JP7546172B2

JP7546172B2 - 置換ｓ－アラニナート誘導体

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Publication number: JP7546172B2
Application number: JP2023550005A
Authority: JP
Inventors: ベック，ハルトムート; メッシュ，ステファニー; ヴァカロプロス，アレクサンドロス; プファフ，ニルス; ツィンマーマン，ステファニー; フォルマン，マルクス; ケルステン，エリザベス; ルヴィラン，ギョーム; パルティケル，カトリン; ブレール，アンドレアス・ペーター; ハイトマイヤー，ステファン; ディーツェ－トーレス，ユリア; レーマン，ルッツ; ゲリッケ，ケルステン・マティアス; ジュースマイヤー，フランク; ベルファッカー，ラース; ヒリッシュ，アレクサンダー; ターシュテーゲン，アドリアン; ブッフミューラー，アンニャ; ゲルデス，クリストフ
Original assignee: バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2022-08-29
Publication date: 2024-09-05
Anticipated expiration: 2042-08-29
Also published as: WO2023031083A1; TW202320754A; CO2024002668A2; IL310777A; AU2022338082A1; MX2024002750A; KR20240055043A; US11912692B2; CA3230721A1; PE20240798A1; DOP2024000024A; JP2024509511A; ECSP24024658A; CN117916236A; EP4396183A1; CL2024000638A1; US20230391761A1; CR20240114A; AR126980A1

Description

本発明は、置換Ｓ－アラニナート誘導体及びそれらの製造方法、さらには疾患、特に血管障害、好ましくは血栓性又は血栓塞栓性障害及び／又は血栓性又は血栓塞栓性合併症の治療及び／又は予防のための医薬を製造するためのそれらの使用に関する。

止血は、傷害後の過度の、生命を脅かす可能性がある失血から生物を保護するための必須の機序であり、主にフィブリンと血小板の網で形成される血栓によって動脈若しくは静脈の血管壁の漏出を迅速かつ確実に塞ぐものである。内皮細胞損傷後に内皮下組織因子が血液に曝露され、活性化された血液凝固因子が次のチモーゲンをそれの活性プロテアーゼ形態に変換する複雑な酵素反応の滝状カスケードを引き起こすと、フィブリン形成が傷害部位で開始される。伝統的に、そのカスケードの初期段階は、トリガーが各種の細胞型に結合した組織因子であるか、負に荷電した表面で活性化される第ＸＩＩ因子であるかに応じて、外因性（又は組織因子）経路及び内因性（又は接触活性化）経路に分けられる。どちらの経路も、トロンビン生成の鍵となる酵素である第Ｘ因子の活性化レベルで収束する。最後に、トロンビンは、多くの基質の変換を介して、カスケードで生成されたシグナルを血液の凝固状態に変換する。すなわち、トロンビンはフィブリノーゲンを開裂させることで、フィブリンの網の生成をもたらし、第ＸＩＩＩ因子を活性化して、血塊安定化に必要な第ＸＩＩＩａ因子に変える。さらに、トロンビンは（ＰＡＲ－１活性化を介した）血小板凝集の強力なトリガーであり、血塊形成にも大きく寄与する。トロンビンは、トロンボモジュリンとの複合体においてＴＡＦＩ（トロンビン活性化型線溶阻害剤）を活性化してＴＡＦＩａとすることにより、血塊の溶解を阻害する。正のフィードバックループで、第Ｖ、ＶＩＩＩ因子、及びＸＩ因子の活性化によりトロンビンの産生が増強され、その結果凝血反応が増幅される。反対に、トロンビン／トロンボモジュリン複合体によるタンパク質Ｃの活性化は、テナーゼ複合体における第ＶＩＩＩａ因子及びプロトロンビナーゼ複合体における第Ｖａ因子の分解をもたらし、それによってさらなるトロンビン生成が減少する。

凝固因子は表面上の複合体として存在することが多く、例えば第Ｘａ因子はプロトロンビナーゼ複合体で第Ｖａ因子と結合する。フィブリン血塊の形成時に、トロンビンとプロトロンビナーゼはフィブリンネットに組み込まれ結合する。これらの酵素分子は活性を維持しており、内因性抗凝固剤、たとえばアンチトロンビンＩＩＩが接近するのは困難である。

止血は、血塊形成と溶解の間の複雑な制御機序の影響を受ける。血管壁の漏れを覆うことは出血を防ぐために不可欠な処置であるが、アテローム性動脈硬化病変などの血管壁の障害、感染過程のような進行中の血液中の炎症プロセス、又は血流の減少によって引き起こされる過剰な血塊形成は、血管閉塞を生じる可能性があり、それは、栄養素の供給と潜在的に有害な分解生成物の除去が妨げられるため、周囲組織にとって非常に危険な事象を生じさせる。これらの血塊は、発生部位で静脈、動脈、又はリンパ管を閉塞し得るか、詰まって動かなくなるまで塞栓として血管内を移動し得る。これらの血栓の多くは、例えばアテローム性動脈硬化性プラークの破裂や深部静脈の血流欠乏など、局所的な血管障害の後に形成される。これらは、主な死因の一つである卒中、心筋梗塞又は肺塞栓症などのあらゆる血管で発生する可能性のある重度の事象を引き起こす可能性がある。他の場合には、感染過程における血球、例えば単球上の組織因子への曝露、又は例えば細胞死後の第ＸＩＩ因子への負に帯電した表面若しくは巨大分子への曝露により、全身的な凝固亢進状態が引き起こされ、微小血栓症が生じ、それに続いて臓器損傷が生じる可能性がある。これらの凝固亢進状態は、例えば細菌、ウィルス若しくは真菌による感染、又は外傷によって引き起こされる可能性がある。

さらに、全身性の凝固亢進は、播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）の文脈で消費性凝固障害を引き起こす可能性がある。血栓塞栓性合併症はさらに、微小血管障害性溶血性貧血、血液透析などの体外循環処置、心腔内、人工心臓弁やステント、移植時に発生する。

抗凝固薬は、血栓形成を防止するために予防的に使用され、急性血栓性／塞栓性事象時にプラスミンによる既存のフィブリンの溶解を支援するために使用される。これらの化合物は血栓の生成を阻害するだけでなく、止血プロセスにも影響を与える可能性があるため、出血時間の延長が起こる可能性があり、それが強力な抗凝固効力の選択肢を制限する可能性がある。したがって、広い治療ウィンドウを有する化合物が有利である。

急性の予防又は介入の状況では、抗凝固効力の急速な発現及び十分な制御性が望まれており、これは薬理作用の持続時間が短い化合物の非経口投与によって達成できる。したがって、主にビタミンＫ拮抗薬や直接経口抗凝固薬（ＤＯＡＣ）を含む経口投与用の抗凝固薬化合物は、薬理学的発現が遅く、薬理作用が長期であるため、治療の制御性が制限されることから、この状況では好ましくない。さらに、多くの患者にとって、経口薬の投与には困難を伴う可能性があると考えられる。このような抗凝血化合物を静脈内に適用できるようにするには、十分な溶解度が必要である。急性病治療の患者は複数の薬剤で治療されることが多いため、急性の薬剤間相互作用の可能性が低いことが望まれる。

従来技術から知られている抗凝血薬、例えば、血液凝固を阻害又は防止するための物質は、さまざまな欠点を有している。従って、実際、血栓性／血栓塞栓性疾患の効率的な治療方法又は予防は、非常に困難であり且つ不充分であることが認められている。

急性の状況では、内因性経路又は外因性経路を介して、凝固亢進状態が開始され得る。したがって、このような適応症では、第Ｘａ因子とトロンビンの共通経路を標的にすることが有益である。第Ｘａ因子阻害単独では、すでに形成された血塊中の既存のトロンビンは阻害されないが、例えばヒルジン、ビバリルジン、又はアルガトロバンによるトロンビン阻害単独では、丁度最終段階で凝固システムの滝状カスケードを停止させるのに多量の化合物が必要とされる可能性があることから、治療ウィンドウに関して不利であるものと考えられる。したがって、第Ｘａ因子阻害によってトロンビン生成を調節し、既存のトロンビンも阻害できる化合物は、それらが例えば細菌、ウィルス及び真菌によって引き起こされる感染性疾患の過程で存在することから、凝固亢進状態の治療に興味深いものとなる可能性がある。さらに、そのような患者は、血液が凝固促進剤表面に曝露される体外システムに関連していることが多く、抗凝固療法から恩恵を受ける可能性がある。

急性血栓塞栓性障害の治療及び予防においては、まずヘパリンが使用され、それは静脈投与又は皮下投与される。より好ましい薬物動態特性及び薬力学特性のため、最近では低分子量ヘパリンが好まれるようになってきている。しかしながら、ヘパリン療法において後述の既知の欠点が、この方法では回避できない。出血、特に脳出血及び消化管出血のリスクが高く、数日にわたる治療はヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）発症のリスクを高める。ヘパリンは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の第Ｘａ因子及びトロンビンへの結合を促進することにより、第Ｘａ因子及びトロンビンを間接的に阻害し、これにより追加のＡＴＩＩＩ消費が生じる。内皮に対する保護的役割を考えると、消耗性凝固障害時には、ヘパリン誘発性のＡＴＩＩＩ枯渇増強がさらに重要である。さらに、ヘパリンは、血塊結合トロンビン及び第Ｘａ因子の阻害にはほとんど寄与しない。

最近、トロンビン及び第Ｘａ因子阻害を１分子内で多様な比率で組み合わせた小分子が報告されている。これらのアプローチはイン・ビトロ及びイン・ビボで試験されており、顕著な相乗効果の可能性が実証されている。

ＥＰ４２６７５は、トロンビンを直接阻害するペプチド模倣部分と、第Ｘａ因子を間接的に阻害するフォンダパリヌクス様部分を組み合わせている。しかしながら、この分子はＡＴＩＩＩの存在に依存する。タノギトランは別の小分子化合物であり、イン・ビトロでトロンビンと第Ｘａ因子の両方を阻害しするが、トロンビンに対してより強力な効力を有する。タノギトランは大部分が代謝されずに腎臓から排出されるため、腎不全患者では用量の調整と綿密なモニタリングが必要となると考えられる。

したがって、本発明の目的は、ヒト及び動物における心血管障害、特に血栓性若しくは血栓塞栓性障害及び／又は血栓性若しくは血栓塞栓性合併症の治療のための第Ｘａ因子及びトロンビン阻害剤として作用する新規化合物を提供することであり、その化合物は広い治療ウィンドウ、良好な溶解度、及び十分な制御性を達成するための短い薬理作用を有する。

ＷＯ２００９／１０３４４０、ＷＯ２０１４／１７４１０２及びＪ．Ｍｅｎｅｙｒｏｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１３，５６，９４４１－９４５では、とりわけ、第Ｘａ因子及びトロンビンの阻害剤としての置換クロロチオフェンアミドが記載されている。Ｊ．－Ｍ．Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒｅｔａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，１２，１７１３－１７３０では、とりわけトロンビンの阻害剤としての置換スルホンアミドが記載されている。

本発明は、下記式（Ｉ）の２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート：

並びにそれの塩、それの溶媒和物及びそれの塩の溶媒和物を提供する。

本発明の化合物は、それらの構造に応じて、種々の立体異性体形態で、すなわち、立体配置異性体の形態で、又は、適切な場合には、立体配座異性体（エナンチオマー、及び／又は、ジアステレオマー、これは、回転異性体及びアトロプ異性体である場合も包含する）の形態で、存在することができる。従って、本発明は、エナンチオマー及びジアステレオマー、並びに、それらのそれぞれの混合物を包含する。立体異性的に均一な成分は、エナンチオマー及び／又はジアステレオマーの上記混合物から既知の方法で単離することができる。このためには、好ましくは、クロマトグラフィープロセスが使用され、特に、アキラル相又はキラル相のＨＰＬＣクロマトグラフィーが使用される。

本発明の化合物が互変異体形態で存在し得る場合、本発明は、全ての互変異体形態を包含する。

実施例１の赤外スペクトラムである。実施例２の赤外スペクトラムである。実施例３の赤外スペクトラムである。実施例４の赤外スペクトラムである。実施例５の赤外スペクトラムである。実施例６の赤外スペクトラムである。実施例７の赤外スペクトラムである。実施例８の赤外スペクトラムである。実施例９の赤外スペクトラムである。

本発明は、本発明の化合物の適切な全ての同位体変種も包含する。本発明の化合物の同位体変種は、ここでは、本発明の化合物の中の少なくとも１個の原子が、原子番号は同じであるが通常又は主に天然で生じる原子量とは異なる原子量を有する別の原子に交換されている化合物を意味するものと理解される。本発明の化合物の中に組み入れることが可能な同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素の同位体、例えば、^２Ｈ（重水素）、^３Ｈ（三重水素）、^１３Ｃ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^１７Ｏ、^１８Ｏ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３３Ｓ、^３４Ｓ、^３５Ｓ、^３６Ｓ、^１８Ｆ、^３６Ｃｌ、^８２Ｂｒ、^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２９Ｉ及び^１３１Ｉである。本発明の化合物の特定の同位体変種、特に、１種類以上の放射性同位体がその中に組み入れられているものは、例えば、体内における活性成分の分布又は作用機序についての試験に関して、有益であり得る。特に、^３Ｈ同位体又は^１４Ｃ同位体で標識された化合物は、調製及び検出が比較的容易であるため、この目的に適している。さらに、同位体（例えば、重水素）を組み入れると、当該化合物の代謝安定性が増大する結果として、特定の治療利点（例えば、体内における半減期の延長、又は、必要とされる活性薬量の低減）がもたらされ得る；従って、本発明の化合物のそのような改変は、場合により、本発明の好ましい実施形態も構成し得る。本発明の化合物の同位体変種は、当業者には既知の調製方法によって、例えば、以下においてさらに記載されている方法及び実施例において記載されている方法によって、個々の試薬及び／又は出発化合物の対応する同位体改変を用いて、調製することができる。

本発明に関連して、好ましい塩は、本発明の化合物の生理学的に許容される塩である。しかしながら、本発明は、それら自体は製薬用途には適していないが、例えば本発明の化合物の単離及び精製に関して使用することが可能な塩も、包含する。

本発明の化合物の生理学的に許容される塩としては、鉱酸、カルボン酸及びスルホン酸の酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸及び安息香酸の塩などがある。本発明による化合物の好ましい生理的に許容される塩には、塩酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、酒石酸、リンゴ酸及びクエン酸の酸付加塩などがある。

本発明の化合物の生理学的に許容される塩としては、さらに、慣習的な塩基の塩、例として、及び、好ましくは、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩及びマグネシウム塩）、及び、アンモニア又は１～１６個の炭素原子を有している有機アミン類（例として、及び、好ましくは、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチルジイソプロピルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、ジメチルアミノエタノール、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、アルギニン、リシン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルピペリジン及びコリン）から誘導されたアンモニウム塩などがある。

本発明に関連して、溶媒和物は、溶媒分子と配位することによって固体又は液体の状態で錯体を形成する本発明の化合物のそのような形態として説明される。水和物は、当該配位が水と成されている、溶媒和物の特定の形態である。

本発明は、さらに、本発明の化合物のプロドラッグも包含する。用語「プロドラッグ」は、それら自体は生物学的に活性でも不活性でもよいが、体内でのそれらの滞留時間中に（例えば、代謝又は加水分解により）、本発明の化合物に変換される化合物を包含する。

本発明に関連して、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語には、疾患、状態、障害、傷害若しくは健康障害、又は、そのような状態及び／若しくはそのような状態の症状の発症、過程若しくは進行を、抑制すること（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）、遅延させること（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）、確認すること（ｃｈｅｃｋｉｎｇ）、軽減させること（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）、弱めること（ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ）、限定させること（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ）、低減させること（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）、抑制すること（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ）、防ぐこと（ｒｅｐｅｌｌｉｎｇ）又は治すこと（ｈｅａｌｉｎｇ）が包含される。「療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、本明細書中においては、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語と同義であると理解される。

「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」及び「防止（ｐｒｅｃｌｕｓｉｏｎ）」という用語は、本発明に関連しては、同義的に使用され、そして、疾患、健康状態、障害、傷害若しくは健康障害、又は、そのような状態及び／若しくはそのような状態の症状の発症若しくは進行を、患う（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ）リスク、経験する（ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｉｎｇ）リスク、患う（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇｆｒｏｍ）リスク又は患う（ｈａｖｉｎｇ）リスクを回避すること又は低減させることを意味する。

疾患、健康状態、障害、傷害若しくは健康障害を治療又は予防することは、部分的又は完全であり得る。

好ましいものは、式（Ｉ）の化合物：２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナートである。

やはり好ましいものは、式（Ｉ）の化合物２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート：

及びそれの生理的に許容される塩である。

やはり好ましいものは、
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート硫酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートメタンスルホン酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート４－メチルベンゼン－スルホン酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートマレイン酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートリン酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート（２Ｒ，３Ｒ）－酒石酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートクエン酸塩
からなる群から選択される、式（Ｉ）の化合物の生理的に許容される塩である。

本発明はさらに、式（Ｉ）の化合物、又はそれの塩、それの溶媒和物又はそれの塩の溶媒和物の製造方法であって、脱水剤の存在下に、下記式の化合物：

を、下記式の化合物：

と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得て、
前記式（Ｉ）の化合物を任意に、相当する（ｉ）溶媒及び／又は（ｉｉ）塩基若しくは酸によって、それの溶媒和物、塩及び／又はその塩の溶媒和物に変換する方法を提供する。

当該反応は、一般に、不活性溶媒中で、適切な場合には、塩基の存在下で、好ましくは、大気圧下、－２０℃～８０℃の温度範囲で実施する。

ここで、適切な脱水剤は、例えば、カルボジイミド類、例えば、Ｎ，Ｎ′－ジエチルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′－ジプロピルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′－ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ′－ジシクロヘキシルカルボジイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、Ｎ－シクロヘキシルカルボジイミド－Ｎ′－プロピルオキシメチル－ポリスチレン（ＰＳ－カルボジイミド）、又は、カルボニル化合物、例えば、カルボニルジイミダゾール、又は、１，２－オキサゾリウム化合物、例えば、２－エチル－５－フェニル－１，２－オキサゾリウム３－スルフェート若しくは２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－メチル－イソオキサゾリウム過塩素酸塩、又は、アシルアミノ化合物、例えば、２－エトキシ－１－エトキシカルボニル－１，２－ジヒドロキノリン、又は、クロロギ酸イソブチル、又は、ビス－（２－オキソ－３－オキサゾリジニル）ホスホリルクロリド若しくはベンゾトリアゾリルオキシトリ（ジメチルアミノ）－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、又は、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２－（２－オキソ－１－（２Ｈ）－ピリジル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＰＴＵ）、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）ビスジメチルアミノメチリウムフルオロボレート（ＴＢＴＵ）若しくはＯ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ－ホスフェート（ＨＡＴＵ）、又は、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、又は、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチル－アミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、又は、シアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ）、又は、（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、又は、Ｎ－［（ジメチルアミノ）（３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジン－３－イルオキシ）メチリデン］－Ｎ－メチルメタン－アミニウムヘキサフルオロホスフェート、又は、２，４，６－トリプロピル－１，３，５，２，４，６－トリオキサトリホスフィナン２，４，６－トリオキシド（Ｔ３Ｐ）、又は、これらと塩基の混合物である。エチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテート（Ｏｘｙｍａ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）との縮合が好ましい。

塩基は、例えば、有機塩基、例えば、トリアルキルアミン、例えば、トリエチルアミン、Ｎ－メチルモルホリン、Ｎ－メチルピペリジン、４－ジメチルアミノピリジン又はジイソプロピルエチルアミン又はピリジンなどである。好ましいものは、塩基を用いない縮合である。

不活性溶媒は、例えば、ハロゲン化炭化水素類、例えば、ジクロロメタン若しくはトリクロロメタン、炭化水素類、例えば、ベンゼン若しくはトルエン、又は、別の溶媒、例えば、１，４－ジオキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド若しくはアセトニトリル、又は、前記溶媒の混合物である。好ましいものは、ジクロロメタン及びＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドの混合物である。

式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物は公知であり、公知のプロセスによって相当する出発化合物から合成することができるか、Ａ）実施例の部に記載の方法と類似の方法で製造することができる。

