CN117904037A - 一种高效治疗骨关节炎的脂肪干细胞及其分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物医药技术领域，涉及一种高效治疗骨关节炎的脂肪干细胞及其分离方法，具体涉及一种包含治疗有效量的分离的脂肪干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物可用于治疗骨关节炎，其中所述的分离的脂肪干细胞是DPP4阳性脂肪干细胞，所述DPP4阳性脂肪干细胞为CD31‑CD45‑DPP4+的特异性脂肪干细胞，所述骨关节炎为膝骨关节炎，经动物实验，结果显示，纯化后的DPP4+脂肪干细胞更利于治疗骨关节炎。
Description
技术领域
本发明属生物医药技术领域，涉及一种高效治疗骨关节炎的脂肪干细胞及其分离方法，具体涉及一种包含治疗有效量的分离的脂肪干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的退行性关节紊乱疾病，随着全球人口寿命的增加，骨关节炎患者的数量逐渐增加，全球约有2.4-2.5亿人受到影响，给社会造成严重的医疗负担。目前关于OA的传统方法有非药物治疗、药物治疗及手术。非药物治疗只有短期的治疗效果，需要物理治疗师的帮助；药物治疗能够有效缓解骨关节炎引发的疼痛，但不能逆转骨关节炎发病进程，而且长期服用药物具有一定的副作用；手术治疗主要针对骨关节炎终末期患者，但费用高、恢复周期长、置换关节寿命有限。由于骨关节炎传统治疗方法的局限性，临床急需一种替代疗法。随着再生医学的发展，间充质干细胞治疗骨关节炎受到更多的关注。
间充质干细胞是一类能够自我更新并具有多种分化潜能的细胞，被称为“种子细胞”。间充质干细胞的强增殖能力、多向分化潜能、免疫调节能力为OA的治疗开辟了一条新道路。间充质干细胞可以从骨髓、脐带、脂肪及滑膜组织中获取，其中脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)来源丰富，提取工艺简单，产量高，同时可以分泌多种细胞因子促进软骨再生，通过旁分泌调节T细胞增殖减轻炎症，因而被广泛应用于临床研究。2018年，Yang Song等人发现关节腔内注射人脂肪干细胞可以改善骨关节炎患者膝关节疼痛和软骨损伤。2019年，Woo-Suk Lee等人对骨关节炎患者注射脂肪干细胞，6个月后患者骨关节炎指数WOMAC显著降低，核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)显示对照组的软骨缺损面积增加，但MSCs注射组没有显著变化。基础研究与临床研究结果一致，小鼠关节腔内注射髌下脂肪垫干细胞能够降低骨关节炎的炎症和软骨损伤，增加糖胺聚糖的合成，诱导内源性软骨生成。但脂肪干细胞治疗骨关节炎临床疗效并不稳定，Yves-Marie Pers发现注射不同剂量自体脂肪干细胞患者疼痛改善效果不同，低剂量组疼痛指标得到显著改善，MRI显示部分患者蛋白聚糖含量增加，软骨变性得到改善，但其他患者观察到相反的效果。供体年龄、BMI、受体软骨损伤面积等因素也影响脂肪干细胞治疗效果，Yong Sang Kim发现大于60岁的骨关节炎患者接受自体脂肪干细胞治疗疗效较差[30]。Yong Gon Koh发现BMI大于27.5kg/m2和软骨损伤面积大于5.4cm2的患者接受自体脂肪干细胞疗效不佳。因此，本发明试图寻找一群特异性脂肪干细胞，能够稳定有效地治疗膝骨关节炎。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的基础与现状，提供能够稳定有效地治疗膝骨关节炎的药物组合物。
