防可为部分或完全的。

优选式(I)的化合物3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯

还优选式(I)的化合物3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯

及其生理上可接受的盐。

还优选选自以下的式(I)化合物的生理上可接受的盐：

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯盐酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯硫酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯甲磺酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯4-甲基苯磺酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯马来酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯磷酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(2R,3R)-酒石酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯柠檬酸盐。

本发明还提供了一种制备式(I)化合物或其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物的方法，其中使下式的化合物

与下式的化合物

在脱水剂的存在下反应，得到式(I)的化合物，

以及任选地将式(I)的化合物用相应的(i)溶剂和/或(ii)碱或酸转化为其溶剂合物、盐和/或盐的溶剂合物。

反应通常在惰性溶剂中进行，如果合适的话在碱的存在下进行，优选在-20℃至80℃的温度范围内在大气压下进行。

在本文中，合适的脱水剂为例如碳二亚胺如N,N’-二乙基碳二亚胺、N,N’-二丙基碳二亚胺、N,N’-二异丙基碳二亚胺、N,N’-二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-环己基碳二亚胺-N’-丙氧基甲基-聚苯乙烯(PS-碳二亚胺)，或羰基化合物如羰基二咪唑，或1,2-噁唑鎓化合物如2-乙基-5-苯基-1,2-噁唑鎓3-硫酸盐或2-叔丁基-5-甲基异噁唑鎓高氯酸盐，或酰氨基化合物如2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氢喹啉，或氯甲酸异丁酯，或双-(2-氧代-3-噁唑烷基)磷酰氯，或苯并三唑基氧基三(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸盐，或O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，或2-(2-氧代-1-(2H)-吡啶基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TPTU)、(苯并三唑-1-基氧基)双二甲氨基甲鎓氟硼酸盐(TBTU)或O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)、或1-羟基苯并三唑(HOBt)，或苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)，或氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)，或(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)，或N-[(二甲氨基)(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐，或2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷-2,4,6-三氧化物(T3P)，或这些和盐的混合物。优选在氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯(Oxyma)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的存在下缩合。

碱为，例如，有机碱如三烷基胺(例如三乙胺)、N-甲基吗啉、N-甲基哌啶、4-二甲基氨基吡啶或二异丙基乙胺，或吡啶。优选无碱缩合。

惰性溶剂为例如卤代烃如二氯甲烷或三氯甲烷，烃如苯或甲苯，或其它溶剂如1,4-二恶烷、乙醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙腈，或所述溶剂的混合物。优选二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺的混合物。

式(II)和(III)的化合物是已知的，可以通过已知的方法由相应的起始化合物合成，或者可以类似于A)实施例部分中描述的方法而制备。

起始化合物和式(I)化合物的制备可以通过下面的合成方案说明。

方案

本发明的化合物具有不可预见的有用药理活性范围和良好的药代动力学特性。它们是抑制Xa因子和凝血酶的化合物。因此，它们适合用作治疗和/或预防人类和动物疾病的药物。

本发明进一步提供了本发明化合物用于治疗和/或预防病症、特别是血管病症，优选血栓性或血栓栓塞性病症和/或血栓性或血栓栓塞性并发症如弥散性血管内凝血，和/或炎症性病症的用途。

Xa因子(FXa)和IIa因子(FIIa，即凝血酶)是参与凝血的关键酶。凝血酶被凝血酶原酶复合物中的FXa直接激活，进而将纤维蛋白原激活为纤维蛋白——血凝块的主要成分之一。

作为凝血的“共同”途径的一部分，FXa和凝血酶是凝血内在启动和外在启动的重要组分。在外在途径中，凝血通过组织因子(TF)触发，该因子表达于血管外膜，并因血管损伤而暴露于血液。组织因子在某些触发物(例如细菌内毒素)下也可以由单核细胞或激活的内皮细胞分泌。在内在途径中，凝血系统特别地可在带负电的表面上(其不仅包括外源细胞(如细菌)的表面结构，还包括人造表面(如人造血管、支架和体外循环))激活。在该表面上，初始XII因子(FXII)被激活为XIIa因子(FXIIa)，XIIa因子随后将附着于细胞表面的XI因子(FXI)激活为XIa因子(FXIa)。外在途径和内在途径都汇合在共同途径中，其中FXa将凝血酶原激活为凝血酶，其又会1)进一步传播下游凝血级联，导致如上所述的纤维蛋白生成和凝块形成，以及2)通过将FXI激活为FXIa而重新启动在反馈回路中的凝血级联。

因此，本发明的化合物适用于治疗和/或预防可由凝块形成引起的病症或并发症。

就本发明的目的而言，“血栓性或血栓栓塞性病症”包括发生在动脉和静脉血管系统中并且可以用本发明的化合物治疗的病症，特别是用于治疗和预防弥漫性血管内凝血(DIC)，其可能尤其与败血症相关而发生，但也可能是由于外科干预、肿瘤病症、烧伤或其他可通过微血栓形成导致严重器官损害的损伤而发生。在感染过程中，可存在凝血系统的广泛激活(弥散性血管内凝血或消耗性凝血病，下文称为“DIC”)，并伴有各种器官的微血栓形成和继发性出血并发症。DIC期间，凝血系统在受损内皮细胞表面、异物表面或交联的血管外组织处被大量激活。因而，在各种器官的小血管中存在凝血，伴随缺氧和随后的器官功能障碍。继发效应是凝血因子(例如X因子、凝血酶原和纤维蛋白原)和血小板的消耗，这降低了血液的可凝固性并可导致大出血。此外，可存在内皮损伤，伴随血管通透性增加以及流体和蛋白质扩散到血管外部空间。

本发明的化合物还适用于预防或治疗在传染病和/或全身炎症综合征(SIRS)(如败血性器官功能障碍、败血性器官衰竭和多器官衰竭)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、急性肺损伤(ALI)、败血性休克和/或败血性器官衰竭的情况下可能出现的并发症。

血栓栓塞性并发症还发生在微血管病性溶血性贫血中，以及通过血液在体外循环的情况下(例如血液透析、ECMO(“体外膜式氧合”)、LVAD(“左心室辅助装置”)和类似方法、AV瘘管、血管和心脏瓣膜假体)与异物表面接触而发生。

此外，本发明的化合物适用于治疗和预防心脏的冠状动脉中的病症，如急性冠状动脉综合征(ACS)、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)和无ST段抬高的心肌梗死(非STEMI)、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、冠状动脉介入(如血管成形术、支架植入或主动脉冠状动脉搭桥术)后的再闭塞和再狭窄。

本发明化合物还适用于预防和治疗患有急性、间歇性或持续性心律失常(例如心房颤动)的患者和接受心脏复律的患者，以及患有心脏瓣膜病症或具有人工心脏瓣膜的患者的心源性血栓栓塞，例如脑缺血、中风和全身性血栓栓塞和局部缺血。

本发明的化合物也可用于治疗和/或预防脑血管动脉中的病症，如短暂性脑缺血发作(TIA)、缺血性中风(包括心源性栓塞性中风，如心房颤动引起的中风)、非心源性栓塞性中风(如腔隙性中风)、大动脉或小动脉疾病引起的中风、或不明原因引起的中风、隐源性中风、栓塞性中风、来源不明的栓塞性中风、或导致中风或TIA的血栓性和/或血栓栓塞性事件。

本发明的化合物还可用于治疗和/或预防导致外周动脉疾病的外周动脉病症，包括外周动脉闭塞、急性肢体缺血、截肢、在介入(如血管成形术、支架植入或手术和搭桥术)之后的再闭塞和再狭窄，和/或支架血栓。

此外，本发明的化合物还可用于治疗和/或预防静脉血管中导致静脉血栓形成的病症，特别是深腿静脉、肾静脉、视网膜静脉和/或脑血管窦静脉中的病症、和/或可能导致肺动脉栓塞的静脉血栓栓塞。

凝血系统的刺激可由各种原因或相关病症引起。尤其在手术介入、不动(immobility)、卧床、感染、炎症或癌症或癌症治疗的情况下，凝血系统会被高度激活，并可能出现血栓性并发症，特别是静脉血栓。因此，本发明的化合物适用于预防罹患癌症的患者在进行手术介入的情况下形成血栓。

本发明的化合物还适用于初步预防患者的血栓性或血栓栓塞性病症和/或炎症性病症和/或血管通透性增加的病症，其中基因突变导致酶的活性增强或酶原水平升高，且这些是通过酶活性或酶原浓度的相关测试/测量来确定的。

本发明进一步提供了本发明化合物用于治疗和/或预防病症(尤其是上述病症)的用途。

本发明进一步提供了本发明化合物用于制备治疗和/或预防病症(尤其是上述病症)的药物的用途。

本发明进一步提供了一种使用治疗有效量的本发明化合物治疗和/或预防病症(尤其是上述病症)的方法。

本发明进一步提供本发明的化合物，其用于使用治疗有效量的本发明化合物以治疗和/或预防病症(尤其是上述病症)的方法中。

特别地，本发明提供本发明的化合物，其用于使用治疗有效量的本发明化合物以治疗和/或预防血栓性或血栓栓塞性病症的方法中。

本发明进一步提供包含本发明化合物与一种或多种其他活性化合物的药物。

此外，本发明的化合物还可用于防止体外凝血，例如用于保护器官移植物免受由凝块形成所引起的损害，以及用于保护器官接受者免受移植器官的血栓栓塞、用于保存血液和血浆产物、用于清洁/预处理导管和其他医疗辅助设备和仪器、用于涂覆体内或体外使用的医疗辅助设备或仪器的合成表面，或用于可含有Xa因子或凝血酶的生物样品。

本发明进一步提供包含本发明化合物与一种或多种其它活性化合物的药物，其特别是用于治疗和/或预防上述病症。适用于进行组合的活性化合物的优选实例包括：

·降脂物质，尤其是HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A)还原酶抑制剂，例如洛伐他汀(lovastatin)(Mevacor)、辛伐他汀(simvastatin)(Zocor)、普伐他汀(pravastatin)(Pravachol)、氟伐他汀(fluvastatin)(Lescol)和阿托伐他汀(atorvastatin)

(Lipitor)；

·冠状动脉治疗/血管舒张剂，尤其是ACE(血管紧张素转换酶)

抑制剂，例如卡托普利(captopril)、赖诺普利(lisinopril)、依那普利(enalapril)、雷米普利(ramipril)、西拉普利(cilazapril)、贝那普利(benazepril)、福辛普利(fosinopril)、喹那普利(quinapril)和培哚普利(perindopril)，或AII(血管紧张素II)受体拮抗剂，例如恩布沙坦(embusartan)、氯沙坦(losartan)、缬沙坦(valsartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、坎地沙坦(candesartan)、依普罗沙坦(eprosartan)和替米沙坦(temisartan)，或β-肾上腺素受体拮抗剂，例如卡维地洛(carvedilol)、阿普洛尔(alprenolol)、比索洛尔(bisoprolol)、醋丁洛尔(acebutolol)、阿替洛尔(atenolol)、倍他洛尔(betaxolol)、卡替洛尔(carteolol)、美托洛尔(metoprolol)、纳多洛尔(nadolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普奈洛尔(propanolol)和噻吗洛尔(timolol)，或α-1-肾上腺素受体拮抗剂，例如哌唑嗪(prazosine)、布那唑嗪(bunazosine)、多沙唑嗪(doxazosine)和特拉唑嗪(terazosine)，或利尿剂，例如氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、呋塞米(furosemide)、布美他尼(bumetanide)、吡咯他尼(piretanide)、托拉塞米(torasemide)、阿米洛利(amiloride)和双肼酞嗪(dihydralazine)，或钙通道阻滞剂，例如维拉帕米(verapamil)和地尔硫卓(diltiazem)，或二氢吡啶衍生物，例如硝苯地平(nifedipin)(Adalat)和尼群地平(nitrendipine)(Bayotensin)，或硝基制剂，例如5-单硝酸异山梨酯、二硝酸异山梨酯和三硝酸甘油酯，或导致环鸟苷单磷酸(cGMP)增加的物质，例如可溶性鸟苷酸环化酶的刺激物，例如利奥西呱(riociguat)；

·纤溶酶原(plasminogen)活化剂(血栓溶解剂/纤维蛋白溶解剂)和促进血栓溶解/纤维蛋白溶解的化合物如纤溶酶原活化剂抑制剂的抑制剂(PAI抑制剂)或凝血酶激活的纤维蛋白溶解抑制剂的抑制剂(TAFI抑制剂)，例如组织纤溶酶原活化剂(t-PA，如)、链激酶，瑞替普酶(reteplase)和导致纤溶酶形成增加的尿激酶或纤溶酶原-调节物质；

·抗凝血物质(抗凝血剂)，例如肝素(UFH)、低分子量肝素(LMW)，例如亭扎肝素(tinzaparin)、塞托帕林(certoparin)、帕肝素(parnaparin)、纳屈肝素(nadroparin)、阿地肝素(ardeparin)、依诺肝素(enoxaparin)、瑞维肝素(reviparin)、达肝素(dalteparin)、达那肝素(danaparoid)、司莫肝素(semuloparin)(AVE 5026)、阿都米肝素(adomiparin)(M118)和EP-42675/ORG42675；

·直接凝血酶抑制剂(DTI)，例如普拉达沙(Pradaxa)(达比加群(dabigatran))、阿特加曲(atecegatran)(AZD-0837)、DP-4088、SSR-182289A、阿加曲班(argatroban)、比伐卢定(bivalirudin)和他诺吉群(tanogitran)(BIBT-986和前药BIBT-1011)、水蛭素(hirudin)；

·直接Xa因子抑制剂，例如利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)、依度沙班(edoxaban)(DU-176b)、贝曲沙班(betrixaban)(PRT-54021)、R-1663、达瑞沙班(darexaban)(YM-150)、奥米沙班(otamixaban)(FXV-673/RPR-130673)、利达沙班(letaxaban)(TAK-442)、雷扎沙班(razaxaban)(DPC-906)、DX-9065a、LY-517717、他诺吉群(BIBT-986，前药：BIBT-1011)、抑达肝素(idraparinux)和磺达肝素(fondaparinux)；

·抑制血小板聚集的物质(血小板聚集抑制剂、凝血细胞聚集抑制剂)，例如乙酰水杨酸(例如阿司匹林)、P2Y12拮抗剂如噻氯匹定(ticlopidine)(Ticlid)、氯吡格雷(clopidogrel)(Plavix)、普拉格雷(prasugrel)、替格瑞洛(ticagrelor)、坎格雷洛(cangrelor)、依利格雷(elinogrel)、PAR-1拮抗剂如沃拉帕克(vorapaxar)、PAR-4拮抗剂、EP3拮抗剂如DG041；

·血小板粘附抑制剂如GPVI和/或GPIb拮抗剂如Revacept或卡帕珠单抗(caplacizumab)；

·纤维蛋白原受体拮抗剂(糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂)，例如阿昔单抗(abciximab)、依替巴肽(eptifibatide)、替罗非班(tirofiban)、拉米非班(lamifiban)、来达非班(lefradafiban)和夫雷非班(fradafiban)；

·重组人类活化蛋白C，例如Xigris或重组血栓调节蛋白；

·以及抗心律不齐药物；

·皮质类固醇，例如阿奈可他(anecortave)、倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、曲安西龙(triamcinolone)、氟轻松(fluocinolone)和醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)；