出発化合物及び式（Ｉ）で表される化合物の製造は、以下の合成図式によって説明することができる。

図式：

本発明による化合物は、予測できない有用な薬理学的活性スペクトル及び良好な薬物動態特性を有する。それらは第Ｘａ因子及びトロンビンを阻害する化合物である。従って、それらは、ヒト及び動物における疾患を治療及び／又は予防するための薬物として使用するのに適している。

本発明は、さらに、障害、特に、血管障害、好ましくは、播種性血管内凝固症候群などの血栓性障害若しくは血栓塞栓性障害及び／又は血栓性合併症若しくは血栓塞栓性合併症、及び／又は炎症性障害を治療及び／又は予防するため本発明による化合物の使用も提供する。

第Ｘａ因子（ＦＸａ）及び第ＩＩａ因子（ＦＩＩａ、すなわちトロンビン）は、凝固に関与する重要な酵素である。トロンビンはプロトロンビナーゼ複合体中のＦＸａによって直接活性化され、次にフィブリノーゲンを活性化して血栓の主要成分の一つであるフィブリンにする。

凝固の「共通」経路の一部として、ＦＸａ及びトロンビンは、凝固の内因性及び外因性の両方の開始にとって重要な構成要素である。外因性経路では、血管外膜で発現され、血管損傷の結果として血液に曝露される組織因子（ＴＦ）を介して凝固が引き起こされる。組織因子はまた、特定のトリガー（細菌内毒素など）により単球又は活性化内皮細胞によって分泌され得る。内因性経路では、凝固系は、外来細胞（細菌など）の表面構造だけでなく、人工血管、ステント及び体外循環などの人工表面も含む、特に負に帯電した表面上で活性化される。表面では、最初に第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）が第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）に活性化され、それがその後、細胞表面に付着した第ＸＩ因子（ＦＸＩ）を活性化して第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）とする。外因性経路と内因性経路の両方が共通の経路に収束し、そこでＦＸａがプロトロンビンを活性化してトロンビンとし、それによって次に、１）下流の凝固カスケードがさらに伝播して、上記のフィブリン生成と血栓形成が生じ、２）ＦＸＩからＦＸＩａへの活性化を介したフィードバックループ内の凝固カスケードが再び開始される。

従って、本発明による化合物は、凝血塊の形成から生じ得る障害又は合併症を治療及び／又は予防するのに適している。

本発明に関して、「血栓性障害若しくは血栓塞栓性障害」には、動脈及び静脈の両方の血管系で発生し、特に、とりわけ敗血症に関連して起こり得るが、微小血栓による重度の臓器損傷を生じさせ得る外科的介入、腫瘍性疾患、火傷その他の傷害によっても起こり得る播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の治療及び予防のために本発明による化合物によって治療可能である障害などがある。感染症の過程では、さまざまな臓器における微小血栓症及び続発性の出血性合併症を伴う凝固系の全身性活性化（播種性血管内凝固症候群又は消費性凝固障害、以下「ＤＩＣ」と称する）が発生することがある。ＤＩＣ時には、損傷した内皮細胞の表面、異物の表面、又は架橋した血管外組織の表面で凝固系が大規模に活性化される。その結果、各種臓器の小血管で凝固が起こり、低酸素症とそれに続く臓器機能不全が起こる。二次的効果は、凝固因子（第Ｘ因子、プロトロンビン及びフィブリノーゲン）及び血小板の消費であり、それにより血液の凝固能が低下し、大量の出血が発生する可能性がある。さらに、血管の透過性の増加や体液やタンパク質の血管外空間への拡散に伴う内皮損傷が発生する可能性がある。

本発明による化合物は、感染症及び／又は全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ）、例えば敗血症性臓器機能不全、敗血症性臓器不全及び多臓器不全、呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、敗血症性ショック及び／又は敗血症性臓器不全に関連して生じ得る合併症を予防又は治療するのにも適している。

血栓塞栓性合併症はさらに、微小血管障害性溶血性貧血の場合や、例えば血液透析、ＥＣＭＯ（「体外膜酸素化」）、ＬＶＡＤ（「左心室補助機器」）及び同様の方法などの体外循環、房室瘻、人工血管及び人工心臓弁の関連で血液が異物表面と接触することによって生じる。

さらに、本発明の化合物は、心臓の冠状動脈における障害、例えば、急性冠症候群（ＡＣＳ）、ＳＴ上昇型心筋梗塞（ＳＴＥＭＩ）及び非ＳＴ上昇型心筋梗塞（非ＳＴＥＭＩ）、安定狭心症、不安定狭心症、冠動脈インターベンション（例えば、血管形成術、ステント移植又は大動脈冠動脈バイパス）後の再閉塞及び再狭窄の治療及び予防に適している。

本発明の化合物はまた、急性、間欠性若しくは持続性の心臓不整脈、例えば心房細動を有する患者での、及び電気的除細動を受けている患者での、さらに心臓弁疾患又は人工心臓弁を使用している患者での心原性血栓塞栓症、例えば脳虚血、脳卒中及び全身性血栓塞栓症及び虚血の予防及び治療にも適している。

本発明による化合物は、脳血管動脈における障害、例えば、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、虚血性脳卒中、例えば、心臓塞栓性脳卒中、例えば、心房細動に起因する脳卒中、非心臓塞栓性脳卒中、例えば、ラクナ脳梗塞、大動脈若しくは小動脈の疾患に起因する脳卒中、又は、未確定の原因に起因する脳卒中、潜因性脳卒中、塞栓性脳卒中、塞栓源不明の塞栓性脳卒中、又は、脳卒中若しくはＴＩＡをもたらす血栓性及び／又は血栓塞栓性起源の事象の治療及び／又は予防での使用に用いることもできる。

本発明による化合物は、末梢動脈疾患をもたらす末梢動脈の障害、例えば、末梢動脈閉塞、急性下肢虚血、切断、血管形成術、ステント移植又は手術及びバイパスなどの介入後の再閉塞及び再狭窄、及び／又はステント血栓症の治療及び／又は予防にも使用することができる。

さらに、本発明による化合物は、特に深脚静脈、腎臓静脈、網膜静脈及び／又は脳血管洞における静脈血栓症、及び／又は肺動脈塞栓を引き起こす可能性のある静脈血栓塞栓症を生じる静脈血管における障害の治療及び／又は予防にも使用することができる。

凝固系の刺激は、さまざまな原因又は関連する障害によって発生し得る。とりわけ、外科的介入、不動、ベッドへの拘束、感染症、炎症又はがん若しくはがん治療に関連して、凝固系は高度に活性化される可能性があり、そして、血栓性合併症、特に、静脈血栓症が存在し得る。従って、本発明による化合物は、がんに罹患している患者への外科的介入の状況に関連した血栓症の予防に適している。

本発明による化合物は、さらに、血栓性障害若しくは血栓塞栓性障害及び／又は炎症性障害及び／又は患者の血管浸透性が増加している障害（ここで、遺伝子変異は、酵素の活性の増強又は酵素前駆体のレベルの増大をもたらし、そして、これらは、酵素活性又は酵素前駆体濃度の関連する試験／測定によって確立される）の一次予防にも適している。

本発明は、さらに、障害、特に、上記で記載した障害を、治療及び／又は予防するための本発明による化合物の使用も提供する。

本発明は、さらに、障害、特に、上記で記載した障害を、治療及び／又は予防するための薬物を製造するための本発明による化合物の使用も提供する。

本発明は、さらに、治療上有効量の本発明による化合物を使用して、障害、特に、上記で記載した障害を治療及び／又は予防する方法も提供する。

本発明は、さらに、治療上有効量の本発明による化合物を使用して、障害、特に、上記で記載した障害を治療及び／又は予防する方法において使用するための本発明による化合物を提供する。

特定の本発明は、治療上有効量の本発明による化合物を用いて、血栓性障害又は血栓塞栓性障害を治療及び／又は予防する方法で使用される本発明による化合物を提供する。

本発明は、さらに、本発明による化合物及び１種類以上のさらなる活性化合物を含んでいる医薬を提供する。

さらに、本発明による化合物は、生体外での凝固を防止するために、例えば、凝血塊の形成によって引き起こされる損傷から臓器移植を保護するために、及び、移植された臓器に由来する血栓塞栓から臓器レシピエントを保護するために、血液製剤及び血漿製剤を保存するために、カテーテル並びに別の医療用の補助具及び機器を清浄／前処理するために、生体内若しくは生体外で使用される医療用の補助具及び器具の合成表面をコーティングするために、又は、第Ｘａ因子又はトロンビンを含んでいる可能性のある生体サンプルに対して、使用することもできる。

本発明は、さらに、特に、上述の障害の治療及び／又は予防のための、本発明による化合物及び１以上の別の活性化合物を含む医薬を提供する。組み合わせに好適な活性化合物の好ましい例には、下記のものなどがある。

・脂質低下物質、特に、ＨＭＧ－ＣｏＡ－（３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－コエンザイムＡ）レダクターゼ阻害剤、例えば、ロバスタチン（メバコル（Ｍｅｖａｃｏｒ））、シンバスタチン（ゾコル（Ｚｏｃｏｒ））、プラバスタチン（プラバコール（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ））、フルバスタチン（レスコール（Ｌｅｓｃｏｌ））及びアトルバスタチン（リピトール）；
・冠血管治療剤／血管拡張剤、特に、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）阻害剤、例えば、カプトプリル、リシノプリル、エナラプリル、ラミプリル、シラザプリル、ベナゼプリル、ホシノプリル、キナプリル及びペリンドプリル、又は、ＡＩＩ（アンジオテンシンＩＩ）受容体拮抗薬、例えば、エンブサルタン（ｅｍｂｕｓａｒｔａｎ）、ロサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン及びテミサルタン（ｔｅｍｉｓａｒｔａｎ）、又は、β－アドレナリン受容体拮抗薬、例えば、カルベジロール、アルプレノロール、ビソプロロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、カルテオロール、メトプロロール、ナドロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロパノロール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）及びチモロール、又は、α－１－アドレナリン受容体拮抗薬、例えば、プラゾシン、ブナゾシン、ドキサゾシン及びテラゾシン、又は、利尿剤、例えば、ヒドロクロロチアジド、フロセミド、ブメタニド、ピレタニド、トラセミド、アミロライド及びジヒドララジン、又は、カルシウムチャンネル遮断薬、例えば、ベラパミル及びジルチアゼム、又は、ジヒドロピリジン誘導体、例えば、ニフェジピン（アダラート）及びニトレンジピン（バイオテンシン（Ｂａｙｏｔｅｎｓｉｎ））、又は、ニトロ製剤、例えば、５－一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド及び三硝酸グリセリン、又は、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の増加を引き起こす物質、例えば、可溶性グアニル酸シクラーゼの刺激剤、例えばリオシグアト；
・プラスミノーゲン活性化剤（血栓溶解剤／線維素溶解剤）及び血栓溶解／線維素溶解を促進する化合物、例えば、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子の阻害剤（ＰＡＩ阻害剤）又はトロンビン活性化線維素溶解阻害因子の阻害剤（ＴＡＦＩ阻害剤）、例えば組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔ－ＰＡ、例えばＡｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）、ストレプトキナーゼ、レテプラーゼ及びウロキナーゼ又はプラスミノーゲン形成増加を引き起こすプラスミノーゲン調節物質；
・抗凝血物質（抗凝血剤）、例えば、ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷ）、例えば、チンザパリン、セルトパリン（ｃｅｒｔｏｐａｒｉｎ）、パルナパリン、ナドロパリン、アルデパリン、エノキサパリン、レビパリン、ダルテパリン、ダナパロイド、セムロパリン（ＡＶＥ５０２６）、アドミパリン（Ｍ１１８）及びＥＰ－４２６７５／ＯＲＧ４２６７５；
・直接トロンビン阻害剤（ＤＴＩ）、例えば、プラダキサ（ダビガトラン）、アテセガトラン（ａｔｅｃｅｇａｔｒａｎ）（ＡＺＤ－０８３７）、ＤＰ－４０８８、ＳＳＲ－１８２２８９Ａ、アルガトロバン、ビバリルジン及びタノギトラン（ＢＩＢＴ－９８６及びプロドラッグＢＩＢＴ－１０１１）、ヒルジン；
・直接Ｘａ因子阻害剤、例えば、リバロキサバン、アピキサバン、エドキサバン（ＤＵ－１７６ｂ）、ベトリキサバン（ＰＲＴ－５４０２１）、Ｒ－１６６３、ダレキサバン（ＹＭ－１５０）、オタミキサバン（ｏｔａｍｉｘａｂａｎ）（ＦＸＶ－６７３／ＲＰＲ－１３０６７３）、レタキサバン（ｌｅｔａｘａｂａｎ）（ＴＡＫ－４４２）、ラザキサバン（ｒａｚａｘａｂａｎ）（ＤＰＣ－９０６）、ＤＸ－９０６５ａ、ＬＹ－５１７７１７、タノギトラン（ｔａｎｏｇｉｔｒａｎ）（ＢＩＢＴ－９８６、プロドラッグ：ＢＩＢＴ－１０１１）、イドラパリナックス及びフォンダパリナックス、
・血小板凝集を阻害する物質（血小板凝集阻害剤、栓球凝集阻害剤）、例えば、Ｐ２Ｙ１２拮抗薬、例えばアセチルサリチル酸（例えばアスピリンなど）、Ｐ２Ｙ１２拮抗薬、例えばチクロピジン（チクリド（Ｔｉｃｌｉｄ））、クロピドグレル（プラビックス）、プラスグレル、チカグレロル、カングレロル、エリノグレル、ＰＡＲ－１拮抗薬、例えば、ボラパクサール、ＰＡＲ－４拮抗薬、ＥＰ３拮抗薬、例えばＤＧ０４１；
・血小板付着阻害薬、例えばＧＰＶＩ及び／又はＧＰＩｂ拮抗薬、例えばレバセプト又はカプラシズマブ（ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）；
・フィブリノゲン受容体拮抗薬（糖タンパク質－ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬）、例えば、アブシキシマブ、エプチフィバチド、チロフィバン、ラミフィバン（ｌａｍｉｆｉｂａｎ）、レフラダフィバン（ｌｅｆｒａｄａｆｉｂａｎ）及びフラダフィバン（ｆｒａｄａｆｉｂａｎ）；
・組み換えヒト活性化タンパク質Ｃ、例えばキシグリス又は組み換えトロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｕｄｕｌｉｎ）；
・並びに、抗不整脈薬；
・コルチコステロイド類、例えばアネコルタブ、ベタメタゾン、デキサメタゾン、トリアムシノロン、フルオシノロン及びフルオシノロンアセトニド；
・シクロオキシゲナーゼ阻害薬、例えば、ブロムフェナク及びネパフェナク；
・カリクレイン－キニン系の阻害薬、例えば、サフォチバント（ｓａｆｏｔｉｂａｎｔ）及びエカランチド；
・スフィンゴシン１－ホスフェートシグナル経路の阻害薬、例えば、ソネプシズマブ；
・補体－Ｃ５ａ受容体の阻害薬、例えば、エクリズマブ；
・５ＨＴ１ａ受容体の阻害薬、例えば、タンドスピロン；
・凝固因子ＸＩ又はＸＩａの阻害薬、例えばオソシマブ、アベラシマブ、アスンデキシアン及びミルベクシアン；
・血管収縮剤、例えばエピネフリン、ノルエピネフリン及びドーパミン；
・抗生物質、例えばピペラシリン、コンバクタム、エリスロマイシン、メトロニダゾール、シプロフロキサシン及びバンコマイシン；
・急性呼吸促迫症候群又は急性腎臓傷害の治療時の末端臓器機能を維持するための化合物。

本発明に関する「組み合わせ」は、成分全て（いわゆる固定の組み合わせ）を含有する製剤及び互いに分かれている成分を含有する組み合わせパックだけでなく、同時若しくは順次投与される成分も意味するが、ただし、これらは同じ疾患の予防及び／又は治療に使用される。２以上の有効成分を互いに組み合わせることも同様に可能であり、それは、そうしてこれらがそれぞれ２成分又は多成分の組み合わせであることを意味する。

本発明の化合物は、全身的及び／又は局所的に作用し得る。これに関しては、それら化合物は、好適な方法で、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌下、舌、口腔、直腸、皮膚、経皮、結膜、若しくは耳経路で、又は、インプラント若しくはステントとして投与することができる。

本発明の化合物は、それらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。

経口投与に適した投与形態は、従来技術に従って機能して本発明の化合物を迅速に及び／又は改変された方法で送達し、且つ、本発明の化合物を結晶質形態及び／又は非晶質にされた形態及び／又は溶解された形態で含んでいる投与形態、例えば、錠剤（素錠、又は、コーティング錠、例えば、腸溶コーティングを有しているコーティング錠、又は、不溶性であるか若しくは遅れて溶解して本発明の化合物の放出を制御するコーティングを有しているコーティング錠）、口内で急速に崩壊する錠剤、又は、フィルム剤／カシェ剤、フィルム剤／凍結乾燥剤、カプセル（例えば、硬ゼラチンカプセル、又は、軟ゼラチンカプセル）、糖衣錠、粒剤、ペレット、散剤、乳濁液、懸濁液、エアロゾル又は液剤である。

非経口投与は、吸収段階を回避して（例えば、静脈経路、動脈経路、心臓内経路、髄腔内経路又は腰椎内経路によって）実施することができるか、吸収段階を含めて（例えば、筋肉径路、皮下経路、皮内経路、経皮経路又は腹腔内経路によって）実施することができる。非経口投与に適した投与形態としては、液剤、懸濁液、乳濁液、凍結乾燥剤又は無菌粉末剤の形態にある注射用製剤及び注入用製剤などがある。

非経口投与が好ましい。

その他の投与経路に関する適切な投与形態は、例えば、吸入用の剤形（これは、粉末吸入器、噴霧器を包含する）、点鼻剤、溶液剤、又は、スプレー剤；舌投与、舌下投与若しくは口腔投与のための錠剤、フィルム剤／カシェ剤、又は、カプセル、坐剤、耳用製剤若しくは眼用製剤、膣用カプセル、水性懸濁液剤（ローション、振盪混合物（ｓｈａｋｉｎｇｍｉｘｔｕｒｅｓ））、親油性懸濁液剤、軟膏剤、クリーム、経皮治療システム（例えば、貼付剤）、乳液剤、ペースト、泡剤、散粉用粉末剤、インプラント、又は、ステントである。

本発明の化合物は、上記で記載した投与形態に変換させることができる。これは、不活性で無毒性の薬学的に適切な賦形剤と混合させることによって、自体公知の方法で実施することができる。これらの賦形剤としては、担体（例えば、微結晶性セルロース、ラクトース、マンニトール）、溶媒（例えば、液体ポリエチレングリコール）、乳化剤及び分散剤又は湿展剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレエート）、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、合成ポリマー及び天然ポリマー（例えば、アルブミン）、安定剤（例えば、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸）、着色剤（例えば、無機顔料、例えば、酸化鉄）、並びに、矯味及び／又は矯臭剤などがある。

本発明は、さらに、好ましくは１以上の不活性で無毒性の薬学的に適切な賦形剤と一緒に、少なくとも一つの本発明の化合物を含んでいる医薬、及び、上記で記載した目的のためのその医薬の使用も提供する。

非経口投与の場合、一般に、有効な結果を達成するためには２４時間毎に約１００ｍｇ～１５ｇの量を投与することが有利であるということが見出されており、２４時間毎に約１ｇ～３．５ｇの量を投与することが非常に好ましい。

それにもかかわらず、特に、体重、投与経路、当該活性成分に対する個々の反応、製剤の型及び投与の時間又は時間間隔に応じて、適切な場合には、上記で特定した量から逸脱することが必要であることもあり得る。

別断の断りがない限り、以下の試験及び実施例における「％」は、重量％であり；「部」は重量部である。液体／液体溶液に関する溶媒比率、希釈率及び濃度のデータは、いずれの場合にも、体積基準である。「ｗ／ｖ」は、「重量／体積」を意味する。例えば、「１０％ｗ／ｖ」は、１００ｍＬの溶液又は懸濁液が１０ｇの物質を含んでいることを意味する。