本发明的第一方面提供一种包含治疗有效量的分离的脂肪干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物用于治疗骨关节炎，其中所述的分离的脂肪干细胞是DPP4阳性脂肪干细胞。优选地，所述DPP4阳性脂肪干细胞为CD31-CD45-DPP4+的特异性脂肪干细胞。优选地，所述DPP4阳性脂肪干细胞采用流式细胞仪分选技术获得。优选地，所述骨关节炎为膝骨关节炎。所述“药学上可接受的载体”包括药物可接受的赋形剂、载体或稀释剂。所述药物组合物还可包括润滑剂、调味剂、乳化剂、或防腐剂。优选地，可将所述药物组合物配制成适于注射进入组织或器官的注射剂。
本发明的第二方面提供DPP4阳性脂肪干细胞在制备用于治疗骨关节炎药物中的用途。优选地，所述DPP4阳性脂肪干细胞为CD31-CD45-DPP4+的特异性脂肪干细胞。优选地，所述骨关节炎为膝骨关节炎。
本发明的第三方面提供一种DPP4阳性脂肪干细胞的分离方法，包括如下步骤：
(1)将经胶原酶消化获得的脂肪组织血管基质组分，加入红细胞裂解液裂解去除红细胞后离心；
(2)PBS重悬清洗后离心；
(3)加入10％羊血清封闭30min；加入5％羊血清稀释的抗体100μL/只，4℃避光放置40min，其中包含抗体CD31(1:1000)，抗体CD45(1:1000)，抗体DPP4(1:200)；
(4)加入含有2％羊血清的PBS清洗，离心后弃上清；
(5)用含有2％羊血清的PBS重悬细胞，细胞悬液用300目筛网过滤，上流式细胞仪分选后获得DPP4阳性脂肪干细胞。。
本发明的第四方面提供本发明第三方面所述的分离方法获得的DPP4阳性脂肪干细胞在制备治疗骨关节炎药物的用途。优选地，所述骨关节炎为膝骨关节炎。
脂肪干细胞主要来自脂肪组织血管基质组分(stromal vascular fraction，SVF)，是异质性的细胞群体，不同细胞亚群特性不同。2018年发表于Nature的一项研究，首次将单细胞测序技术用于探究脂肪干细胞的异质性，对Lin-/CD29+/CD34+SCA1+细胞进行单细胞测序，分为三个亚群，组1为SCA1+VAP-1+亚群，组2为SCA1+CD55+亚群，组三为CD142+ABCG1+亚群，发现CD142+ABCG1+是脂肪生成调节细胞，以旁分泌的方式抑制脂肪细胞的生成。2019年，David Merrick运用单细胞测序解析小鼠脂肪干细胞的异质性，发现3群丰富的脂肪干细胞亚群：DPP4+，CD142+，ICAM1+细胞亚群，研究发现间质祖细胞DPP4+细胞亚群增殖及多向分化潜能较强，可以形成脂肪前体细胞ICAM1+和CD142+细胞亚群，DPP4+、ICAM1+、CD142+在体内均具有较强的成脂能力。肥胖对脂肪干细胞的异质性具有一定的影响。HahnNahmgoong等人发现饮食诱导的肥胖会增加iWAT特异性CXCL14+ASCs亚群；David Merrick等人发现饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织血管基质组分中间质祖细胞DPP4+细胞亚群比例减少、脂肪前体细胞CD142+细胞亚群比例增加；Blanca 发现肥胖和代谢综合症患者(BMI＞40kg/m2)白色脂肪组织SVF中CD90+细胞含量高于非肥胖代谢正常个体(BMI＜25kg/m2)。
为挑选优质干细胞治疗膝骨关节炎，本发明采用了以下技术方案：
通过比较非肥胖组(wild type，WT)和肥胖组小鼠(ob/ob，OB)的脂肪干细胞对骨关节炎小鼠模型治疗效果，发现WT-ASCs有效抑制软骨变性，缓解关节疼痛，疗效优于OB-ASCs。在体外实验中，发现WT-ASCs增殖能力、成软骨潜能、抗炎能力优于OB-ASCs。
