CN117904224A - 一种连续发酵生产l-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种连续发酵生产L‑丙氨酸的方法，包括：利用含有发酵培养基的N个发酵罐进行多批次连续发酵；其中，L‑丙氨酸生产菌种子液接种至第一发酵罐中进行第一批次发酵，当第N‑1发酵罐发酵至OD值增加4.0‑7.0时，将第N‑1发酵罐内部分发酵液接种到第N发酵罐中，进行第N批次发酵，N≥2。本发明的方法实现了L‑丙氨酸发酵菌种的循环利用，减少种子罐的使用，生产成本低，生产周期短，生产速率高，产酸量高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种连续发酵生产L-丙氨酸的方法。
背景技术
L-丙氨酸主要用于生化研究、组织培养、肝功能测定、增味剂、可增加调味品的调味效果、还可用作酸味矫正剂，改善有机酸的酸味。
目前L-丙氨酸主要的生产方法一是通过酶催化天门冬氨酸生产；二是微生物发酵法进行生产。微生物发酵法生产丙氨酸条件相对温和、副产物较少，且降低了对石油化工原料的依赖。但是，目前大多数微生物发酵法存在发酵周期较长、生产速率低、原材料L-天冬氨酸价格较贵、成本高等问题。
现有技术中有通过高产L-丙氨酸的菌株及生物发酵法生产L-丙氨酸，采用厌氧发酵的方式，经18h种子培养及48h发酵培养，其L-丙氨酸含量最高可达115g/L。在实际生产中，种子培养18h后还需扩大培养2-3次才能提供发酵培养所需种液，实际生产全周期需102-120h，生产周期长，效率低。
发明内容
为了解决现有技术中微生物发酵生产L-丙氨酸的过程中生产全周期长及生产效率低的问题，本发明提供了一种连续发酵生产L-丙氨酸的方法，缩短生产周期，提高生产效果的同时，还可以提高最终发酵产酸率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种连续发酵生产L-丙氨酸的方法，包括：利用含有发酵培养基的N个发酵罐进行多批次连续发酵；其中，L-丙氨酸生产菌种子液接种至第一发酵罐中进行第一批次发酵，当第N-1发酵罐发酵至OD值增加4.0-7.0时，将第N-1发酵罐内部分发酵液接种到第N发酵罐中，进行第N批次发酵，N≥2。
在一些实施方式中，将所述第N-1发酵罐内10％-30％(例如10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、28％、30％或它们之间的任意值)体积的发酵液接种到所述第N发酵罐中。本发明将接种到所述第N发酵罐中的发酵液的体积控制在第N-1发酵罐内发酵液总体积的10％-30％，可以兼顾发酵周期和生产效益，若接入的发酵液太少(低于10％)，生产周期长，生产效率会降低。
本发明的方法通过将前一批次的发酵液接种到后一批次的发酵培养基中，实现了L-丙氨酸发酵菌种的循环利用，省去了种子活化培养及种子扩大培养的步骤，减少种子罐的使用，降低了生产成本，大幅缩短生产周期。
在一些实施方式中，N的值满足2≤N≤6，例如N为2，3，4，5或6。在一些实施方式中，N的值满足3≤N≤5。
在一些实施方式中，所述发酵培养基中，初始还原糖浓度为100-140g/L，优选为110-130g/L。
在一些实施方式中，所述发酵培养基包括：葡萄糖110-130g/L，酵母粉1-3g/L，蛋白胨2-6g/L，玉米浆20-30g/L，糖蜜3-8g/L，氯化铵4-6g/L，磷酸氢二铵5-7g/L，磷酸二氢钾4-6g/L，磷酸氢二钾4-6g/L，硫酸镁0.01-0.03g/L，硫酸锌0.005-0.02g/L。
在一些实施方式中，所述L-丙氨酸生产菌为大肠杆菌。在一些实施方式中，所述L-丙氨酸生产菌为大肠杆菌CGMCC14067。
在一些实施方式中，所述种子液的制备包括：
将L-丙氨酸生产菌种子接种于活化培养基中活化，再将活化后的种子接种于种子扩大培养基中扩大培养，得到所述种子液。
在一些实施方式中，所述活化培养基包括：酵母浸粉4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠12-15g/L。
在一些实施方式中，所述种子扩大培养基包括：葡萄糖30-40g/L，酵母浸粉3-8g/L，蛋白胨8-15g/L，氯化铵4-6g/L，磷酸二氢钾3-5g/L，磷酸氢二钾3-5g/L，硫酸镁0.01-0.03g/L，硫酸锌0.005-0.02g/L。
在一些实施方式中，所述种子扩大培养阶段还通入无菌空气。在一些具体实施方式中，种子扩大培养阶段以通气量1:(0.1-0.5)通入无菌空气，其中，通风量1:(0.1-0.5)是指以每1m3种子液体积计算，通气量为0.1-0.5m3/min。
在一些实施方式中，步骤(2)中，所述第一发酵罐中种子的接种量为10-30％(占第一发酵罐的体积分数)。
在一些实施方式中，所述N个发酵罐内的发酵温度为36-38℃。在一些实施方式中，所述N个发酵罐内的转速为150-250rpm。在一些实施方式中，所述N个发酵罐内的发酵pH值为6.8-7.1。