Ａ）実施例
略称

ＨＰＬＣ及びＬＣ－ＭＳ方法：
方法１（分取ＨＰＬＣ）：カラム：ＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＣ１８、１０μｍ、２０５×５０ｍｍ；溶離液Ａ：水、溶離液Ｂ：アセトニトリル；３分で注入；勾配：０．０分１０％Ｂ→６．０分１０％Ｂ→２７分９５％Ｂ→３８分９５％Ｂ→３９分１０％Ｂ→４０．２分１０％Ｂ；流量：１５０ｍＬ／分；ＵＶ－検出：２１０ｎｍ。

方法２（分取ＨＰＬＣ）：カラム：ＲＰ１８カラム、溶離液：アセトニトリル／水勾配＋水相に０．１％ＴＦＡを添加。

方法３（分取ＨＰＬＣ）：カラム：ＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＣ１８、１０μｍ、２０５×５０ｍｍ；溶離液Ａ：水、溶離液Ｂ：アセトニトリル；３分で注入；勾配：０．０分１０％Ｂ→５．５分１０％Ｂ→１７．６５分９５％Ｂ→１９．４８分９５％Ｂ→１９．６６分１０％Ｂ→２０．５１分１０％Ｂ；流量：１５０ｍＬ／分；ＵＶ－検出：２１０ｎｍ。

方法４（分取ＨＰＬＣ）：ＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＣ１８、１０μｍ、２５０×５０ｍｍ３０％アセトニトリル／７０％水（＋０，１％ＴＦＡ）→３８分かけての勾配→９５％アセトニトリル／５％水（＋０．１％ＴＦＡ）。

方法５（分取ＨＰＬＣ）：ＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＣ１８、１０μｍ、１２５×３０ｍｍ；溶離液Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ、溶離液Ｂ：アセトニトリル；３分で注入；勾配：０．０分１０％Ｂ→６．０分１０％Ｂ→２７分９５％Ｂ→３８分９５％Ｂ→３９分１０％Ｂ→４０．２分１０％Ｂ；流量：７５ｍＬ／分；ＵＶ－検出：２１０ｎｍ。

方法６（分取ＨＰＬＣ）：ＣｈｒｏｍａｔｏｒｅｘＣ１８、１０μｍ、１２５×３０ｍｍ；溶離液Ａ：水＋０．０１％ＨＣｌ、溶離液Ｂ：アセトニトリル；３分で注入；勾配：０．０分１０％Ｂ→６．０分１０％Ｂ→２７分９５％Ｂ→３８分９５％Ｂ→３９分１０％Ｂ→４０．２分１０％Ｂ；流量：７５ｍＬ／分、ＵＶ－検出：２１０ｎｍ。

方法７（ＬＣ／ＭＳ）：システムＭＳ：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＦＴ－ＭＳ；システムＵＨＰＬＣ＋：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＵｌｔｉＭａｔｅ３０００；カラム：Ｗａｔｅｒｓ、ＨＳＳＴ３、２．１×７５ｍｍ、Ｃ１８１．８μｍ；溶離液Ａ：１リットル水＋０．０１％ギ酸；溶離液Ｂ：１リットルアセトニトリル＋０．０１％ギ酸；勾配：０．０分１０％Ｂ→２．５分９５％Ｂ→３．５分９５％Ｂ；オーブン：５０℃；流量：０．９０ｍＬ／分；ＵＶ－検出：２１０ｎｍ／至適積分経路２１０－３００ｎｍ。

方法８（ＬＣ／ＭＳ）：装置：ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＳＱＤＵＰＬＣシステム；カラム：ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＨＳＳＴ３１．８μｍ５０×１ｍｍ；溶離液Ａ：１リットル水＋０．２５ｍＬ９９％ギ酸、溶離液Ｂ：１リットルアセトニトリル＋０．２５ｍＬ９９％ギ酸；勾配：０．０分９０％Ａ→１．２分５％Ａ→２．０分５％Ａ；オーブン：５０℃；流量：０．４０ｍＬ／分；ＵＶ－検出：２１０ｎｍ。

方法９（ＬＣ／ＭＳ）：装置：ＡｇｉｌｅｎｔＭＳＱｕａｄ６１５０；ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０；カラム：ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＨＳＳＴ３１．８μｍ５０×２．１ｍｍ；溶離液Ａ：１リットル水＋０．２５ｍＬ９９％ギ酸、溶離液Ｂ：１リットルアセトニトリル＋０．２５ｍＬ９９％ギ酸；勾配：０．０分９０％Ａ→０．３分９０％Ａ→１．７分５％Ａ→３．０分５％Ａ；オーブン：５０℃；流量：１．２０ｍＬ／分；ＵＶ－検出：２０５－３０５ｎｍ。

方法１０（キラルＨＰＬＣ）：カラム：ＤａｉｃｅｌＣｈｉｒａｌｐａｋＩＧ、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ；溶離液Ａ：５０％イソヘキサン、５０％エタノール＋１％水＋０．２％ＴＦＡ；流量：１．０ｍＬ／分、温度：４０℃。

方法１１（キラルＨＰＬＣ）：カラム：ＤａｉｃｅｌＣｈｉｒａｌｃｅｌＩＧ、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ；溶離液Ａ：５０％ｎ－ヘプタン、５０％エタノール＋０．２％ジエチルアミン；流量：１．０ｍＬ／分、温度：６０℃。

本発明の化合物を、溶離液が添加剤（例えば、トリフルオロ酢酸、ギ酸又はアンモニア）を含んでいる上記方法によって、分取ＨＰＬＣで精製する場合、本発明の化合物が十分な塩基官能性又は十分な酸官能性を含んでいれば、本発明の化合物は塩形態で（例えば、トリフルオロ酢酸塩、ギ酸塩又はアンモニウム塩として）得られる場合がある。そのような塩は、当業者に公知の各種方法によって、対応する遊離塩基又は遊離酸に変換させることができる。

以下に記載されている本発明の合成中間体及び実施例の場合、対応する塩基又は酸の塩の形態で特定されている化合物は、一般に、それぞれの製造方法及び／又は精製プロセスによって得られた、正確な化学量論的な組成が未知の塩である。従って、より詳細に特定されていない限り、「塩酸塩」、「トリフルオロ酢酸塩」、「ナトリウム塩」、又は、「×ＨＣｌ」、「×ＣＦ_３ＣＯＯＨ」、「×Ｎａ^＋」その他の塩などの化学名及び構造式に対する付加は、そのような塩の場合、化学量論的な意味で理解されるべきではなく、その中に存在している塩形成成分に関する記述的特徴を有しているに過ぎない。

このことは、合成中間体又は実施例又はそれらの塩が記載されている製造方法及び／又は精製プロセスによって化学量論的な組成が未知の溶媒和物（例えば、水和物）の形態（それらが定められた型である場合）で得られた場合、同様に当てはまる。

マイクロ波：使用したマイクロ波反応器は、ＢｉｏｔａｇｅＩｎｉｔｉａｔｏｒ（商標名）又はＩｎｉｔｉａｔｏｒＰｌｕｓ（商標名）型の「シングルモード」機器であった。

定量イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）：外部標準によるイオンの測定；装置：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩＣＳ５０００＋；キャピラリＩＣカラム：ＩｏｎＰａｃＡＳ１１－ＨＣ及びＩｏｎＰａｃＣＳ１６；溶離液：溶離液勾配［Ｈ］^＋［ＯＨ］^－；検出器：伝導度検出。

プロトン核磁気共鳴分光法（ ^１Ｈ－ＮＭＲ）： ^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、示されるように、４００、５００又は６００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅ分光計を用いて、重水素化溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ_６）中で記録した。化学シフトは、内部標準としてのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するｐｐｍで報告している。^１ＨＮＭＲシグナルのカップリングパターンの説明は、シグナルの光学的外観に基づいており、必ずしも物理的に正しい解釈を反映しているわけではない。一般に、化学シフト情報はシグナルの中心を指す。多重線の場合、間隔が提供される。溶媒又は水によって不明瞭化又は部分的に不明瞭化されたシグナルは、暫定的に割り当てられているか、列記されていない。例えば、分子部分の急速な回転により、又はプロトン交換のために引き起こされる大きく広がったシグナルも同様に暫定的に割り当てられるか（広い多重線又は広い一重線と称されることが多い）、列記されていない。

Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）：Ｘ線回折パターンは、ＸＲＤ回折計Ｘ｀ＰｅｒｔＰＲＯ（ＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ）を使用して室温で記録した（放射線ＣｕＫα１、波長１．５４０６Å）。サンプルの準備はなかった。すべてのＸ線反射は、分解能±０．２°での°２θ（シータ）値（ピーク最大値）として引用される。

赤外分光法（ＩＲ）：Ｂｒｕｋｅｒ製のＴｅｎｓｏｒ３７装置を使用するＦＴ－ＩＲ分光光度計を使用して、ＩＲスペクトラムを室温で記録した。分解能は２ｃｍ^－１であった。

立体異性体の混合物のＮＭＲスペクトラムにおいて、「及び」で言及されている数字は、それらの立体異性体がそれぞれの水素原子に対して別々のシグナルを示すことを示している、すなわち、「・・・．及び・・・．．（２×ｓ、１Ｈ）」は、１個の水素原子が二つの一重線で表され、各一重線が１以上の異なる立体異性体からのものであることを意味する。

図面の説明：
図１：実施例１の赤外スペクトラム
図２：実施例２の赤外スペクトラム
図３：実施例３の赤外スペクトラム
図４：実施例４の赤外スペクトラム
図５：実施例５の赤外スペクトラム
図６：実施例６の赤外スペクトラム
図７：実施例７の赤外スペクトラム
図８：実施例８の赤外スペクトラム
図９：実施例９の赤外スペクトラム
出発化合物
中間体１
１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－エチルフェニル］ピロリジン－２－オン

１－（ベンジルスルファニル）－３－ブロモ－２－エチルベンゼン（１３．０ｇ、４２．３ｍｍｏｌ；製造については、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物４０ｂを参照）及びピロリジン－２－オン（１４．５ｍＬ、１９０ｍｍｏｌ）のジオキサン（３４５ｍＬ）及びＤＭＦ（８７ｍＬ）中溶液にアルゴン下で、ＤＭＥＤＡ（５．５ｍＬ、５０．８ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（９．６７ｇ、５０．８ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（３５．１ｇ、２５４ｍｍｏｌ）を加え、アルゴンを混合物に５分間吹き込んだ。次に、密閉オートクレーブ中、混合物を１１０℃で１６時間攪拌し、追加の圧調節は行わなかった。冷却して室温とした後、混合物を濾過し、溶媒を減圧下に除去した。残留物を水及び酢酸エチルに取り、相を分離した。水相を酢酸エチルで３回抽出し、その後、合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、シクロヘキサン／酢酸エチル１：１）によって精製して、標題化合物の第１のバッチ（９．３０ｇ、理論値の６５％、純度９２％）を得た。さらなるフラッシュクロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ、５０ｇシリカゲルＳＮＡＰＵｌｔｒａカートリッジ、シクロヘキサン／酢酸エチル勾配）後に第２のバッチ（２８０ｍｇ、理論値の２％、純度９９％）を得た。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝２．０３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３１２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 7.41-7.36 (m, 3H), 7.34-7.29 (m, 2H), 7.28-7.19 (m, 2H), 7.02 (dd, 1H), 4.25 (s, 2H), 3.61 (t, 2H), 2.59-2.50 (m, 2H, 一部不明瞭), 2.40 (t, 2H), 2.16-2.05 (m, 2H), 1.01 (t, 3H)
中間体２
（３Ｓ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－メチルフェニル］－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン

アルゴン下に、１－（ベンジルスルファニル）－３－ブロモ－２－メチルベンゼン（４．５０ｇ、１５．３ｍｍｏｌ；製造については、ＷＯ２００９／１０３４４０，ｐ．８１、中間体８３を参照）を（３Ｓ）－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン（３．１０ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（４．０９ｇ、２１．５ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（８．４８ｇ、６１．４ｍｍｏｌ）と混合し、次にジオキサン（１２０ｍＬ）及びＤＭＦ（３１ｍＬ）を加えた。ＤＭＥＤＡ（２．３ｍＬ、２１．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１１０℃で終夜攪拌した。冷却して室温とした後、混合物を、それぞれ１－（ベンジルスルファニル）－３－ブロモ－２－メチルベンゼン１００ｍｇ及び１．０ｇから出発して同様の条件下で得られた二つの試験反応からの混合物と合わせた。合わせた混合物はセライトで濾過し、酢酸エチルで洗浄し、溶媒を減圧下に除去した。残留物を酢酸エチル及び水に溶かし、再度セライトで濾過した。相を分離し、水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をフラッシュ－クロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ、シリカカートリッジ、シクロヘキサン／酢酸エチル勾配）によって精製して、標題化合物（４．２４ｇ、理論値の６５％、純度９２％）を得た。収率は、合わせた実験に基づくものである。

ＬＣ－ＭＳ（方法９）：Ｒ_ｔ＝１．１８分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３１４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 7.38 (d, 2H), 7.34-7.29 (m, 3H), 7.27-7.23 (m, 1H), 7.21 (t, 1H), 7.05 (d, 1H), 5.65 (d, 1H), 4.33-4.25 (m, 1H), 4.23 (s, 2H), 3.59-3.54 (m, 1H), 3.54-3.48 (m, 1H), 2.45-2.38 (m, 1H), 2.05 (s, 3H), 1.98-1.89 (m, 1H).
中間体３
（３Ｒ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－メチルフェニル］－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン

アルゴン下に、１－（ベンジルスルファニル）－３－ブロモ－２－メチルベンゼン（３．００ｇ、１０．２ｍｍｏｌ；製造については、ＷＯ２００９／１０３４４０、ｐ．８１、中間体８３を参照）を（３Ｒ）－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン（１．８６ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２．７３ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（５．６６ｇ、４０．９ｍｍｏｌ）と混合し、次にジオキサン（８２ｍＬ）及びＤＭＦ（２１ｍＬ）を加えた。ＤＭＥＤＡ（１．５ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を１１０℃で終夜攪拌した。冷却して室温とした後、混合物を、１－（ベンジルスルファニル）－３－ブロモ－２－メチルベンゼン４２ｍｇから出発して同様の条件下で得られた試験反応からの混合物と合わせた。合わせた混合物はセライトで濾過し、酢酸エチルで洗浄し、溶媒を減圧下に除去した。残留物を酢酸エチル及び水に溶かし、再度セライトで濾過した。相を分離し、水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をフラッシュ－クロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ、シリカカートリッジ、シクロヘキサン／酢酸エチル勾配）によって精製して、標題化合物を得た（２．２７ｇ、理論値の５４％、純度７９％）。収率は、合わせた実験に基づくものである。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 7.42 (d, 2H), 7.38-7.33 (m, 3H), 7.31-7.27 (m, 1H), 7.25 (t, 1H), 7.08 (d, 1H), 5.69 (d, 1H), 4.34-4.30 (m, 1H), 4.27 (s, 2H), 3.63-3.57 (m, 1H), 3.57-3.57 (m, 1H), 2.49-2.42 (m, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.02-1.94 (m, 1H).
中間体４
（３Ｓ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－エチルフェニル］－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン

１－（ベンジルスルファニル）－３－ブロモ－２－エチルベンゼン（４．０５ｇ、１３．１９ｍｍｏｌ；製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物４０ｂを参照）及び（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－ピロリジノン（４．０ｇ、３９．５６ｍｍｏｌ）のジオキサン（１０５ｍＬ）及びＤＭＦ（２７ｍＬ）中混合物にアルゴン下で、ＤＭＥＤＡ（１．１４ｍＬ、１０．５５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（２．０１ｇ、１０．５５ｍｍｏｌ）及び炭酸カリウム（７．２９ｇ、５２．７５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を８本のマイクロ波容器に等量で小分けし、キャップを施した。これらの容器のうちの２本をマイクロ波装置中１１０℃で１６時間加熱し、他の容器６本は加熱ブロックに置いて１０℃で１６時間攪拌した。冷却して室温とした後、合わせた混合物を濾過し、溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル及び水に取り、相分離後、水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をＩｓｏｌｕｔｅに吸着させ、フラッシュ－クロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ、１００ｇＳＮＡＰ－Ｕｌｔｒａシリカゲル、シクロヘキサン－酢酸エチル勾配）によって精製した。合わせた生成物分画を濃縮し、真空乾燥して、標題化合物を得た（２．１７ｇ、理論値の４９％、純度９８％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法８）：Ｒ_ｔ＝０．９２分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３２８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 7.41-7.36 (m, 3H), 7.34-7.29 (m, 2H), 7.28-7.20 (m, 2H), 7.01 (dd, 1H), 5.69 (d, 1H), 4.30-4.24 (m, 3H), 3.58-3.52 (m, 1H), 3.50-3.42 (m, 1H), 2.60-2.47 (m, 2H, 一部不明瞭), 2.45-2.36 (m, 1H), 1.98-1.87 (m, 1H), 1.01 (t, 3H).
中間体５
（３Ｒ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－エチルフェニル］－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン

１－（ベンジルスルファニル）－３－ブロモ－２－エチルベンゼン（８４４ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ；製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物４０ｂを参照）にアルゴン下で、（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－ピロリジノン（５００ｍｇ、４．９５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（７３３ｍｇ、３．８５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．５２ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）、ジオキサン（２２ｍＬ）、ＤＭＦ（５．６ｍＬ）及びＤＭＥＤＡ（０．４１ｍＬ、３．８５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１１０℃で終夜攪拌した。冷却して室温とした後、混合物をセライトで濾過し、溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル及び水に取り、セライトで再度濾過し、相分離後、水相を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をフラッシュ－クロマトグラフィー（シリカゲル、シクロヘキサン－酢酸エチル勾配）によって精製した。合わせた生成物分画を濃縮し、真空乾燥して、標題化合物を得た（５４８ｍｇ、理論値の６０％、純度９９％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．７８分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３２８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 7.41-7.36 (m, 3H), 7.34-7.29 (m, 2H), 7.28-7.20 (m, 2H), 7.01 (d, 1H), 5.66 (d, 1H), 4.30-4.24 (m, 3H), 3.58-3.52 (m, 1H), 3.50-3.42 (m, 1H), 2.60-2.47 (m, 2H, 一部不明瞭), 2.45-2.36 (m, 1H), 1.98-1.87 (m, 1H), 1.01 (t, 3H).
中間体６
（３Ｓ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－エチルフェニル］－３－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝ピロリジン－２－オン

（３Ｓ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－エチルフェニル］－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン（２．１７ｇ、６．６４ｍｍｏｌ、中間体４）のＤＣＭ（１９ｍＬ）及びＤＭＦ（４．８ｍＬ）中溶液に、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロライド（３．０ｇ、１９．９３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２．９ｍＬ、１６．６１ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。混合物を濃縮し、残留物をアセトニトリル及び水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法１）によって精製した。合わせた生成物分画を凍結乾燥して、標題化合物を得た（２．０ｇ、理論値の６８％、純度１００％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝２．８４分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝４４２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 7.41-7.36 (m, 3H), 7.34-7.29 (m, 2H), 7.28-7.20 (m, 2H), 7.02 (d, 1H), 4.48 (t, 1H), 4.26 (s, 2H), 3.62-3.53 (m, 1H), 3.53-3.45 (m, 1H), 2.59-2.40 (m, 3H, 一部不明瞭), 2.03-1.90 (m, 1H), 1.01 (t, 3H), 0.9 (s, 9H), 0.13 (s, 3H), 0.12 (s, 3H).
中間体７
２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニルクロライド

１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－エチルフェニル］ピロリジン－２－オン（９．３０ｇ、２９．８６ｍｍｏｌ、純度については調節していない、中間体１）の酢酸（５５０ｍＬ）中溶液に、塩化スルフリル（９．６０ｍＬ、１１９．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。水を加え、混合物をＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をシクロヘキサンに取り、フラッシュクロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａＯｎｅ、１００ｇＳＮＡＰＵｌｔｒａシリカゲルカートリッジ、シクロヘキサン／酢酸エチル勾配）によって精製して、標題化合物を得た（５．１５ｇ、理論値の５５％、純度９１％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．６６分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝２８８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

