CN117904082A - 一种耐酸性提高的蛋白酶及其突变体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种耐酸性提高的蛋白酶及其突变体和应用。所述蛋白酶为蛋白酶BLAPRm1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白酶第365位的苯丙氨酸变为色氨酸获得的，其耐酸性得到了明显提升。本发明在蛋白酶BLAPRm1的基础上，经过多种突变获得了耐酸性显著提高的蛋白酶突变体BLAPRm2、BLAPRm3、BLAPRm4、BLAPRm5、BLAPRm6。根据动物消化特征，耐酸性提高意味着提升了蛋白酶在动物胃酸环境下的留存率，保证在动物肠道中有效提升蛋白类饲料原料的消化率，同时节约成本和减少环境污染，将促进蛋白酶在饲料、食品添加剂等领域中的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种耐酸性提高的蛋白酶及其突变体和应用。
背景技术
蛋白酶是催化水解蛋白质中肽键的一类酶，广泛存在于动物、植物和微生物中，有着许多不同的生理功能。蛋白酶在各个领域中被广泛应用，例如食品工业、酿酒酿造、洗涤剂行业、饲料工业、制革工业、丝绸行业和医药行业等，所以，这种环境下对蛋白酶的产量和特性改良方面都提出了更高的要求。
本课题组前期研发了多个耐热型蛋白酶产品，显著提高了蛋白酶制剂在喷干、高温造粒等工艺中的收率，节约了成本。然而在饲料中应用时，往往需要蛋白酶具有一定的耐胃酸性能，使其在动物肠道内最大限度的发挥蛋白原料降解作用。对蛋白原料降解效果较好的蛋白酶类通常是中性偏碱性蛋白酶，往往耐酸性较差，目前解决方法大多是通过蛋白酶包衣的方式，但工艺复杂且成本较高。
随着基因编辑技术的发展，对基因本身进行分析和突变，结合定向筛选，可以实现逐步改良蛋白酶性能。本研究采用耐热型蛋白酶为基础，筛选出耐酸性显著提升的突变体，以更好的适应动物消化特征，降本增效，促进蛋白酶制剂在饲料、养殖等领域中的应用。
发明内容
本发明提供了一种耐酸性提高的蛋白酶及其突变体和应用。本发明通过对Bacillus licheniformis WX-02来源的蛋白酶基因和氨基酸进行分析后，确定了多个关键位点，分别对关键位点进行饱和突变，再结合易错PCR随机突变和高通量定向筛选技术，经过多轮突变，获得了多种耐酸性提高的蛋白酶突变体，有助于促进其在饲料、食品等领域中的应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种耐酸性提高的蛋白酶，其具体为蛋白酶BLAPRm1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步的，所述蛋白酶BLAPRm1是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白酶第365位的苯丙氨酸变为色氨酸获得的。
本发明还提供了一种编码基因，其为所述的蛋白酶BLAPRm1的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明还提供了一种耐酸性提高的蛋白酶突变体，其是由所述的蛋白酶BLAPRm1经突变获得的，其具有如下之一所示的氨基酸序列：
（1）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
（2）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
（3）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
（4）如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
（5）如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
进一步的，所述蛋白酶突变体是由氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白酶BLAPRm1的第193位的丝氨酸变为丙氨酸获得的；或者第155位的苯丙氨酸变为甲硫氨酸获得的；或者第125位的甘氨酸变为甲硫氨酸获得的；或者第100位的组氨酸变为精氨酸和第193位的丝氨酸变为丙氨酸获得的；或者第186位的亮氨酸变为异亮氨酸和第193位的丝氨酸变为丙氨酸获得的。
本发明还提供了所述的蛋白酶突变体的编码基因，其具有如下之一所示的核苷酸序列：
（1）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
（3）如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；
（4）如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
（5）如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组表达载体，其中含有所述的编码基因。
本发明还提供了一种基因工程菌，其中含有所述的编码基因。
本发明还提供了所述的蛋白酶或者所述的蛋白酶突变体在制备饲料添加剂或者食品添加剂中的应用。
进一步的，所述饲料添加剂或食品添加剂中含有氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白酶BLAPRm1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白酶突变体BLAPRm2、氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的蛋白酶突变体BLAPRm3、氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的蛋白酶突变体BLAPRm4、氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的蛋白酶突变体BLAPRm5和氨基酸序列如SEQID NO：13所示的蛋白酶突变体BLAPRm6中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的优点和有益技术效果是：
本发明以Bacillus licheniformis WX-02来源的蛋白酶基因为基础，分别提供了包含F365W的单点突变体BLAPRm1，以及包含F365W/S193A、F365W/F155M、F365W/G125M的双位点突变体BLAPRm2至BLAPRm4，包含F365W/H100R/S193A、F365W/L186I/S193A的三位点突变体BLAPRm5和BLAPRm6。
本发明改造后的突变体BLAPRm1至BLAPRm6与野生型蛋白酶相比，其耐酸性由36%分别提高至45.5％、59.0％、54.0％、49%、56.5％、60.0％，提升幅度在26%-67%，因此耐酸性得到了显著提高，将促进蛋白酶在饲料、养殖等领域中的应用。根据动物消化特征，在饲料中应用时，提升了蛋白酶在动物胃酸环境下的留存率，保证在动物肠道中有效提升蛋白类饲料原料的消化率，同时节约成本和减少环境污染，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是蛋白酶突变体平板筛选。
图2是蛋白酶突变体经过pH 3.5处理30分钟后耐酸残留率比较结果。
图3是蛋白酶在30L发酵罐中的发酵数据。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版) J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
1、菌株和载体