进一步，通过单细胞测序及实时定量PCR发现WT小鼠皮下脂肪组织血管基质组分中间质祖细胞DPP4+细胞亚群比例和DPP4基因表达高于OB小鼠。
最后，通过流式分选DPP4+及DPP4-细胞亚群进行动物实验，结果显示，两种细胞亚群形态没有显著差异，但DPP4+细胞亚群有效缓解骨关节炎疼痛，DPP4-细胞没有疗效，提示DPP4+细胞亚群含量影响脂肪干细胞对骨关节炎的治疗效果。
本发明提供了DPP4+细胞比例较高的脂肪干细胞，其治疗骨关节炎的效果更好，纯化后的DPP4+脂肪干细胞更利于治疗骨关节炎，进一步，本发明提供了一种包含治疗有效量的分离的脂肪干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，该药物组合物可用于治疗骨关节炎。
附图说明
图1：脂肪干细胞的分离过程。
图2:WT-ASCs有效抑制内侧半月板不稳术诱导的骨关节炎小鼠的软骨损伤，其中，A，实验流程图，B，ASCs注射4周后小鼠膝关节番红固绿染色(比例尺＝200微米，上图)和苏木精-伊红染色(比例尺＝200微米，下图)，C，OARSI评分分析骨关节炎严重程度(n＝5)，D，CatWalk分析获取小鼠同侧和对侧后肢步态参数的变化(n＝7)，E，用冯弗雷细丝测量机械性刺激缩足阈值(n＝6-7)，数据以平均值±标准误表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图3:WT-ASCs与OB-ASCs细胞形态、增殖能力及成软骨潜能的比较，其中，A，P2代WT-ASCs和OB-ASCs的细胞形态(比例尺＝200微米)，B，用CCK8试剂盒检测ASCs的增殖能力，C，脂肪干细胞成软骨诱导0天、7天、14天和21天的阿利新蓝染色。D，Western blot检测软骨诱导21天时Sox9的表达，E，软骨诱导21天时检测Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan的基因表达，F，术后8周取小鼠软骨组织，Western blot检测软骨组织中CollagenⅡ、Sox9、Aggrecan的表达，G-H，F12/DMEM，WT-ASCs和OB-ASCs上清液孵育RAW 264.7细胞IL-1β、IL-6基因的表达，数据以平均值±标准误表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图4:WT-SVF和OB-SVF的单细胞测序分析，其中，A-B，雄性C57BL/6和OB小鼠皮下脂肪血管基质组分的聚类分群，C，每群细胞占SVF的比例，D，UMAP显示单个标记基因的表达水平和分布，E，间充质干细胞标记基因CD140a、CD140b、ICAM1、CD142、PPARγ、aP2在WT-SVF和HFD-SVF的表达，数据以平均值±标准误表示，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图5:DPP4+细胞亚群有效缓解骨关节炎小鼠的疼痛，其中，A，DPP4+/DPP4-细胞的分选流程，B，P2代DPP4+/DPP4-的细胞形态(比例尺＝200微米)，C，动物实验流程图。D，CatWalk分析获取小鼠同侧和对侧后肢步态参数的变化(n＝8)，E，用冯弗雷细丝测量机械性刺激缩足阈值(n＝7-8)，数据以平均值±标准误表示，*p＜0.05，**p＜0.01。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
1主要实验材料与仪器
1.1实验动物