中間体８
３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニルクロライド

（３Ｓ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－メチルフェニル］－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン（４．２４ｇ、純度９２％、１２．４５ｍｍｏｌ、中間体２）のＤＣＭ（７３ｍＬ）及び酢酸（２９０ｍＬ）中溶液に、ＮＣＳ（６．６５ｇ、４９．８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。水を加え、混合物をジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をＤＣＭに取り、飽和塩化ナトリウム溶液で３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮し、残留物を真空乾燥して、標題化合物を得た（３．９４ｇ、理論値の８０％、純度７３％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．２６分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝２９０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

中間体９
３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニルクロライド

（３Ｒ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－メチルフェニル］－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン（２．２７ｇ、純度７９％、５．７２ｍｍｏｌ、中間体３）のＤＣＭ（３４ｍＬ）及び酢酸（１３５ｍＬ）中溶液に、ＮＣＳ（３．０６ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。水を加え、混合物をジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をＤＣＭに取り、飽和塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、次に、合わせた水相をＤＣＭで１回再抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮し、残留物を真空乾燥して、標題化合物を得た（１．９０ｇ、理論値の６２％、純度５４％）。

中間体１０
２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニルクロライド

（３Ｓ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－エチルフェニル］－３－｛［ｔｅｒｔ－ブチル（ジメチル）シリル］オキシ｝ピロリジン－２－オン（２．０ｇ、４．５３ｍｍｏｌ、中間体６）の酢酸（１２０ｍＬ）中溶液に、塩化スルフリル（１．５０ｍＬ、１８．１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。混合物を水で希釈し、ＤＣＭで５回抽出し、その後、水相を塩化ナトリウムで飽和させ、ＤＣＭで再度抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで脱水し、ロータリーエバポレータによって浴温２５℃で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ、１００ｇＳＮＡＰ－Ｕｌｔｒａシリカゲル、シクロヘキサン－酢酸エチル勾配）によって二つに分けて精製した。合わせた生成物分画を浴温２５℃でのロータリーエバポレータによって濃縮して、標題化合物を得た（１．１１ｇ、理論値の７２％、ＬＣ－ＭＳにより純度９０％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．３９分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝３０４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

中間体１１
２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニルクロライド

（３Ｒ）－１－［３－（ベンジルスルファニル）－２－エチルフェニル］－３－ヒドロキシピロリジン－２－オン（５４５ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ、中間体５）のＤＣＭ（１０ｍＬ）及び酢酸（３９ｍＬ）中溶液にＮＣＳ（８８０ｍｇ、６．５９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。次に、混合物を水で希釈し、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で３回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、浴温２５℃でのロータリーエバポレータによって濃縮した。残留物をフラッシュ－クロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ、ＳＮＡＰ－Ｕｌｔｒａシリカゲル、シクロヘキサン－酢酸エチル勾配）によって精製した。合わせた生成物分画を浴温２５℃でのロータリーエバポレータによって濃縮して、標題化合物を得た（４５０ｍｇ、理論値の８４％、ＮＭＲにより純度９３％、少量の溶媒を含有）。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 7.80 (dd, 1H), 7.21-7.16 (m, 1H), 7.13 (dd, 1H), 4.27 (t, 1H), 3.63-3.57 (m, 1H), 3.55-3.46 (m, 1H), 3.02-2.87 (m, 2H), 2.46-2.38 (m, 1H), 1.97-1.89 (m, 1H), 1.05 (t, 3H).
中間体１２
メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート

３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニルクロライド（３．６９ｇ、７．３９ｍｍｏｌ、純度５８％、中間体８）のＤＣＭ（９１ｍＬ）中溶液にトリエチルアミン（４．１ｍＬ、２９．５５ｍｍｏｌ）及びメチル－３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｓ－アラニナート（２．０４ｇ、７．７６ｍｍｏｌ；製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３、５６、９４４１－９４５６、化合物４９を参照）を加え、反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。混合物を、３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニルクロライド２５０ｍｇ（純度９４％）から出発して同様の条件下で得られた、より小規模の反応からの混合物と合わせた。合わせた混合物をＤＣＭで希釈し、水で２回洗浄し、次に合わせた水相をＤＣＭで再抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、脱水し、濃縮した。残留物をフラッシュ－クロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ／メタノール２０：１）によって精製して、標題化合物を得た（２．２５ｇ、理論値の４６％、純度８７％）。収率は、合わせた実験に基づくものである。

ＬＣ－ＭＳ（方法９）：Ｒ_ｔ＝０．９９分；ＭＳ（ＥＳＩｎｅｇ）：ｍ／ｚ＝５１４［Ｍ－Ｈ］^－。

中間体１３
メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート

３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニルクロライド（１．９０ｇ、純度５４％、３．５４ｍｍｏｌ、中間体９）のＤＣＭ（４４ｍＬ）中溶液に、トリエチルアミン（２．０ｍＬ、１４．２ｍｍｏｌ）及びメチル－３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｓ－アラニナート（０．９８ｇ、３．７２ｍｍｏｌ；製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物４９を参照）を加え、反応混合物を室温で１．５時間攪拌した。混合物をＤＣＭで希釈し、水で２回洗浄し、次に合わせた水相をＤＣＭで再抽出した。有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、脱水し、濃縮した。残留物をフラッシュ－クロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ／メタノール勾配）によって精製して、標題化合物を得た（８８２ｍｇ、理論値の４６％、純度９６％）。

中間体１４
リチウム（２Ｓ）－３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－２－（｛［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝アミノ）プロパノエート

メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニナート（２．０ｇ、３．８９ｍｍｏｌ、参考例５）のＴＨＦ（３０ｍＬ）中溶液に水酸化リチウム・１水和物（８１６ｍｇ、１９．４５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で４時間攪拌した。混合物を濃縮し、残留物を水／メタノール／アセトニトリルに取り、分取ＨＰＬＣ（方法３）によって精製した。合わせた生成物分画を濃縮し、残留物を真空乾燥して、標題化合物を得た（１．５６ｇ、理論値の８０％、純度１００％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．３８分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５００［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 8.65 (br s, 1H), 7.91 (d, 1H), 7.47 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.36 (t, 1H), 7.15 (d, 1H), 3.65 (br s, 2H), 3.57-3.48 (m, 1H), 3.38-3.27 (不明瞭, 2H), 2.98-2.88 (m, 1H), 2.88-2.80 (m, 1H), 2.42 (t, 2H), 2.17-2.08 (m, 2H), 1.08 (t, 3H).
中間体１５
３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニン

メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニナート（５１５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ、参考例５）のＴＨＦ（５ｍＬ）中溶液に１Ｍ水酸化リチウム溶液（５．０ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。次に、混合物を水で希釈し、ジエチルエーテルで洗浄した。水相を１Ｍ塩酸（６ｍＬ）で処理し、ブタノールで３回抽出した。合わせたブタノール相を濃縮し、残留物をアセトニトリル／水に取り、凍結乾燥して、標題化合物を得た（４８２ｍｇ、理論値の９０％、純度９４％）。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 12.84 (s, 1H), 8.68 (t, 1H), 8.44 (d, 1H), 7.85 (d, 1H), 7.55 (d, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.32 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 4.00 (dd, 1H), 3.66-3.57 (br m, 2H), 3.57-3.50 (m, 1H), 3.43-3.36 (m, 1H), 2.93-2.80 (m, 2H), 2.42 (t, 2H), 2.16-2.09 (m, 2H), 1.08 (t, 3H).
中間体１６
３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン

メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（２．２５ｇ、純度８７％、３．７９ｍｍｏｌ、中間体１２）のＴＨＦ（８．１ｍＬ）中溶液に水酸化リチウム水溶液（３８ｍＬ、１．０Ｍ、３８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。ＴＨＦの留去後、水系混合物をｐＨ値１に達するまで２Ｍ塩酸でゆっくり酸性とした。得られた混合物を酢酸エチルで２回抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮し、真空乾燥して、標題化合物を得た（１．９６ｇ、理論値の９７％、純度９４％、ＮＭＲにより少量の溶媒を含有）。

ＬＣ－ＭＳ（方法９）：Ｒ_ｔ＝０．８９分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５０２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 12.84 (br s, 1H), 8.55 (t, 1H), 8.35 (d, 1H), 7.81 (d, 1H), 7.48 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.31 (t, 1H), 7.15 (d, 1H), 5.70 (d, 1H), 4.33-4.28 (m, 1H), 4.02-3.97 (m, 1H), 3.58-3.49 (m, 2H), 3.49-3.41 (m, 1H), 3.38-3.30 (m, 1H, 一部不明瞭), 2.47-2.39 (m, 1H), 2.35 (s, 3H), 1.97-1.89 (m, 1H).
中間体１７
３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン

メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（８８２ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ、中間体１３）のＴＨＦ（３．６ｍＬ）中溶液に、水酸化リチウム水溶液（１７ｍＬ、１．０Ｍ、１７ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。ＴＨＦの留去後、水系混合物を、ｐＨ値１に達するまで２Ｍ塩酸でゆっくり酸性とした。得られた混合物を酢酸エチルで２回抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮し、真空乾燥して、標題化合物を得た（７８４ｍｇ、理論値の８１％、純度８９％、ＮＭＲにより少量の溶媒を含有）。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 12.76 (br s, 1H), 8.57 (t, 1H), 8.36 (d, 1H), 7.82 (d, 1H), 7.50 (d, 1H), 7.42 (d, 1H), 7.32 (t, 1H), 7.16 (d, 1H), 5.70 (d, 1H), 4.31 (br t, 1H), 4.02-3.97 (m, 1H), 3.58-3.50 (m, 2H), 3.50-3.44 (m, 1H), 3.39-3.33 (m, 1H), 2.47-2.39 (m, 1H), 2.36 (s, 3H), 1.98-1.92 (m, 1H).
中間体１８
リチウム（２Ｓ）－３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－２－［（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）アミノ］プロパノエート

メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、参考例６）のＴＨＦ（２．１ｍＬ）中溶液に、水酸化リチウム・１水和物（４８ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）及水２滴を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。次に、混合物を濃縮し、残留物を分取ＨＰＬＣ（方法１）によって精製した。合わせた生成物分画を凍結乾燥して、標題化合物を得た（１４０ｍｇ、理論値の７１％、純度１００％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．２３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５１６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 8.70-8.64 (m, 1H), 7.93 (d, 1H), 7.47-7.40 (m, 2H), 7.40-7.34 (m, 1H), 7.16 (d, 1H), 5.75 (br s, 1H), 4.28 (t, 1H), 3.65-3.57 (m, 1H), 3.56-3.47 (m, 2H), 3.38-3.20 (m, 4H, 一部不明瞭), 2.98-2.76 (m, 2H), 2.47-2.38 (m, 1H), 2.00-1.87 (m, 1H), 1.07 (t, 1H).
中間体１９
３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン

メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（５０８ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ、参考例６）のＴＨＦ（２．０ｍＬ）中溶液に、水酸化リチウム水溶液（１Ｍ、９．６ｍＬ、９．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。ＴＨＦの留去後、水系混合物を、ｐＨ値１に達するまで１Ｍ塩酸でゆっくり酸性とした。得られた混合物を酢酸エチルで２回抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮し、真空乾燥して、ＨＮＭＲによる少量の溶媒を含む標題化合物を得た（３９１ｍｇ、理論値の７５％、純度９５％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法８）：Ｒ_ｔ＝０．６５分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５１６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

キラルＨＰＬＣ（方法１０）：Ｒ_ｔ＝７．７６分。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 12.83 (br s, 1H), 8.60 (t, 1H), 8.40 (d, 1H), 7.86 (dd, 1H), 7.52 (d, 1H), 7.39 (dd, 1H), 7.33 (t, 1H), 7.16 (d, 1H), 5.70 (d, 1H), 4.32-4.26 (m, 1H), 4.05-4.00 (m, 1H), 3.59-3.51 (m, 2H), 3.49-3.36 (m, 2H), 2.91-2.81 (m, 2H), 2.47-2.37 (m, 1H), 1.97-1.87 (m, 1H), 1.06 (t, 3H).
中間体２０
３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン

メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（６２０ｍｇ、純度９５％、１．１１ｍｍｏｌ、参考例７）のＴＨＦ（２．４ｍＬ）中溶液に水酸化リチウム水溶液（１１ｍＬ、１．０Ｍ、１１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。ＴＨＦの留去後、水系混合物を、ｐＨ値１に達するまで１Ｍ塩酸でゆっくり酸性とした。得られた混合物を酢酸エチルで２回抽出し、合わせた有機相を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮し、真空乾燥して、標題化合物を得た（５７０ｍｇ、理論値の９９％、純度１００％、ＮＭＲにより少量の溶媒を含有）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．２１分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５１６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

キラルＨＰＬＣ（方法１０）：Ｒ_ｔ＝６．３１分。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 12.90 (br s, 1H), 8.61 (t, 1H), 8.40 (d, 1H), 7.87 (dd, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.40 (d, 1H), 7.33 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 5.71 (br s, 1H), 4.29 (br t, 1H), 4.06-3.99 (m, 1H), 3.61-3.50 (m, 2H), 3.49-3.44 (m, 1H), 3.44-3.37 (m, 1H), 2.94-2.80 (m, 2H), 2.48-2.40 (m, 1H), 1.97-1.91 (m, 1H), 1.07 (t, 3H).
参考化合物
参考例１
５－クロロ－Ｎ－［（２Ｓ）－２－（｛［２－メチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝アミノ）－３－（４－メチルピペラジン－１－イル）－３－オキソプロピル］チオフェン－２－カルボキサミド塩酸塩

製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物１５を参照する。

参考例２
２－（ジメチルアミノ）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－｛［２－メチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－｛［２－メチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝－Ｓ－アラニン（１５０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物５１を参照する。）のＴＨＦ（１．５ｍＬ）中溶液に、ＨＢＴＵ（１４０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（０．１６ｍＬ、０．９３ｍｍｏｌ）及び２－（ジメチルアミノ）エタノール（３７μＬ、３７０μｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。次に、混合物をロータリーエバポレータによって濃縮し、残留物をアセトニトリル／水に取り、移動相にＴＦＡを加えた分取ＨＰＬＣ（方法５）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成するために、ＴＦＡ含有バッチを最初にアセトニトリル／水に溶かし、得られた溶液をクロライドイオン交換樹脂（２．０ｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ）とともに１時間攪拌した。その後、溶液を移動相に塩化水素を加えた分取ＨＰＬＣ（方法６）によって精製して、標題化合物の第１のバッチ（９６ｍｇ、理論値の５２％、純度１００％）及び標題化合物の第２のバッチ（６ｍｇ、理論値の３％、純度９４％）を得た。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝０．９９分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５５７［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 10.28 (br s, 1H), 8.92 (t, 1H), 8.74 (d, 1H), 7.81 (d, 1H), 7.66 (d, 1H), 7.48 (d, 1H), 7.37 (t, 1H), 7.19 (d, 1H), 4.24-4.18 (m, 1H), 4.16-4.08 (m, 2H), 3.68-5.57 (m, 3H), 3.52-3.45 (m, 1H), 3.23 (m, 2H), 2.75 (d, 3H), 2.73 (d, 3H), 2.45 (t, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.18-2.11 (m, 2H).
ＩＣ：６．０重量％クロライド、＜１重量％ＴＦＡ。

参考例３
１－メチルピペリジン－４－イル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－｛［２－メチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－｛［２－メチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝－Ｓ－アラニン（１５０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物５１を参照する。）のＴＨＦ（１．５ｍＬ）中溶液にＴＢＴＵ（１１９ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１２５７００－６７－６）、ＤＩＰＥＡ（０．１６ｍＬ、０．９３ｍｍｏｌ）及びＮ－メチル－４－ピペリジノール（４４μＬ、３７０μｍｏｌ）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。次に、混合物を移動相に塩化水素を加えた分取ＨＰＬＣ（方法６）によって精製して、標題化合物を得た（２８ｍｇ、理論値の１４％、純度１００％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．００分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５８３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 10.28 (br s, 1H), 8.86 and 8.81 (2 x t, 1 H), 8.75 and 8.74 (2 x d, 1H), 7.83 and 7.81 (2 x d, 1H), 7.62及び7.58 (2 x d, 1H), 7.49-7.45 (m, 1H), 7.39-7.34 (m, 1H), 7.19-7.17 (m, 1H), 4.83-4.78 and 4.65-4.59 (2 x m, 1H), 4.14-4.08 and 4.04-3.98 (2 x m, 1H), 3.66-3.13 (3 x m, 6H, 一部不明瞭), 3.03-2.89 (m, 2H), 2.69-2.65 (m, 3H), 2.47-2.41 (m, 2H), 2.37 (s, 3H), 2.18-2.11 (m, 2H), 1.97-1.73 (2 x m, 2H), 1.67-1.50 (m, 2H).
ＩＣ：５．６重量％クロライド。

参考例４
メチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－｛［２－メチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝－Ｓ－アラニナート

製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物５０を参照する。

参考例５
メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニナート

２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニルクロライド（５．１５ｇ、１７．９０ｍｍｏｌ、中間体７）のＤＣＭ（２１５ｍＬ）中混合物にメチル－３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩（５．８９ｇ、１９．７ｍｍｏｌ、製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物４９を参照する。）及びトリエチルアミン（５．０ｍＬ、３５．８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１時間攪拌した。次に、混合物を濃縮し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ、１００ｇＳＮＡＰ－Ｕｌｔｒａシリカゲル、ＤＣＭ／メタノール勾配）によって精製した。合わせた生成物分画を濃縮し、真空乾燥して、標題化合物の第１のバッチ（８．３５ｇ、理論値の８６％、純度９５％）及び標題化合物の第２のバッチ（８３０ｍｇ、理論値の９％、純度１００％）を得た。

ＬＣ－ＭＳ（方法８）：Ｒ_ｔ＝０．８５分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５１４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 8.68 (t, 1H), 8.63 (d, 1H), 7.81 (dd, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.45 (dd, 1H), 7.37 (t, 1H), 7.18 (d, 1H), 4.12-4.00 (m, 1H), 3.73-3.49 (m, 3H), 3.46-3.35 (m, 4H), 2.98-2.74 (m, 2H), 2.43 (t, 2H), 2.19-2.08 (m, 2H), 1.08 (t, 3H).
参考例６
メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート

２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニルクロライド（１．１１ｇ、３．６６ｍｍｏｌ、中間体１０）のＤＣＭ（４５ｍＬ）中混合物にメチル－３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩（１．６４ｇ、５．５０ｍｍｏｌ、製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物４９を参照する。）及びトリエチルアミン（１．０ｍＬ、７．３２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。混合物を濃縮し、残留物をＩｓｏｌｕｔｅに吸着させ、フラッシュ－クロマトグラフィー（ＢｉｏｔａｇｅＩｓｏｌｅｒａ、５０ｇＳＮＡＰ－Ｕｌｔｒａシリカゲル、シクロヘキサン／酢酸エチル／メタノール勾配）によって精製した。合わせた生成物分画を濃縮し、真空乾燥して、標題化合物を得た（８９２ｍｇ、理論値の４４％、ＬＣ－ＭＳによる純度９６％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒｔ＝１．４２分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５３０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ [ppm]: 8.71-8.62 (m, 2H), 7.85-7.80 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.46-7.42 (m, 1H), 7.40-7.34 (m, 1H), 7.17 (d, 1H), 5.76-5.74 (m, 1H), 4.34-4.27 (m, 1H), 4.11-4.00 (m, 1H), 3.68-3.34 (m, 7H), 2.95-2.77 (m, 2H), 2.48-2.39 (m, 1H), 2.00-1.88 (m, 1H), 1.07 (t, 3H).
参考例７
メチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート

２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニルクロライド（４４５ｍｇ、純度９３％、１．３６ｍｍｏｌ、中間体１１）のＤＣＭ（１７ｍＬ）中混合物にトリエチルアミン（０．６３ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）及びメチル－３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩（４８１ｍｇ、１．６１ｍｍｏｌ、製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物４９を参照する。）を加え、混合物を室温で１５分間攪拌した。追加のメチル－３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩（４５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温でさらに１０分間攪拌した。次に、水を加え、相を分離した。水相をＤＣＭで２回抽出した。合わせた有機相を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。残留物をフラッシュ－クロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル／メタノール勾配）によって精製した。合わせた生成物分画を濃縮し、真空乾燥して、標題化合物を得た（６２０ｍｇ、理論値の８２％、ＮＭＲによる純度９５％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．４０分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５３０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 8.65 (t, 1H), 8.61 (d, 1H), 7.83 (d, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.44 (d, 1H), 7.38 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 5.71 (d, 1H), 4.33-4.27 (m, 1H), 4.10-4.04 (m, 1H), 3.62-3.48 (m, 3H), 3.45-3.38 (m, 4H), 2.95-2.87 (m, 1H), 2.86-2.77 (m, 1H), 2.47-2.40 (m, 1H), 2.00-1.91 (m, 1H), 1.07 (t, 3H).
参考例８
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－｛［２－メチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝－Ｓ－アラニナート