·环氧合酶抑制剂，例如溴芬酸(bromfenac)和奈帕芬胺(nepafenac)；

·激肽释放酶-激肽系统的抑制剂，例如沙夫替班(safotibant)和艾卡拉肽(ecallantide)；

·鞘氨醇-1-磷酸信号通路的抑制剂，例如索奈珠单抗(sonepcizumab)；

·补体-C5a受体的抑制剂，例如依库珠单抗(eculizumab)；

·5HT1a受体的抑制剂，例如坦度螺酮(tandospirone)；

·凝血因子XI或XIa的抑制剂，例如奥索西单抗(osocimab)、阿贝拉西单抗(abelacimab)、asundexian和milvexian；

·血管收缩剂，例如肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺(dopamine)；

·抗生素，例如哌拉西林(piperacillin)、combactam、红霉素(erythromycin)、甲硝唑(metronidazol)、环丙沙星(ciprofloxacin)和万古霉素(vancomycin)；

·在治疗急性呼吸窘迫综合征或急性肾损伤期间维持终末器官功能的化合物。

“组合”就本发明的目的而言不仅意指含有所有组分的剂型(所谓的固定组合)和含有彼此分离的组分的组合包，而且也意指同时或循序给药的组分，前提是它们用于预防和/或治疗相同的疾病。同样可以将两种或更多种活性成分彼此组合，这意味着它们因此各自为双组分或多组分组合。

本发明的化合物可以全身性地和/或局部性地起作用。为此目的，它们可以以合适的方式给药，例如通过口服、肠胃外、经肺、经鼻、舌下、经舌、经颊部、直肠、经皮、穿皮、经结膜或经耳道，或者以植入物或支架给药。

本发明的化合物可以适用于这些给药途径的给药形式来给药。

用于口服给药的合适给药形式是根据现有技术起作用并快速和/或以减缓的方式递送本发明化合物的那些，且其含有结晶形式和/或非晶形式和/或溶解形式的本发明化合物，例如片剂(未包衣或经包衣的片剂，例如具有肠溶性包衣或者不溶或延迟溶解的包衣，其控制本发明化合物的释放)、在口腔中迅速崩解的片剂，或薄膜/薄片(wafer)、薄膜/冻干物、胶囊剂(例如硬或软的明胶胶囊)、糖衣片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、乳剂、混悬剂、气雾剂或溶液剂。

肠胃外给药可以避免吸收步骤(例如通过静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰椎内途径)或包括吸收(例如通过肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内途径)来完成。适用于肠胃外给药的给药形式包括以溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干剂或无菌粉剂形式用于注射和输液的制剂。

优选肠胃外给药。

用于其他给药途径的合适给药形式为，例如，用于吸入的药物形式(包括粉末吸入剂、喷雾剂)、滴鼻剂、鼻用溶液剂或喷鼻剂；用于经舌、舌下或口腔给药的片剂、薄膜/薄片或胶囊剂、栓剂、用于耳朵或眼睛的制剂、阴道胶囊、水性混悬剂(洗剂、振荡合剂(shakingmixture))、亲脂性混悬剂、软膏剂、乳膏、经皮治疗系统(例如贴剂)、乳液剂(milk)、糊剂、泡沫剂、撒布剂、植入物或支架。

本发明的化合物可以转化为上述给药形式。这可以以本身已知的方式通过与惰性、无毒、药学上合适的赋形剂混合来完成。这些赋形剂包括载体(例如微晶纤维素、乳糖、甘露醇)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂和分散剂或润湿剂(例如十二烷基硫酸钠、聚氧山梨聚糖油酸酯)、粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然聚合物(例如白蛋白)、稳定剂(例如抗氧化剂，例如抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料，例如铁氧化物)和调味剂和/或气味矫正剂。

本发明进一步提供药物，其包含至少一种本发明化合物，优选与一种或多种惰性无毒药学上合适的赋形剂，以及其用于上述目的的用途。

在肠胃外给药的情况下，通常发现每24小时给药约100mg至15g的量以达到有效结果是有利的，优选每24小时给药约500mg至7.5g的量，并且非常优选每24小时给药约1g至3.5g的量。

尽管如此，如果合适，可以有必要偏离规定的量，具体取决于体重、给药途径、对活性成分的个体行为、制剂类型以及给药时间或间隔。

除非另有说明，否则以下试验和实施例中的百分比为重量百分比；份是重量份。就液体/液体溶液而言的溶剂比、稀释比和浓度数据在各情况下都基于体积计。“w/v”指“重量/体积”。例如，“10％w/v”是指：100ml溶液或悬浮液包含10g物质。

A)实施例

缩写：

HPLC和LC-MS方法：

方法1(制备型HPLC)：柱：Chromatorex C18，10μm，205x 50mm；洗脱液A：水，洗脱液B：乙腈；在3min注射；梯度：0.0min 10％B→6.0min 10％B→27min 95％B→38min 95％B→39min 10％B→40.2min 10％B；流量：150ml/min；UV-检测：210nm。

方法2(制备型HPLC)：柱：RP18柱，洗脱液：乙腈/水梯度，其中将0.1％TFA加入水相。

方法3(制备型HPLC)：柱：Chromatorex C18，10μm，205x50mm；洗脱液A：水，洗脱液B：乙腈；在3min注射；梯度：0.0min 10％B→5.5min 10％B→17.65min 95％B→19.48min95％B→19.66min 10％B→20.51min 10％B；流量：150ml/min；UV-检测：210nm。

方法4(制备型HPLC)：Chromatorex C18，10μm，250x 50mm 30％乙腈/70％水(+0.1％TFA)→梯度达38min→95％乙腈/5％水(+0.1％TFA)。

方法5(制备型HPLC)：Chromatorex C18，10μm，125x 30mm；洗脱液A：水+0.1％TFA，洗脱液B：乙腈；在3min注射；梯度：0.0min10％B→6.0min 10％B→27min 95％B→38min95％B→39min10％B→40.2min 10％B；流量：75ml/min；UV-检测：210nm。

方法6(制备型HPLC)：Chromatorex C18，10μm，125x 30mm；洗脱液A：水+0.01％HCl，洗脱液B：乙腈；在3min注射；梯度：0.0min 10％B→6.0min 10％B→27min 95％B→38min 95％B→39min 10％B→40.2min 10％B；流量：75ml/min，UV-检测：210nm。

方法7(LC/MS)：系统MS：Thermo Scientific FT-MS；系统UHPLC+：ThermoScientific UltiMate 3000；柱：Waters，HSST3，2.1x 75mm，C181.8μm；洗脱液A：1l水+0.01％甲酸；洗脱液B：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min 10％B→2.5min 95％B→3.5min95％B；烘箱：50℃；流量：0.90ml/min；UV-检测：210nm/最佳积分路径210-300nm。

方法8(LC/MS)：仪器：Waters ACQUITY SQD UPLC系统；柱：Waters Acquity UPLCHSS T31.8μm 50x 1mm；洗脱液A：1l水+0.25ml 99％甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.25ml 99％甲酸；梯度：0.0min 90％A→1.2min 5％A→2.0min 5％A；烘箱：50℃；流量：0.40ml/min；UV-检测：210nm。

方法9(LC/MS)：仪器：Agilent MS Quad 6150；HPLC：Agilent 1290；柱：WatersAcquity UPLC HSS T31.8μm 50x 2.1mm；洗脱液A：1l水+0.25ml 99％甲酸，洗脱液B：1l乙腈+0.25ml 99％甲酸；梯度：0.0min90％A→0.3min 90％A→1.7min 5％A→3.0min 5％A；烘箱：50℃；流量：1.20ml/min；UV-检测：205-305nm。

方法10(手性HPLC)：柱：Daicel Chiralpak IG,5μm,250x 4.6mm；洗脱液A：50％异己烷，50％乙醇+1％水+0.2％TFA；流量：1.0ml/min，温度：40℃。

方法11(手性HPLC)：柱：Daicel Chiralcel IG,5μm,250x 4.6mm；洗脱液A：50％正庚烷，50％乙醇+0.2％二乙胺；流量：1.0ml/min，温度：60℃。

当本发明化合物通过上述方法藉由制备型HPLC(其中洗脱液含有添加剂，例如三氟乙酸、甲酸或氨)纯化时，如果本发明化合物含有足够的碱性或酸性官能度，则本发明化合物可以以盐形式获得，例如作为三氟乙酸盐、甲酸盐或铵盐而获得。这种盐可以通过本领域技术人员已知的各种方法转化为相应的游离碱或酸。

在下文所述的本发明的合成中间体和工作实施例的情况下，以相应碱或酸的盐的形式指定的任何化合物通常是通过各自的制备和/或纯化方法获得的精确化学计量组成未知的盐。因此，除非有更详细的说明，否则名称和结构式的附加词(如“盐酸盐”、“三氟乙酸盐”、“钠盐”或“x HCl”、“x CF₃COOH”、“x Na⁺”或其他盐)在这种盐的情况下不应以化学计量意义来理解，而应对其中存在的成盐组分仅具有描述性。

如果合成中间体或工作实施例或其盐是通过所述的制备和/或纯化方法以化学计量组成未知(如果它们为确定的类型)的溶剂合物(例如水合物)的形式获得，则这相应地适用。

微波：使用的微波反应器为Biotage Initiator^TM或Initiator Plus^TM类型的“单模式”仪器。

定量离子色谱法(IC)：用外标物测定离子；仪器：Thermo Scientific ICS 5000+；毛细IC柱：IonPac AS11-HC和IonPac CS16；洗脱液：洗脱液梯度[H]⁺[OH]^-；检测器：电导检测。

质子核磁共振波谱法(¹H-NMR)：如所示，在氘代溶剂(DMSO-d₆)中用在400、500或600MHz下操作的Bruker Avance波谱仪记录¹H-NMR谱。化学位移相对于作为内标物的四甲基硅烷(TMS)以ppm报告。¹H-NMR信号的耦合模式的说明基于信号的光学外观且不一定反映物理上正确的解释。通常，化学位移信息指的是信号的中心。在多重峰的情况下，给出区间。被溶剂或水遮蔽或部分遮蔽的信号被暂时指定或未被列出。显著加宽的信号——例如，由分子部分的快速旋转或由于质子交换所引起的——同样被暂时指定(通常称为宽多重峰或宽单峰)或未列出。

X射线粉末衍射(XRPD)：使用XRD衍射仪X`Pert PRO(PANalytical)(辐射Cu Kα1，波长)在室温下记录X射线衍射图。没有样品制备。所有X射线反射都以°2θ(θ)值(峰最大值)示出，分辨率为±0.2°。

红外光谱法(IR)：使用来自Bruker的Tensor 37装置使用FT-IR分光光度计在室温下记录IR光谱。分辨率为2cm^-1。

在立体异构体的混合物的NMR光谱中，用“和”提及的数字表明立体异构体显示出各自氢原子的独立信号，即“…和…(2 x s,1H)”意思是一个氢原子由2个单峰表示，每个单峰来自一种或多种不同的立体异构体。

附图说明

图1：实施例1的红外光谱；

图2：实施例2的红外光谱；

图3：实施例3的红外光谱；

图4：实施例4的红外光谱；

图5：实施例5的红外光谱；

图6：实施例6的红外光谱；

图7：实施例7的红外光谱；

图8：实施例8的红外光谱；

图9：实施例9的红外光谱。

起始化合物

中间体1

1-[3-(苄基硫基)-2-乙基苯基]吡咯烷-2-酮

在氩气下，向1-(苄基硫基)-3-溴-2-乙基苯(13.0g，42.3mmol；制备参见Journalof Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456,化合物40b)和吡咯烷-2-酮(14.5ml，190mmol)在二恶烷(345ml)和DMF(87ml)中的溶液中，加入DMEDA(5.5ml，50.8mmol)、碘化铜(I)(9.67g，50.8mmol)和碳酸钾(35.1g，254mmol)，并将氩气再鼓泡通入混合物5分钟。然后，在封闭高压釜中将混合物在110℃下搅拌16小时，无需额外的压力调节。冷却至室温后，将混合物过滤并在减压下除去溶剂。将残余物溶于水和乙酸乙酯中，并分离各相。将水相用乙酸乙酯萃取三次，之后将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(二氧化硅，环己烷/乙酸乙酯1:1)进行纯化，得到第一批标题化合物(9.30g，理论值的65％，92％纯度)。在另外的快速色谱法(Biotage Isolera，50g硅胶SNAP Ultra柱，环己烷/乙酸乙酯梯度)后获得第二批(280mg，理论值的2％，99％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.03min；MS(ESIpos)：m/z＝312[M+H]⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：7.41-7.36(m,3H),7.34-7.29(m,2H),7.28-7.19(m,2H),7.02(dd,1H),4.25(s,2H),3.61(t,2H),2.59-2.50(m,2H,部分遮蔽),2.40(t,2H),2.16-2.05(m,2H),1.01(t,3H)

中间体2

(3S)-1-[3-(苄基硫基)-2-甲基苯基]-3-羟基吡咯烷-2-酮

在氩气下，将1-(苄基硫基)-3-溴-2-甲基苯(4.50g，15.3mmol；制备参见WO 2009/103440，第81页，中间体83)与(3S)-3-羟基吡咯烷-2-酮(3.10g，30.7mmol)、碘化铜(I)(4.09g，21.5mmol)和碳酸钾(8.48g，61.4mmol)混合，然后加入二恶烷(120ml)和DMF(31ml)。然后加入DMEDA(2.3ml，21.5mmol)，并将混合物在110℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物与在相似条件下分别从100mg和1.0g 1-(苄基硫基)-3-溴-2-甲基苯开始的两个试验反应所获得的混合物合并。将合并的混合物用硅藻土(Celite)过滤，用乙酸乙酯洗涤并在减压下去除溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯和水中，并再次用硅藻土过滤。分离各相，并将水相用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(Biotage Isolera，二氧化硅柱，环己烷/乙酸乙酯梯度)进行纯化，得到标题化合物(4.24g，理论值的65％，92％纯度)。产率基于合并实验计。

LC-MS(方法9)：R_t＝1.18min；MS(ESIpos)：m/z＝314[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：7.38(d,2H),7.34-7.29(m,3H),7.27-7.23(m,1H),7.21(t,1H),7.05(d,1H),5.65(d,1H),4.33-4.25(m,1H),4.23(s,2H),3.59-3.54(m,1H),3.54-3.48(m,1H),2.45-2.38(m,1H),2.05(s,3H),1.98-1.89(m,1H)。

中间体3

(3R)-1-[3-(苄基硫基)-2-甲基苯基]-3-羟基吡咯烷-2-酮

在氩气下，将1-(苄基硫基)-3-溴-2-甲基苯(3.00g，10.2mmol；制备参见WO 2009/103440，第81页，中间体83)与(3R)-3-羟基吡咯烷-2-酮(1.86g，18.4mmol)、碘化铜(I)(2.73g，14.3mmol)和碳酸钾(5.66g，40.9mmol)混合，然后加入二恶烷(82ml)和DMF(21ml)。然后加入DMEDA(1.5ml，14mmol)，并将混合物在110℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物与在相似条件下从42mg 1-(苄基硫基)-3-溴-2-甲基苯开始的试验反应所获得的混合物合并。将合并的混合物用硅藻土过滤，用乙酸乙酯洗涤并在减压下去除溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯和水中，并再次用硅藻土过滤。分离各相，并将水相用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(BiotageIsolera，二氧化硅柱，环己烷/乙酸乙酯梯度)进行纯化，得到标题化合物(2.27g，理论值的54％，79％纯度)。产率基于合并实验计。