枯草芽胞杆菌WB600、质粒pUB110、大肠杆菌BL21、质粒pET-21a(+)购自Invitrogen公司，T载体和DH5a大肠杆菌感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
2、试剂与培养基
质粒提取试剂盒、片段纯化回收试剂盒、限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；GeneMorph II随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司；氨苄青霉素、IPTG等购自生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白Marker：Blue Plus II Protein Marker (14-120 kDa) 购自北京全式金生物技术有限公司。
LB培养基配方：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl。
发酵培养基：豆粕粉50-80g/L，玉米淀粉60-100g/L，磷酸氢二钠2-4g/L，碳酸钠1-2g/L，pH自然。
实施例1：构建蛋白酶饱和突变体文库
通过对Bacillus licheniformis WX-02来源的蛋白酶基因（核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示）和氨基酸（氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）进行三维结构、保守区域、活性位点等多方面分析后，认为其第365位点对耐酸性可能影响较大，因此对其第365位点进行饱和突变，突变引物如表1所示。采用对应引物进行上游/下游基因片段分别扩增，再与T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5a，将获得的突变体进行测序分析，测序正确后，获得饱和突变体文库。
表1：饱和突变引物设计
经过蛋白酶饱和突变体筛选，测序正确并获得了19种饱和突变体，需要重新进行PCR扩增，使用的引物序列如下：
BLAPR-F：GCTCTAGAATGATGAGGAAGAAATC（SEQ ID NO:15）；
BLAPR-R：CGCGGATCCTTACTGTGCAGCTGCTTCGA（SEQ ID NO:16）。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s和72℃延伸1min，共30个循环。
将扩增好的PCR产物用Xba I和BamH I双酶切，纯化回收后连接到pET-21a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21-DE3，氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，得到pET-BLAPRx。同样方法将合成的原始基因连接到pET-21a(+)载体上并转化大肠杆菌BL21-DE3，得到pET-BLAPR0。
将筛选的单菌落接种到96孔深孔板中。每个平板接入2个表达BLAPR0的单菌落作为对照。每孔装入300μL LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm震荡培养4小时后，转移50μL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200μL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃、200rpm摇床培养10h诱导表达蛋白酶。
将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，进行酸处理(pH3.5，37℃处理30min)，然后检测蛋白酶的剩余活性。
筛选得到一个以BLAPR0为出发模板的耐酸性提高的突变体F365W (命名为BLAPRm1)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例2：易错PCR构建蛋白酶BLAPRm1突变体文库
根据实施例1筛选的结果，以BLAPRm1的蛋白酶氨基酸序列(如SEQ ID NO:3所示)和DNA序列(如SEQ ID NO:4所示)设计引物，在5’端设计Xba I限制性酶切位点，3’端设计BamH I限制性酶切位点。
利用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以SEQ ID NO:4的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：
BLAPR-F：GCTCTAGAATGATGAGGAAGAAATC（SEQ ID NO:15）；
BLAPR-R：CGCGGATCCTTACTGTGCAGCTGCTTCGA（SEQ ID NO:16）。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s和72℃延伸1min，共30个循环。
将扩增好的随机突变PCR产物用Xba I和BamH I双酶切，纯化回收后连接到pET-21a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21-DE3，氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，得到pET-BLAPRx。
将筛选的单菌落接种到96孔深孔板中。每个平板接入2个表达BLAPRm1的单菌落作为对照。每孔装入300μL LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm震荡培养4小时后，转移50μL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200μL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃、200rpm摇床培养10h诱导表达蛋白酶。
将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，进行酸处理(pH3.5，37℃处理30min)，然后检测蛋白酶的剩余活性。对剩余酶活高于BLAPRm1的突变体基因进行测序。
最终筛选到以下耐酸性提高的突变体：
BLAPRm2突变方式为F365W/S193A（第365位的苯丙氨酸变为色氨酸、第193位的丝氨酸变为丙氨酸），其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:6所示；
BLAPRm3突变方式为F365W/F155M（第365位的苯丙氨酸变为色氨酸、第155位的苯丙氨酸变为甲硫氨酸），其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，编码基因的核苷酸序列如SEQID NO:8所示；
BLAPRm4突变方式为F365W/G125M（第365位的苯丙氨酸变为色氨酸、第125位的甘氨酸变为甲硫氨酸），其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示。
BLAPRm5突变方式为F365W/H100R/S193A（第365位的苯丙氨酸变为色氨酸、第100位的组氨酸变为精氨酸、第193位的丝氨酸变为丙氨酸），其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。
BLAPRm6突变方式为F365W/L186I/S193A（第365位的苯丙氨酸变为色氨酸、第186位的亮氨酸变为异亮氨酸、第193位的丝氨酸变为丙氨酸），氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。