３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－｛［２－メチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝－Ｓ－アラニン（１５０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ、製造については、ＪｏｕｒｎｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１３，５６，９４４１－９４５６、化合物５１を参照する。）のＴＨＦ（３．０ｍＬ）中溶液に、ＨＢＴＵ（２１１ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（１０８μＬ、０．６２ｍｍｏｌ）及び２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エタノール（１１７ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１８９９４－７０－２）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。次に、混合物を水／アセトニトリルに取り、分取ＨＰＬＣ（方法４）によって精製した。合わせた生成物分画を濃縮し、残留物を凍結乾燥した。凍結乾燥物を酢酸エチルに溶かし、溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で数回洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。得られた残留物を真空乾燥して、標題化合物を得た（３１ｍｇ、理論値の１７％、純度１００％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．０８分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝５９４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 13.94 (br s, 1H), 8.65 (t, 1H), 8.59 (d, 1H), 7.75 (dd, 1H), 7.58 (d, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.48 (d, 1H), 7.44 (dd, 1H), 7.32 (t, 1H), 7.18 (d, 1H), 4.25-4.15 (m, 2H), 4.06-3.99 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.66-3.55 (m, 2H), 3.53-3.44 (m, 1H), 3.40-3.30 (1H, 不明瞭), 3.17 (t, 2H), 2.44 (t, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.18-2.10 (m, 2H).
参考例９
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニン（６０ｍｇ、１２０μｍｏｌ、中間体１５）のＴＨＦ（２．３ｍＬ）中溶液にＨＢＴＵ（８２ｍｇ、２１６μｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（６３μＬ、３６０μｍｏｌ）及び２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）エタノール（１９ｍｇ、１５０μｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ８０２０２７－２５－４）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。次に、混合物を水浴温度３０℃でのロータリーエバポレータによって濃縮し、残留物をアセトニトリル／ＴＦＡ／水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成させるため、ＴＦＡ含有バッチをアセトニトリル／水に溶かし、その溶液を重力により塩素イオン交換器（１．０ｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）に１０回通した。樹脂を脱イオン水／アセトンでリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（６４ｍｇ、理論値の８１％、純度９８％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．１１分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６０８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.26 (br s, 1H), 8.99 (s, 1H), 8.84 (t, 1H), 8.70 (d, 1H), 7.81 (dd, 1H), 7.60 (d, 1H), 7.45 (dd, 1H), 7.42 (s, 1H), 7.34 (t, 1H), 7.18 (d, 1H), 4.15 (t, 2H), 4.08-4.03 (m, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.69-3.57 (m, 2H), 3.57-3.50 (m, 1H), 3.47-3.40 (m, 1H), 2.93-2.78 (m, 4H), 2.43 (t, 2H), 2.17-2.10 (m, 2H), 1.08 (t, 3H).
参考例１０
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－｛［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）フェニル］スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニン（３５０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ、中間体１５）のＴＨＦ（１３．６ｍＬ）中溶液にＨＢＴＵ（４７８ｍｇ、１．２６ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（０．３７ｍＬ、２．１０ｍｍｏｌ）及び２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エタノール（１１６ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ、純度９５％、ＣＡＳ－ＲＮ１８９９４－７０－２）を加え、混合物を室温で４時間攪拌した。次に、混合物を水浴温度３０℃でのロータリーエバポレータによって濃縮し、残留物をアセトニトリル／ＴＦＡ／水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成させるため、ＴＦＡ含有バッチをアセトニトリル／水に溶かし、その溶液を重力により塩素イオン交換器（４．６７ｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）に１０回通した。樹脂を脱イオン水／アセトンでリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（３２１ｍｇ、理論値の９０％、純度９９％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法８）：Ｒ_ｔ＝０．６３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６０８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.43 (br s, 1H), 9.00-8.93 (m, 1H), 8.70 (d, 1H), 7.80 (dd, 1H), 7.70-7.66 (m, 1H), 7.58 (d, 1H), 7.53 (d, 1H), 7.44 (d, 1H), 7.32 (t, 1H), 7.18 (d, 1H), 4.28-4.20 (m, 2H), 4.08-4.03 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.70-3.57 (m, 2H), 3.54-3.47 (m, 1H), 3.46-3.39 (m, 1H), 3.23 (t, 2H), 2.91-2.83 (m, 1H), 2.83-2.74 (m, 1H), 2.42 (t, 2H), 2.17-2.09 (m, 2H), 1.06 (t, 3H).
参考例１１
３－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）プロピル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－［２－エチル－３－（２－オキソピロリジン－１－イル）ベンゼン－１－スルホニル］－Ｓ－アラニン（５０．０ｍｇ、１００μｍｏｌ、中間体１５）のＴＨＦ（１．９ｍＬ）中溶液に、ＨＢＴＵ（６８ｍｇ、１８０μｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（５２μＬ、３００μｍｏｌ）及び３－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）プロパン－１－オール（１８ｍｇ、純度９５％、１２５μｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１３６６０９－５８－０）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。次に、混合物を水浴温度３０℃でのロータリーエバポレータによって濃縮し、残留物をアセトニトリル／ＴＦＡ／水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成させるため、ＴＦＡ含有バッチをアセトニトリル／水に溶かし、その溶液を重力により塩素イオン交換器（４００ｍｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）に１０回通した。樹脂を脱イオン水／アセトンでリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（３３ｍｇ、理論値の４９％、純度９７％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．１６分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６２２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.25 (br s, 1H), 8.92 (t, 1H), 8.74 (d, 1H), 7.84 (dd, 1H), 7.65 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.45 (dd, 1H), 7.35 (t, 1H), 7.16 (d, 1H), 4.10-4.02 (m, 1H), 3.98-3.92 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.69-3.51 (m, 3H), 3.50-3.40 (m, 1H), 2.95-2.79 (m, 4H), 2.42 (t, 2H), 2.17-2.09 (m, 2H), 1.92-1.83 (m, 2H), 1.08 (t, 3H).
参考例１２
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン（６０ｍｇ、純度９４％、０．１１ｍｍｏｌ、中間体１６）のＴＨＦ（２．２ｍＬ）中溶液にＨＢＴＵ（７７ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（０．１０ｍＬ、０．５６ｍｍｏｌ）及び２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エタノール（１８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１８９９４－７０－２）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。次に、混合物を水浴温度３０℃でのロータリーエバポレータによって濃縮し、残留物をアセトニトリル／ＴＦＡ／水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成させるため、ＴＦＡ含有バッチをアセトニトリル／水に溶かし、その溶液を重力により塩素イオン交換器（４００ｍｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）に１０回通した。樹脂を脱イオン水でリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（３３ｍｇ、理論値の４５％、純度９８％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝０．９６分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６１０［Ｍ－ＨＣｌ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.27 (br s, 1H), 8.82 (t, 1H), 8.64 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.59 (d, 2H), 7.57 (d, 1H), 7.52 (d, 1H), 7.42 (d, 1H), 7.32 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 5.73 (br s, 1H), 4.32 (t, 1H), 4.29-4.17 (m, 2H), 4.06-4.01 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.57-3.44 (m, 3H), 3.41-3.35 (m, 1H), 3.20 (t, 2H), 2.47-2.38 (m, 1H), 2.34 (s, 3H), 2.02-1.91 (m, 1H).
参考例１３
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］－２－メチルベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン（６０ｍｇ、純度８９％、０．１１ｍｍｏｌ、中間体１７）のＴＨＦ（２．１ｍＬ）中溶液にＨＢＴＵ（７３ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（０．０９ｍＬ、０．５３ｍｍｏｌ）及び２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エタノール（１７ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１８９９４－７０－２）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。次に、混合物を水浴温度３０℃でのロータリーエバポレータによって濃縮し、残留物をアセトニトリル／ＴＦＡ／水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成させるため、ＴＦＡ含有バッチをアセトニトリル／水に溶かし、その溶液を重力により塩素イオン交換器（６００ｍｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）に１０回通した。樹脂を脱イオン水でリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（４５ｍｇ、理論値の６２％、純度９５％）。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.35 (br s, 1H), 8.87 (t, 1H), 8.66 (d, 1H), 7.77 (d, 1H), 7.62 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 7.53 (d, 1H), 7.44 (d, 1H), 7.33 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 5.71 (br s, 1H), 4.32 (t, 1H), 4.26-4.17 (m, 2H), 4.09-4.03 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.58-3.46 (m, 3H), 3.43-3.38 (m, 1H), 3.21 (t, 2H), 2.48-2.40 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.02-1.93 (m, 1H).
参考例１４
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン（１２０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、中間体２０）のＴＨＦ（４．５ｍＬ）中溶液に、ＨＢＴＵ（１５９ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（０．１２ｍＬ、０．７０ｍｍｏｌ）及び２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エタノール（３７ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１８９９４－７０－２）を加え、混合物を室温で終夜攪拌した。次に、混合物を水浴温度３０℃でのロータリーエバポレータによって濃縮し、残留物をに取りアセトニトリル／ＴＦＡ／水、によって精製した分取ＨＰＬＣ（方法２）。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有生成物を得た。塩酸塩を生成するため、ＴＦＡ含有生成物をアセトニトリル／水に溶かし、溶液を塩素イオン交換器（１．５ｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）で１０回溶離した。樹脂を脱イオン水でリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（９５ｍｇ、理論値の６１％、純度９９％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．０２分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６２４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.20 (s, 1H), 8.81 (br s, 1H), 8.66 (d, 1H), 7.81 (d, 1H), 7.60 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.34 (t, 1H), 7.18 (d, 1H), 4.30 (t, 1H), 4.27-4.21 (m, 2H), 4.06 (dd, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.63-3.56 (m, 1H), 3.55-3.47 (m, 2H), 3.46-3.39 (m, 1H), 3.22 (t, 2H), 2.92-2.84 (m, 1H), 2.83-2.75 (m, 1H), 2.48-2.40 (m, 1H), 2.00-1.91 (m, 1H), 1.06 (m, 3H)。

参考例１５
３－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）プロピル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン（６０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、中間体１９）のＴＨＦ（２．３ｍＬ）中溶液にＨＢＴＵ（７９ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（０．０８ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）及び３－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）プロパン－１－オール（２４．５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１３６６０９－５８－０）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。次に、混合物をアセトニトリル／ＴＦＡ／水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成させるため、ＴＦＡ含有バッチをに溶かしアセトニトリル／水、その溶液を重力により塩素イオン交換器（８８０ｍｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）に１０回通した。樹脂を脱イオン水でリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（１９ｍｇ、理論値の２２％、純度９０％）
ＬＣ－ＭＳ（方法９）：Ｒ_ｔ＝０．８３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６３８［Ｍ－ＨＣｌ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.06 (br s, 1H), 8.80 (t, 1H), 8.72 (d, 1H), 7.85 (dd, 1H), 7.60-7.57 (m, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.43 (dd, 1H), 7.37 (t, 1H), 7.16 (d, 1H), 5.75 (br s, 1H), 4.31 (t, 1H), 4.12-4.02 (m, 1H), 3.97 (t, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.65-3.53 (m, 2H), 3.51-3.42 (m, 2H), 2.96-2.84 (m, 4H), 2.47-2.40 (m, 1H), 1.99-1.80 (m, 3H), 1.07 (t, 3H).
参考例１６
３－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）プロピル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｒ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン（６０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、中間体２０）のＴＨＦ（２．３ｍＬ）中溶液にＨＢＴＵ（７９ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（０．０８ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）及び３－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）プロパン－１－オール（２４．５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１３６６０９－５８－０）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。混合物をアセトニトリル／ＴＦＡ／水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成させるため、ＴＦＡ含有バッチをアセトニトリル／水に溶かし、その溶液をに重力により塩素イオン交換器（５００ｍｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）１０回通した。樹脂を脱イオン水でリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（４３ｍｇ、理論値の４９％、純度９０％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法９）：Ｒ_ｔ＝０．８３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６３８［Ｍ－ＨＣｌ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.10 (br s, 1H), 8.84 (br s, 1H), 8.72 (d, 1H), 7.86 (dd, 1H), 7.62-7.57 (m, 2H), 7.55 (d, 1H), 7.44 (d, 1H), 7.37 (t, 1H), 7.16 (d, 1H), 5.75 (br s, 1H), 4.31 (t, 1H), 4.11-4.02 (m, 1H), 4.00-3.91 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.63-3.40 (m, 4H), 2.96-2.77 (m, 4H), 2.47-2.40 (m, 1H), 1.99-1.82 (m, 3H), 1.07 (t, 3H).
作業例
実施例１
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート

３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン（２．０ｇ、３．８８ｍｍｏｌ、中間体１９）のＤＣＭ（２０ｍＬ）及びＤＭＦ（４ｍＬ）中溶液に、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エタノール（９７８ｍｇ、７．７５ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１８９９４－７０－２）を加え、溶液を冷却して０℃とした。次に、Ｏｘｙｍａ（６６１ｍｇ、４．６５ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ３８４９－２１－６）を少量ずつ加え、次にＥＤＣＩ（８９２ｍｇ、４．６５ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ２５９５２－５３－８）を加え、混合物を０℃で１．５時間攪拌した。混合物を氷冷水（２０ｍＬ）で洗浄し、相分離後、有機相を氷冷水で３回洗浄した。３回目の洗浄時に、ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び１０％塩化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加えて相分離を改善した。次に、有機相を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮した。真空乾燥後、残留物を、塩基性シリカゲル相（Ｉｓｏｌｅｒａ、ＫＰ－ＮＨ２８ｇ、ＤＣＭ／アセトン勾配９：１→１：９）を用いるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。合わせた生成物分画を濃縮し、残留物を真空乾燥して、標題化合物を得た（１．５１ｇ、理論値の６２％、純度１００％）。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 9.09 (t, 1H), 8.65 (d, 1H), 7.82 (dd, 1H), 7.57 (d, 1H), 7.44 (dd, 1H), 7.38 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 7.03 (d, 1H), 6.74 (d, 1H), 5.75 (d, 1H), 4.34-4.01 (m, 4H), 3.66-3.56 (m, 1H), 3.51 (s, 3H), 3.50-3.39 (m, 3H), 2.94-2.70 (m, 4H), 2.48-2.38 (m, 1H), 2.01-1.87 (m, 1H), 1.06 (t, 3H).
ＩＲ：図１参照。

実施例２
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩

別途合成Ａ
３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニン（１９０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、中間体１９）のＴＨＦ（７．２ｍＬ）中溶液に、ＨＢＴＵ（２５１ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ９４７９０－３７－１）、ＤＩＰＥＡ（０．１９ｍＬ、１．１１ｍｍｏｌ）及び２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エタノール（９３ｍｇ、０．７４ｍｍｏｌ、ＣＡＳ－ＲＮ１８９９４－７０－２）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。次に、混合物を水浴温度３０℃でのロータリーエバポレータによって濃縮し、残留物をアセトニトリル／ＴＦＡ／水に取り、分取ＨＰＬＣ（方法２）によって精製した。凍結乾燥後、ＴＦＡ含有バッチを得た。相当する塩酸塩を生成させるため、ＴＦＡ含有バッチをアセトニトリル／水に溶かし、その溶液を重力により塩素イオン交換器（２．６６ｇアンバーライトＩＲＡ４０５Ｃｌ樹脂、脱イオン水でコンディショニング）に１０回通した。樹脂を脱イオン水でリンスし、その溶液を凍結乾燥して、標題化合物を得た（１２２ｍｇ、理論値の４９％、純度９８％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．０１分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６２４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.30 (br s, 1H), 8.88 (t, 1H), 8.69 (d, 1H), 7.81 (d, 1H), 7.63 (d, 1H), 7.57 (d, 1H), 7.53 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.33 (t, 1H), 7.18 (d, 1H), 5.74 (br s, 1H), 4.30 (t, 1H), 4.29-4.19 (m, 2H), 4.05 (dd, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.63-3.56 (m, 1H), 3.54-3.39 (m, 3H), 3.22 (t, 2H), 2.90-2.76 (m, 2H), 2.48-2.40 (m, 1H), 2.00-1.87 (m, 1H), 1.05 (t, 3H).
ＩＣ：４．６重量％クロライド、＜１重量％ＴＦＡ。

別途合成Ｂ
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（２．３１ｇ、３．７０ｍｍｏｌ、実施例１）のＤＣＭ（３．５ｍＬ）中溶液に、高攪拌及び氷浴での冷却下で、１Ｍ塩化水素／ジエチルエーテル溶液（４．０７ｍＬ、４．０７ｍｍｏｌ）を滴下し、次に攪拌性を向上させるために追加のジエチルエーテル（７０ｍＬ）を加えた。冷却下で１０分間及び室温で１５分間にわたり攪拌した後、沈澱を濾去し、ジエチルエーテル（１００ｍＬ）で洗浄した。次に、短時間の超音波処理で支援しながら、沈澱を再度氷冷水（２０ｍＬ）に溶かし、その溶液を凍結乾燥した。痕跡量のジエチルエーテルを除去するために、凍結乾燥を繰り返して、標題化合物を得た（２．０６ｇ、理論値の８４％、純度９９％）。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝０．９９分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６２４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

キラルＨＰＬＣ（方法１１）：Ｒ_ｔ＝９．１０分。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.42 (br s, 1H), 8.98 (t, 1H), 8.75 (d, 1H), 7.80 (dd, 1H), 7.68 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.33 (t, 1H), 7.19 (d, 1H), 5.80 (br s, 1H), 4.31 (t, 1H), 4.29-4.19 (m, 2H), 4.08-4.01 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.63-3.56 (m, 1H), 3.54-3.39 (m, 3H), 3.23 (t, 2H), 2.90- 2.73 (m, 2H), 2.48-2.40 (m, 1H), 2.00-1.87 (m, 1H), 1.05 (t, 3H).
ＩＣ：４．７重量％クロライド。

別途合成Ｃ
酢酸エチル（２．０ｍＬ）に６０℃で、攪拌しながら、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（３０ｍｇ、４８．１ｍｍｏｌ、実施例１）を加えた。溶液を冷却して室温とし、１Ｍ塩酸（５０．２ｍｇ、４９．２２ｍｍｏｌ）を加え、キャップを施したガラスバイアル中、その混合物を室温で２日間攪拌した。次に、キャップをパラフィルムテープに代え、針でテープに２～５個の穴を開け、混合物を室温でさらに１０日間ゆっくり攪拌して、溶媒をゆっくり蒸発させた。標題化合物を固体として得た。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．０３分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６２４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 14.40 (br s, 1H), 8.97 (t, 1H), 8.74 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.67 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 7.54 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.33 (t, 1H), 7.19 (d, 1H), 5.75 (br s, 1H), 4.31 (t, 1H), 4.28-4.19 (m, 2H), 4.08-4.00 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.63-3.56 (m, 1H), 3.54-3.39 (m, 3H), 3.23 (t, 2H), 2.90-2.74 (m, 2H), 2.48-2.41 (m, 1H), 1.98-1.92 (m, 1H), 1.05 (t, 3H).
ＸＲＰＤ：非晶質；ＩＲ：図２参照。

実施例３
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート硫酸塩

酢酸エチル（２．０ｍＬ）に６０℃で、攪拌しながら、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（３０ｍｇ、４８．１ｍｍｏｌ、実施例１）を加えた。溶液を冷却して室温とし、０．５Ｍ硫酸（１００．６ｍｇ、４７．９０ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を室温で２日間攪拌した。次に、キャップをパラフィルムテープに代え、針でテープに２～５個の穴を開け、混合物を室温でさらに１０日間ゆっくり攪拌して、溶媒をゆっくり蒸発させた。標題化合物を固体として得た。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 13.94 (br s, 1H), 8.70 (t, 1H), 8.64 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.62-7.56 (m, 1H), 7.55 (d, 1H), 7.52 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.34 (t, 1H), 7.21-7.17 (m, 1H), 4.36-4.27 (m, 1H), 4.27-4.17 (m, 2H), 4.11-3.97 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.64-3.55 (m, 1H), 3.55-3.34 (m, 3H), 3.21 (t, 2H), 2.91-2.75 (m, 2H), 2.49-2.41 (m, 1H), 2.01-1.92 (m, 1H), 1.06 (t, 3H).
ＸＲＰＤ：非晶質；ＩＲ：図３参照。