在一些实施方式中，所述发酵罐开始发酵(0h)至OD值增加4.0-7.0阶段内，还通入无菌空气。
在一些具体实施方式中，所述发酵罐开始发酵(0h)至OD值增加4.0-7.0阶段内，以通风量1:(0.1-0.5)通入无菌空气；其中，通风量1:(0.1-0.5)是指以每1m3发酵液体积计算通气量为0.1-0.5m3/min。
在一些具体实施方式中，当第N-1发酵罐发酵至OD值增加4.0-7.0时，将第N-1发酵罐内部分发酵液接种到第N发酵罐中，进行第N批次发酵，同时第N-1发酵罐内停止通入无菌空气，开始厌氧发酵。
在一些实施方式中，所述方法还包括：
当发酵罐内还原糖浓度降至20-50g/L时，向发酵罐内一次性加入碳源和氮源至还原糖浓度达到75-85g/L，例如达到75g/L、78g/L、80g/L、82g/L、85g/L或它们之间的任意值。
在一些实施方式中，通过DNS(二硝基水杨酸法)测量还原糖浓度。
在一些实施方式中，一次性加入碳源和氮源后，还原糖浓度增加30-60g/L，例如30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L或它们之间的任意值。
在一些实施方式中，所述碳源包括葡萄糖、淀粉水解糖和木质纤维素水解糖中的一种或多种。在一些实施方式中，所述碳源包括结晶葡萄糖和/或淀粉水解糖。
在一些实施方式中，所述碳源为质量分数为70-80％的葡萄糖。
在一些实施方式中，所述氮源包括磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵、氯化铵、酵母浸粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、复合氮素、玉米蛋白粉、豆粕水解液、玉米蛋白水解液、毛发水解液中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述氮源包括磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵、氯化铵、酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、豆粕水解液、玉米蛋白水解液、复合氮素中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述氮源包括磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵和酵母浸粉。
在一些实施方式中，所述氮源包括磷酸氢二铵14-16g/L、磷酸二氢铵14-16g/L、硫酸铵8-12g/L、酵母浸粉6-10g/L。
在一些实施方式中，加入氮源的质量与加入碳源和氮源后发酵液的总体积之比为(2-50)：1g/L。
在一些实施方式中，发酵至发酵罐内还原糖剩余量≤0.1wt％时放罐。
在一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
(1)将L-丙氨酸生产菌种子活化并扩大培养，得到种子液；
(2)将所述种子液接入第一发酵罐发酵培养至OD值增加至4.0-7.0，将10％-30％体积的发酵液接种到后一批次发酵培养基中；同时，发酵过程中，当发酵罐内还原糖浓度降至20-50g/L时，向发酵罐内一次性加入碳源和氮源至还原糖浓度达到75-85g/L，继续发酵至发酵罐内还原糖剩余量≤0.1wt％时放罐；
(3)如此重复2-6个批次的发酵。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明通过将前一批次的发酵液接种到后一批次的发酵培养基中，实现了L-丙氨酸发酵菌种的循环利用，省去了种子活化培养及种子扩大培养的步骤，减少种子罐的使用，降低了生产成本，大幅缩短生产周期至36-60h，提高了生产效率。
2.本发明通过在发酵过程中补加碳源和氮源，提高了生产速率，同时还解决了初始碳源浓度过高导致菌种受抑制从而影响发酵周期的问题，提高发酵罐利用率，显著提高了L-丙氨酸的产量，最终发酵产酸可达140g/L。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
以下实施例和对比例中，所述以通风量1:0.1-0.5通入无菌空气是指以每1m3种子液或者发酵液的体积计算，无菌空气的通气量为0.1-0.5m3/min。
以下实施例和对比例中，所述碳源剩余2％-5％是指发酵液中DNS测量还原糖浓度为20-50g/L，例如碳源剩余3％，是指发酵液中DNS测量还原糖浓度为30g/L，碳源剩余4％，是指发酵液中DNS测量还原糖浓度为40g/L；碳源剩余≤0.1％，是指发酵液中DNS测量还原糖浓度≤1g/L。
实施例和对比例中使用的L-丙氨酸生产菌种子培养液的制备方法为：
(1)种子活化培养
将L-丙氨酸生产菌种子大肠杆菌CGMCC14067接种于活化培养基中，于37℃、摇床转速200r/min培养18h，得到活化种子。