实验包括C57BL/6J品系的雄性野生型小鼠及ob/ob肥胖小鼠，小鼠均购自江苏集萃药康生物科技有限公司，SPF级，6-8周龄，动物实验均获得复旦大学基础医学院动物伦理委员会的批准。动物饲养在复旦大学上海医学院实验动物楼，饲养区为SPF级别(无特定病原体生物)，进行标准的12h明暗周期，温度维持设定在21-23℃之间，自由进食和饮水。
1.2实验细胞
小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7，购自ATCC细胞库。
1.3主要实验仪器
1.4主要试剂
2主要试剂配置
2.1磷酸盐缓冲溶液(1×PBS，pH7.4)
电子天平称取上述药品放置在1L烧杯中，加去离子水溶解，量筒定容至1000mL，溶解混匀，0.22μm滤器过滤，分装到250mL无菌玻璃瓶中，封口膜密封，置于室温保存。
2.2 DEPC水
将500μL DEPC溶于500mL去离子水，剧烈震荡，充分混匀后装到无菌玻璃瓶，进行高压灭菌，冷却后分装到50mL离心管，封口膜密封，置于-20℃保存。
2.3 1.5M Tris-HCL溶液(pH8.8)
电子天平称取181.71g Tris-base试剂放置在1L烧杯中，加去离子水溶解，放置在磁力搅拌器充分溶解混匀，用pH计测定pH，通过加入一定量的浓盐酸调节至pH＝8.8，终体积为1L，置于4℃保存。
2.4 1M Tris-HCl溶液(pH6.8)
电子天平称取121.14g Tris-base试剂放置在1L烧杯中，加去离子水溶解，放置在磁力搅拌器充分溶解混匀，用pH计测定pH，通过加入一定量的浓盐酸调节至pH＝6.8，终体积为1L，置于室温保存。
2.5 10％SDS溶液
电子天平称取10g十二烷基硫酸钠(SDS)放置在500mL烧杯中，溶解混匀，加入去离子水定容至100mL，置于室温保存。
2.6 10％AP溶液
电子天平称取10g过硫酸铵(AP)放置在500mL烧杯中，溶解混匀，加去离子水定容到100mL，分装在1.5mL EP管，置于-20℃保存。
2.7细胞裂解液
称取上述体积的试剂充分混匀，配置细胞裂解液，室温保存。
2.8 5×蛋白质loading buffer(蛋白质上样缓冲液)
称取上述体积和质量的试剂及粉末放置在500mL烧杯中，放置在磁力搅拌器充分混匀，分装在5mL EP管，封口膜密封，置于-20℃保存。使用时，需要加入5％巯基乙醇。
2.9 SDS-PAGE凝胶
10％分离胶
上述溶液按照一定体积加入烧杯中，充分混匀后加入制胶板槽中，加1mL正丁醇封胶，30min后，待分离胶凝固，继续配置浓缩胶。
浓缩胶
将封胶液体正丁醇弃去，用自来水冲洗干净，自然晾干，将上述溶液按照一定体积加入烧杯中，充分混匀后加入制胶板槽中，迅速将梳子插入卡进板槽。待浓缩胶凝固后可直接使用或用保鲜膜包裹，置于4℃保存。
2.10 5×SDS Running Buffer电泳缓冲液
电子天平称取上述药品放置在5L烧杯中，溶解混匀，加去离子水定容到2000mL，置于室温保存。
2.11 10×转膜缓冲液
电子天平称取60.5g Tris-base试剂和288g甘氨酸放置在5L烧杯中，溶解混匀，加去离子水定容到2000mL，置于室温保存。
2.12 10×TTBS(pH＝7.5)
电子天平称取上述粉末加入一定体积的盐酸和吐温，放置在5L烧杯中，加去离子水溶解混匀，用pH计测定pH，通过加入一定量的浓盐酸调节至pH＝7.5，终体积为1L，置于室温保存。
2.13封闭液
电子天平称取5g的脱脂奶粉溶于100mL TTBS溶液，充分搅拌混匀，完全溶解，置于4℃保存。
2.14一抗稀释液(3％ BSA)
电子天平称取3g牛血清白蛋白(BSA)试剂溶于100mL TTBS，加入1mL叠氮化钠，充分搅拌混匀，完全溶解，置于4℃保存。
2.15二抗稀释液
5％脱脂奶粉溶液，电子天平称取5g的脱脂奶粉溶于100mL TTBS溶液，充分搅拌混匀，完全溶解，置于4℃保存。