LC-MS(方法9)：R_t＝1.18min；MS(ESIpos)：m/z＝314[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：7.42(d,2H),7.38-7.33(m,3H),7.31-7.27(m,1H),7.25(t,1H),7.08(d,1H),5.69(d,1H),4.34-4.30(m,1H),4.27(s,2H),3.63-3.57(m,1H),3.57-3.57(m,1H),2.49-2.42(m,1H),2.09(s,3H),2.02-1.94(m,1H)。

中间体4

(3S)-1-[3-(苄基硫基)-2-乙基苯基]-3-羟基吡咯烷-2-酮

在氩气下，向1-(苄基硫基)-3-溴-2-乙基苯(4.05g，13.19mmol；制备参见Journalof Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物40b)和(3S)-3-羟基-2-吡咯烷酮(4.0g，39.56mmol)在二恶烷(105ml)和DMF(27ml)中的混合物中，加入DMEDA(1.14ml，10.55mmol)、碘化铜(I)(2.01g，10.55mmol)和碳酸钾(7.29g，52.75mmol)。将混合物平均分配至8个微波容器中并加盖。将这些容器中的两个在微波中在110℃下加热16小时，而将其他6个容器在加热块中在110℃下搅拌16小时。冷却至室温后，将合并的混合物过滤并除去溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯和水中，并在相分离后，将水相用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物吸附在Isolute上，并通过快速色谱法(Biotage Isolera，100g SNAP-Ultra硅胶，环己烷-乙酸乙酯梯度)进行纯化。将合并的产物级分进行浓缩并在真空中进行干燥，得到标题化合物(2.17g，理论值的49％，纯度98％)。

LC-MS(方法8)：R_t＝0.92min；MS(ESIpos)：m/z＝328[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：7.41-7.36(m,3H),7.34-7.29(m,2H),7.28-7.20(m,2H),7.01(dd,1H),5.69(d,1H),4.30-4.24(m,3H),3.58-3.52(m,1H),3.50-3.42(m,1H),2.60-2.47(m,2H,部分遮蔽),2.45-2.36(m,1H),1.98-1.87(m,1H),1.01(t,3H)。

中间体5

(3R)-1-[3-(苄基硫基)-2-乙基苯基]-3-羟基吡咯烷-2-酮

在氩气下，向1-(苄基硫基)-3-溴-2-乙基苯(844mg，2.75mmol；制备参见Journalof Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物40b)中加入(3R)-3-羟基-2-吡咯烷酮(500mg，4.95mmol)、碘化铜(I)(733mg，3.85mmol)，碳酸钾(1.52g，11.0mmol)、二恶烷(22ml)、DMF(5.6ml)和DMEDA(0.41ml，3.85mmol)。将混合物在110℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将混合物用硅藻土过滤并除去溶剂。将残余物溶于乙酸乙酯和水中，再次用硅藻土过滤，并在相分离后，将水相用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(硅胶，环己烷-乙酸乙酯梯度)进行纯化。将合并的产物级分进行浓缩并在真空中进行干燥，得到标题化合物(548mg，理论值的60％，纯度99％)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.78min；MS(ESIpos)：m/z＝328[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：7.41-7.36(m,3H),7.34-7.29(m,2H),7.28-7.20(m,2H),7.01(d,1H),5.66(d,1H),4.30-4.24(m,3H),3.58-3.52(m,1H),3.50-3.42(m,1H),2.60-2.47(m,2H,部分遮蔽),2.45-2.36(m,1H),1.98-1.87(m,1H),1.01(t,3H)。

中间体6

(3S)-1-[3-(苄基硫基)-2-乙基苯基]-3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}吡咯烷-2-酮

向(3S)-1-[3-(苄基硫基)-2-乙基苯基]-3-羟基吡咯烷-2-酮(2.17g，6.64mmol，中间体4)在DCM(19ml)和DMF(4.8ml)中的溶液中，加入叔丁基二甲基氯硅烷(3.0g，19.93mmol)、DIPEA(2.9ml，16.61mmol)和DMAP(16mg，0.13mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物进行浓缩，将残余物溶于乙腈和水中，并通过制备型HPLC(方法1)进行纯化。将合并的产物级分进行冻干，得到标题化合物(2.0g，理论值的68％，100％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝2.84min；MS(ESIpos)：m/z＝442[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：7.41-7.36(m,3H),7.34-7.29(m,2H),7.28-7.20(m,2H),7.02(d,1H),4.48(t,1H),4.26(s,2H),3.62-3.53(m,1H),3.53-3.45(m,1H),2.59-2.40(m,3H,部分遮蔽),2.03-1.90(m,1H),1.01(t,3H),0.9(s,9H),0.13(s,3H),0.12(s,3H)。

中间体7

2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰氯

向1-[3-(苄基硫基)-2-乙基苯基]吡咯烷-2-酮(9.30g，29.86mmol，未经纯度调整，中间体1)在乙酸(550ml)中的溶液中，加入磺酰氯(9.60ml，119.4mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。加入水，并将混合物用DCM萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤三次，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物溶于环己烷中，并通过快速色谱法(BiotageIsolera One，100g SNAP Ultra硅胶柱，环己烷/乙酸乙酯梯度)进行纯化，得到标题化合物(5.15g，理论值的55％，91％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.66min；MS(ESIpos)：m/z＝288[M+H]⁺

中间体8

3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰氯

向(3S)-1-[3-(苄基硫基)-2-甲基苯基]-3-羟基吡咯烷-2-酮(4.24g，92％纯度，12.45mmol，中间体2)在DCM(73ml)和乙酸(290ml)中的溶液中，加入NCS(6.65g，49.8mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤三次，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物溶于DCM中，并用饱和氯化钠溶液洗涤三次。将有机相用硫酸钠进行干燥并浓缩，并将残余物在真空中进行干燥，得到标题化合物(3.94g，理论值的80％，73％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.26min；MS(ESIpos)：m/z＝290[M+H]⁺。

中间体9

3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰氯

向(3R)-1-[3-(苄基硫基)-2-甲基苯基]-3-羟基吡咯烷-2-酮(2.27g，79％纯度，5.72mmol，中间体3)在DCM(34ml)和乙酸(135ml)中的溶液中，加入NCS(3.06g，22.9mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物溶于DCM中，并用饱和氯化钠溶液洗涤三次，然后用DCM将合并的水相再萃取一次。将合并的有机相用硫酸钠进行干燥并浓缩，并将残余物在真空中进行干燥，得到标题化合物(1.90g，理论值的62％，纯度54％)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.26min；MS(ESIpos)：m/z＝290[M+H]⁺。

中间体10

2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰氯

向(3S)-1-[3-(苄基硫基)-2-乙基苯基]-3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}吡咯烷-2-酮(2.0g，4.53mmol，中间体6)在乙酸(120ml)中的溶液中，加入磺酰氯(1.50ml，18.1mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。将混合物用水稀释并用DCM萃取五次，之后将水相用氯化钠进行饱和并用DCM再次进行萃取。将合并的有机相用硫酸钠进行干燥，并通过旋转蒸发器在25℃的浴温下进行浓缩。将残余物通过快速色谱法(Biotage Isolera，100g SNAPUltra硅胶，环己烷-乙酸乙酯梯度)分两部分进行纯化。将合并的产物级分通过旋转蒸发器在25℃的浴温下进行浓缩，得到标题化合物(1.11g，理论值的72％，根据LC-MS的纯度为90％)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.39min；MS(ESIpos)：m/z＝304[M+H]⁺。

中间体11

2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰氯

向(3R)-1-[3-(苄基硫基)-2-乙基苯基]-3-羟基吡咯烷-2-酮(545mg，1.65mmol，中间体5)在DCM(10ml)和乙酸(39ml)中的溶液中，加入NCS(880mg，6.59mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。然后，将混合物用水稀释，并用DCM萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤三次，用硫酸钠进行干燥，并在25℃的浴温下通过旋转蒸发器进行浓缩。将残余物通过快速色谱法(Biotage Isolera，SNAP Ultra硅胶，环己烷-乙酸乙酯梯度)进行纯化。将合并的产物级分通过旋转蒸发器在25℃的浴温下进行浓缩，得到标题化合物(450mg，理论值的84％，根据NMR的纯度为93％，含有一些溶剂)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.39min；MS(ESIpos)：m/z＝304[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：7.80(dd,1H),7.21-7.16(m,1H),7.13(dd,1H),4.27(t,1H),3.63-3.57(m,1H),3.55-3.46(m,1H),3.02-2.87(m,2H),2.46-2.38(m,1H),1.97-1.89(m,1H),1.05(t,3H)。

中间体12

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基}-丙氨酸甲酯

向3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰氯(3.69g，7.39mmol，58％纯度，中间体8)在DCM(91ml)中的溶液中，加入三乙胺(4.1ml，29.55mmol)和甲基-3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-S-丙氨酸酯(2.04g，7.76mmol；制备参见Journal ofMedicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物49)，并将反应混合物在室温下搅拌1.5h。将混合物与在相似条件下从250mg(94％纯度)3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰氯开始所获得的小规模反应的混合物合并。将合并的混合物用DCM进行稀释并用水洗涤两次，然后将合并的水相用DCM再萃取。然后将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(硅胶，DCM/甲醇20:1)进行纯化，得到标题化合物(2.25g，理论值的46％，87％纯度)。产率基于合并实验计。

LC-MS(方法9)：R_t＝0.99min；MS(ESIneg)：m/z＝514[M-H]^-。

中间体13

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸甲酯

向3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰氯(1.90g，54％纯度，3.54mmol，中间体9)在DCM(44ml)中的溶液中，加入三乙胺(2.0ml，14.2mmol)和甲基-3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-S-丙氨酸酯(0.98g，3.72mmol；制备参见Journal ofMedicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物49)，并将反应混合物在室温下搅拌1.5h。将混合物用DCM进行稀释并用水洗涤两次，然后将合并的水相用DCM再萃取。然后将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(硅胶，DCM/甲醇梯度)进行纯化，得到标题化合物(882mg，理论值的46％，96％纯度)。

LC-MS(方法9)：R_t＝0.99min；MS(ESIneg)：m/z＝514[M-H]^-。

中间体14

(2S)-3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-2-({[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}氨基)丙酸锂

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸甲酯(2.0g，3.89mmol，参考物5)在THF(30ml)中的溶液中，加入氢氧化锂一水合物(816mg，19.45mmol)，并将混合物在室温下搅拌4h。然后将混合物进行浓缩，将残余物溶于水/甲醇/乙腈中，并通过制备型HPLC(方法3)进行纯化。将合并的产物级分进行浓缩，并将残余物在真空中进行干燥，得到标题化合物(1.56g，理论值的80％，100％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.38min；MS(ESIpos)：m/z＝500[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：8.65(br s,1H),7.91(d,1H),7.47(d,1H),7.43(d,1H),7.36(t,1H),7.15(d,1H),3.65(br s,2H),3.57-3.48(m,1H),3.38-3.27(遮蔽,2H),2.98-2.88(m,1H),2.88-2.80(m,1H),2.42(t,2H),2.17-2.08(m,2H),1.08(t,3H)。

中间体15

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸甲酯(515mg，1.00mmol，参考物5)在THF(5ml)中的溶液中，加入1M氢氧化锂溶液(5.0ml，5.0mmol)，并将混合物在室温下搅拌2h。然后，将混合物用水稀释并用乙醚洗涤。然后将水相用1M盐酸(6ml)处理，并用丁醇萃取三次。将合并的丁醇相进行浓缩，将残余物溶于乙腈/水中并冻干，得到标题化合物(482mg，理论值的90％，94％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.38min；MS(ESIpos)：m/z＝500[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：12.84(s,1H),8.68(t,1H),8.44(d,1H),7.85(d,1H),7.55(d,1H),7.41(d,1H),7.32(t,1H),7.17(d,1H),4.00(dd,1H),3.66-3.57(br m,2H),3.57-3.50(m,1H),3.43-3.36(m,1H),2.93-2.80(m,2H),2.42(t,2H),2.16-2.09(m,2H),1.08(t,3H)。

中间体16

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸甲酯(2.25g，87％纯度，3.79mmol，中间体12)在THF(8.1ml)中的溶液中，加入氢氧化锂水溶液(38ml，1.0M，38mmol)，并将混合物在室温下搅拌2小时。THF蒸发后，将含水混合物用2M盐酸缓慢酸化，直到pH值达到1。将所得混合物用乙酸乙酯萃取两次，并将合并的有机相用硫酸钠进行干燥，浓缩并在真空中干燥，得到标题化合物(1.96g，理论值的97％，94％纯度，根据NMR含有一些溶剂)。

LC-MS(方法9)：R_t＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝502[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：12.84(br s,1H),8.55(t,1H),8.35(d,1H),7.81(d,1H),7.48(d,1H),7.40(d,1H),7.31(t,1H),7.15(d,1H),5.70(d,1H),4.33-4.28(m,1H),4.02-3.97(m,1H),3.58-3.49(m,2H),3.49-3.41(m,1H),3.38-3.30(m,1H,部分遮蔽),2.47-2.39(m,1H),2.35(s,3H),1.97-1.89(m,1H)。

中间体17

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸甲酯(882mg，1.71mmol，中间体13)在THF(3.6ml)中的溶液中，加入氢氧化锂水溶液(17ml，1.0M，17mmol)，并将混合物在室温下搅拌2小时。THF蒸发后，将含水混合物用2M盐酸缓慢酸化，直到pH值达到1。将所得混合物用乙酸乙酯萃取两次，并将合并的有机相用硫酸钠进行干燥，浓缩并在真空中干燥，得到标题化合物(784mg，理论值的81％，89％纯度，根据NMR含有一些溶剂)。

LC-MS(方法9)：R_t＝0.89min；MS(ESIpos)：m/z＝502[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：12.76(br s,1H),8.57(t,1H),8.36(d,1H),7.82(d,1H),7.50(d,1H),7.42(d,1H),7.32(t,1H),7.16(d,1H),5.70(d,1H),4.31(br t,1H),4.02-3.97(m,1H),3.58-3.50(m,2H),3.50-3.44(m,1H),3.39-3.33(m,1H),2.47-2.39(m,1H),2.36(s,3H),1.98-1.92(m,1H)。

中间体18

(2S)-3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-2-[({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)氨基]丙酸锂

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-丙氨酸甲酯(200mg，0.38mmol，参考物6)在THF(2.1ml)中的溶液中，加入氢氧化锂一水合物(48mg，1.13mmol)和两滴水，并将混合物在室温下搅拌1h。然后将混合物进行浓缩，并将残余物通过制备型HPLC(方法1)进行纯化。将合并的产物级分进行冻干，得到标题化合物(140mg，理论值的71％，100％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.23min；MS(ESIpos)：m/z＝516[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：8.70-8.64(m,1H),7.93(d,1H),7.47-7.40(m,2H),7.40-7.34(m,1H),7.16(d,1H),5.75(br s,1H),4.28(t,1H),3.65-3.57(m,1H),3.56-3.47(m,2H),3.38-3.20(m,4H,部分遮蔽),2.98-2.76(m,2H),2.47-2.38(m,1H),2.00-1.87(m,1H),1.07(t,1H)。