种子活化培养基的组成为：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，121℃灭菌30min。
(2)种子扩大培养
将种子活化培养获得的种子接种于种子扩大培养基中，于37℃、120r/min、以通风量1:0.1-0.5通入无菌空气下培养6-9h，得到体积扩大化种子；视生产实际情况增加/减少种子扩大培养次数。
种子扩大培养基的组成为：葡萄糖35g/L，酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化铵4.8g/L，磷酸二氢钾3.7g/L，磷酸氢二钾3.7g/L，硫酸镁0.02g/L，硫酸锌0.01g/L，121℃灭菌30min。
实施例中使用的发酵培养基的组成为：葡萄糖120g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨4g/L，玉米浆25g/L，糖蜜5g/L，氯化铵4.8g/L，磷酸氢二铵5.8g/L，磷酸二氢钾4.3g/L，磷酸氢二钾4.3g/L，硫酸镁0.02g/L，硫酸锌0.01g/L。
实施例1
本实施例提供了一种于50L发酵罐中发酵生产L-丙氨酸的方法，步骤如下：
将上述制备的种子扩大培养液以10％的接种量接种到装有30L发酵培养基的发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1。发酵培养0h至OD值增加5.0期间以风量0.45m3/h通入无菌空气。碳源剩余4％时，一次性加入75％浓度结晶葡萄糖溶液2L，氮源混合溶液2L(其中：磷酸氢二铵15.4g/L、磷酸二氢铵15.4g/L、硫酸铵9.6g/L、酵母浸粉8g/L)，发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。
实施例2
本实施例提供了一种于50L发酵罐中连续发酵生产L-丙氨酸的方法，步骤如下：
将上述制备的种子扩大培养液以10％的接种量接种到装有30L发酵培养基的第一批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1。发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。第一次发酵培养OD值增加6.5时，移出6L第一批次发酵液(即20％体积发酵液)接种到装有30L发酵培养基的第二批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1，第一批次发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。
同理，第二批次发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。第二次发酵培养OD值增加6.5时，移出6L发酵液接种到装有30L发酵培养基的第三批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1，第二批次发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。重复五批次。
实施例3
本实施例提供了一种于50L发酵罐中连续发酵生产L-丙氨酸的方法，步骤如下：
将上述制备的种子扩大培养液以10％的接种量接种到装有30L发酵培养基的第一批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1。发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。第一次发酵培养OD值增加6.5时，移出6L发酵液(即20％体积发酵液)接种到装有30L发酵培养基的第二批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1，第一批次发酵碳源剩余3％时，一次性加入75％浓度结晶葡萄糖溶液2L，氮源混合溶液1L(其中：磷酸氢二铵5.8g/L、磷酸二氢铵5.8g/L、玉米浆25g/L、酵母浸粉10g/L)，第一批次发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。
同理，第二批发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。第二次发酵培养OD值增加6.5时，移出6L发酵液(即20％体积发酵液)接种到装有30L发酵培养基的第三批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1，第二批次发酵碳源剩余3％时，一次性加入75％浓度结晶葡萄糖溶液2L，氮源混合溶液1L(其中：磷酸氢二铵5.8g/L、磷酸二氢铵5.8g/L、玉米浆25g/L、酵母浸粉10g/L)，第二批次发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。重复五批次。
实施例4
本实施例提供了一种于50L发酵罐中连续发酵生产L-丙氨酸的方法，步骤如下：
