CN117904065A - 血红素加氧酶突变体及其在胆绿素合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血红素加氧酶突变体及其在胆绿素合成中的应用，属于基因工程技术领域。本发明实现了胆绿素合成关键酶来源筛选和理性改造，解决了之前胆绿素产量低的问题。通过从10种不同动物、植物、微生物来源的HO中筛选出最适合胆绿素大肠杆菌合成的关键限速酶，并在此基础上理性改造，可实现摇瓶水平胆绿素在大肠杆菌中的高效合成。在摇瓶水平，胆绿素产量可达13.41mg/L，该结果为胆绿素在食品、医药、化妆品领域的应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及血红素加氧酶突变体及其在胆绿素合成中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
血红素衍生物胆绿素(Biliverdin,BV)天然存在于动物胆汁中，以其抗氧化、抗炎、抗凋亡的特性而闻名，在食品、药品和化妆品领域均有着广泛应用，在疾病治疗方面，胆绿素被广泛应用于艾滋病毒、HCV、HBV、登革热、埃博拉病毒、肠病毒等治疗。因此，国内外市场对胆绿素的需求量也在不断增加。
目前，胆绿素通常从猪胆汁中提取。该方法与从动物血液中提取血红素的方法一样，存在着诸多问题，例如原料短缺、价格昂贵、浪费能源、不可持续、不易纯化等。因此，需要寻求其他更加高效、环保、经济的方法生产胆绿素。与化学合成法相比，微生物法合成具有低成本、低合成难度、高纯度、高天然性和高安全性等优势，更能被人们所接受，是其能在工业上得到广泛利用的重要前提。与此同时，在各种微生物宿主菌株中，大肠杆菌是遗传和代谢信息研究最充分的生物体，作为微生物细胞工厂具有多种优势，是天然产物生产中最受欢迎的微生物宿主之一。因此，应用大肠杆菌来合成胆绿素是最佳的选择。
利用重组大肠杆菌合成胆绿素需要解决两个方面的难题：第一，确定重组大肠杆菌合成胆绿素的关键限速酶(HO)来源；第二，基于理性改造获得更高催化活力的关键酶HO，进一步提高胆绿素的合成效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种催化效率提高的血红素加氧酶突变体及其在合成胆绿素中的应用。
本发明提供了血红素加氧酶(HO)突变体，是以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为出发序列，进行了如下任意一种改进：
(1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第29位的苯丙氨酸突变为色氨酸；
(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第166位的赖氨酸突变为天冬氨酸；
(3)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第29位的苯丙氨酸突变为色氨酸，并将第166位的赖氨酸突变为天冬氨酸。
本发明还提供了编码所述血红素加氧酶突变体的基因。
本发明还提供了携带所述基因的重组质粒。
在一种实施方式中，所述质粒为pRSFDuet-1。
本发明还提供了表达所述血红素加氧酶的重组微生物。
在一种实施方式中，所述重组微生物以大肠杆菌为宿主。
在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于BL21(DE3)，C41(DE3)或C43(DE3)。
本发明还提供了一种提高血红素加氧酶催化效率的方法，所述方法是以SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列为出发序列，将第29位的苯丙氨酸突变为色氨酸，和/或将第166位的赖氨酸突变为天冬氨酸。
本发明还提供了一种发酵生产胆绿素的方法，将所述重组大肠杆菌在LB和/或TB培养基中培养。
在一种实施方式中，所述方法为：将所述重组大肠杆菌接种于LB培养基中，于37℃，220rpm，摇床培养8～12h；将一级种子液按2％的接种量(v/v)接种到TB培养基中，于30℃，220rpm，摇床培养至少24h，至OD600≥10。
本发明还提供了上述重组大肠杆菌或上述方法在制备胆绿素或含胆绿素的产品中的应用。
有益效果：
本发明实现了胆绿素合成关键酶的来源筛选和理性改造，解决了之前胆绿素产量低的问题。通过从10种不同动物、植物、微生物来源的HO中筛选出最适合胆绿素合成的关键限速酶，并在此基础上理性改造，可实现摇瓶水平胆绿素和藻蓝素在大肠杆菌中的高效合成。在摇瓶水平，所得胆绿素产量可达13.41mg/L，该结果为胆绿素在食品、医药、化妆品领域的应用奠定了基础。