実施例４
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートメタンスルホン酸塩

酢酸エチル（２．０ｍＬ）に６０℃で、攪拌しながら、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（３０ｍｇ、４８．１ｍｍｏｌ、実施例１）を加えた。溶液を冷却して室温とし、メタンスルホン酸（４．９ｍｇ、５１．０ｍｍｏｌ）を加え、キャップを施したガラスバイアル中、その混合物を室温で２日間攪拌した。次に、キャップをパラフィルムテープに代え、針でテープに２～５個の穴を開け、混合物を室温でさらに１０日間ゆっくり攪拌して、溶媒をゆっくり蒸発させた。標題化合物を固体として得た。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 13.97 (br s, 1H), 8.72 (t, 1H), 8.65 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.55 (d, 1H), 7.53 (d, 1H), 7.43 (d, 1H), 7.34 (t, 1H), 7.19 (d, 1H), 5.75 (br s, 1H), 4.31 (t, 1H), 4.27-4.18 (m, 2H), 4.09-3.98 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.63-3.57 (m, 1H), 3.55-3.36 (m, 3H), 3.21 (br t, 2H), 2.91-2.74 (m, 2H), 2.48-2.41 (m, 1H), 2.34 (s, 3H), 1.98-1.88 (m, 1H), 1.06 (t, 3H).
ＸＲＰＤ：非晶質；ＩＲ：図４参照。

実施例５
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート４－メチルベンゼンスルホン酸塩

酢酸エチル（２．０ｍＬ）に６０℃で、攪拌しながら、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（３０ｍｇ、４８．１ｍｍｏｌ、実施例１）を加えた。溶液を冷却して室温とし、４－トルエンスルホン酸（９．６ｍｇ、５５．７ｍｍｏｌ）を加え、キャップを施したガラスバイアル中、その混合物を室温で２日間攪拌した。次に、キャップをパラフィルムテープに代え、針でテープに２～５個の穴を開け、混合物を室温でさらに１０日間ゆっくり攪拌して、溶媒をゆっくり蒸発させた。標題化合物を固体として得た。

ＬＣ－ＭＳ（方法７）：Ｒ_ｔ＝１．０２分；ＭＳ（ＥＳＩｐｏｓ）：ｍ／ｚ＝６２４［Ｍ＋Ｈ］^＋及びＲ_ｔ＝０．５７分、ＭＳ（ＥＳＩｎｅｇ）：ｍ／ｚ＝１７１［Ｍ－Ｈ］^－。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 13.92 (br s, 1H), 8.69 (br t, 1H), 8.64 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.60-7.56 (m, 1H), 7.55 (d, 1H), 7.52 (d, 1H), 7.48 (d, 2H), 7.43 (d, 1H), 7.36-7.31 (m, 1H), 7.21-7.16 (m, 1H), 7.11 (d, 2H), 4.35-4.28 (m, 1H), 4.27-4.17 (m, 2H), 4.07-4.00 (m, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.63-3.56 (m, 1H), 3.54-3.36 (m, 3H), 3.20 (br t, 2H), 2.91-2.75 (m, 2H), 2.48-2.41 (m, 1H), 2.29 (s, 3H), 2.02-1.92 (m, 1H), 1.09-1.03 (m, 3H).
ＸＲＰＤ：非晶質；ＩＲ：図５参照。

実施例６
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートマレイン酸塩

酢酸エチル（２．０ｍＬ）に６０℃で、攪拌しながら、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（３０ｍｇ、４８．１ｍｍｏｌ、実施例１）を加えた。溶液を冷却して室温とし、マレイン酸（５．８ｍｇ、５０．０ｍｍｏｌ）を加え、キャップを施したガラスバイアル中、その混合物を室温で２日間攪拌した。次に、キャップをパラフィルムテープに代え、針でテープに２～５個の穴を開け、混合物を室温でさらに１０日間ゆっくり攪拌して、溶媒をゆっくり蒸発させた。標題化合物を固体として得た。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 8.75 (br t, 1H), 8.65 (br d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.52 (d, 1H), 7.50 (d, 1H), 7.45-7.40 (m, 2H), 7.38-7.32 (m, 1H), 7.19 (d, 1H), 6.07 (s, 2H), 5.76 (br s, 1H), 4.31 (t, 1H), 4.23 (br t, 2H), 4.09-3.99 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.65-3.56 (m, 1H), 3.52-3.37 (m, 3H), 3.13 (br t, 2H), 2.91-2.75 (m, 2H), 2.48-2.41 (m, 1H), 1.97-1.90 (m, 1H), 1.06 (t, 3H).
ＸＲＰＤ：非晶質；ＩＲ：図６参照。

実施例７
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートリン酸塩

酢酸エチル（２．０ｍＬ）に６０℃で、攪拌しながら、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（３０ｍｇ、４８．１ｍｍｏｌ、実施例１）を加えた。溶液を冷却して室温とし、１Ｍリン酸（４８．７ｍｇ、４６．３８ｍｍｏｌ）を加え、キャップを施したガラスバイアル中、その混合物を室温で２日間攪拌した。次に、キャップをパラフィルムテープに代え、針でテープに２～５個の穴を開け、混合物を室温でさらに１０日間ゆっくり攪拌して、溶媒をゆっくり蒸発させた。標題化合物を固体として得た。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 9.10 (t, 1H), 8.79-8.58 (br m, 1H), 7.82 (d, 1H), 7.57 (d, 1H), 7.47-7.40 (m, 1H), 7.40-7.35 (m, 1H), 7.17 (d, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 4.30 (t, 1H), 4.25-4.11 (m, 2H), 4.09-4.04 (m, 1H), 3.65-3.57 (m, 1H), 3.54 (s, 3H), 3.51-3.37 (m, 3H), 2.93-2.77 (m, 4H), 2.47-2.39 (m, 1H), 1.97-1.90 (m, 1H), 1.06 (t, 3H).
ＸＲＰＤ：非晶質；ＩＲ：図７参照。

実施例８
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート（２Ｒ，３Ｒ）－酒石酸塩

酢酸エチル（２．０ｍＬ）に６０℃で、攪拌しながら、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（３０ｍｇ、４８．１ｍｍｏｌ、実施例１）を加えた。溶液を冷却して室温とし、（２Ｒ，３Ｒ）－酒石酸（７．４ｍｇ、４９．３ｍｍｏｌ）を加え、キャップを施したガラスバイアル中、その混合物を室温で２日間攪拌した。次に、キャップをパラフィルムテープに代え、針でテープに２～５個の穴を開け、混合物を室温でさらに１０日間ゆっくり攪拌して、溶媒をゆっくり蒸発させた。標題化合物を固体として得た。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 9.09 (br t, 1H), 8.67 (br s, 1H), 7.82 (d, 1H), 7.57 (d, 1H), 7.44 (d, 1H), 7.38 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 4.30 (t, 1H), 4.25-4.22 (m, 2H), 4.22-4.10 (m, 2H), 4.06-4.00 (m, 1H), 3.53 (s, 3H), 3.50-3.38 (m, 3H), 2.92-2.74 (m, 4H), 2.47-2.40 (m, 1H), 1.98-1.90 (m, 1H), 1.06 (t, 3H).
ＸＲＰＤ：非晶質；ＩＲ：図８参照。

実施例９
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート・クエン酸塩

酢酸エチル（１０．０ｍＬ）に６０℃で、攪拌しながら、２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート（１００ｍｇ、１６０．２ｍｍｏｌ、実施例１）を加えた。溶液を冷却して室温とし、クエン酸（３１ｍｇ、１６１．４ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（８ｍＬ）中溶液を室温で加えたところ、白色固体の沈澱が生じた。キャップを施したガラスバイアル中、その混合物を室温で５日間攪拌し、その後に沈澱を濾去し、風乾して、標題化合物を固体として得た。

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ [ppm]: 9.01 (t, 1H), 8.66 (d, 1H), 7.82 (dd, 1H), 7.56 (d, 1H), 7.44 (dd, 1H), 7.37 (t, 1H), 7.17 (d, 1H), 7.15 (d, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.30 (t, 1H), 4.25-4.11 (m, 2H), 4.07-4.01 (m, 1H), 3.65-3.58 (m, 1H), 3.57 (s, 3H), 3.50-3.40 (m, 3H), 2.92-2.79 (m, 4H), 2.70 (d, 2H), 2.61 (d, 2H), 2.48-2.40 (m, 1H), 1.98-1.90 (m, 1H), 1.06 (t, 3H).
ＸＲＰＤ：非晶質；ＩＲ：図９参照。

表１：実施例１及び塩型（実施例２～９）の赤外線分光法

Ｂ）生理的効力の評価
本発明による化合物の血栓塞栓性障害の治療への好適性を、以下のアッセイシステムで示すことができる。

ａ）試験の説明（イン・ビトロ）
ａ．１）緩衝液中の第Ｘａ因子阻害の測定
上記で挙げた物質の第Ｘａ因子阻害を確認するため、第Ｘａ因子基質の変換を用いてヒト第Ｘａ因子の酵素活性を求める生物学的試験システムを構築する。ここで、第Ｘａ因子は、ペプチド性基質から、蛍光的に測定されるアミノメチルクマリンを開裂させる。測定はマイクロタイタープレートで実施する。

試験物質をジメチルスルホキシドに各種濃度で溶かし、ヒト第Ｘａ因子（１．３ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液［Ｃ，Ｃ，Ｃ－トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム、０．１％ＢＳＡ［ウシ血清アルブミン］、ｐＨ７．４に溶かしたもの０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ）とともに２２℃で１５分間インキュベートする。基質（５μｍｏｌ／ＬＢｏｃ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、Ｂａｃｈｅｍから）を加える。３０分間インキュベートした後、サンプルを３６０ｎｍの波長で励起し、発光を４６０ｎｍで測定する。試験物質を含む試験バッチの測定された発光を、試験物質を含まない対照バッチ（試験物質のジメチルスルホキシド中溶液ではなくジメチルスルホキシドのみ）の発光と比較し、濃度／活性関係から、ＩＣ_５０値を計算する。この試験からの代表的な活性データを下記の表２ａ及び２ｂに列記している。

ａ．２）緩衝液中のトロンビン阻害の測定
上記で挙げた物質のトロンビン阻害を確認するため、トロンビン基質の変換を用いてヒトトロンビンの酵素活性を求める生物学的試験システムを構築する。ここで、トロンビンは、ペプチド基質から、蛍光的に測定されるアミノメチルクマリンを開裂させる。測定はマイクロタイタープレートで実施する。

試験物質をジメチルスルホキシドに各種濃度で溶かし、ヒトトロンビン（５０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ緩衝液［Ｃ，Ｃ，Ｃ－トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ［ウシ血清アルブミン］、ｐＨ７．４に溶かしたもの０．０６ｎｍｏｌ／Ｌ）とともに２２℃で１５分間インキュベートする。基質（５μｍｏｌ／ＬＢｏｃ－Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、Ｂａｃｈｅｍから）を加える。３０分間インキュベートした後、サンプルを３６０ｎｍの波長で励起し、発光を４６０ｎｍで測定する。試験物質を含む試験バッチの測定された発光を、試験物質を含まない対照バッチ（試験物質のジメチルスルホキシド中溶液ではなくジメチルスルホキシドのみ）の発光と比較し、濃度／活性関係から、ＩＣ_５０値を計算する。この試験からの代表的な活性データを下記の表２ａ及び２ｂに列記している。

ａ．３）選択性の測定
トロンビン及び第Ｘａ因子阻害に関する物質の選択性を示すため、第ＸＩａ因子、トリプシン、プラスミン、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）及び血漿カリクレインなどの他のヒトセリンプロテアーゼの阻害について、試験物質を調べる。測定は、マイクロタイタープレートで行う。第ＸＩａ因子（０．１５ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｋｏｒｄｉａから）、トリプシン（４２ｍＵ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａから）、プラスミン（０．１μｇ／ｍＬ、Ｋｏｒｄｉａから）、ＴＰＡ（１ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｋｏｒｄｉａから）及び血漿カリクレイン（０．２ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｌｏｘｏから）の酵素活性を測定するため、これらの酵素を溶解し（５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ緩衝液［Ｃ，Ｃ，Ｃ－トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．１％ＢＳＡ［ウシ血清アルブミン］、５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、ｐＨ７．４）、ジメチルスルホキシド中の各種濃度の試験物質と、そして、試験物質を含まないジメチルスルホキシドと、１５分間インキュベートする。次いで、適当な基質（第ＸＩａ因子についてはＢａｃｈｅｍからの５μｍｏｌ／ＬのＢｏｃ－Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、トリプシンについてはＢａｃｈｅｍからの５μｍｏｌ／ＬのＢｏｃ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、プラスミンについてはＢａｃｈｅｍからの５０μｍｏｌ／ＬのＭｅＯＳｕｃ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－ＡＭＣ、ＴＰＡについてはＰｅｎｔａｐｈａｒｍからの５μｍｏｌ／ＬのＣＨ３ＳＯ２－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、及び血漿カリクレインについてはＢａｃｈｅｍからの５μｍｏｌ／ＬのＨ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ＡＭＣ）の添加により酵素反応を開始する。２２℃で３０分間のインキュベーション時間の後、蛍光を測定する（励起：３６０ｎｍ、発光：４６０ｎｍ）。試験物質を含む試験バッチの測定された発光を、試験物質を含まない対照バッチ（試験物質ジメチルスルホキシド中溶液ではなく、ジメチルスルホキシドのみ）と比較し、濃度／活性関係から、ＩＣ_５０値を計算する。この試験からの代表的な活性データを、下記の表２ａ及び２ｂに列記している。

表２ａ：

表２ｂ：

ａ．４）血漿サンプル中の阻害薬候補剤の第Ｘａ因子阻害活性の測定
血漿サンプル中の第Ｘａ因子の阻害を測定するため、血漿中に存在する第Ｘ因子を、ガラガラヘビ毒素からのプロテアーゼによって活性化する。次に、第Ｘａ因子活性又は阻害薬候補剤によるそれの阻害を、発色性基質を加えることで測定する。

各種濃度の被験物質をジメチルスルホキシドに溶かし、レフルダン水溶液（１０μｇ／ｍＬ）と混和する。平底を有する透明９６ウェルプレートで、クエン酸塩血漿（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）３０μＬを物質希釈液１０μＬと混和する。次に、ガラガラヘビ毒素（ラッセルクサリヘビ毒（ＲＶＶ）；ＲＶＶ試薬：Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ１２１－０６、最終濃度０．６ｍＵ）の塩化カルシウム緩衝水溶液中溶液（最終塩化カルシウム濃度０．０５Ｍ）２０μＬ又はＲＶＶ試薬を含まない塩化カルシウム水溶液（最終塩化カルシウム濃度０．０５Ｍ）２０μＬ（非刺激サンプルの基準として）を加える。ＣｈｒｏｍｏｚｙｍＸ基質（最終濃度１．６ｍｍｏｌ／Ｌ、ＢａｃｈｅｍＬ－１５６５、水で希釈）２０μＬを加えた後、２０分の期間にわたり、毎分４０５ｎｍの測定フィルターを用いるＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒＲｅａｄｅｒでサンプルを測定する。最大シグナルの約７０％に達した時に（約１２分）、ＩＣ_５０値を求める。これらの試験からの代表的な活性データを、下記の表３ａ及び３ｂに列記している。

ａ．５）血漿サンプル中の阻害薬候補剤のトロンビン阻害活性の測定
各種濃度の被験物質をジメチルスルホキシドに溶かし、水で希釈する。平底を有する透明９６ウェルプレートで、物質希釈液２０μＬを、エカリン溶液（エカリン試薬、ＳｉｇｍａＥ－０５０４から、最終濃度２０ｍＵ／バッチ）のＣａ緩衝液（２００ｍＭＨｅｐｅｓ＋５６０ｍＭ塩化ナトリウム＋１０ｍＭ塩化カルシウム＋０．４％ＰＥＧ）中溶液２０μＬ又はＣａ緩衝液（非刺激対照として）２０μＬと混和する。さらに、蛍光性トロンビン基質（ＢａｃｈｅｍＩ－１１２０から、最終濃度５０μｍｏｌ／Ｌ）２０μＬ及びクエン酸塩血漿（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａから）２０μＬを加え、十分に均質化する。２０分の期間にわたり、毎分３６０ｎｍの励起フィルター及び４６５ｎｍの発光フィルターを用いてＳｐｅｃｔｒａＦｌｕｏｒＲｅａｄｅｒでプレートを測定する。最大シグナルの約７０％に達した時に（約１２分）、ＩＣ_５０値を求める。これらの試験からの代表的な活性データを、下記の表３ａ及び３ｂに列記している。

表３ａ：

表３ｂ：

ａ．６）トロンビン発生アッセイ（トロンボグラム）
トロンボグラム（Ｈｅｍｋｅｒによるトロンビン発生アッセイ）に対する試験物質の効果を、ヒト血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａから）においてイン・ビトロで求める。Ｈｅｍｋｅｒによるトロンビン発生アッセイでは、基質Ｉ－１１４０（Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ、Ｂａｃｈｅｍ）の蛍光性開裂生成物を測定することで、血漿凝固におけるトロンビンの活性を求める。Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅからの試薬（ＰＰＰ試薬：３０ｐＭ組換え組織因子、２４μＭリン脂質のＨＥＰＥＳ中溶液）を用いて、凝固反応を開始する。反応は、多様な濃度の試験物質又は相当する溶媒の存在下に行う。さらに、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅからのトロンビン較正物質を用い、それのアミド分解活性が、血漿サンプルにおけるトロンビン活性を計算するのに必要である。

その試験は、製造者（ＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅＢＶ）の説明書に従って行う。試験物質又は溶媒４μＬ、血漿７６μＬ及びＰＰＰ試薬若しくはトロンビン較正物質２０μＬを、３７℃で５分間インキュベートする。２．５ｍＭトロンビン基質の２０ｍＭ／Ｈｅｐｅｓ、６０ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、１０２ｍＭ塩化カルシウム２０μＬを加えた後、１２０分間の期間にわたり２０秒ごとにトロンビン発生を測定する。測定は、３９０／４６０ｎｍフィルター対及びディスペンサーを取り付けたＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎからの蛍光光度計（ＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＡｓｃｅｎｔ）を用いて行う。Ｔｈｒｏｍｂｏｓｃｏｐｅソフトウェアを用い、トロンボグラムを計算し、グラフで提供する。計算するものは、次のパラメータ：遅延時間、ピークまでの時間、ピーク、ＥＴＰ（内因性トロンビン生成能）及びスタート・テール（ｓｔａｒｔｔａｉｌ）である。

ａ．７）抗凝血活性の測定
試験物質の抗凝血活性を、イン・ビトロで、ヒト血漿、ウサギ血漿及びラット血漿で測定する。このためには、０．１１モル濃度のクエン酸ナトリウム溶液をレシーバーとして使用して、クエン酸ナトリウム／血液の混合比１／９で、採血する。採血直後に、それを十分に混和し、約４０００ｇで１５分間遠心する。上清をピペットで取る。

プロトロンビン時間（ＰＴ、同義語：トロンボプラスチン時間、クイック試験）を、各種濃度の試験物質又は相当する溶媒の存在下で、市販の試験キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍからのＮｅｏｐｌａｓｔｉｎ（登録商標）又はＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙからのＨｅｍｏｌｉａｎｃｅ（登録商標）ＲｅｃｏｍｂｉＰｌａｓｔｉｎ）を使用して測定する。試験化合物を、血漿と共に、３７℃で、３分間インキュベートする。次いで、トロンボプラスチンの添加により凝固を開始させ、凝固が起こる時間を測定する。プロトロンビン時間を倍増させる試験物質の濃度を求める。