中间体19

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸甲酯(508mg，0.96mmol，参考物6)在THF(2.0ml)中的溶液中，加入氢氧化锂水溶液(1M，9.6ml，9.6mmol)，并将混合物在室温下搅拌2h。THF蒸发后，将含水混合物用1M盐酸缓慢酸化，直到pH值达到1。将所得混合物用乙酸乙酯萃取两次，并将合并的有机相用硫酸钠进行干燥，浓缩并在真空中干燥，得到标题化合物(391mg，理论值的75％，95％纯度)，根据HNMR含有一些溶剂。

LC-MS(方法8)：R_t＝0.65min；MS(ESIpos)：m/z＝516[M+H]⁺

手性HPLC(方法10)：R_t＝7.76min

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：12.83(br s,1H),8.60(t,1H),8.40(d,1H),7.86(dd,1H),7.52(d,1H),7.39(dd,1H),7.33(t,1H),7.16(d,1H),5.70(d,1H),4.32-4.26(m,1H),4.05-4.00(m,1H),3.59-3.51(m,2H),3.49-3.36(m,2H),2.91-2.81(m,2H),2.47-2.37(m,1H),1.97-1.87(m,1H),1.06(t,3H)。

中间体20

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸甲酯(620mg，95％纯度，1.11mmol，参考物7)在THF(2.4ml)中的溶液中，加入氢氧化锂水溶液(11ml，1.0M，11mmol)，并将混合物在室温下搅拌2h。THF蒸发后，将含水混合物用1M盐酸缓慢酸化，直到pH值达到1。将所得混合物用乙酸乙酯萃取两次，并将合并的有机相用硫酸钠进行干燥，浓缩并在真空中干燥，得到标题化合物(570mg，理论值的99％，100％纯度，根据NMR含有一些溶剂)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.21min；MS(ESIpos)：m/z＝516[M+H]⁺

手性HPLC(方法10)：R_t＝6.31min

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：12.90(br s,1H),8.61(t,1H),8.40(d,1H),7.87(dd,1H),7.54(d,1H),7.40(d,1H),7.33(t,1H),7.17(d,1H),5.71(br s,1H),4.29(br t,1H),4.06-3.99(m,1H),3.61-3.50(m,2H),3.49-3.44(m,1H),3.44-3.37(m,1H),2.94-2.80(m,2H),2.48-2.40(m,1H),1.97-1.91(m,1H),1.07(t,3H)。

参考化合物

参考物1

5-氯-N-[(2S)-2-({[2-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}氨基)-3-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-氧代丙基]噻吩-2-甲酰胺盐酸盐

制备参见Journal of Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物15。

参考物2

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-{[2-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}-S-丙氨酸2-(二甲氨基)乙基酯盐酸盐

向3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-{[2-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}-S-丙氨酸(150mg，0.31mmol，制备参见Journal of Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物51)在THF(1.5ml)中的溶液中，加入HBTU(140mg，0.37mmol，CAS-RN94790-37-1)、DIPEA(0.16ml，0.93mmol)和2-(二甲基氨基)乙醇(37μl，370μmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。然后，将混合物通过旋转蒸发器进行浓缩，将残余物溶于乙腈/水中，并通过制备型HPLC用加入到流动相中的TFA(方法5)进行纯化。在冻干后，获得含有TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，首先将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并将溶液与氯离子交换树脂(2.0g amberlite IRA405Cl)搅拌1小时。然后，将溶液通过制备型HPLC用加入到流动相中的氯化氢(方法6)进行纯化，得到第一批标题化合物(96mg，理论值的52％，100％纯度)和第二批标题化合物(6mg，理论值的3％，94％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝0.99min；MS(ESIpos)：m/z＝557[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：10.28(br s,1H),8.92(t,1H),8.74(d,1H),7.81(d,1H),7.66(d,1H),7.48(d,1H),7.37(t,1H),7.19(d,1H),4.24-4.18(m,1H),4.16-4.08(m,2H),3.68-5.57(m,3H),3.52-3.45(m,1H),3.23(m,2H),2.75(d,3H),2.73(d,3H),2.45(t,2H),2.39(s,3H),2.18-2.11(m,2H)。

IC：6.0重量％氯化物，<1重量％TFA

参考物3

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-{[2-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}-S-丙氨酸1-甲基哌啶-4-基酯盐酸盐

向3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-{[2-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}-S-丙氨酸(150mg，0.31mmol，制备参见Journal of Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物51)在THF(1.5ml)中的溶液中，加入TBTU(119mg，0.37mmol，CAS-RN125700-67-6)、DIPEA(0.16ml，0.93mmol)和N-甲基-4-哌啶醇(44μl，370μmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。然后，将混合物通过制备型HPLC用加入到流动相中的氯化氢(方法6)进行纯化，得到标题化合物(28mg，理论值的14％，100％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.00min；MS(ESIpos)：m/z＝583[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：10.28(br s,1H),8.86和8.81(2 x t,1H),8.75和8.74(2 x d,1H),7.83和7.81(2 x d,1H),7.62和7.58(2 x d,1H),7.49-7.45(m,1H),7.39-7.34(m,1H),7.19-7.17(m,1H),4.83-4.78和4.65-4.59(2 x m,1H),4.14-4.08和4.04-3.98(2 x m,1H),3.66-3.13(3 x m,6H,部分遮蔽),3.03-2.89(m,2H),2.69-2.65(m,3H),2.47-2.41(m,2H),2.37(s,3H),2.18-2.11(m,2H),1.97-1.73(2 x m,2H),1.67-1.50(m,2H)。

IC：5.6重量％氯化物

参考物4

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-{[2-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}-S-丙氨酸甲酯

制备参见Journal of Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物50。

参考物5

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸甲酯

向2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰氯(5.15g，17.90mmol，中间体7)在DCM(215ml)中的混合物中，加入甲基-3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-S-丙氨酸酯盐酸盐(5.89g，19.7mmol，制备参见Journal of Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物49)和三乙胺(5.0ml，35.8mmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。然后，将混合物进行浓缩，并将残余物通过快速色谱法(Biotage Isolera，100g SNAP-Ultra硅胶，DCM/甲醇梯度)进行纯化。将合并的产物级分进行浓缩并在真空中干燥，得到第一批标题化合物(8.35g，理论值的86％，95％纯度)和第二批标题化合物(830mg，理论值的9％，100％纯度)。

LC-MS(方法8)：R_t＝0.85min；MS(ESIpos)：m/z＝514[M+H]⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：8.68(t,1H),8.63(d,1H),7.81(dd,1H),7.54(d,1H),7.45(dd,1H),7.37(t,1H),7.18(d,1H),4.12-4.00(m,1H),3.73-3.49(m,3H),3.46-3.35(m,4H),2.98-2.74(m,2H),2.43(t,2H),2.19-2.08(m,2H),1.08(t,3H)。

参考物6

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸甲酯

向2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰氯(1.11g，3.66mmol，中间体10)在DCM(45ml)中的混合物中，加入甲基-3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-S-丙氨酸酯盐酸盐(1.64g，5.50mmol，制备参见Journal of Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物49)和三乙胺(1.0ml，7.32mmol)，并将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物进行浓缩，将残余物吸附在Isolute上，并通过快速色谱法(Biotage Isolera，50gSNAP Ultra硅胶，环己烷/乙酸乙酯/甲醇梯度)进行纯化。将合并的产物级分进行浓缩并在真空中进行干燥，得到标题化合物(892mg，理论值的44％，根据LC-MS的纯度为96％)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.42min；MS(ESIpos)：m/z＝530[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：8.71-8.62(m,2H),7.85-7.80(m,1H),7.54(d,1H),7.46-7.42(m,1H),7.40-7.34(m,1H),7.17(d,1H),5.76-5.74(m,1H),4.34-4.27(m,1H),4.11-4.00(m,1H),3.68-3.34(m,7H),2.95-2.77(m,2H),2.48-2.39(m,1H),2.00-1.88(m,1H),1.07(t,3H)。

参考物7

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸甲酯

向2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰氯(445mg，93％纯度，1.36mmol，中间体11)在DCM(17ml)中的混合物中，加入三乙胺(0.63ml，4.5mmol)和甲基-3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-S-丙氨酸酯盐酸盐(481mg，1.61mmol，制备参见Journalof Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物49)，并将混合物在室温下搅拌15min。加入更多的甲基-3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-S-丙氨酸酯盐酸盐(45mg，0.15mmol)，并将混合物在室温下再搅拌10分钟。然后，加入水并分离各相。将水相用DCM萃取两次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法(硅胶，乙酸乙酯/甲醇梯度)进行纯化。将合并的产物级分进行浓缩并在真空中进行干燥，得到标题化合物(620mg，理论值的82％，根据NMR的纯度为95％)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.40min；MS(ESIpos)：m/z＝530[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：8.65(t,1H),8.61(d,1H),7.83(d,1H),7.54(d,1H),7.44(d,1H),7.38(t,1H),7.17(d,1H),5.71(d,1H),4.33-4.27(m,1H),4.10-4.04(m,1H),3.62-3.48(m,3H),3.45-3.38(m,4H),2.95-2.87(m,1H),2.86-2.77(m,1H),2.47-2.40(m,1H),2.00-1.91(m,1H),1.07(t,3H)。

参考物8

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-{[2-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯

向3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-{[2-甲基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}-S-丙氨酸(150mg，0.31mmol，制备参见Journal of Medicinal Chemistry 2013,56,9441-9456，化合物51)在THF(3.0ml)中的溶液中，加入HBTU(211mg，0.56mmol，CAS-RN94790-37-1)、DIPEA(108μl，0.62mmol)和2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙醇(117mg，0.93mol，CAS-RN18994-70-2)，并将混合物在室温下搅拌过夜。然后，将混合物溶于水/乙腈中，并通过制备型HPLC(方法4)进行纯化。将合并的产物级分进行浓缩，并将残余物冻干。将冻干物溶解在乙酸乙酯中，并将溶液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤数次，用硫酸钠进行干燥并浓缩。将所得残余物在真空中进行干燥，得到标题化合物(31mg，理论值的17％，纯度100％)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.08min；MS(ESIpos)：m/z＝594[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：13.94(br s,1H),8.65(t,1H),8.59(d,1H),7.75(dd,1H),7.58(d,1H),7.54(d,1H),7.48(d,1H),7.44(dd,1H),7.32(t,1H),7.18(d,1H),4.25-4.15(m,2H),4.06-3.99(m,1H),3.74(s,3H),3.66-3.55(m,2H),3.53-3.44(m,1H),3.40-3.30(1H,遮蔽),3.17(t,2H),2.44(t,2H),2.34(s,3H),2.18-2.10(m,2H)。

参考物9

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)乙基酯盐酸盐

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(60mg，120μmol，中间体15)在THF(2.3ml)中的溶液中，加入HBTU(82mg，216μmol，CAS-RN 94790-37-1)、DIPEA(63μl，360μmol)和2-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)乙醇(19mg，150μmol，CAS-RN802027-25-4)，并将混合物在室温下搅拌过夜。然后，将混合物通过旋转蒸发器在30℃的水浴温度下进行浓缩，并将残余物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并通过重力使溶液通过氯离子交换器(1.0g amberlite IRA405Cl树脂，用去离子水调节)十次。然后用去离子水/丙酮冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(64mg，理论值的81％，98％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.11min；MS(ESIpos)：m/z＝608[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.26(br s,1H),8.99(s,1H),8.84(t,1H),8.70(d,1H),7.81(dd,1H),7.60(d,1H),7.45(dd,1H),7.42(s,1H),7.34(t,1H),7.18(d,1H),4.15(t,2H),4.08-4.03(m,1H),3.74(s,3H),3.69-3.57(m,2H),3.57-3.50(m,1H),3.47-3.40(m,1H),2.93-2.78(m,4H),2.43(t,2H),2.17-2.10(m,2H),1.08(t,3H)。

参考物10

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-{[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯基]磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯盐酸盐

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(350mg，0.70mmol，中间体15)在THF(13.6ml)中的溶液中，加入HBTU(478mg，1.26mmol，CAS-RN 94790-37-1)、DIPEA(0.37ml，2.10mmol)和2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙醇(116mg，0.88mmol，95％纯度，CAS-RN 18994-70-2)，并将混合物在室温下搅拌4h。然后，将混合物通过旋转蒸发器在30℃的水浴温度下进行浓缩，并将残余物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并通过重力使溶液通过氯离子交换器(4.67gamberlite IRA405Cl树脂，用去离子水调节)十次。然后用去离子水/丙酮冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(321mg，理论值的90％，99％纯度)。

LC-MS(方法8)：R_t＝0.63min；MS(ESIpos)：m/z＝608[M+H]⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.43(br s,1H),9.00-8.93(m,1H),8.70(d,1H),7.80(dd,1H),7.70-7.66(m,1H),7.58(d,1H),7.53(d,1H),7.44(d,1H),7.32(t,1H),7.18(d,1H),4.28-4.20(m,2H),4.08-4.03(m,1H),3.76(s,3H),3.70-3.57(m,2H),3.54-3.47(m,1H),3.46-3.39(m,1H),3.23(t,2H),2.91-2.83(m,1H),2.83-2.74(m,1H),2.42(t,2H),2.17-2.09(m,2H),1.06(t,3H)。

参考物11

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸3-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)丙基酯盐酸盐

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-[2-乙基-3-(2-氧代吡咯烷-1-基)苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(50.0mg，100μmol，中间体15)在THF(1.9ml)中的溶液中，加入HBTU(68mg，180μmol，CAS-RN 94790-37-1)、DIPEA(52μl，300μmol)和3-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)丙-1-醇(18mg，95％纯度，125μmol，CAS-RN 136609-58-0)，并将混合物在室温下搅拌2h。然后，将混合物通过旋转蒸发器在30℃的水浴温度下进行浓缩，并将残余物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并通过重力使溶液通过氯离子交换器(400mg amberliteIRA405Cl树脂，用去离子水调节)十次。然后用去离子水/丙酮冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(33mg，理论值的49％，97％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.16min；MS(ESIpos)：m/z＝622[M+H]⁺

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.25(br s,1H),8.92(t,1H),8.74(d,1H),7.84(dd,1H),7.65(d,1H),7.58(d,1H),7.54(d,1H),7.45(dd,1H),7.35(t,1H),7.16(d,1H),4.10-4.02(m,1H),3.98-3.92(m,2H),3.72(s,3H),3.69-3.51(m,3H),3.50-3.40(m,1H),2.95-2.79(m,4H),2.42(t,2H),2.17-2.09(m,2H),1.92-1.83(m,2H),1.08(t,3H)。