将上述制备的种子扩大培养液以10％的接种量接种到装有30L发酵培养基的第一批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1。发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。第一次发酵培养OD值增加6.5时，移出3L发酵液(即10％体积发酵液)接种到装有30L发酵培养基的第二批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1，第一批次发酵碳源剩余3％时，一次性加入75％浓度结晶葡萄糖溶液2L，氮源混合溶液1L(其中：磷酸氢二铵5.8g/L、磷酸二氢铵5.8g/L、玉米浆25g/L、酵母浸粉10g/L)，第一批次发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。
同理，第二批发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。第二次发酵培养OD值增加6.5时，移出3L发酵液接种到装有30L发酵培养基的第三批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1，第二批次发酵碳源剩余3％时，一次性加入75％浓度结晶葡萄糖溶液2L，氮源混合溶液1L(其中：磷酸氢二铵5.8g/L、磷酸二氢铵5.8g/L、玉米浆25g/L、酵母浸粉10g/L)，第二批次发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。重复五批次。
实施例5
本实施例提供了一种于50L发酵罐中连续发酵生产L-丙氨酸的方法，步骤如下：
将上述制备的种子扩大培养液以10％的接种量接种到装有30L发酵培养基的第一批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1。发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。第一次发酵培养OD值增加6.5时，移出6L发酵液接种到装有30L发酵培养基的第二批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1，第一批次发酵碳源剩余3％时，一次性加入75％浓度结晶葡萄糖溶液2L，第一批次发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。
同理，第二批发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。第二次发酵培养OD值增加6.5时，移出6L发酵液接种到装有30L发酵培养基的第三批次发酵罐内，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1，第二批次发酵碳源剩余3％时，一次性加入75％浓度结晶葡萄糖溶液2L，第二批次发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。重复五批次。
对比例1
本对比例提供了一种于50L发酵罐中发酵生产L-丙氨酸的方法，步骤如下：
将上述制备的种子扩大培养液以10％的接种量接种到装有30L发酵培养基的发酵罐内(发酵培养基的组成为：葡萄糖120g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨4g/L，玉米浆25g/L，糖蜜5g/L，氯化铵4.8g/L，磷酸氢二铵5.8g/L，磷酸二氢钾4.3g/L，磷酸氢二钾4.3g/L，硫酸镁0.02g/L，硫酸锌0.01g/L)，于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1。发酵培养0h至OD值增加5.0期间以风量0.45m3/h通入无菌空气。发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。
对比例2
本对比例提供了一种于50L发酵罐中发酵生产L-丙氨酸的方法，步骤如下：
将上述制备的种子扩大培养液以10％的接种量接种到装有30L发酵培养基的发酵罐内(发酵培养基为：葡萄糖170g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨4g/L，玉米浆25g/L，糖蜜5g/L，氯化铵4.8g/L，磷酸氢二铵5.8g/L，磷酸二氢钾4.3g/L，磷酸氢二钾4.3g/L，硫酸镁0.02g/L，硫酸锌0.01g/L。)于37℃、200rpm条件下发酵培养，发酵过程中使用氨水维持发酵液pH值为6.8-7.1。发酵培养0h至OD值增加6.5期间以风量0.9m3/h通入无菌空气。发酵至碳源剩余≤0.1％放罐。
试验例
随机选取实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、对比例1及对比例2的放罐发酵液进行测试，结果见下表1。