附图说明
图1为不同来源血红素加氧酶(HO)在大肠杆菌中的表达与筛选。
图2为理性改造提高血红素加氧酶(HO)催化效率。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB培养基：10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠、5g/L酵母膏，121℃灭菌15min。
TB培养基：12g/L蛋白胨、5g/L甘油、24g/L酵母膏、17mM磷酸二氢钾、72mM磷酸氢二钾，115℃灭菌20min。
检测方法：
胆绿素高效液相色谱分析方法：将甲醇和发酵液按2:1体积混合，50℃水浴加热1小时，震荡5min，13000g离心15min，取上清液通过0.22μm滤膜过滤，进行高效液相色谱分析(日本岛津)，使用Robussil C18柱(5μm，4.6×250mm，美正检测)。检测波长376nm，柱温30℃，流速1ml/min，进样量10ul，等度洗脱法：A(甲醇)：B(水溶液,用冰乙酸调PH至2.6)＝70：30，运行时间：25min。
实施例1：不同来源血红素加氧酶(HO)在大肠杆菌中的表达与筛选
(1)通过在BRENDA Enzyme Database(https://www.brenda-enzymes.org)检索heme oxygenase(EC1.14.14.18)，选择来源于嗜热聚球藻(Thermosynechococcuselongatus)BP-1的hoT、来源于集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC6803的hoS、来源于念珠藻属(Nostoc sp.)PCC 7120的hoN、来源于脑膜炎耐双球菌(Neisseria meningitidis)的hoNM、来源于大豆(Glycine max)的hoGM、来源于人(Homo sapiens)的hoH、来源于牛(Bostaurus)的hoB、来源于兔(Oryctolagus cuniculus)的hoO、来源于鼠(Rattus norvegicus)的hoR、来源于鸡(Gallus gallus)的hoGG进行大肠杆菌密码子优化，获得相应的优化后基因序列(分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11所示)。合成上述基因，并将其分别亚克隆到pRSFDuet-1的Nde I和Xho I位点之间，分别得到重组质粒pRSFDuet-T7lac-hoT、pRSFDuet-T7lac-hoS、pRSFDuet-T7lac-hoN、pRSFDuet-T7lac-hoNM、pRSFDuet-T7lac-hoGM、pRSFDuet-T7lac-hoH、pRSFDuet-T7lac-hoB、pRSFDuet-T7lac-hoO、pRSFDuet-T7lac-hoR、pRSFDuet-T7lac-hoGG，分别将上述10个重组质粒转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中得到10个重组菌株，分别命名为S1-S10。
(2)对S1-S10重组菌株使用进行发酵，首先将单菌落接种于LB培养基中，于37℃，220rpm，摇床培养8～12h，接着将一级种子液按2％的接种量(v/v)接种到TB培养基中，于37℃培养至OD 600值为0.6-0.8时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，然后在30℃，220rpm继续培养24h，至OD600＝10。发酵结果如图1所示，S1菌株(含有重组质粒pRSFDuet-T7lac-hoT)BV滴度为5.62mg/L，S2菌株(含有重组质粒pRSFDuet-T7lac-hoS)BV滴度为5.42mg/L，优于其他藻类、微生物、植物和动物来源的HO。
实施例2：理性改造HOT提高胆绿素(BV)产量
(1)以实施例1筛选得到的HOT的分子结构出发进行理性改造设计。首先，通过Discovery Studio 2019对Thermosynechococcus vestitus BP-1来源的HO进行同源建模，通过序列搜索选取来源于Synechocystis sp.PCC6803的HO(PDB代码1WE1，71.4％同源性，86.6％相似性，分辨率)作为模板，预测HOT蛋白结构，接着对预测产生的20种全原子模型进行打分、骨架结构拉式评估，选出DOPE SCORE＝-25997，Residues in allowedregion＝98.5％的HOT蛋白结构为最佳模型，将此模型和血红素进行分子对接，将距离活性中心/>范围内所有氨基酸进行丙氨酸扫描、虚拟饱和突变，选择突变能量小于-0.5kcal/mol的点进行突变体菌株构建。