参考物12

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯盐酸盐

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(60mg，94％纯度，0.11mmol，中间体16)在THF(2.2ml)中的溶液中，加入HBTU(77mg，0.20mmol，CAS-RN94790-37-1)、DIPEA(0.10ml，0.56mmol)和2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙醇(18mg，0.14mmol，CAS-RN 18994-70-2)，并将混合物在室温下搅拌过夜。然后，将混合物通过旋转蒸发器在30℃的水浴温度下进行浓缩，并将残余物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并通过重力使溶液通过氯离子交换器(400mg am-berlite IRA405Cl树脂，用去离子水调节)十次。然后用去离子水冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(33mg，理论值的45％，98％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝0.96min；MS(ESIpos)：m/z＝610[M-HCl+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.27(br s,1H),8.82(t,1H),8.64(d,1H),7.76(d,1H),7.59(d,2H),7.57(d,1H),7.52(d,1H),7.42(d,1H),7.32(t,1H),7.17(d,1H),5.73(br s,1H),4.32(t,1H),4.29-4.17(m,2H),4.06-4.01(m,1H),3.76(s,3H),3.57-3.44(m,3H),3.41-3.35(m,1H),3.20(t,2H),2.47-2.38(m,1H),2.34(s,3H),2.02-1.91(m,1H)。

参考物13

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯盐酸盐

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]-2-甲基苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(60mg，89％纯度，0.11mmol，中间体17)在THF(2.1ml)中的溶液中，加入HBTU(73mg，0.19mmol，CAS-RN94790-37-1)、DIPEA(0.09ml，0.53mmol)和2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙醇(17mg，0.13mmol，CAS-RN 18994-70-2)，并将混合物在室温下搅拌过夜。然后，将混合物通过旋转蒸发器在30℃的水浴温度下进行浓缩，并将残余物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并通过重力将溶液通过氯离子交换器(600mg am-berlite IRA405Cl树脂，用去离子水调节)十次。然后用去离子水冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(45mg，理论值的62％，95％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝0.96min；MS(ESIpos)：m/z＝610[M-HCl+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.35(br s,1H),8.87(t,1H),8.66(d,1H),7.77(d,1H),7.62(d,1H),7.58(d,1H),7.53(d,1H),7.44(d,1H),7.33(t,1H),7.17(d,1H),5.71(br s,1H),4.32(t,1H),4.26-4.17(m,2H),4.09-4.03(m,1H),3.76(s,3H),3.58-3.46(m,3H),3.43-3.38(m,1H),3.21(t,2H),2.48-2.40(m,1H),2.33(s,3H),2.02-1.93(m,1H)。

参考物14

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯盐酸盐

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(120mg，0.23mmol，中间体20)在THF(4.5ml)中的溶液中，加入HBTU(159mg，0.42mmol，CAS-RN 94790-37-1)、DIPEA(0.12ml，0.70mmol)和2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙醇(37mg，0.29mmol，CAS-RN 18994-70-2)，并将混合物在室温下搅拌过夜。然后，将混合物通过旋转蒸发器在30℃的水浴温度下进行浓缩，并将残余物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的产物。为了生成盐酸盐，将含TFA的产物溶解在乙腈/水中，并通过氯离子交换器(1.5g amberlite IRA405Cl树脂，用去离子水调节)将溶液洗脱十次。然后用去离子水冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(95mg，理论值的61％，99％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.02min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.20(s,1H),8.81(br s,1H),8.66(d,1H),7.81(d,1H),7.60(d,1H),7.58(d,1H),7.54(d,1H),7.43(d,1H),7.34(t,1H),7.18(d,1H),4.30(t,1H),4.27-4.21(m,2H),4.06(dd,1H),3.76(s,3H),3.63-3.56(m,1H),3.55-3.47(m,2H),3.46-3.39(m,1H),3.22(t,2H),2.92-2.84(m,1H),2.83-2.75(m,1H),2.48-2.40(m,1H),2.00-1.91(m,1H),1.06(m,3H)

参考物15

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸3-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)丙基酯盐酸盐

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(60mg，0.12mmol，中间体19)在THF(2.3ml)中的溶液中，加入HBTU(79mg，0.21mmol，CAS-RN 94790-37-1)、DIPEA(0.08ml，0.47mmol)和3-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)丙-1-醇(24.5mg，0.17mmol，CAS-RN 136609-58-0)，并将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并通过重力使溶液通过氯离子交换器(880mg am-berlite IRA405Cl树脂，用去离子水调节)十次。然后用去离子水冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(19mg，理论值的22％，90％纯度)。

LC-MS(方法9)：R_t＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝638[M-HCl+H]⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.06(br s,1H),8.80(t,1H),8.72(d,1H),7.85(dd,1H),7.60-7.57(m,2H),7.54(d,1H),7.43(dd,1H),7.37(t,1H),7.16(d,1H),5.75(brs,1H),4.31(t,1H),4.12-4.02(m,1H),3.97(t,2H),3.72(s,3H),3.65-3.53(m,2H),3.51-3.42(m,2H),2.96-2.84(m,4H),2.47-2.40(m,1H),1.99-1.80(m,3H),1.07(t,3H)。

参考物16

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸3-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)丙基酯盐酸盐

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3R)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(60mg，0.12mmol，中间体20)在THF(2.3ml)中的溶液中，加入HBTU(79mg，0.21mmol，CAS-RN 94790-37-1)、DIPEA(0.08ml，0.47mmol)和3-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)丙-1-醇(24.5mg，0.17mmol，CAS-RN 136609-58-0)，并将混合物在室温下搅拌2h。然后将混合物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并通过重力使溶液通过氯离子交换器(500mg am-berlite IRA405Cl树脂，用去离子水调节)十次。然后用去离子水冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(43mg，理论值的49％，90％纯度)。

LC-MS(方法9)：R_t＝0.83min；MS(ESIpos)：m/z＝638[MHCl+H]⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.10(br s,1H),8.84(br s,1H),8.72(d,1H),7.86(dd,1H),7.62-7.57(m,2H),7.55(d,1H),7.44(d,1H),7.37(t,1H),7.16(d,1H),5.75(br s,1H),4.31(t,1H),4.11-4.02(m,1H),4.00-3.91(m,2H),3.72(s,3H),3.63-3.40(m,4H),2.96-2.77(m,4H),2.47-2.40(m,1H),1.99-1.82(m,3H),1.07(t,3H)。

工作实施例

实施例1

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(2.0g，3.88mmol，中间体19)在DCM(20ml)和DMF(4ml)中的溶液中，加入2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙醇(978mg，7.75mmol，CAS-RN 18994-70-2)，并将溶液冷却至0℃。然后，分批加入Oxyma(661mg，4.65mmol，CAS-RN 3849-21-6)，然后加入EDCI(892mg，4.65mmol，CAS-RN 25952-53-8)，并在0℃下搅拌混合物1.5h。将混合物用冰冷水(20ml)洗涤，并在相分离后，将有机相用冰冷水洗涤三次。在第三次洗涤时，加入DCM(10ml)和10％氯化钠水溶液(10mL)用于改善相分离。然后将有机相用硫酸钠进行干燥并浓缩。在真空中干燥后，将残余物通过快速色谱法使用碱性硅胶相(Isolera，KP-NH 28g，DCM/丙酮梯度9:1→1:9)进行纯化。将合并的产物级分进行浓缩，并将残余物在真空中进行干燥，得到标题化合物(1.51g，理论值的62％，100％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.02min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：9.09(t,1H),8.65(d,1H),7.82(dd,1H),7.57(d,1H),7.44(dd,1H),7.38(t,1H),7.17(d,1H),7.03(d,1H),6.74(d,1H),5.75(d,1H),4.34-4.01(m,4H),3.66-3.56(m,1H),3.51(s,3H),3.50-3.39(m,3H),2.94-2.70(m,4H),2.48-2.38(m,1H),2.01-1.87(m,1H),1.06(t,3H)。

IR：见图1

实施例2

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯盐酸盐

可选的合成A

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基]-S-丙氨酸(190mg，0.37mmol，中间体19)在THF(7.2ml)中的溶液中，加入HBTU(251mg，0.66mmol，CAS-RN 94790-37-1)、DIPEA(0.19ml，1.11mmol)和2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙醇(93mg，0.74mmol，CAS-RN 18994-70-2)，并将混合物在室温下搅拌2h。然后，将混合物通过旋转蒸发器在30℃的水浴温度下进行浓缩，并将残余物溶于乙腈/TFA/水中，并通过制备型HPLC(方法2)进行纯化。在冻干后，获得含TFA的批料。为了产生相应的盐酸盐，将含TFA的批料溶解在乙腈/水中，并通过重力使溶液通过氯离子交换器(2.66gamberlite IRA405Cl树脂，用去离子水调节)十次。然后用去离子水冲洗树脂，并将溶液冻干，得到标题化合物(122mg，理论值的49％，98％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.01min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.30(br s,1H),8.88(t,1H),8.69(d,1H),7.81(d,1H),7.63(d,1H),7.57(d,1H),7.53(d,1H),7.43(d,1H),7.33(t,1H),7.18(d,1H),5.74(br s,1H),4.30(t,1H),4.29-4.19(m,2H),4.05(dd,1H),3.77(s,3H),3.63-3.56(m,1H),3.54-3.39(m,3H),3.22(t,2H),2.90-2.76(m,2H),2.48-2.40(m,1H),2.00-1.87(m,1H),1.05(t,3H)。

IC：4.6重量％氯化物，<1重量％TFA

可选的合成B

向3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(2.31g，3.70mmol，实施例1)在DCM(3.5ml)中的溶液中，滴加——同时剧烈搅拌并用冰浴冷却——1M氯化氢在乙醚(4.07ml，4.07mmol)中的溶液，然后加入更多的乙醚(70ml)用于改善搅拌性。在冷却下搅拌10分钟以及在室温下搅拌15分钟后，将沉淀物滤出并用乙醚(100ml)进行洗涤。然后，借助于短暂的超声波处理将沉淀物再次溶解在冰冷水(20ml)中，并将溶液冻干。为了除去痕量的乙醚，重复进行冻干，得到标题化合物(2.06g，理论值的84％，99％纯度)。

LC-MS(方法7)：R_t＝0.99min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

手性HPLC(方法11)：R_t＝9.10min

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.42(br s,1H),8.98(t,1H),8.75(d,1H),7.80(dd,1H),7.68(d,1H),7.58(d,1H),7.54(d,1H),7.43(d,1H),7.33(t,1H),7.19(d,1H),5.80(br s,1H),4.31(t,1H),4.29-4.19(m,2H),4.08-4.01(m,1H),3.77(s,3H),3.63-3.56(m,1H),3.54-3.39(m,3H),3.23(t,2H),2.90-2.73(m,2H),2.48-2.40(m,1H),2.00-1.87(m,1H),1.05(t,3H)。

IC：4.7重量％氯化物

可选的合成C

在60℃下，在搅拌下，向乙酸乙酯(2.0ml)中加入3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(30mg，48.1mmol，实施例1)。将溶液冷却至室温，加入1M盐酸(50.2mg，49.22mmol)，并将混合物在加盖玻璃小瓶中在室温下搅拌2天。然后，用Parafilm胶带代替盖子，用针在胶带上打2-5个孔，并将混合物在室温下再轻轻搅拌10天，使溶剂缓慢蒸发。获得呈固体的标题化合物。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：14.40(br s,1H),8.97(t,1H),8.74(d,1H),7.80(d,1H),7.67(d,1H),7.58(d,1H),7.54(d,1H),7.43(d,1H),7.33(t,1H),7.19(d,1H),5.75(br s,1H),4.31(t,1H),4.28-4.19(m,2H),4.08-4.00(m,1H),3.77(s,3H),3.63-3.56(m,1H),3.54-3.39(m,3H),3.23(t,2H),2.90-2.74(m,2H),2.48-2.41(m,1H),1.98-1.92(m,1H),1.05(t,3H)。

XRPD：无定形；IR：见图2

实施例3

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯硫酸盐

在60℃下，在搅拌下，向乙酸乙酯(2.0ml)中加入3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(30mg，48.1mmol，实施例1)。将溶液冷却至室温，加入0.5M硫酸(100.6mg，47.90mmol)，并将混合物在加盖玻璃小瓶中在室温下搅拌2天。然后，用Parafilm胶带代替盖子，用针在胶带上打2-5个孔，并将混合物在室温下再轻轻搅拌10天，使溶剂缓慢蒸发。获得呈固体的标题化合物。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：13.94(br s,1H),8.70(t,1H),8.64(d,1H),7.80(d,1H),7.62-7.56(m,1H),7.55(d,1H),7.52(d,1H),7.43(d,1H),7.34(t,1H),7.21-7.17(m,1H),4.36-4.27(m,1H),4.27-4.17(m,2H),4.11-3.97(m,1H),3.76(s,3H),3.64-3.55(m,1H),3.55-3.34(m,3H),3.21(t,2H),2.91-2.75(m,2H),2.49-2.41(m,1H),2.01-1.92(m,1H),1.06(t,3H)。

XRPD：无定形；IR：见图3

实施例4

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯甲磺酸盐

在60℃下，在搅拌下，向乙酸乙酯(2.0ml)中加入3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(30mg，48.1mmol，实施例1)。将溶液冷却至室温，加入甲磺酸(4.9mg，51.0mmol)，并将混合物在加盖玻璃小瓶中在室温下搅拌2天。然后，用Parafilm胶带代替盖子，用针在胶带上打2-5个孔，并将混合物在室温下再轻轻搅拌10天，使溶剂缓慢蒸发。获得呈固体的标题化合物。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.02min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：13.97(br s,1H),8.72(t,1H),8.65(d,1H),7.80(d,1H),7.59(s,1H),7.55(d,1H),7.53(d,1H),7.43(d,1H),7.34(t,1H),7.19(d,1H),5.75(br s,1H),4.31(t,1H),4.27-4.18(m,2H),4.09-3.98(m,1H),3.76(s,3H),3.63-3.57(m,1H),3.55-3.36(m,3H),3.21(br t,2H),2.91-2.74(m,2H),2.48-2.41(m,1H),2.34(s,3H),1.98-1.88(m,1H),1.06(t,3H)。

XRPD：无定形；IR：见图4

实施例5

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯4-甲基苯磺酸盐

在60℃下，在搅拌下，向乙酸乙酯(2.0ml)中加入3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(30mg，48.1mmol，实施例1)。将溶液冷却至室温，加入4-甲苯磺酸(9.6mg，55.7mmol)，并将混合物在加盖玻璃小瓶中在室温下搅拌2天。然后，用Parafilm胶带代替盖子，用针在胶带上打2-5个孔，并将混合物在室温下再轻轻搅拌10天，使溶剂缓慢蒸发。获得呈固体的标题化合物。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.02min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺且R_t＝0.57min,MS(ESIneg)：m/z＝171[M-H]^-

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：13.92(br s,1H),8.69(br t,1H),8.64(d,1H),7.80(d,1H),7.60-7.56(m,1H),7.55(d,1H),7.52(d,1H),7.48(d,2H),7.43(d,1H),7.36-7.31(m,1H),7.21-7.16(m,1H),7.11(d,2H),4.35-4.28(m,1H),4.27-4.17(m,2H),4.07-4.00(m,1H),3.76(s,3H),3.63-3.56(m,1H),3.54-3.36(m,3H),3.20(br t,2H),2.91-2.75(m,2H),2.48-2.41(m,1H),2.29(s,3H),2.02-1.92(m,1H),1.09-1.03(m,3H)。