实施例3：耐酸性提高的蛋白酶突变体在枯草芽胞杆菌中的表达验证
分别将实施例2的突变体以及BLAPR0分别克隆入质粒pUB110的Xba I和BamH I位点；参考Spizizen创立的枯草芽胞杆菌转化方法，将上述重组质粒转化入枯草芽胞杆菌WB600中，获得重组菌。经过平板筛选，获得BLAPRm1至BLAPRm6的突变体如图1所示。重组菌在发酵培养基中进行摇瓶发酵78h后，将培养液离心获得上清，测定每个突变体发酵液上清的平均酶活，取每个突变体中酶活最高的转化子发酵上清液，在pH 3.5、37℃处理30min后，比较酶活保留率。
结果如图2所示，突变后得到的蛋白酶BLAPRm1至BLAPRm6的耐酸残留率分别是45.5％、59％、54％、49.0％、56.5％、60％，比对照（BLAPR0耐酸残留率36%）提高了26%-67%。
以上结果表明，将BLAPR0第365位的Phe突变为Trp，能够在保持原有酶活力的同时提高其耐酸性。在此基础上，将其第193位的Ser突变为Ala得到的突变体，或将其155位Phe突变为Met得到的突变体；或将其125位Gly突变为Met得到的突变体；或将其第100位的His突变为Arg，同时将其第193位的Ser突变为Ala得到的突变体；或将其第186位的Leu突变为Ile，同时将其第193位的Ser突变为Ala得到的突变体，其耐酸性又进一步提高。由此可见，突变后的蛋白酶的耐酸性与野生型相比有了较大提高，更加有利于其在饲料、食品等领域中的应用。
实施例4：蛋白酶突变体在30L发酵罐中发酵和制备
将实施例3中表达蛋白酶BLAPR0以及蛋白酶突变体BLAPRm1、BLAPRm2、BLAPRm3、BLAPRm4、BLAPRm5、BLAPRm6的重组菌分别划线于含有卡那霉素（终浓度为20 μg/mL）抗性的LB平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在含有卡那霉素（终浓度为20 μg/mL）抗性的LB平板上划线培养，如此活化三代得到的重组枯草芽胞杆菌菌落，接种于50mL含有卡那霉素（终浓度为20μg/mL）的LB培养基中，37℃、200rpm培养24h。以2％的接种量接种到1L含有卡那霉素（终浓度为20μg/mL）的LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD600为5左右，用作种子液接种发酵罐。
发酵生产工艺：豆粕5-10%、玉米粉1-5%、PPG-20000 0.1-1.0%、蛋白酶0.1-1.0%、淀粉酶0.1-1.0%、磷酸氢二钠（12水）0.2-0.5%、pH自然、温度37℃、搅拌速率600rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上。发酵过程pH自然，发酵24h后开始测定酶活力，每4h测定一次，直到发酵结束（48h）。
酶活结果如图3所示，随着发酵时间的增长，蛋白酶酶活均持续提高，蛋白酶突变体的酶活和野生型蛋白酶BLAPR0相当，但蛋白酶突变体的耐酸性较野生型更好。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种耐酸性提高的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶具体为蛋白酶BLAPRm1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶BLAPRm1是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白酶第365位的苯丙氨酸变为色氨酸获得的。
3.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因为权利要求1所述的蛋白酶BLAPRm1的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.一种耐酸性提高的蛋白酶突变体，其特征在于，所述蛋白酶突变体是由权利要求1所述的蛋白酶BLAPRm1经突变获得的，其具有如下之一所示的氨基酸序列：
（1）如SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；
（2）如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列；
（3）如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列；
（4）如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
（5）如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的蛋白酶突变体，其特征在于，所述蛋白酶突变体是由氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白酶BLAPRm1的第193位的丝氨酸变为丙氨酸获得的；或者第155位的苯丙氨酸变为甲硫氨酸获得的；或者第125位的甘氨酸变为甲硫氨酸获得的；或者第100位的组氨酸变为精氨酸和第193位的丝氨酸变为丙氨酸获得的；或者第186位的亮氨酸变为异亮氨酸和第193位的丝氨酸变为丙氨酸获得的。
6.权利要求4所述的蛋白酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因具有如下之一所示的核苷酸序列：
（1）如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；
（2）如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
（3）如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；
（4）如SEQ ID NO：12所示的核苷酸序列；
（5）如SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列。
7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有权利要求3或者权利要求6所述的编码基因。
8.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌中含有权利要求3或者权利要求6所述的编码基因。
9.权利要求1所述的蛋白酶或者权利要求4所述的蛋白酶突变体在制备饲料添加剂或者食品添加剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂或食品添加剂中含有氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的蛋白酶BLAPRm1、氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示的蛋白酶突变体BLAPRm2、氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的蛋白酶突变体BLAPRm3、氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示的蛋白酶突变体BLAPRm4、氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的蛋白酶突变体BLAPRm5和氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示的蛋白酶突变体BLAPRm6中的至少一种。
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