トロンビン時間（ＴＴ）は、市販の試験キット（Ｒｏｃｈｅからのトロンビン試薬）を用いて、多様な濃度の試験物質又は相当する溶媒の存在下に求める。試験化合物を、３７℃で３分間にわたり血漿とともにインキュベートする。次に、トロンビン試薬を加えることで凝固を開始し、凝固が起こる時間を測定する。トロンビン時間の倍増を生じる試験物質の濃度を求める。

活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を、各種濃度の試験物質又は相当する溶媒の存在下で、市販の試験キット（ＰＴＴ試薬、Ｒｏｃｈｅから）を使用して測定する。試験化合物を、血漿及びＰＴＴ試薬（セファリン、カオリン）と、３７℃で３分間インキュベートする。次いで、２５ｍＭ塩化カルシウムの添加により凝固を開始させ、凝固が起こる時間を測定する。ＡＰＴＴを倍増させる試験物質の濃度を求める。

ａ．８）トロンボエラストグラフィー（トロンボエラストグラム）
トロンボエラストグラフィーは、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍからのトロンボエラストグラフィー装置ＲＯＴＥＭ及びそれの付属品であるカップ及びピンを用いて行う。測定は、Ｓａｒｓｔｅｄｔからのクエン酸ナトリウムモノベット（ｍｏｎｏｖｅｔｔｅｓ）に予め採取しておいた全血で行う。モノベット中の血液を、振盪器を用いて揺動状態に維持し、３７℃で３０分間前インキュベートする。

２Ｍ塩化カルシウム水溶液原液を調製する。これを０．９％強度塩化ナトリウム水溶液で１：１０希釈する。測定のため、最初に、この２００ｍＭ塩化カルシウム溶液２０μＬをカップに入れる（塩化カルシウムの最終濃度１２．５ｍＭ）。物質又は溶媒３．２μＬを加える。全血３００μＬを加えることで測定を開始する。添加後、ピペットの先端を用いて、混合物を短時間でピペットに吸い取り、気泡が発生しないようにしながら再度吐出させる。その測定を２．５時間にわたって実施し、線維素溶解が始まったら停止する。評価のため、次のパラメータ：ＣＴ（凝固時間／［秒］）、ＣＦＴ（凝固塊形成時間／［秒］）、ＭＣＦ（最大凝固塊硬度／［ｍｍ］）及びα角［°］を求める。測定点は３秒ごとに求め、ｙ軸をＭＣＦ［ｍｍ］とし、ｘ軸を時間［秒］としてグラフ表示する。

ａ．９）進行中の凝固の阻害
試験化合物を１０ｍＭストック溶液としてＤＭＳＯに溶解し、０．０１８～６００μＭの連続希釈液をＤＭＳＯで調製する。

白色３８４ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ２００、Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、Ｏｃｔａｐｌａｓ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍ）２０μＬ、蒸留水１０μＬ、ＰｅｆａｂｌｏｃＦＧ（ＤＳＭ、２４ｍＭ）１０μｌＬ及び蛍光性トロンビン基質（ＢＡＣＨＥＭ、Ｉ－１５６０、３００μＭ）１０μＬを加える。凝固を開始するために、組織因子（ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｒｅｃｏｍｂｉｐｌａｓｔｉｎ２Ｇ、０．０６％）とＣａＣｌ_２（４０ｍＭ）の混合物１０μＬを添加する。基質の開裂によって生じる蛍光シグナルを、ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００Ｐｒｏを使用して、３７℃、励起波長３４０ｎｍ及び発光波長４６０ｎｍで３０秒ごとに２０分間測定する。蛍光シグナルが倍増した後、ＤＭＳＯ中の化合物溶液１μＬを各ウェルに添加し、測定を継続する。試験化合物が進行中の凝固を阻害できるか否かは、化合物添加後の蛍光シグナルの傾きによって決定される。

ａ．１０）組織因子によって開始される血小板凝集の阻害
全血を、健常な男性及び女性から静脈穿刺によって採取する。検体を、１／１０体積の３．１２％クエン酸三ナトリウムを含む採血管に入れ、血液を２０℃で２０分間にわたり１４０ｇで直ちに遠心分離して血小板豊富血漿（ＰＲＰ）を得る。血小板数を調節するには、ＰＲＰを乏血小板血漿で３００，０００～３５０，０００血小板／μＬに希釈する。乏血小板血漿は、ＰＲＰを２０℃で２０分間にわたり１０００ｇで遠心することによって得られる。ＰｅｆａｂｌｏｃＦＧ（Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｏｔｚｅｒｌａｎｄ）を脱塩水に溶解し（２ｍｇ／ｍＬ；最終濃度）、フィブリン重合を防ぐために添加する。ＣａＣｌ_２（７ｍｍｏｌ／Ｌ、最終濃度）の添加後、小分けサンプル（１７８μＬ）を凝集計（Ａｐａｃｔ４、ＤｉａＳｙｓＧｒｅｉｎｅｒ，Ｆｌａｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に直ちに入れる。サンプルに、濃度を上昇させながら試験化合物（血漿濃度０．３～１０μｍｏｌ／Ｌ）又はビヒクル２μＬを添加し、３７℃で３分間インキュベートする。１０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２水溶液に溶解した組織因子（ＲｅｃｏｍｂｉＰｌａｓＴｉｎ２Ｇ；ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）２０ｍＬの添加により血小板凝集を誘発する（製造業者の説明書に従って）。個々の組織因子濃度（１０ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２溶液で１：１０～１：２５００に希釈）を使用して、各実験の最小組織因子濃度を達成し、最大の凝集をもたらす。凝集を比濁法で測定し、１０分間にわたって記録し、凝集応答を濃度－時間曲線の下の面積として評価する。ボルツマン検定（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ）を使用してＩＣ_５０値を計算する。

ａ．１１）全血でのＬＰＳ又は熱不活化黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）誘発性凝固の阻害
１０^１０個の熱殺菌黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を水１ｍＬに溶かし、０．９％ＮａＣｌ水溶液で希釈することによって１０^９～１０^６個の細胞を含む溶液を調製する。リポ多糖類（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ）を０．９％ＮａＣｌ水溶液に溶かして、０．００５ｍｇ／ｍＬ溶液を得る。

新鮮な全血を、健常な男性と女性から静脈穿刺によって、１／１０体積の３．１２％クエン酸三ナトリウムを含む採血管に採取する。試験化合物のＤＭＳＯ中溶液（０～２０μＭ、最終濃度）１０μｌ及び加熱殺菌黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）又はＬＰＳを含むトリガー溶液１０μＬをクエン酸処理全血９８０μＬに加え、穏やかに混合し、３７℃で４時間インキュベートする。

混合物１５０μＬと０．１Ｍ塩化カルシウム溶液２０μＬをキュベットに加え、凝固時間の測定を開始する（Ａｐａｃｔ４，ＤｉａＳｙｓＧｒｅｉｎｅｒ，Ｆｌａｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。各種濃度の対照サンプル及び化合物サンプルの凝固時間を比較して、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用して凝固時間を２倍にするのに必要な濃度を計算する。

ａ．１２）トロンビン存在下での内皮層の完全性に対する影響
ヒト組換え上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、ヘパリンを含む塩基性ヒト線維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ－Ｂ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヒト組換えインスリン様増殖因子（長鎖Ｒ３－ＩＧＦ－１）、ヘパリン、ＧＡ－１０００、及び２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した内皮細胞基礎培地－２（ＥＢＭ－２）５０μＬを、Ｅ－Ｐｌａｔｅ９６（ＯＬＳＯｍｎｉＬｉｆｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の各ウェルに充填し、次にそれをＡＣＥＡ－ＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）上に置いて、培地のバックグラウンドインピーダンスを測定する。

凍結保存でプールされたヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｌｏｎｚａ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｃ２５１９ａ）を、ヒト組換え上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、ヘパリンを含む塩基性ヒト線維芽細胞増殖因子（ｈＦＧＦ－Ｂ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヒト組換えインスリン様増殖因子（長鎖Ｒ３－ＩＧＦ－１）、ヘパリン、ＧＡ－１０００及び２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充した内皮細胞基礎培地－２（ＥＢＭ－２）で増殖及び維持させる。細胞を、５％ＣＯ_２を含む加湿空気中３７℃で培養する。

継代３で２００００個の細胞を含む培地５０μＬを各ウェルに添加する。プレートを、ＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅＲＴＣＡ装置のインキュベータで、３７℃及び５％ＣＯ_２で２４時間維持する。次に、被験化合物のＤＭＳＯ中溶液又はＤＭＳＯ単独１０μＬを各ウェルに添加し、インピーダンスを３０分間にわたって５分ごとに測定する。続いて、トロンビンの溶液（最終濃度０．１Ｕ／ｍｌ）４０μＬを加え、インピーダンスを５分ごとに１９０分間にわたり再度測定する。

細胞接着の強さを、ＲＴＣＡソフトウェアによって細胞指数として表し、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍを使用して、ブランク実験を行って、異なる化合物濃度間で比較する。

ｂ）抗血栓活性の測定（イン・ビボ）
ｂ．１）動静脈シャント及び出血モデル（混合モデルウサギ）
体重２７００～３５００ｇの雄ウサギ（ニュージーランド白ウサギ；Ｃｒｌ：ＫＢＬ（ＮＺＷ））に２％キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ，ＢａｙｅｒＶｉｔａｌ）及び１００ｍｇ／ｍＬケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ、Ｚｏｅｔｉｓ）で麻酔を施す。ＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒＮ．Ｂｅｒｒｙｅｔａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９９４），１１３，１２０９－１２１４によって記載の方法に従って、動静脈シャントで血栓形成を開始する。そのために、左顔面静脈と右頸動脈を切開する。１０ｃｍポリエチレン管の体外シャントを用いて、両方の血管をつなぐ。この管を、サンドペーパーで粗くして折りたたんで３ｃｍのループとした６ｃｍナイロン糸（直径０．１４ｍｍ）を含む別の長さ４ｃｍのポリエチレン管（ＰＥ２４０）に入れる。この糸は、凝固を誘発するのに必要な血栓形成表面を提供する。体外循環を１５分間維持してから、シャントを取り出し、ナイロン糸を血栓とともに秤量する。ナイロン糸の風袋重量を求めてから、実験を行う。出血時間を求めるため、滅菌メスを用いて末梢耳静脈の隣で０．５ｃｍの切開を行う。３０秒ごとに、出血が止まるまで血液を濾紙で拭き取る。試験化合物を連続静脈内注入として与えてから３０分後に、大腿静脈を介して動静脈シャントを開く。

ｂ．２）エンドトキシン血症モデルにおける有効性の判定（イン・ビボ）
ｂ．２．１）ＬＰＳ誘発エンドトキシン血症ウサギモデル
実験は、麻酔を施した雄ウサギ（ニュージーランド白ウサギ）で行う。５ｍｇ／ｋｇの２％キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ，ＢａｙｅｒＶｉｔａｌ）及び４０ｍｇ／ｋｇの１００ｍｇ／ｍＬケタミン（Ｋｅｔａｖｅｔ，Ｐｆｉｚｅｒ）の筋肉注射によって麻酔を導入し、その後２％キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ，ＢａｙｅｒＶｉｔａｌ）及び１００ｍｇ／ｍＬケタミン（Ｋｅｔａｖｅｔ，Ｐｆｉｚｅｒ）を連続注入する。

エンドトキシン血症を誘発するため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＬＰＳ０５５：Ｂ５；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；ＬＯＴ０２５Ｍ４０４０Ｖ）由来のリポ多糖１００μｇ／ｋｇ／ｈを左大腿静脈から８時間連続注入する。試験化合物を、右大腿静脈を介して継続注入する。心拍数及び動脈血圧などの血行力学パラメータを継続的に測定するために、マイクロチップ圧力カテーテル（ＳＰＲ－５９５；ＭｉｌｌａｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を左大腿動脈に埋め込む。動脈血サンプルを、１時間に１回、右大腿動脈から８時間にわたり採取する。全血検体から得られる読取パラメータには、血球数（血小板、白血球、赤血球）、凝固パラメータ（ＰＴ、ａＰＴＴ）、及び回転トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ）などがある。血漿を全血の一部から得て、炎症マーカー（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α）、フィブリノーゲンレベル、及び血清クレアチニンや肝酵素（ＡＬＴやＡＳＴなど）などの末端器官損傷のバイオマーカーを測定する。

ｂ．２．２）熱失活黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）の注入によって誘発される敗血症のヒヒモデル
動物を１２時間絶食させてから処置を行い、水を自由に与える。各動物は、固有のタトゥー番号によって識別される。実験前に動物の体重を計測して、麻酔薬の適切な用量と菌血症の負荷を計算する。

動物をまず塩酸ケタミン（１４～２０ｍｇ／ｋｇ／ＩＭ）で鎮静させ、次いでペントバルビタールナトリウム（２５ｍｇ／ｋｇ／ＩＶ）を３０分ごとに投与するか、まぶた及び足指のつまみ反射をモニタリングすることによって麻酔を維持するのに必要と思われる場合に投与して麻酔する。麻酔を施した動物を継続的にモニタリングし、処置中には適切なレベルの麻酔薬及び生命維持を提供する。麻酔中、肺の沈下性鬱血を防ぐために、８～１０時間の麻酔を通じて動物を左右に揺らす。静脈カテーテルを配置して、流体や薬剤へのアクセスを提供する。８～１０時間の麻酔中、生理食塩水を約５ｍｌ／ｋｇ／ｈｒの速度で注入して、麻酔の水分補給への影響を最小限に抑え、採血による血液量の損失を補う。キングビジョンビデオ喉頭鏡を使用して麻酔下で経口挿管を行って、誤嚥性肺炎を防ぎ、必要に応じて呼吸補助を可能にする。超音波によってガイドして、細菌注入用に１８～２０ゲージの静脈カテーテル（短線カテーテル）を上腕静脈に埋め込み、試験化合物の注入用に１８～２０ゲージのイントラカテーテル（長線カテーテル）を伏在静脈に埋め込む。

低体温症を防ぐために、動物を循環水加熱パッド（３７℃）上に乗せ、動物を暖かく保つためにすべての四肢を袖／靴下で覆う。

熱失活黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（Ｂ１７２６６ローゼンバッハ株；ＡＴＣＣ４９４９６）を、１．５ｍＬ／ｋｇの滅菌食塩水中の３×１０^１０細菌／ｋｇで、２時間のゆっくりとした連続注入として静脈注入する。麻酔下で、細菌負荷後Ｔ０、２、４、６、及び８時間で採血を行う。すべての実験において、２４時間後及び４８時間後、屠殺前にも採血を行う。留置伏在静脈カテーテル又は静脈穿刺により、５～１０ｍＬの採血を行う。血液検体を、炎症マーカー及び血液凝固マーカーの存在について分析する。

ｃ）試験化合物の薬物動態特性の決定
ｃ．１）ミニブタにおける薬物動態／薬力学研究
雄又は雌のＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタ（Ｅｌｌｅｇａｒｄ）に、２０ｍｇ／ｋｇケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ，Ｚｏｅｔｉｓ）、８ｍｇ／ｋｇアザペロン（Ｓｔｒｅｓｎｉｌ，Ｅｌａｎｃｏ）及び０．０３ｍｇ／ｋｇアトロピン硫酸（Ａｔｒｏｐｉｎ，Ｂ．Ｂｒａｕｎ）の筋肉注射によって麻酔を施す。麻酔は、末梢耳静脈への３ｍｇ／ｋｇケタミン及び０．５ｍｇ／ｋｇミダゾラム（Ｄｏｒｍｉｃｕｍ，Ｃｈｅｐｌａｐｈａｒｍ）のボラス注射、その後の２２ｍｇ／ｋｇ／ｈケタミン及び３．４ｍｇ／ｋｇ／ｈミダゾラムの持続注入によって維持する。気管チューブ（ＳｕｐｅｒＳａｆｅｔｙＣｌｅａｒ、内径４ｍｍ、Ｒｕｓｃｈ）を埋め込んで、機械換気できるようにする（ＡｖａｎｃｅＣＳ^２、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）。挿管前に、末梢耳静脈を介して０．０３ｍｇ／ｋｇのパンクロニウム（Ｉｎｒｅｓａ）をボラス注射して、筋弛緩を誘発する。筋肉弛緩を維持するために、０．３ｍｇ／ｋｇ／ｈのパンクロニウムの持続静脈注入を行う。動物の水分補給を維持するために、乳酸リンゲル液を静脈投与する。

試験化合物を、右大腿静脈を介して最長１８０分間連続注入する。全血凝固（ＰＴ、ａＰＴＴ）を測定するため、及び３部のアセトニトリルで沈殿させた後の薬物動態分析のために、動脈血を採取する。試験化合物の注入を停止した後、試験化合物の薬理的及び薬物動態的半減期をモニタリングするために追加の採血を行う。

ｃ．２）ウサギにおける薬物動態／薬力学試験
雄ウサギ（ニュージーランド白ウサギ）に５ｍｇ／ｋｇのキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ，ＢａｙｅｒＶｉｔａｌ）及び４０ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｋｅｔａｖｅｔ，Ｚｏｅｔｉｓ）の筋肉注射によって麻酔を施す。麻酔は、右末梢耳静脈を介したキシラジンとケタミンの連続静脈注入によって維持する。試験化合物を、右大腿静脈を介して最長１２０分間連続注入する。動脈血を頸動脈を介して採取して、凝固パラメーター（ＰＴ、ａＰＴＴ）の測定、及び３部のアセトニトリルによる沈殿後の薬物動態分析に供する。試験化合物の注入を停止した後、試験化合物の薬理的及び薬物動態的半減期をモニタリングするために追加の採血を行う。

ｄ）安定性
ｄ．１）加水分解安定性
試験化合物０．１５ｍｇをＤＭＳＯ０．１ｍＬ及びアセトニトリル０．４ｍＬに溶かす。完全に溶解させるために、サンプル溶液の入ったＨＰＬＣバイアルを振盪し、超音波処理する。次いで、各緩衝液１．０ｍＬ（例えば、クエン酸緩衝液ｐＨ４、クエン酸緩衝液ｐＨ５、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．５、リン酸緩衝生理食塩水７．４）を加え、サンプルを渦攪拌する。サンプル溶液をＨＰＬＣによって分析して、３７℃で、２４時間の期間にわたる特定の時間における試験化合物及び最大二つの副生成物の量を測定する。ｔ（０）値は、室温で緩衝液とともに渦攪拌した直後に採取されたサンプルから得る。ピーク面積（単位：パーセント）を定量に用いる。ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ分析：出発材料について、ＨＰＬＣによって純度を分析する。さらに、２４時間サンプルをＬＣ／ＭＳによって分析する。

ＨＰＬＣ条件：カラム：Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ１００Ｃ１８ｅｃ３μｍ５０×２ｍｍ；温度：３７℃；１ｍＬＴＦＡ／リットル水及び１ｍＬＴＦＡ／リットルアセトニトリルの異なる勾配システム。

クエン酸緩衝液（ｐＨ４）におけるこの試験からの代表的な加水分解安定性データを以下の表４ａ及び４ｂに示す。

表４ａ：

表４ｂ：

ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４でのこの試験からの代表的な加水分解安定性データを以下の表５ａ及び５ｂに示す。

表５ａ：

表５ｂ：

ｄ．２）加水分解安定性
原薬の異なる水溶液（水、０．１ＭＨＣｌ、緩衝液ｐＨ１０及び緩衝液ｐＨ７）（溶解度を向上させるための５０％水溶液及び５０％テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール又はクエン酸緩衝液中の０．２５ｍｇ／ｍＬ原薬））を７０℃で２４時間、室温で１週間保存する。さらに、個々のクロマトグラムを比較することによって分解ピークを明確に特定するために、各ストレス溶液に対してブランク溶液を調製する。保存前後の溶液を、それ以上後処理することなく、ＨＰＬＣに直接注入する。データ評価のため、各クロマトグラムを統合して互いに比較する。形成された有機不純物の量（＜２％、２～５％、又は＞５％）に応じて、安定性を「安定」、「わずかに不安定」、又は「不安定」という記述語で記載する。