2.16 100×生物素溶液
电子天平称取1.6g生物素粉末和0.8g泛酸钙粉末放置在5L烧杯中，加2000mL去离子水溶解，放置于56℃的水浴锅中溶解，待完全溶解后在细胞房的超净工作台用0.22μm的过滤器过滤除菌，过滤后的液体分装到15mL的无菌离心管，置于-20℃保存。每次使用时需用细胞培养基稀释至1×使用。
2.17地塞米松(1mM，1000×)
电子天平称取0.2695g地塞米松粉末，加30mL去离子水溶解，待完全溶解后在细胞房的超净工作台用0.22μm的过滤器过滤除菌，过滤后的液体分装到1.5mL的无菌离心管，置于-20℃保存。每次使用时需用细胞培养基稀释至1×使用。
2.18 4％多聚甲醛(pH＝7.2-7.3)
电子天平称取40g多聚甲醛放置在5L烧杯中，加入500mL去离子水，加热至60℃充分溶解混匀，加入适量NaOH晶体，搅拌至透明，加入PBS 400mL，用pH计测定pH，调至pH＝7.2-7.3，终体积为1000mL。
2.19 4％水合氯醛溶液
电子天平称取10g水合氯醛，加100mL去离子水溶解，震荡混匀，待完全溶解后在细胞房的超净工作台用0.22μm的过滤器过滤除菌，置于室温保存。
2.20 0.075％胶原酶溶液
电子天平称取0.075gⅧ型胶原酶，加100mL 1×PBS溶解，震荡混匀，待完全溶解后在细胞房的超净工作台用0.22μm的过滤器过滤除菌，现配现用。
3.实验方法
3.1内侧半月板不稳术(destabilization of the medial meniscus，DMM)
6-8周龄C57BL/6雄性小鼠，禁食4-6h后，腹腔注射4％的水合氯醛溶液，2-3分钟后麻醉成功。剃除小鼠右侧膝关节处毛发，碘伏擦拭进行消毒，一次性手术刀外侧切开小鼠皮肤0.5-0.8cm，暴露关节囊，手术刀轻轻划开髌韧带，膝关节弯曲至90℃将髌韧带及髌骨脱位，钝性剥离髌下脂肪垫，暴露半月板，离断内侧半月板与胫骨平台连接的内侧半月板胫韧带，游离内侧半月板，髌韧带及髌骨复位，闭合关节腔；8-0圆针缝合筋膜韧带，6-0角针缝合皮肤，碘伏擦拭。假手术组划开皮肤和髌韧带后，不做处理，直接逐层缝合。
3.2关节腔注射脂肪干细胞
DMM术后4周，造模组随机分为3组，分别关节腔注射PBS，WT-ASCs，OB-ASCs。小鼠禁食4-6h后，腹腔注射4％的水合氯醛溶液，2-3分钟后麻醉成功。小鼠右侧膝关节处剃除毛发，碘伏擦拭消毒3次，将小鼠右侧膝关节弯曲，胰岛素微量注射器入针注射5×105WT-ASCs/OB-ASCs/PBS，待小鼠苏醒后放置于鼠笼继续喂养。
3.3 Catwalk步态分析
CatWalk步态分析系统(Noldus Information Technology)是测量小鼠自由运动时步态参数的仪器。动物步态分析系统(CatWalk XT)主要包括一块玻璃板，行走通道，光源和可移动的挡板，利用内光源脚印折射技术可以捕捉啮齿动物的足迹，记录和自动分析啮齿动物的运动和足迹，分析系统可以将足迹可视化呈现，并计算足迹尺寸，足迹之间的时间和距离等有关的统计信息。测量前一周，训练小鼠能够顺利不间断通过通道，正式实验时，将灯关闭，使小鼠处于黑暗的环境下，保持安静，设定参数，使小鼠从通道一头行走至另一头，根据仪器所记录的脚印参数汇总后进行数据分析。
3.4 Von Frey检测疼痛
将小鼠放置在透明塑料盒内，底板为不锈钢丝格栅，适应0.5h，采用0.2g的冯弗雷细丝刺激小鼠脚掌中心待细丝呈S状，5s后观测其是否有舔足或抬足行为，若有则为阳性记为X，每两次刺激中间间隔5s。若出现阳性，则选择一个较弱细丝进行刺激，若阴性，则选择较强细丝进行刺激，出现变化后再测四次则停止检测，数据通过50％g缩足阈值＝(10[Xf +kδ])/10000公式进行校正。