XRPD：无定形；IR：见图5

实施例6

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯马来酸盐

在60℃下，在搅拌下，向乙酸乙酯(2.0ml)中加入3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(30mg，48.1mmol，实施例1)。将溶液冷却至室温，加入马来酸(5.8mg，50.0mmol)，并将混合物在加盖玻璃小瓶中在室温下搅拌2天。然后，用Parafilm胶带代替盖子，用针在胶带上打2-5个孔，并将混合物在室温下再轻轻搅拌10天，使溶剂缓慢蒸发。获得呈固体的标题化合物。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：8.75(br t,1H),8.65(br d,1H),7.80(d,1H),7.52(d,1H),7.50(d,1H),7.45-7.40(m,2H),7.38-7.32(m,1H),7.19(d,1H),6.07(s,2H),5.76(br s,1H),4.31(t,1H),4.23(br t,2H),4.09-3.99(m,1H),3.72(s,3H),3.65-3.56(m,1H),3.52-3.37(m,3H),3.13(br t,2H),2.91-2.75(m,2H),2.48-2.41(m,1H),1.97-1.90(m,1H),1.06(t,3H)。

XRPD：无定形；IR：见图6

实施例7

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯磷酸盐

在60℃下，在搅拌下，向乙酸乙酯(2.0ml)中加入3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(30mg，48.1mmol，实施例1)。将溶液冷却至室温，加入1M磷酸(48.7mg，46.38mmol)，并将混合物在加盖玻璃小瓶中在室温下搅拌2天。然后，用Parafilm胶带代替盖子，用针在胶带上打2-5个孔，并将混合物在室温下再轻轻搅拌10天，使溶剂缓慢蒸发。获得呈固体的标题化合物。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：9.10(t,1H),8.79-8.58(br m,1H),7.82(d,1H),7.57(d,1H),7.47-7.40(m,1H),7.40-7.35(m,1H),7.17(d,1H),7.08(s,1H),6.82(s,1H),4.30(t,1H),4.25-4.11(m,2H),4.09-4.04(m,1H),3.65-3.57(m,1H),3.54(s,3H),3.51-3.37(m,3H),2.93-2.77(m,4H),2.47-2.39(m,1H),1.97-1.90(m,1H),1.06(t,3H)。

XRPD：无定形；IR：见图7

实施例8

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(2R,3R)-酒石酸盐

在60℃下，在搅拌下，向乙酸乙酯(2.0ml)中加入3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(30mg，48.1mmol，实施例1)。将溶液冷却至室温，加入(2R,3R)-酒石酸(7.4mg，49.3mmol)，并将混合物在加盖玻璃小瓶中在室温下搅拌2天。然后，用Parafilm胶带代替盖子，用针在胶带上打2-5个孔，并将混合物在室温下再轻轻搅拌10天，使溶剂缓慢蒸发。获得呈固体的标题化合物。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.03min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：9.09(br t,1H),8.67(br s,1H),7.82(d,1H),7.57(d,1H),7.44(d,1H),7.38(t,1H),7.17(d,1H),7.06(s,1H),6.78(s,1H),4.30(t,1H),4.25-4.22(m,2H),4.22-4.10(m,2H),4.06-4.00(m,1H),3.53(s,3H),3.50-3.38(m,3H),2.92-2.74(m,4H),2.47-2.40(m,1H),1.98-1.90(m,1H),1.06(t,3H)。

XRPD：无定形；IR：见图8

实施例9

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯柠檬酸盐

在60℃下，在搅拌下，向乙酸乙酯(10.0ml)中加入3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(100mg，160.2mmol，实施例1)。将溶液冷却至室温，并在室温下加入柠檬酸(31mg，161.4mmol)在乙酸乙酯(8ml)中的溶液，产生白色固体的沉淀。将混合物在加盖玻璃小瓶中在室温下搅拌5天，之后将沉淀物滤出并在空气中干燥，得到呈固体的标题化合物。

LC-MS(方法7)：R_t＝1.02min；MS(ESIpos)：m/z＝624[M+H]⁺

¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ[ppm]：9.01(t,1H),8.66(d,1H),7.82(dd,1H),7.56(d,1H),7.44(dd,1H),7.37(t,1H),7.17(d,1H),7.15(d,1H),6.91(s,1H),4.30(t,1H),4.25-4.11(m,2H),4.07-4.01(m,1H),3.65-3.58(m,1H),3.57(s,3H),3.50-3.40(m,3H),2.92-2.79(m,4H),2.70(d,2H),2.61(d,2H),2.48-2.40(m,1H),1.98-1.90(m,1H),1.06(t,3H)。

XRPD：无定形；IR：见图9

表1：实施例1和盐形式(实施例2至9)的红外光谱带最大值(cm^-1)

带最大值(cm^-1)

B)生理功效的评估

本发明化合物用于治疗血栓栓塞性病症的适用性可在以下测定体系中证明：

a)试验说明(体外)

a.1)在缓冲液中Xa因子抑制的测量

为了测定上列物质的Xa因子抑制，构建了生物试验系统，其中使用Xa因子底物的转化来测定人Xa因子的酶活性。此处，Xa因子从肽底物上裂解氨基甲基香豆素，其通过荧光测量。在微量滴定板中进行测定。

将待测物质以不同浓度溶解在二甲基亚砜中，并与人Xa因子(1.3nmol/l，溶于50mmol/l的Tris缓冲液[C,C,C-三(羟甲基)氨基甲烷]、100mmol/l的氯化钠、5mmol/l的氯化钙、0.1％BSA[牛血清白蛋白]、pH 7.4)在22℃下培养30min。然后加入底物(Bachem的5μmol/l Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC)。培养30分钟后，在360nm的波长下激发样品，并在460nm下测量发射量。将含有试验物质的试验批次的所测发射量与没有试验物质的对照批次(仅是二甲基亚砜，而不是试验物质在二甲基亚砜中)进行比较，并由浓度/活性关系计算IC₅₀值。该试验的代表性活性数据列于下表2a和2b中。

a.2)缓冲液中凝血酶抑制的测量

为了测定上列物质的凝血酶抑制，构建了生物试验系统，其中使用凝血酶底物的转化来测定人凝血酶的酶活性。此处，凝血酶从肽底物上裂解氨基甲基香豆素，其通过荧光测量。在微量滴定板中进行测定。

将待测物质以不同浓度溶解在二甲基亚砜中，并与人凝血酶(0.06nmol/l，溶于50mmol/l的Tris缓冲液[C,C,C-三(羟甲基)氨基甲烷]、100mmol/l的氯化钠、0.1％BSA[牛血清白蛋白]、pH 7.4)在22℃下培养15min。然后加入底物(Bachem的5μmol/l Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-AMC)。培养30分钟后，在360nm的波长下激发样品，并在460nm下测量发射量。将含有试验物质的试验批次的所测发射量与没有试验物质的对照批次(仅是二甲基亚砜，而不是试验物质在二甲基亚砜中)进行比较，并由浓度/活性关系计算IC₅₀值。该试验的代表性活性数据列于下表2a和2b中。

a.3)选择性的测定

为了证明物质对凝血酶和Xa因子抑制的选择性，检查试验物质对其他人丝氨酸蛋白酶(如XIa因子、胰蛋白酶、纤溶酶、组织纤溶酶原活化剂(TPA)和血浆激肽释放酶)的抑制。在微量滴定板中进行测定。为了测定XIa因子(0.15nmol/l，Kordia)、胰蛋白酶(42mU/ml，Sigma)、纤溶酶(0.1μg/ml，Kordia)、TPA(1nmol/l，Kordia)和血浆激肽释放酶(0.2nmol/l，Loxo)的酶活性，将这些酶溶解(50mmol/l的Tris缓冲液[C,C,C-三(羟甲基)氨基甲烷]、100mmol/l的氯化钠、0.1％BSA[牛血清白蛋白]，5mmol/l的氯化钙，pH 7.4)，并与在二甲基亚砜中的各种浓度的试验物质以及与不含试验物质的二甲基亚砜培养15分钟。然后通过添加适当的底物(5μmol/l的Bachem的Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMC用于XIa因子，5μmol/l的Bachelm的Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-AMC用于胰蛋白酶，50μmol/l的Bachelm的MeOSuc-Ala-Phe-Lys-AMC用于纤溶酶，5μmol/l的Pentapharm的CH3SO2-D-Phe-Gly-Arg-AMC用于TPA以及5μmol/l的Bachem的H-Pro-Phe-Arg-AMC用于血浆激肽释放酶)来开始酶促反应。在22℃下培养30分钟后，测量荧光(激发：360nm，发射：460nm)。将含有试验物质的试验批次的所测发射量与没有试验物质的对照批次(仅是二甲基亚砜，而不是试验物质在二甲基亚砜中)进行比较，并由浓度/活性关系计算IC₅₀值。该试验的代表性活性数据列于下表2a和2b中。

表2a：

将值四舍五入至两位有效数字。

表2b：

n.d.：未检出

将值四舍五入至两位有效数字。

a.4)血浆样品中潜在抑制剂的Xa因子抑制活性的测定

为了测定血浆样品中Xa因子的抑制，将存在于血浆中的X因子通过来自响尾蛇毒素的蛋白酶激活。然后通过添加显色底物来测量Xa因子活性或潜在抑制剂对其的抑制。

将不同浓度的待测物质溶解在二甲基亚砜中，并与refludan水溶液(10μg/ml)混合。在具有平底的透明96孔板中，将30μl柠檬酸盐血浆(Octapharma)与10μl物质稀释液混合。然后，加入20μl的响尾蛇毒素(喹蛇毒液(Russel viper venom(RVV))；RVV试剂：Pentapharm121-06，最终浓度0.6mU)在氯化钙水溶液缓冲液(氯化钙的最终浓度0.05M)中的溶液或20μl的不含RVV试剂的氯化钙水溶液(氯化钙的最终浓度0.05M)(作为未经刺激样品的参照物)。在加入20μl的ChromozymX底物(最终浓度1.6mmol/l，Bachem L-1565，在水中稀释)后，在SpectraFluor读数仪中使用405nm的测量滤光片在20分钟的时间内每分钟测量样品。当达到最大信号的约70％(约12min)时，确定IC₅₀值。这些试验的代表性活性数据列于下表3a和3b中。

a.5)血浆样品中潜在抑制剂的凝血酶抑制活性的测定

将不同浓度的待测物质溶解在二甲基亚砜中并用水稀释。在具有平底的白色96孔板中，将20μl物质稀释液与20μl在Ca缓冲液(200mM Hepes+560mM氯化钠+10mM氯化钙+0.4％PEG)中的蛇静脉酶(ecarin)溶液(蛇静脉酶试剂，Sigma E-0504，每批次最终浓度20mU)或20μl钙缓冲液(作为未刺激的对照)混合。此外，加入20μl荧光凝血酶底物(BachemI-1120，最终浓度50μmol/l)和20μl柠檬酸盐血浆(Octapharma)并彻底均质化。在SpectraFluorplus读数仪中使用360nm的激发滤光片和465nm的发射滤光片在20分钟的时间内每分钟对板进行测量。当达到最大信号的约70％(约12min)时，确定IC₅₀值。这些试验的代表性活性数据列于下表3a和3b中。

表3a：

将值四舍五入至两位有效数字。

表3b：

将值四舍五入至两位有效数字。

a.6)凝血酶生成试验(凝血酶曲线(thrombogram))

以人血浆(Octapharma的)在体外测定试验物质对凝血酶曲线的影响(根据Hemker的凝血酶生成试验)。在根据Hemker的凝血酶生成试验中，通过测量底物I-1140(Z-Gly-Gly-Arg-AMC，Bachem)的荧光裂解产物来测定凝血血浆中凝血酶的活性。使用Thrombinoscope的试剂(PPP试剂：30pM重组组织因子，24μM的磷脂在HEPES中)以开始凝血反应。反应在不同浓度的试验物质或相应溶剂的存在下进行。此外，使用Thrombinoscope的凝血酶校准物，其酰胺分解(amidolytic)活性是计算血浆样品中凝血酶活性所必需的。

根据制造商(Thrombinoscope BV)的说明书进行试验：将4μl试验物质或溶剂、76μl血浆和20μl PPP试剂或凝血酶校准物在37℃下培养5分钟。加入20μl的2.5mM的凝血酶底物在20mM Hepes、60mg/ml的BSA、102mM氯化钙中的溶液后，在120分钟内每20s测量一次凝血酶生成。使用Thermo Electron的配备有390/460nm滤光片对和分配器的荧光计(Fluoroskan Ascent)进行测量。使用Thrombinoscope软件，计算凝血酶曲线并以图形方式显示。计算以下参数：滞后时间、达到峰值的时间、峰值、ETP(内源性凝血酶潜能)和拖尾时间(start tail)。

a.7)抗凝活性的测定

以人血浆、兔血浆和大鼠血浆体外测定试验物质的抗凝活性。为此，使用0.11摩尔柠檬酸钠溶液作为接收器，以1/9的柠檬酸钠/血液的混合比例抽取血液。取出血液后立即将其彻底混合，并以约4000g离心15分钟。用移液器吸出上清液。

使用商业试验试剂盒(Boehringer Mannheim的或Instrumentation Laboratory的RecombiPlastin)在不同浓度的试验物质或相应溶剂的存在下测定凝血酶原时间(PT，同义词：凝血活酶时间，快速试验)。将试验化合物与血浆在37℃下培养3分钟。然后通过加入凝血活酶开始凝血，并测定凝血发生的时间。测定使凝血酶原时间加倍的试验物质的浓度。

使用商业试验试剂盒(Roche的凝血酶试剂)在不同浓度的试验物质或相应溶剂的存在下测定凝血酶时间(TT)。将试验化合物与血浆在37℃下培养3分钟。然后通过加入凝血酶试剂开始凝血，并测定凝血发生的时间。测定使凝血酶时间加倍的试验物质的浓度。

使用商业试验试剂盒(Roche的PTT试剂)在不同浓度的试验物质或相应溶剂的存在下测定活化部分凝血活酶时间(APTT)。将试验化合物与血浆和PTT试剂(脑磷脂、高岭土)在37℃下培养3分钟。然后通过加入25mM氯化钙开始凝血，并测定凝血发生的时间。测定使APTT加倍的试验物质的浓度。

a.8)血栓弹力成像(thromboelastography)(血栓弹力图(thromboelastogram))