ｄ．３）血漿安定性
血漿安定性サンプルの調製は、手動又はＨａｍｉｌｔｏｎロボットシステムによって行う。

手動によるサンプル調製によるアッセイの説明：
試験化合物１ｍｇをアセトニトリル／ＤＭＳＯ（異なる比率が可能）０．５ｍＬに溶解する。完全に溶解させるため、ＨＰＬＣバイアルを振盪し、超音波処理する。試験化合物を含むこの溶液２０μＬを、温度３７℃に保たれた血漿１ｍＬに添加し、混合物を直接渦攪拌する。０．１７、０．５、１、１．５、２及び４時間後、室温若しくは１０℃のアセトニトリル／クエン酸緩衝液ｐＨ３（８０：２０）又はアセトニトリル３００μＬを含むバイアルに化合物血漿溶液１００μＬを添加することによって酵素反応を停止する。混合物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心する。上清をＨＰＬＣで分析して、試験化合物及び最大二つの副生成物の量を測定する。室温で血漿と渦攪拌した直後に採取された処理済みサンプルからｔ（０）値を得る。ピーク面積（単位：パーセント）を定量に用いる。４時間サンプルをさらに、ＬＣ／ＭＳで分析する。

自動サンプル調製によるアッセイの説明（ＨａｍｉｌｔｏｎＳｔａｒｌｅｔ及びＨ－Ｍｏｔｉｏｎ－システム）：
試験化合物１ｍｇをアセトニトリル／ＤＭＳＯ０．５ｍＬに手動で溶かす（異なる比率が可能）。完全に溶解させるために、ＨＰＬＣバイアルを手動で振盪し、超音波処理する。次に、ロボットを介して自動ピペット操作段階を次のように実行する。試験化合物を含むこの溶液２０μＬを、３７℃の温度に保った血漿１ｍＬに加え、ピペットで混和する。０．１７、０．５、１、１．５、２及び４時間後、１０℃のアセトニトリル／クエン酸緩衝液ｐＨ３（８０：２０）又はアセトニトリル３００μＬを含むバイアルに化合物血漿溶液１００μＬを添加することによって酵素反応を停止する。混合物を１０℃で、５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離する。上清をＨＰＬＣで分析して、試験化合物と最大二つの副生成物の量を測定する。室温で血漿と渦攪拌した直後に採取された処理済みサンプルからｔ（０）値を得る。ピーク面積（単位：パーセント）を定量に用いる。

ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ分析：出発材料について、ＨＰＬＣによって純度を分析する。４時間サンプルをさらにＬＣ／ＭＳで分析する。

この試験からの代表的なヒト血漿安定性データを以下の表６ａ及び６ｂに示す。

表６ａ：

表６ｂ：

ｄ．４）血漿及び血液の安定性
血漿及び血液の安定性を、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ミニブタ、サル、及びヒトにおいて、公称試験濃度１０００μｇ／Ｌのリチウムヘパリン添加血漿又は血液１ｍＬを使用して、３７℃で５時間調べる。０時間、０．０８３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、３時間、及び５時間の時点で、小分けサンプル５０μＬを、二つの標準を補充したアセトニトリル＋１％ギ酸１５０μＬで沈殿させる。１３００ｇで１０分間渦攪拌及び遠心分離した後、上清の小分けサンプル５０μＬを、ｐＨ３の１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で１／１０希釈し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定する。濃度－時間プロファイルはＥｘｃｅｌで記述し、ｔ_１／２＝ｌｎ２／ｋを使用してそれぞれの半減期を計算する。

ｄ．５）過酸化安定性
原薬を、室温で２４時間にわたり、過酸化条件下（溶解度を向上させるため、３％Ｈ_２Ｏ_２及び５０％テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール又はクエン酸緩衝液ｐＨ４を含む５０％クエン酸緩衝液ｐＨ４中の０．２５ｍｇ／ｍＬ原薬）で保存する。さらに、Ｈ_２Ｏ_２を含まない同じ溶液を調製し、室温で２４時間保存する。さらに、それぞれのクロマトグラムを比較することによって分解ピークを明確に特定するために、各ストレス溶液についてのブランク溶液を調製する。保存後、そのＨ_２Ｏ_２溶液を白金で反応停止して、Ｈ_２Ｏ_２がさらに反応するのを停止する。保存前後（反応停止を含む）の溶液を、それ以上処理を行わずにＨＰＬＣに直接注入する。データ評価のため、個々のクロマトグラムを統合して互いに比較する。形成された有機不純物の量（＜２％、２～５％、又は＞５％）に応じて、安定性を「安定」、「わずかに不安定」、又は「不安定」という記述語で記載する。

ｄ．６）ホルムアルデヒド安定性
原薬を、室温で２４時間にわたり、過酸化条件下（溶解度を向上させるため、３％ＣＨ_２Ｏ及び５０％テトラヒドロフラン、アセトニトリル、メタノール又はクエン酸緩衝液ｐＨ４を含む５０％クエン酸緩衝液ｐＨ４中の原薬０．２５ｍｇ／ｍＬ）で保存する。さらに、ＣＨ_２Ｏを含まない同じ溶液を調製し、室温で２４時間保存する。さらに、個々のクロマトグラムを比較することによって分解ピークを明確に特定するために、各ストレス溶液についてブランク溶液を調製する。保存前後の溶液を、それ以上の後処理をすることなく、ＨＰＬＣに直接注入する。データ評価のため、個々のクロマトグラムを統合して互いに比較する。形成された有機不純物の量（＜２％、２～５％、又は＞５％）に応じて、安定性を「安定」、「わずかに不安定」、又は「不安定」という記述語で記載する。

ｄ．７．）熱安定性
原薬を、固体として９０℃で１日及び１週間、６０℃で１週間保存する。保存後、サンプルをテトラヒドロフランに０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させる。これらの溶液をＨＰＬＣに注入する。データ評価のため、個々のクロマトグラムを統合して互いに比較する。形成された有機不純物の量（＜２％、２～５％、又は＞５％）に応じて、安定性を「安定」、「わずかに不安定」、又は「不安定」という記述語で記載する。

ｅ．１．）溶解度
最大１２．５ｍｇ／ｍＬの原薬の懸濁液を、水、０．１ＭＨＣｌ、緩衝液ｐＨ２、緩衝液ｐＨ３、緩衝液ｐＨ４、緩衝液ｐＨ４．５、緩衝液ｐＨ５、緩衝液ｐＨ６、緩衝液ｐＨ７、緩衝液ｐＨ８、アセトニトリル及び０．９％ＮａＣｌ溶液中、２５℃で２４時間±４時間撹拌してから、ろ過し、ＨＰＬＣによって分析する、ただし、完全に溶解したサンプル（溶解度「＞１２５００μｇ／ｍＬ」で示されている）は除く。

ＨＰＬＣ分析のため、サンプルを溶媒で１：１０及び１：１００希釈して、検量線に適合させる。さらに、５００μｇ／ｍＬ（５ｍｇ／１０ｍＬ）、５０μｇ／ｍＬ（１ｍｇ／２０ｍＬ）、及び１μｇ／ｍＬ（５０μｇ／ｍＬ標準０．４ｍＬ／２０ｍＬ）の濃度を有する３種類の検量線用標準液を調製する。すべてのサンプル溶液及び標準溶液を、特定の順序でＨＰＬＣに注入する。サンプル中の物質ピークの総面積を検量線（外部標準）と比較することによって溶解度を求める。

また、ＳＳＴ（システム適合性テスト）も標準溶液を使用して実行し、それは次の要件を満たしていなければならない。

同じ標準の最小６回の注入が、≦２．０％の変動係数を有するものでなければならない。

較正基準の最小４回の注入が、≦５．０％の精度を有するものでなければならない。

非線形検量線の切片が３．０％以下でなければならない。

計算用の検量線はゼロを通過しなければならない。

溶解度の計算は、較正ポイント内にある最小希釈サンプルを使用して行う。

次の緩衝液を用いる。

物質４ｍｇをクエン酸緩衝液ｐＨ４５０μＬに溶解させることによって、原薬の溶解度を視覚的に測定する。その後、原薬を、濃度が４００ｍｇ／ｍＬに達するか懸濁液が生じるまで添加する。溶液を７日間観察して、潜在的な沈殿を検出する。７日後、溶液を１０ｍｇ／ｍＬに希釈し、安定性を調べる。

原薬の安定性を、ＨＰＬＣ及びＬＣ／ＭＳによって調べる。外部標準を使用してアッセイ及び分解を調べる。試験には、サンプルを希釈して０．１ｍｇ／ｍＬとし、二つの標準溶液（１２０μｇ／ｍＬ及び５０μｇ／ｍＬ）を調製する。すべてのサンプル溶液及び標準溶液を、特定の順序でＨＰＬＣに注入する。アッセイは、物質のピークの総面積を検量線（外部標準）と比較することによって求める。分解量は、サンプルのクロマトグラム全体の面積％として報告される。さらに、サンプルをＬＣ／ＭＳによって測定して、分解生成物を確認する。

ｅ．２．）溶解度
化合物２５ｍｇを溶媒２ｍＬに入れる。溶媒中の化合物の溶解度（１２．５ｍｇ／ｍＬより高い又は低い）に応じて、溶液又は懸濁液が形成される。この溶液又は懸濁液を２５℃で２４時間±４時間撹拌する。その後、溶液又は懸濁液を濾過し、残った溶液をＨＰＬＣで分析する。溶解度は、物質ピークの総面積を検量線（外部標準）と比較することによって求められる。分解量はサンプルのクロマトグラム全体の面積％として報告され、エステル加水分解の記述語として使用される。溶解度アセスメントで調べられる溶媒は、水系緩衝液（ｐＨ範囲１～８）、等張食塩水、及びアセトニトリルである。

実施例２：実施例２の化合物４４０ｍｇをクエン酸緩衝液０．５ｍＬに入れた。得られた溶液の体積は約０．９ｍＬであり、２５℃で２４時間±４時間撹拌した。その後、溶液を遠心分離し、ＨＰＬＣで分析した。溶解度を物質ピークの総面積を検量線（外部標準）と比較することによって決定した。測定は三連で実施した。クエン酸緩衝液ｐＨ４中の実施例２の化合物の溶解度は＞５００ｍｇ／ｍＬである。

ｆ）ＣＹＰ阻害
試験化合物がヒトＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ３Ａ４を阻害する可能性は、酵素源としてプールされたヒト肝臓ミクロソーム及びそれぞれの標準基質を用いて調べる。阻害効果を試験化合物の６濃度（０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０μＭ）の試験化合物で測定し、阻害薬候補剤の非存在下での代謝産物形成の程度と比較する。最後に、ＩＣ_５０値を計算する。単一のＣＹＰアイソフォームを特異的に阻害する標準阻害剤を常に含めることで、一連の実験間で結果が同等であることを確認する。アッセイ手順：６濃度の阻害薬候補剤の存在下での、フェナセチン、アモジアキン、ジクロフェナク、デキストロメトルファン、及びミダゾラムのヒト肝ミクロソームとのインキュベーション。標準的なインキュベーション混合物には、総容量２００μＬ中に１ｍＭＮＡＤＰ、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭグルコース６－リン酸、１．５Ｕ／ｍＬグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼ及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含ませた。試験化合物をアセトニトリルに溶かす。９６ウェルプレートを３７℃で適切な時間インキュベートし、それぞれの内部標準を含むアセトニトリル１００μＬを添加して反応を停止する。沈殿したタンパク質をウェルプレートの遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）によって除去する。上清を合わせて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ又はＲａｐｉｄＦｉｒｅ－ＭＳ／ＭＳによって分析を実行する。

この試験からの代表的なＣＹＰ阻害データを以下の表７ａ及び７ｂに示す。

表７ａ：

表７ｂ：

ｇ）ＣＹＰ誘発
ヒト肝細胞を３Ｄで約１０，０００細胞／３８４ウェルの密度で播種し、化合物処理前に１日間培養する。細胞を、毎日培地を交換しながら、連続２日間にわたり、８濃度の１：３連続希釈で処理する。４８時間の化合物処理後、細胞は溶解させ、最先端の磁気ビーズ技術によってｍＲＮＡを調製する。ｍＲＮＡ単離後、ｍＲＮＡコートビーズからｃＤＮＡを直接転写し、ｑＰＣＲ用にさらに処理する。ＣＹＰ相対発現レベルを、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、アクチン及びチューブリンの多重化によるＴａｑＭａｎプローブを介して測定する。ＣＹＰ誘発をΔΔＣｔ法に基づいて計算し、ビヒクル処理対照に対する誘発倍率として表す。

ｈ）肝細胞での代謝安定性
化合物を１μＭ及び１×１０^６細胞／ｍＬの低細胞数でインキュベートして線形動態を確保することによって、肝細胞の代謝安定性を確認する。インキュベーション混合物中の有機溶媒の影響を最小限とするために、それらの含有量はアセトニトリルについては最大１％に、又はＤＭＳＯについては最大０．２％に制限する。７時点で、インキュベーション混合物から、傾き値ｔ_１／２＝－０．６９３／ｋからの化合物の半減期を定義するための分析用に抜き取る。イン・ビトロｔ_１／２（単位：分）の固有クリアランス（ＣＬ′_{ｉｎｔｒ，ｈｅｐ}、単位：Ｌ／ｈ／ｋｇ）への変換を、下記方程式で計算する。

ＣＬ′_{ｉｎｔｒ，ｈｅｐ}＝ｋＶ／Ｎ×倍率
ＣＬ′_{ｉｎｔｒ，ｈｅｐ}：流量制限及び血中の細胞若しくはタンパク質への結合がない状態で薬剤を除去するための肝臓の固有クリアランス
Ｖ＝インキュベーション体積（０．２５ｍＬ）
Ｎ＝ウェル当たりの肝細胞数（０．２５×１０^６細胞）
十分に撹拌されたモデルに従って下記の方程式を使用して、固有クリアランスを予測肝臓クリアランス（ＣＬ’_{ｂｌｏｏｄ，ｈｅｐ，ｗｓ}、単位：Ｌ／ｈ／ｋｇ）に変換する。

ＣＬ′_{ｂｌｏｏｄ，ｈｅｐ，ｗｓ}＝Ｑ_Ｈ×ＣＬ′_{ｉｎｔｒ，ｈｅｐ}／（Ｑ_Ｈ＋ＣＬ′_{ｉｎｔｒ，ｈｅｐ}）
Ｑ_Ｈ＝肝血流量
ＣＬ′_{ｂｌｏｏｄ，ｈｅｐ，ｗｓ}：十分に攪拌されたモデルに基づく肝臓クリアランスの計算。「十分に撹拌された」モデルは、肝臓が単一の十分に撹拌されたコンパートメントであり、出現した血液中の非結合薬剤の濃度が肝臓内の非結合薬剤と平衡にあると仮定する。

Ｆｍａｘ値（（最大可能バイオアベイラビリティ）を、次の方程式を使用して計算する。

Ｆ_ｍａｘ十分攪拌［％］＝（１－（ＣＬ_{ｂｌｏｏｄ}十分攪拌／Ｑ_Ｈ））×１００
異なる肝細胞種を用いるイン・ビボ固有クリアランス予測のための倍率を下記に列記している。

ｉ）タンパク質結合
限外濾過によるタンパク質結合の測定については、孔径３０ｋＤａのフィルター膜を含むＣｅｎｔｒｉｆｒｅｅ（登録商標）マイクロパーティションシステムを使用して、血漿とタンパク質を含まない限外濾過液を分離する。濾過の駆動力は遠心分離によって加えられる。タンパク質結合試験の前に、試験化合物の限外濾過装置への吸着（回収）及び試験化合物のフィルター膜通過能力を、ある濃度で血漿及び緩衝液に溶解した試験化合物を濾過することによってチェックする。血漿に添加される有機溶媒の量は、総インキュベーション容量の１％を超えることはできない。化合物を２０００μｇ／ＬのＥＤＴＡカリウム血漿中、３７℃及び７％ＣＯ_２で１５分間インキュベートした後、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ（登録商標）マイクロパーティションシステムを１８００ｇで１２分間遠心する。得られた濾液をアセトニトリルで沈殿させ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定用に希釈する。未結合部分を次の方法で計算する。

式中、
Ｃ＝血漿（又は緩衝液）中総濃度
Ｃ_ｕ＝未結合濃度（限外濾液中の濃度）
ｊ）（イン・ビボ）薬物動態の評価
イン・ビボでの試験物質の薬物動態を評価するため、物質を適切な製剤ビヒクル（血漿、エタノール、ジメチルスルホキシド、ＰＥＧ４００の混合物；生理学的製剤）に溶かす。次に、試験物質を、ラット及びイヌに０．１～２ｍｇ／ｋｇ／ｈの低用量で１０分間連続注入する。カテーテル（ラット）又は右若しくは左足の伏在大静脈（イヌ）を介して２４時間までの適切な時点で血液５０μＬを採取し、Ｋ３－ＥＤＴＡ抗凝固剤及び血液検体を直接沈殿させるための内部標準を補充したアセトニトリル１５０μＬの入った管に収集する。１３００ｇで１０分間の遠心分離後、上清５０μＬの小分けサンプルを、ｐＨ３の１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液で１／１０希釈し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定する。血漿濃度－時間プロファイルの評価を、バリデーションされた薬物動態評価プログラムで行う。さらに、臓器、組織、尿の検体を取得することも可能である。

Ｃ）医薬組成物の作業例
本発明による物質は、以下のようにして医薬製剤に変換することができる。

静注液剤：
本発明による化合物を、生理的に許容される溶媒（例えば、等張塩化ナトリウム溶液、５％グルコース溶液及び／又は３０％ＰＥＧ４００溶液）中に飽和溶解度未満の濃度で溶解する。溶液を濾過によって滅菌し、滅菌された発熱物質を含まない注射容器に充填する。

Claims

下記式（Ｉ）の２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート又は該化合物の塩、該化合物の溶媒和物又は該化合物の塩の溶媒和物のうちの一つ。
下記式（Ｉ）の請求項１に記載の２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート。
前記塩が前記式（Ｉ）の化合物の生理的に許容される塩である、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物の塩。
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－［（５－クロロチオフェン－２－カルボニル）アミノ］－Ｎ－｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］ベンゼン－１－スルホニル｝－Ｓ－アラニナート塩酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート硫酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートメタンスルホン酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート４－メチルベンゼン－スルホン酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートマレイン酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートリン酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナート（２Ｒ，３Ｒ）－酒石酸塩
及び
２－（１－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）エチル３－｛［（５－クロロ－２－チエニル）カルボニル］アミノ｝－Ｎ－（｛２－エチル－３－［（３Ｓ）－３－ヒドロキシ－２－オキソピロリジン－１－イル］フェニル｝スルホニル）－Ｓ－アラニナートクエン酸塩
からなる群から選択される請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物の生理的に許容される塩。
下記式の化合物：
を、脱水剤の存在下に下記式の化合物：
と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得て、
式（Ｉ）の化合物を任意に、相当する（ｉ）溶媒及び／又は（ｉｉ）塩基若しくは酸で、それの溶媒和物、塩及び／又は塩の溶媒和物に変換する、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物又は該化合物の塩、該化合物の溶媒和物又は該化合物の塩の溶媒和物のうちの一つの製造方法。
疾患の治療及び／又は予防のための医薬を製造するための請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
血栓性若しくは血栓塞栓性障害及び／又は血栓性若しくは血栓塞栓性合併症、及び／又は炎症障害の治療及び／又は予防のための医薬を製造するための請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
血栓性若しくは血栓塞栓性障害及び／又は血栓性若しくは血栓塞栓性合併症が、播種性血管内凝固症候群である、請求項７に記載の使用。
不活性で無毒性の薬学的に好適な賦形剤と組み合わせて請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物を含む医薬。
血栓性若しくは血栓塞栓性障害及び／又は血栓性若しくは血栓塞栓性合併症、及び／又は炎症障害の治療及び／又は予防のための請求項９に記載の医薬。
血栓性若しくは血栓塞栓性障害及び／又は血栓性若しくは血栓塞栓性合併症が、播種性血管内凝固症候群である、請求項１０に記載の医薬。
医療上有効量の請求項１に記載の少なくとも一つの化合物又は請求項９に記載の医薬の投与による、非ヒト動物での血栓性若しくは血栓塞栓性障害及び／又は血栓性若しくは血栓塞栓性合併症、及び／又は炎症障害の治療及び／又は予防方法。
血栓性若しくは血栓塞栓性障害及び／又は血栓性若しくは血栓塞栓性合併症が、播種性血管内凝固症候群である、請求項１２に記載の方法。