3.5小鼠膝关节组织包埋切片
(1)固定：DMM术后8周，处死小鼠，沿股骨和胫骨远端取出膝关节，仔细剔除膝关节周围皮肤肌肉及结缔组织，注意不要破坏膝关节，保证膝关节的完整性。将其浸泡在4％多聚甲醛溶液中，室温固定24h，PBS多次清洗，去除多余的多聚甲醛固定液。
(2)脱钙：将膝关节放至pH＝7.4的10％EDTA脱钙液中进行脱钙，每3天换一次脱钙液，4℃摇床进行脱钙，3周后，用针刺膝关节无阻力时则脱钙结束。脱钙结束后PBS多次清洗，去除多余的脱钙液。
(3)脱水：将标本依次放置在50％乙醇溶液1h、70％乙醇溶液1h、80％乙醇溶液1h、90％乙醇溶液1h、100％乙醇溶液1h梯度脱水。
(4)透明：脱水后，将标本放置在二甲苯Ⅰ30min，将标本放置在二甲苯Ⅱ30min。
(5)包埋：将组织放在盛有石蜡的模具中，于石蜡包埋机冷却凝固。
(6)切片：将蜡块放置在切片机，取矢状位切片，厚度为5μm，65℃烘30min，至石蜡融化。
(7)脱蜡及复水：将玻片依次放置在二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浸泡15min脱蜡。将玻片依次放置在100％乙醇溶液Ⅰ、100％乙醇溶液Ⅱ、95％乙醇溶液、70％乙醇溶液及蒸馏水，每次2min，重复一次以上操作。
3.6番红固绿染色
脱蜡复水后，固绿染色10min，流水冲洗5s。番红染色30s，流水冲洗5s。置于95％乙醇Ⅰ1min，95％乙醇Ⅱ1min。将玻片分别置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5min，中性树胶封片，置于显微镜下观察拍照。
3.7 HE染色
脱蜡复水后，苏木素染细胞核3min，流水冲洗1min。用1％盐酸乙醇分化30s，流水冲洗3min。稀氨水返蓝30s，流水冲洗10s。伊红染胞浆2min，流水冲洗5s，置于95％乙醇Ⅰ3min，95％乙醇Ⅱ3min。将玻片分别置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5min，中性树胶封片。置于显微镜下观察拍照。
3.8脂肪干细胞的分离
实验动物为6-8周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠、ob/ob及HFD雄性小鼠，颈椎脱臼处死，浸泡在75％乙醇溶液中，转移至细胞房的超净工作台操作，以下步骤需保证无菌操作。提前灭菌的器械划开皮肤，暴露皮下脂肪组织，取出皮下白色脂肪组织(subcutaneouswhite adipose tissue,Sc-WAT)至含有双抗的PBS溶液中漂洗2遍，转移至离心管，在5mLPBS中剪碎至1立方毫米大小，加入3倍体积的0.075％Ⅷ型胶原酶，37℃，150rpm，消化40min，每隔10min取出剧烈摇晃。待组织完全消化后，加入3mL含血清的细胞培养基终止胰酶的消化，颠倒混匀，过100目滤网去除较大的组织块，1700rpm室温离心5min。弃去上层液体，加入3mL提前配置的1×红细胞裂解液去除红细胞，1700rpm室温离心5min，弃上层液体，PBS清洗1遍，再次离心，管底沉淀为血管基质组分，DMEM/F12完全培养基重悬接种到培养皿，贴壁后细胞为脂肪干细胞(图1)。
3.9脂肪干细胞的培养及传代
(1)细胞培养：DMEM/F12完全培养基包括10％胎牛血清、青霉素和链霉素。脂肪干细胞用DMEM/F12完全培养基培养。
(2)细胞传代：细胞密度融合到80％-90％时，PBS漂洗2次，用0.025％胰酶消化1min，镜下观察待其恢复至圆形加完全培养基终止消化。