借助Pentapharm的血栓弹力成像ROTEM及其配件、杯和针来进行血栓弹力成像。在事先抽取到Sarstedt的柠檬酸钠采血管(monovette)中的全血中进行测量。使用摇动器使采血管中的血液保持运动，并在37℃下预培养30min。制备2摩尔氯化钙在水中的储液。将其用0.9％浓度的氯化钠水溶液以1:10进行稀释。为了进行测量，首先将20μl的这种200mM的氯化钙溶液装入杯中(氯化钙的最终浓度为12.5mM)。加入3.2μl的物质或溶剂。通过加入300μl全血开始测量。加入后，使用移液器的尖端，将混合物短暂地吸入移液器中并在不产生气泡的情况下再次释放。测量进行2.5小时，或者在纤维蛋白溶解开始时停止。为了评估，测定以下参数：CT(凝血时间/[sec.])、CFT(凝块形成时间/[sec.])，MCF(最大凝块硬度/[mm])和α角[°]。测量点每3秒测定一次，并用图形表示，其中y轴表示MCF[mm]，x轴表示时间[sec.]。

a.9)正在进行的凝血的抑制

将试验化合物溶解为10mM的在DMSO中的储液，并用DMSO制备0.018至600μM之间的连续稀释液。

向白色384孔板(Lumitrac 200,Greiner)中加入20μl Octaplas(Octapharm)、10μl蒸馏水、10μl Pefabloc FG(DSM，24mM)和10μl荧光凝血酶底物(BACHEM，I-1560，300μM)。为了引发凝血，加入10μl组织因子(Instrumentation Laboratory,Recombiplastin 2G,0.06％)和CaCl₂(40mM)的混合物。在37℃及340nm激发和460nm发射波长下，用Tecaninfinite M1000Pro每30秒测量一次底物裂解所产生的荧光信号，持续20分钟。荧光信号加倍后，将1μl的化合物在DMSO中的溶液加入到每个孔中，并继续测量。试验化合物是否能抑制正在进行的凝血取决于加入化合物后荧光信号的斜率。

a.10)组织因子引发的血小板聚集的抑制

通过静脉穿刺从健康的男性和女性身上采集全血。将样品放入含有1/10体积的3.12％柠檬酸三钠的真空采血管中，并通过立即将血液在20℃下以140g离心20分钟，获得富含血小板的血浆(PRP)。

为了调整血小板计数，用贫血小板血浆将PRP稀释至300000-350000血小板/μl。通过将PRP在20℃下以1000g离心20分钟来获得贫血小板血浆。将Pefabloc FG(Pentapharm,Basel,瑞士)溶于软化水中(2mg/ml；最终浓度)并加入以防止纤维蛋白聚合。加入CaCl₂(7mmol/l，最终浓度)后，立即将等分试样(178μl)放入凝集计(Apact 4，DiaSys Greiner，Flacht，德国)。向样品中掺入2μl浓度递增的试验化合物(血浆浓度0.3-10μmol/l)或载体，并在37℃下培养3分钟。通过加入20ml的溶解在10mmol/l CaCl₂的水溶液中的组织因子(RecombiPlasTin 2G；Instrumenta-tion Laboratory)来引发血小板聚集(根据制造商的说明)。使用单个组织因子浓度(用10mmol/l CaCl₂溶液稀释1:10-1:2500)以实现各实验的最小组织因子浓度，从而产生最大聚集。通过比浊法测量聚集，记录10分钟，并以浓度-时间曲线下的面积评估聚集反应。使用Boltzmann检验(GraphPad Prism)计算IC₅₀值。

a.11)LPS或热灭活金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)诱发的全血凝固的 抑制

将热灭活金黄色葡萄球菌(InvivoGen)的10¹⁰个细胞溶解在1ml水中，并通过在0.9％NaCl水溶液中稀释来制备含有10⁹至10⁶个细胞的溶液。将脂多糖(LPS，Sigma)溶于0.9％NaCl水溶液中以产生0.005mg/ml的溶液。

通过静脉穿刺将新鲜的全血从健康男性和女性身上采集到含有1/10体积的3.12％柠檬酸三钠的真空采血管中。将10μl的试验化合物(0-20μM，最终浓度)在DMSO的溶液和10μl含有热灭活金黄色葡萄球菌或LPS的触发溶液加入到980μl的含柠檬酸盐的全血中，轻轻混合并在37℃下培养4小时。

将150μl混合物和20μl的0.1M氯化钙溶液加入比色皿中以开始凝血时间测量(Apact 4,DiaSys Greiner,Flacht,德国)。比较对照样品和不同浓度的化合物样品的凝血时间，以使用GraphPad Prism计算凝血时间加倍所需的浓度。

a.12)在凝血酶存在下对内皮层完整性的影响

将补充有人重组表皮生长因子(hEGF)、人碱性成纤维细胞生长因子与肝素(hFGF-B)、血管内皮生长因子(VEGF)、抗坏血酸、氢化可的松、人重组胰岛素样生长因子(长R3-IGF-1)、肝素、GA-1000和2％胎牛血清(FBS)的50μl的内皮细胞基础培养基-2(EBM-2)填充到E-Plate96(OLS Omni Life，德国)的各个孔中，然后将其放置在ACEA-Xcel-ligenceRTCA仪器(Agilent，美国)上以测量培养基的背景阻抗。

使冷冻保存的汇集的人脐静脉内皮细胞(HUVEC；Lonza,德国；C2519a)在补充有人重组表皮生长因子(hEGF)、人碱性成纤维细胞生长因子与肝素(hFGF-B)、血管内皮生长因子(VEGF)、抗坏血酸、氢化可的松、人重组胰岛素样生长因子(长R3-IGF-1)、肝素、GA-1000和2％胎牛血清(FBS)的内皮细胞基础培养基-2(EBM-2)中繁殖和维持。在37℃下、在含5％CO₂的加湿空气中培养细胞。

将50μl含有20000个第3代细胞的培养基加入各个孔中。将板在Xcelligence RTCA仪器的培养箱中在37℃和5％CO₂下保持24小时。然后，将10μl的试验化合物在DMSO中的溶液或单独的DMSO加入到各个孔中，并在30分钟内每5分钟测量一次阻抗。随后，加入40μl的凝血酶溶液(最终浓度0.1U/ml)，并每5分钟再测量一次阻抗，持续190分钟。

细胞粘附的强度由RTCA软件表示为细胞指数，并使用Graphpad Prism在不同化合物浓度与空白实验之间进行比较。

b)抗血栓活性的测定(体内)

b.1)动静脉分流和出血模型(组合模型兔)

将重量为2700-3500g的雄兔(新西兰白兔；Crl:KBL(NZW)用2％赛拉嗪(Xylazin)(Rompun，Bayer Vital)和100mg/ml氯胺酮(Ketamine)(Ketaset，Zoetis)麻醉。根据Christopher N.Berry等人,Br.J.Pharmacol.(1994),113,1209-1214所述的方法，在动静脉分流管中引发血栓形成。为此，解剖左面静脉和右颈动脉。使用10cm聚乙烯管的体外分流管连接两个血管。将该管放置在另一个4cm长的聚乙烯管(PE 240)中，其包含6cm尼龙线(直径0.14mm)，该尼龙线已经用砂纸粗糙化并且已折叠形成3cm的环。该线提供了诱发凝血所必需的血栓形成表面。在移除分流管之前，将体外循环维持15分钟，并将尼龙线与血栓一起称重。在实验前测定尼龙线的皮重。为了确定出血时间，用无菌手术刀在耳周静脉旁切0.5cm。每30s，用滤纸擦拭血液，直到出血停止。在打开动静脉分流管之前30分钟，经由股静脉以连续静脉输注的方式给予试验化合物。

b.2)内毒素血症模型中功效的测定(体内)

b.2.1)LPS诱发的内毒素血症兔模型

该实验在经麻醉的雄兔(新西兰白兔)中进行。通过肌内注射5mg/kg的2％赛拉嗪(Rompun，Bayer Vital)和40mg/kg的100mg/ml氯胺酮(Ketavet，Pfizer)，然后连续输注2％赛拉嗪(Rompun，Bayer Vital)和100mg/ml氯胺酮(Ketave，Pfizer)诱发麻醉。

为了诱发内毒素血症，经由左股静脉连续输注100μg/kg/h来自大肠杆菌(E.coli)的脂多糖(LPS 055:B5；Sigma-Aldrich；LOT 025M4040V)，持续8h。经由右股静脉连续输注试验化合物。为了连续测量血液动力学参数，例如心率和动脉血压，将微尖压力导管(SPR-595；Millar In-struments)植入左股动脉。经由右股动脉每小时采集一次动脉血样，持续8h。从全血样本中获得的读出参数包括血细胞计数(血小板、白细胞、红细胞)、凝血参数(PT、aPTT)和旋转血栓弹力成像(ROTEM)。由一部分的全血产生血浆，以确定炎症的标志物(IL-6、TNF-α)、纤维蛋白原水平和终末器官损伤的生物标志物，如血清肌酐或肝酶如ALT和AST。

b.2.2)通过输注热灭活金黄色葡萄球菌诱发的败血症的狒狒模型

动物在手术前禁食12小时，并随意饮水。每只动物都通过其唯一的纹身编号来识别。实验前对动物进行称重，以计算麻醉剂和菌血症刺激的适当剂量。

首先用盐酸氯胺酮(14-20mg/kg/IM)使动物镇静，然后以每30min或通过监测眼睑和脚趾捏压反射在认为有必要维持麻醉的情况下给予戊巴比妥钠(25mg/kg/IV)进行麻醉。持续监测麻醉的动物，并在手术期间提供适当水平的麻醉剂和生命支持。在麻醉期间，在8-10h麻醉的中途将动物从一侧转向另一侧，以防止肺沈积性充血。放置静脉内导管以提供液体和药物的通路。在8-10hr麻醉期间，以～5ml/kg/hr的速度输注盐水以将麻醉对水合作用的影响最小化，并替代因采血而造成的血量损失。在麻醉下使用King vision Video喉镜进行口腔插管，以防止吸入性肺炎，并在需要时允许辅助呼吸。在超声波引导下，将18-20号静脉导管(venocath)(短线导管)植入肱静脉用于细菌输注，并将18-20号内导管(intracath)(长线导管)植入隐静脉用于输注试验化合物。

为了防止体温过低，将动物放在循环水加热的垫(37℃)上，并用袖子/袜子覆盖所有四肢以保持动物温暖。

将热灭活金黄色葡萄球菌(菌株B17266 Rosenbach；ATCC 49496)以1.5ml/kg无菌盐水溶液以3x10¹⁰细菌/kg静脉内缓慢连续输注2小时。进行抽血。在麻醉下，在细菌刺激后的T0、2、4、6和8小时采集血样。对于所有实验，还在24和48小时后、安乐死前也抽取血液。从留置的隐静脉导管或经由静脉穿刺采集5-10mL血样。分析血样中是否存在炎症和凝血标志物。

c)试验化合物的药代动力学特性的测定

c.1)小型猪的药代动力学/药效学研究

将雄性或雌性小型猪(Ellegard)通过肌内注射20mg/kg氯胺酮(Ketaset，Zoetis)、8mg/kg阿扎哌隆(Azaperon)(Stresnil，Elanco)和0.03mg/kg硫酸阿托品(Atropinsulfate)(Atropin,B.Braun)进行麻醉。通过将3mg/kg氯胺酮和0.5mg/kg咪达唑仑(Midazolam)(Dormicum，Cheplapharm)快速注射到耳周静脉，然后连续输注22mg/kg/h氯胺酮和3.4mg/kg/h咪达唑仑来维持麻醉。植入气管插管(Super Safety Clear,I.D.4mm；Rüsch)以允许机械通气(Avance CS²；GE Healthcare)。在插管之前，经由耳周静脉快速注射0.03mg/kg潘库溴铵(Pancuronium)(Inresa)，以诱导肌肉放松。为了保持肌肉放松，连续静脉内输注0.3mg/kg/h潘库溴铵。静脉内给予林格-乳酸盐(Ringer-Lactate)溶液以维持动物的水合作用。

经由右股静脉连续输注试验化合物，最长达180min。采集动脉血以测定全血凝固(PT，aPTT)，并在用3份乙腈进行沉淀后用于药代动力学分析。在停止输注试验化合物后，进行额外的抽血以监测试验化合物的药理学和药代动力学半衰期。

c.2)兔的药代动力学/药效学研究

将雄兔(新西兰白兔)用肌内注射5mg/kg赛拉嗪(Rompun，Bayer Vital)和40mg/kg氯胺酮(Ketavet，Zoetis)进行麻醉。经由右耳外周静脉连续静脉内输注赛拉嗪和氯胺酮维持麻醉。经由右股静脉连续输注试验化合物，最长达120min。经由颈动脉采集动脉血用于测定凝血参数(PT，aPTT)，并在用3份乙腈进行沉淀后用于药代动力学分析。在停止输注试验化合物后，进行额外的抽血以监测试验化合物的药理学和药代动力学半衰期。

d)稳定性

d.1)水解稳定性

将0.15mg的试验化合物溶于0.1ml DMSO和0.4ml乙腈中。为了完全溶解，将装有样品溶液的HPLC小瓶摇动并进行声波处理。然后，加入1.0ml的相应缓冲溶液(例如柠檬酸盐缓冲液pH 4、柠檬酸盐缓冲液pH 5、磷酸盐缓冲盐水pH 6.5、磷酸盐缓冲盐水7.4)，并使样品进行涡旋。通过HPLC分析样品溶液，以在37℃下在24h内的特定时间测定试验化合物和最多达两种副产物的量。由在室温下用缓冲液涡旋后立即采集的样品得到t(0)值。峰面积(以百分比计)用于定量。HPLC、LC/MS分析：通过HPLC分析起始材料的纯度。另外通过LC/MS分析24h样品。

HPLC条件：柱：Nucleodur 100 C18ec 3μm 50x2mm；温度：37℃；含有1ml TFA/l水和1ml TFA/l乙腈的不同梯度系统。

该试验在柠檬酸盐缓冲液pH 4中的代表性水解稳定性数据列于下表4a和4b中：

表4a：

表4b：

该试验在PBS缓冲液pH 7.4中的代表性水解稳定性数据列于下表5a和5b中：

表5a：

表5b：

d.2)水解稳定性

将原料药(drug substance)(0.25mg/ml原料药在50％水溶液和50％四氢呋喃、乙腈、甲醇或柠檬酸盐缓冲液pH 4中以提高溶解度)的不同水溶液(水、0.1M HCl、缓冲液pH10和缓冲液pH 7)在70℃下储存24h，并在室温下储存一周。此外，制备各应激(stresss)溶液的空白溶液，以通过比较各自的色谱图来明确识别降解峰。将在储存之前和之后的溶液直接注射到HPLC中，而无需进一步后处理。为了进行数据评估，对各自的色谱图进行积分并相互比较。根据有机杂质的形成量(<2％、2-5％或>5％)，用描述词“稳定”、“稍微不稳定”或“不稳定”来描述稳定性。

d.3)血浆稳定性

手动或通过Hamilton机器人系统进行血浆稳定性样品制备。

手动样品制备的测定说明：

将1mg的试验化合物溶于0.5ml乙腈/DMSO(可以为不同比例)中。为了完全溶解，将HPLC小瓶摇动并进行声波处理。将20μl的该含有试验化合物的溶液加入到1ml保持在37℃温度下的血浆中，并将混合物直接进行涡旋。0.17、0.5、1、1.5、2和4小时后，通过在室温下或10℃下将100μl的化合物血浆溶液加入至含有300μl乙腈/柠檬酸盐缓冲液pH 3(80:20)或乙腈的小瓶中来停止酶促反应。将混合物以5000rpm离心10分钟。通过HPLC分析上清液以测定试验化合物和最多达两种副产物的量。由在室温下用血浆涡旋后立即采集的经处理的样品得到t(0)值。峰面积(以百分比计)用于定量。HPLC、LC/MS分析：通过HPLC分析起始材料的纯度。另外通过LC/MS分析4h样品。