以实施例1构建的重组菌株S1(含有重组质粒pRSFDuet-T7lac-hoT)为模板，根据PCR扩增整个质粒的方法，使用引物(含有所需点突变)将碱基替换引入质粒中。两个引物在其5′端有15bp的重叠，使得扩增后的PCR产物可以相互退火重组为双链DNA，构建含突变的重组质粒pRSFDuet-T7lac-hoTmutF29W、pRSFDuet-T7lac-hoTmutK166D、pRSFDuet-T7lac-hoTmu tK139D、pRSFDuet-T7lac-hoTmutK169Y、pRSFDuet-T7lac-hoTmutR10W、pRSFDuet-T7lac-hoTmutL30W、pRSFDuet-T7lac-hoTmutK139E、pRSFDuet-T7lac-hoTmutK166E、pRSFDuet-T7lac-hoTmutV26Q，并将上述9个质粒分别转化至BL21(DE3)中，获得分别含血红素加氧酶突变体F29W、K166D、K139D、K169Y、R10W、L30W、K139E、K166E和V26Q重组菌株。
(2)将上述重组菌株(F29W、K166D、K139D、K169Y、R10W、L30W、K139E、K166E和V26Q)分别进行摇瓶发酵，发酵条件如实施例1，结果如图2所示，重组菌株F29W菌株(含有质粒pRSFDuet-T7lac-hoTmutF29W)胆绿素产量为10.99mg/L，与实施例1构建的菌株S1相比，提高95.55％。
在此基础上以重组菌株F29W菌株(含有质粒pRSFDuet-T7lac-hoTmutF29W)为模板，引物设计原则同步骤(1)，构建了8株HOT双突变菌株(F29W/K166D,F29W/K139D,F29W/K169Y,F29W/R10W,F29W/L30W,F29W/K139E,F29W/K166E,F29W/V26Q)，并分别进行摇瓶发酵，结果发现催化活性进一步提高(图2)，效果最佳的双突变株F29W/K166D胆绿素产量可达13.41mg/L，相较于F29W菌株提升了22.02％。
(3)对F29W/K166D进行同源建模，并和小分子血红素进行分子对接，根据对接结果，虽然氨基酸Try29和Asp166不直接与底物血红素相互作用，但在HOT(F29W/K166D)模型中，底物周围的氢键较HOT模型增加。此外，Try29和Asp166与周围氨基酸的疏水相互作用增加，可能导致了更灵活的底物进入。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.血红素加氧酶突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为出发序列，进行了如下任一种改进：
(1)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第29位的苯丙氨酸突变为色氨酸；
(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第166位的赖氨酸突变为天冬氨酸；
(3)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第29位的苯丙氨酸突变为色氨酸，并将第166位的赖氨酸突变为天冬氨酸。
2.编码权利要求1所述血红素加氧酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒为pRSFDuet-1。
5.表达权利要求1所述血红素加氧酶突变体的重组微生物。
6.根据权利要求5所述的重组微生物，其特征在于，以大肠杆菌为宿主。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，所述大肠杆菌包括但不限于BL21(DE3)，C41(DE3)或C43(DE3)。
8.一种提高血红素加氧酶催化效率的方法，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为出发序列，将第29位的苯丙氨酸突变为色氨酸，和/或将第166位的赖氨酸突变为天冬氨酸。
9.一种发酵生产胆绿素的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在LB和/或TB培养基中培养。
10.权利要求1所述的血红素加氧酶突变体或权利要求5～7任一所述的重组微生物，或权利要求8～9任一所述的方法在制备胆绿素或含胆绿素的产品中的应用。
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