(3)细胞冻存：细胞终止消化后，室温1100rpm离心5min，弃上清，加入冻存液(胎牛血清：DMEM/F12：DMSO＝5:4:1)重悬细胞沉淀，转移至冻存管，梯度降温后于液氮保存。
(4)细胞复苏：将冻存管从液氮罐中迅速取出，放置在37℃水浴锅，轻微摇晃1min左右，将冻存管液体转移至9mL DMEM/F12完全培养基，1100rpm室温离心5min，弃上清，用DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液转移至细胞培养皿中进行培养。
3.10脂肪干细胞诱导成软骨及阿利新蓝染色
(1)软骨诱导液：DMEM/F12培养基中依次加入地塞米松、抗坏血酸和胰岛素铁硒传递蛋白、TGF-β，终浓度为100nm、50ug/mL、1％、10ng/mL。
(2)成软骨诱导：细胞铺板后，加入成软骨诱导液，每隔3天换液，诱导21天收样。
(3)阿利新蓝染色：弃去诱导分化后培养皿里的培养基，用1×PBS轻缓漂洗3次；加入2mL 4％的多聚甲醛固定30min，用1×PBS轻缓漂洗3次；加入1mL阿利新蓝染液室温染色2小时，弃染液，1×PBS洗三遍，在皿中加入2mL 1×PBS，显微镜下观察。
3.11 RAW264.7细胞系的培养及极化
(1)细胞培养：RAW264.7细胞在10％胎牛血清、青霉素、链霉素和生物素的DMEM完全培养基中培养。
(2)细胞传代：细胞密度融合到80％-90％时，PBS漂洗2次，加入2mL完全培养基，细胞刮子轻轻刮动细胞表层，枪头吹散细胞。
(3)细胞极化：细胞密度融合到70％-80％时，加入含1ug/mL脂多糖的完全培养基诱导24h，镜下观察细胞呈现M1型细胞形态。
3.12总RNA的提取、逆转录及实时定量PCR(qPCR)
(1)总RNA的提取：收集组织样本和细胞样本，1×PBS洗2次；加1mL TRIZOL试剂。将动物组织样本置于组织匀浆仪匀碎，细胞样品枪头吹打。将液体转移至1.5mL无RNA酶的1.5mL EP管，12000rpm，10min，4℃离心，吸取中间澄清液体至新的EP管，去除油脂和组织碎片；加200μL三氯甲烷，颠倒30次，充分混匀，静置5min，12000rpm，4℃离心10min；吸上清转移至新的无RNA酶的1.5mL的EP管，加等量的异丙醇，充分混匀，12000rpm，4℃离心10min；弃上清，加75％乙醇DEPC水1mL，12000rpm，4℃离心10min；弃上清，静置2min，加DEPC水10μL-20μL，于4℃溶解30min。RNA样品提取结束后，通过微量分光光度计测定样品RNA的浓度，用于逆转录实验。
(2)逆转录：按照说明书分3步进行。逆转录结束后，可以获得20μL体积的cDNA产物，可作为模板用于实时定量PCR。
(3)实时定量PCR(qPCR)：用灭菌的去离子水将2×SYBR Green Mix稀释至1×，反应体系中加入模板cDNA及引物，通用对照引物为18S。根据模板数目及待测基因，在程序进行设定参数，进行实时定量PCR反应。根据结果进行数据分析，检测基因表达水平。
引物序列：
3.13总蛋白提取及Western blot
(1)收集组织样本和细胞样本，1×PBS洗2次，根据细胞量加入细胞裂解液。将动物组织样本置于组织匀浆仪匀碎，细胞样品吹打刮下，转移至EP管，12000rpm，10min，4℃离心，吸取中间澄清液体至新的EP管，去除油脂和组织碎片，脂肪细胞重复3遍，非脂肪细胞仅离心一遍去除细胞碎片即可。
(2)BCA定量：根据说明书测定标准曲线及计算蛋白样品浓度，加入1×Loading蛋白上样缓冲液，震荡混匀后放置在100℃金属浴煮15min。