自动化样品制备(Hamilton Starlet和H-Motion-System)的测定说明：

将1mg的试验化合物手动溶于0.5ml乙腈/DMSO(可以为不同比例)中。为了完全溶解，手动摇动HPLC小瓶并对其进行声波处理。然后，通过机器人如下进行自动移液步骤：将20μl的该含有试验化合物的溶液加入到1ml保持在37℃温度下的血浆中，并用移液器混合。0.17、0.5、1、1.5、2和4小时后，通过在10℃下将100μl的化合物血浆溶液加入至含有300μl乙腈/柠檬酸盐缓冲液pH 3(80:20)或乙腈的小瓶中来停止酶促反应。将混合物在10℃下以5000rpm离心10分钟。通过HPLC分析上清液以测定试验化合物和最多达两种副产物的量。由在室温下用血浆进行涡旋后立即采集的经处理的样品得到t(0)值。峰面积(以百分比计)用于定量。HPLC、LC/MS分析：通过HPLC分析起始材料的纯度。另外通过LC/MS分析4h样品。

HPLC条件：柱：Nucleodur 100 C18ec 3μm 50x2mm；温度：37℃；含有1ml TFA/l水和1ml TFA/l乙腈的不同梯度系统。

该试验的代表性人血浆稳定性数据列于下表6a和6b中：

表6a：

表6b：

d.4)血浆和血液稳定性

使用1ml标称试验浓度为1000μg/l的肝素化锂血浆或血液，在37℃下持续5h研究小鼠、大鼠、狗、兔、小型猪、猴子和人的血浆和血液稳定性。在时间点0h、0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、3h和5h，用150μl乙腈+1％甲酸(其补充有两种内标物)沉淀50μl等分试样。在涡旋和以1300g离心10min后，将50μl上清液的等分试样用pH 3的10mM乙酸铵缓冲液稀释1/10，并通过LC-MS/MS进行测量。在Excel中描述浓度-时间曲线，并使用t_1/2＝ln2/k进行各自的半衰期计算。

d.5)过氧化稳定性

将原料药在过氧化条件下(0.25mg/ml原料药在50％的含有3％H₂O₂的柠檬酸盐缓冲液pH 4和50％的四氢呋喃、乙腈、甲醇或柠檬酸盐缓冲液pH 4中以提高溶解度)在室温下储存24h。此外，制备不含H₂O₂的相同溶液并在室温下储存24h。此外，制备每种应激溶液的空白溶液，以通过比较各自的色谱图来明确识别降解峰。储存后，用铂猝灭H₂O₂溶液以阻止H₂O₂进一步反应。将在储存之前和之后(包括猝灭)的溶液直接注入HPLC，而无需进一步后处理。为了进行数据评估，对各自的色谱图进行积分并相互比较。根据有机杂质的形成量(<2％、2-5％或>5％)，用描述语“稳定”、“稍微不稳定”或“不稳定”来描述稳定性。

d.6)甲醛稳定性

将原料药在过氧化条件下(0.25mg/ml原料药在50％的含有3％CH₂O的柠檬酸盐缓冲液pH 4和50％的四氢呋喃、乙腈、甲醇或柠檬酸盐缓冲液pH 4中以提高溶解度)在室温下储存24h。此外，制备不含CH₂O的相同溶液并在室温下储存24h。此外，制备每种应激溶液的空白溶液，以通过比较各自的色谱图来明确识别降解峰。将在储存之前和之后的溶液直接注射到HPLC中，而无需进一步后处理。为了进行数据评估，对各自的色谱图进行积分并相互比较。根据有机杂质的形成量(<2％、2-5％或>5％)，用描述语“稳定”、“稍微不稳定”或“不稳定”来描述稳定性。

d.7.)热稳定性

将原料药以固体形式在90℃下储存一天和一周，并在60℃下储存一周。储存后，将样品以0.25mg/ml的浓度溶解在四氢呋喃中。将这些溶液注入HPLC。为了进行数据评估，对各自的色谱图进行积分并相互比较。根据有机杂质的形成量(<2％、2-5％或>5％)，用描述语“稳定”、“稍微不稳定”或“不稳定”来描述稳定性。

e.1.)溶解度

将最多达12.5mg/ml的原料药的悬浮液在水、0.1M HCl、缓冲液pH 2、缓冲液pH 3、缓冲液pH 4、缓冲液PH 4.5、缓冲液PH 5、缓冲液pH 6、缓冲液pH 7、缓冲液pH 8、乙腈和0.9％NaCl溶液中在25℃下搅拌24h±4h，然后过滤并经HPLC进行分析，完全溶解的样品除外，其显示溶解度为“>12500μg/ml”。

对于HPLC分析，将样品在溶剂中以1:10和1:100稀释，以适合校准。此外，制备用于校准曲线的三种标准溶液，其浓度为500μg/ml(5mg/10ml)、50μg/ml(1mg/20ml)和1μg/ml(0.4ml的50μg/ml标准物/20ml)。将所有样品和标准溶液以特定顺序注入HPLC。通过比较样品中物质峰的总面积与校准曲线(外标物)来确定溶解度。

还使用标准溶液进行SST(系统适用性测试)，其必须达到以下要求：

相同标准物的最少6次进样必须具有<＝2.0％的变异系数。

校准标准物的最少4次进样必须具有<＝5.0％的精度。

非线性校准曲线的截距必须<＝3.0％。

用于计算的校准曲线必须经过零。

使用校准点内的最低稀释的样品进行溶解度的计算。

使用以下缓冲液：

在柠檬酸盐缓冲液pH 4中的溶解度/稳定性

通过将4mg物质溶解在50μl的柠檬酸缓冲液pH 4中，目测确定原料药的溶解度。然后，随后加入原料药直到达到400mg/ml的浓度或产生悬浮液。观察溶液七天以检测潜在的沉淀。七天后，将溶液稀释至10mg/ml，并研究稳定性。

通过HPLC和LC/MS测试原料药的稳定性。使用外标物对测定和降解进行研究。对于试验，将样品稀释至0.1mg/ml，并制备两种标准溶液(120μg/ml和50μg/ml)。将所有样品和标准溶液以特定顺序注入HPLC。通过比较物质峰的总面积与校准曲线(外标物)来确定测定。降解量记录为样品的整个色谱图的面积％。此外，通过LC/MS对样品进行测量以确定降解产物。

e.2.)溶解度

将25mg化合物置于2ml溶剂中。根据化合物在溶剂中的溶解度(高于或低于12.5mg/ml)，形成溶液或悬浮液。将该溶液或悬浮液在25℃下搅拌24h±4h。然后，过滤溶液或悬浮液，并通过HPLC分析剩余的溶液。通过比较物质峰的总面积与校准曲线(外标物)来确定溶解度。降解量记录为样品整个色谱图的面积％，并用作酯水解的描述语。在溶解度评估中所测试的溶剂为水性缓冲液(pH范围1至8)、等渗盐水溶液和乙腈。

实施例2：将440mg实施例2的化合物置于0.5ml柠檬酸盐缓冲液中。所得溶液具有约为0.9ml的体积并在25℃下搅拌24h±4h。之后，将溶液离心并通过HPLC进行分析。通过比较物质峰的总面积与校准曲线(外标物)来确定溶解度。测量以一式三份进行。实施例2的化合物在柠檬酸缓冲液pH 4中的溶解度>500mg/ml。

f)CYP抑制

用汇集的人肝微粒体作为酶源和相应标准底物研究试验化合物抑制人CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的潜力。以6种浓度(0.625、1.25、2.5、5、10、20μM)测定试验化合物的抑制作用，并与在没有潜在抑制剂的情况下的代谢物形成程度进行比较。最后，计算IC₅₀值。始终包括标准抑制剂(特异性抑制单一CYP同种型(isoform))以确保结果在一系列实验之间具有可比性。测定程序：在六种浓度的潜在抑制剂的存在下将非那西汀(phenacetin)、阿莫地喹(amodiaquine)、双氯芬酸(diclofenac)、右美沙芬(dextromethorphan)和咪达唑仑(midazolam)与人肝微粒体培养。标准培养混合物在200μl的总体积中含有1mM NADP、1mM EDTA、5mM葡萄糖6-磷酸、1.5U/ml葡萄糖6-磷酸脱氢酶和50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)。将试验化合物溶解在乙腈中。将96孔板在37℃下培养一段适当的时间，并通过加入100μl含有相应内标物的乙腈来停止反应。通过将孔板离心(3000rpm，10min)除去沉淀的蛋白质。将上清液合并，并通过LC-MS/MS或RapidFire-MS/MS进行分析。

该试验的代表性CYP抑制数据列于下表7a和7b中：

表7a：

表7b：

g)CYP诱导

将人肝细胞以3D以～10000个细胞/384孔的密度接种，并在化合物处理前培养一天。用8种浓度的1:3连续稀释液连续两天处理细胞，其中培养基每天进行更换。化合物处理48h后，将细胞裂解，并通过现有技术的磁珠技术制备mRNA。在分离mRNA后，将cDNA直接从mRNA包覆的珠中转录，并进一步处理用于qPCR。经由TaqMan探针通过多路传输CYP3A4、CYP1A2、肌动蛋白和微管蛋白来测定CYP相对表达水平。基于ΔΔCt方法计算CYP诱导，并将其表示为与载体处理的对照相比的倍数诱导。

h)肝细胞中的代谢稳定性

通过在1μM和1*10⁶个细胞/ml的低细胞数下培养化合物来测定肝细胞中的代谢稳定性，以确保线性动力学。为了将有机溶剂在培养混合物中的影响最小化，将它们的含量限制在最大1％的乙腈或最大0.2％的DMSO。从培养混合物中抽七个时间点用于分析，以从斜率值t_1/2＝-0.693/k确定化合物的半衰期。使用以下方程计算体外t_1/2(以分钟计)到内在清除率(CL'_intr,hep，以L/h/kg计)的转换：

CL'_intr,hep＝kV/N×比例因子

CL'_intr,hep：在没有流量限制和与血液中的细胞或蛋白质结合的情况下，肝脏清除药物的内在清除率

V＝培养体积(0.25ml)

N＝每孔的肝细胞数量(0.25×10⁶个细胞)

根据充分搅拌模型(well stirred model)，用以下方程将内在清除率转换为预测的肝清除率(CL'_blood,hep,ws，以L/h/kg计)：

CL’_blood,hep,ws＝Q_H*CL’_intr,hep/(Q_H+CL’_intr,hep)

Q_H＝肝血流量

CL'_blood,hep,ws：基于充分搅拌模型的肝清除率计算。“充分搅拌”模型假设肝脏为单一的充分搅拌的隔室，并且排出的血液中未结合药物的浓度与肝脏内未结合药物处于平衡。

使用以下方程计算Fmax值((最大可能生物利用度)：

F_max充分搅拌[％]＝(1-(CL_blood充分搅拌/Q_H))*100

使用不同种类的肝细胞进行体内内在清除率预测的比例因子如下所示：

i)蛋白质结合

对于通过超滤测定蛋白质结合，使用含有30kDa孔径的滤膜的微分配系统来分离血浆和无蛋白超滤液。通过离心施加过滤的驱动力。在蛋白质结合研究之前，通过过滤以一种浓度溶解在血浆和缓冲液中的试验化合物来检查试验化合物在超滤装置上的吸附(回收)和试验化合物通过滤膜的能力。加入到血浆中的有机溶剂的量不得超过总培养体积的1％。将化合物在EDTA钾血浆中以2000μg/l在37℃和7％CO₂下培养15min后，将微分配系统以1800g离心12min。将所产生的滤液用乙腈沉淀并稀释用于LC-MS/MS测量。未结合的级分按以下方式计算：

其中C＝血浆(或缓冲液)中的总浓度

C_u＝未结合的浓度(超滤液中的浓度)

j)(体内)药代动力学的评估

为了评估试验物质在体内的药代动力学，将这些物质溶解在合适的制剂载体(血浆，乙醇、二甲基亚砜、PEG400的混合物；基于生理的制剂)。然后将试验物质以0.1-2mg/kg/h的低剂量连续输注至大鼠和狗，持续10min。在适当的时间点至24h，通过导管(大鼠)或者右腿或左腿的隐静脉(狗)抽取50μl血液，并采集到含有K3-EDTA抗凝剂和150μl乙腈(其补充有内标物)的管中，以直接沉淀血样。在1300g离心10min后，将50μl上清液的等分试样用pH 3的10mM乙酸铵缓冲液稀释1/10，并通过LC-MS/MS进行测量。用经过验证的药代动力学评估程序对血浆浓度-时间曲线进行评估。此外，还可以获取器官样本、组织样本和尿液样本。

C)药物组合物的工作实施例

本发明的物质可以转化为如下的药物制剂：

i.v.溶液

将本发明的化合物以低于饱和溶解度的浓度溶解在生理上可接受的溶剂(例如等渗氯化钠溶液、5％葡萄糖溶液和/或30％PEG 400溶液)中。将溶液通过过滤灭菌，并装入无菌且无热原的注射容器中。

Claims (12)

1.式(I)的3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯

或其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物中的一种。

2.根据权利要求1所述的式(I)的3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯

3.根据权利要求1所述的式(I)的化合物的盐，其特征在于，所述盐是式(I)的化合物的生理上可接受的盐。

4.根据权利要求3所述的式(I)的化合物的生理上可接受的盐，其选自：

3-[(5-氯噻吩-2-羰基)氨基]-N-{2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯-1-磺酰基}-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯盐酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯硫酸盐和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯甲磺酸盐和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯4-甲基苯磺酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯马来酸盐和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯磷酸盐和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯(2R,3R)-酒石酸盐

和

3-{[(5-氯-2-噻吩基)羰基]氨基}-N-({2-乙基-3-[(3S)-3-羟基-2-氧代吡咯烷-1-基]苯基}磺酰基)-S-丙氨酸2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)乙基酯柠檬酸盐。

5.制备权利要求1所述的式(I)的化合物或其盐、其溶剂合物或其盐的溶剂合物中的一种的方法，其特征在于，使下式的化合物

与下式的化合物

在脱水剂的存在下反应，得到式(I)的化合物，

以及任选地将式(I)的化合物用相应的(i)溶剂和/或(ii)碱或酸转化为其溶剂合物、盐和/或盐的溶剂合物。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其用于治疗和/或预防疾病。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备治疗和/或预防疾病的药物的用途。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物用于制备治疗和/或预防血栓性或血栓栓塞性病症和/或血栓性或血栓栓塞性并发症如弥散性血管内凝血，和/或炎症性病症的药物的用途。

9.药物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的化合物与惰性、无毒、药学上合适的赋形剂。

10.根据权利要求9所述的药物，其用于治疗和/或预防血栓性或血栓栓塞性病症和/或血栓性或血栓栓塞性并发症如弥散性血管内凝血，和/或炎症性病症。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其用于使用治疗有效量的本发明化合物治疗和/或预防血栓性或血栓栓塞性病症和/或血栓性或血栓栓塞性并发症如弥散性血管内凝血，和/或炎症性病症的方法中。

12.通过给予治疗有效量的至少一种权利要求1至4中任一项所述的化合物、权利要求9所述的药物或根据权利要求7或8获得的药物来治疗和/或预防人和动物的血栓性或血栓栓塞性病症和/或血栓性或血栓栓塞性并发症如弥散性血管内凝血，和/或炎症性病症的方法。