其中，碳源残余量(g/L)的测定方法为：利用生物传感分析仪SBA-40D(山东省科学院)进行测定。
转化率(％)的计算方法为：L-丙氨酸产量(g)÷碳源总量(g)×100％。
发酵生产速率(g/L·h)的计算方法为：L-丙氨酸产量(g/L)÷发酵时间(h)。
表1
从表1数据可以看出，相比实施例1和对比例1-2，本发明实施例2-4采用连续发酵生产L-丙氨酸的方法，相比较单批次发酵可以大幅降低发酵周期，节约一级、二级种子罐的成本。使用连续发酵的方式进行补糖和氮源，还可以进一步提高放罐L-丙氨酸浓度，这将降低提取过程的损耗。本发明的方法生产周期低，生产速率更高，L-丙氨酸的产量高，转化率高。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种连续发酵生产L-丙氨酸的方法，包括：利用含有发酵培养基的N个发酵罐进行多批次连续发酵；其中，L-丙氨酸生产菌种子液接种至第一发酵罐中进行第一批次发酵，当第N-1发酵罐发酵至OD值增加4.0-7.0时，将第N-1发酵罐内部分发酵液接种到第N发酵罐中，进行第N批次发酵，N≥2。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述第N-1发酵罐内10％-30％体积的发酵液接种到所述第N发酵罐中；优选地，2≤N≤6，更优选地，3≤N≤5。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中，初始还原糖浓度为100-140g/L；
优选地，所述发酵培养基包括：葡萄糖110-130g/L，酵母粉1-3g/L，蛋白胨2-6g/L，玉米浆20-30g/L，糖蜜3-8g/L，氯化铵4-6g/L，磷酸氢二铵5-7g/L，磷酸二氢钾4-6g/L，磷酸氢二钾4-6g/L，硫酸镁0.01-0.03g/L，硫酸锌0.005-0.02g/L。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述L-丙氨酸生产菌为大肠杆菌。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述种子液的制备包括：
将L-丙氨酸生产菌种子接种于活化培养基中活化，再将活化后的种子接种于种子扩大培养基中扩大培养，得到所述种子液；
优选地，所述活化培养基包括：酵母浸粉4-6g/L，蛋白胨8-12g/L，氯化钠12-15g/L；
优选地，所述种子扩大培养基包括：葡萄糖30-40g/L，酵母浸粉3-8g/L，蛋白胨8-15g/L，氯化铵4-6g/L，磷酸二氢钾3-5g/L，磷酸氢二钾3-5g/L，硫酸镁0.01-0.03g/L，硫酸锌0.005-0.02g/L；
优选地，所述种子扩大培养阶段还通入无菌空气，优选地，以每1m3种子液体积计算，无菌空气的通气量为0.1-0.5m3/min。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述第一发酵罐中种子的接种量为10-30％。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述N个发酵罐内的发酵条件为：温度36-38℃，和/或，转速为150-250rpm，和/或，pH值为6.8-7.1。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵罐开始发酵至OD值增加4.0-7.0阶段内，还通入无菌空气；优选地，以每1m3发酵液体积计算，无菌空气的通气量为0.1-0.5m3/min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
当发酵罐内还原糖浓度降至20-50g/L时，向发酵罐内一次性加入碳源和氮源至还原糖浓度达到75-85g/L；
优选地，所述碳源包括葡萄糖、淀粉水解糖和木质纤维素水解糖中的一种或多种，更优选包括葡萄糖和/或淀粉水解糖；
优选地，所述氮源包括磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵、氯化铵、酵母浸粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆、糖蜜、复合氮素、玉米蛋白粉、豆粕水解液、玉米蛋白水解液、毛发水解液中的一种或多种，更优选包括磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硫酸铵和酵母浸粉。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述氮源包括磷酸氢二铵14-16g/L、磷酸二氢铵14-16g/L、硫酸铵8-12g/L、酵母浸粉6-10g/L；和/或，
加入氮源的质量与加入碳源和氮源后发酵液的总体积之比为(2-50)：1g/L。
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