(3)Western blot：制备SDS-PAGE凝胶，下层为分离胶，上层为浓缩胶；由蛋白定量结果计算上样体积，用上样针或移液枪注入胶孔中，在一胶孔注入蛋白marker；将电压调至80V，待样品运动到分离胶，将电压调至100V，溴酚蓝电泳到胶底部时关闭电压；转膜使用PVDF膜，预先在甲醇溶液中浸泡活化，转膜时为三明治方法即滤纸-PVDF膜-聚丙烯酰胺凝胶-滤纸放置在转膜槽，300mA，转膜120min；转膜结束后，将PVDF膜取出放置在5％脱脂牛奶溶液中封闭1h；将PVDF膜浸泡在1×TTBS中漂洗1min；根据目的条带的分子量裁剪PVDF膜，用3％BSA稀释一抗，一抗孵育4℃过夜；1×TTBS洗一抗，10min/次，共计3次；根据一抗说明书选择二抗抗鼠或抗兔，用5％脱脂牛奶稀释二抗，二抗室温孵育1h；1×TTBS洗二抗，15min/次，共计3次；PVDF膜ECL发光液孵育1-2min，显影曝光。
3.14细胞增殖实验(Cell Counting Kit-8，CCK8)
选择Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂检测WT-ASCs和OB-ASCs的增殖活力。胶原酶消化法获得两种脂肪干细胞，经过传代培养，取第2代细胞使用0.0125％胰酶进行消化，1100rpm室温离心5min，弃上清后用DMEM/F12完全培养基重悬调整细胞密度，在96孔板接种脂肪干细胞，每孔接种3000个细胞，设定0h，24h，48h，72h，96h五个时间点检测，每个时间点有4个复孔，置入37℃、5％ CO2细胞培养箱中培养。接种4h后计为0h，更换含有10％CCK-8的完全培养基，体积为100μL/孔，将孔板置于细胞培养箱中孵育2小时。通过酶标仪测定波长450nm时每孔的吸光度。通过减去空白孔获得调整后OD值，以时间作为横坐标，OD值作为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
3.15流式分选DPP4+/-细胞
(1)将经胶原酶消化获得的血管基质组分，加入红细胞裂解液2mL/只裂解去除红细胞，1700rpm离心5min。
(2)PBS重悬清洗，1700rpm离心5min。
(3)加入10％羊血清封闭30min；加入5％羊血清稀释的抗体100μL/只，4℃避光放置40min。抗体CD31(BD PharmingenTM，102427，1:1000)，CD45(biolegend，103107，1:1000)，DPP4(biolegend，137809，1:200)。
(4)加入含有2％羊血清的PBS清洗，1700rpm离心5min，弃上清。
(5)用含有2％羊血清的PBS重悬细胞，细胞悬液用300目筛网过滤，上机分选。
3.16单细胞测序
将经胶原酶消化获得的血管基质组分制成单细胞悬液，送至公司进行单细胞测序及分析。
3.17统计分析
本实验所有数据在图中均以平均值±标准差(mean±SEM)表示，两组数据进行比较时使用Student’s-t检验，多组数据之间进行比较时采用单因素方差分析(one-wayANOVA)。在GraphPad Prism 8.0软件中进行数据分析确定差异。图中*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001以及****P＜0.0001表示统计学差异，ns认为没有统计学差异。
4实验结果
4.1 WT-ASCs与OB-ASCs治疗骨关节炎疗效比较
目前大量研究报道脂肪干细胞可以有效缓解骨关节炎，但疗效并不稳定。肥胖发病率逐渐增加，且脂肪干细胞供体的BMI影响脂肪干细胞对骨关节炎的疗效，因此我们想要探究正常与肥胖小鼠脂肪干细胞对骨关节炎的疗效差异。
我们购买8周龄的雄性C57BL/6小鼠，使小鼠适应环境一周，对小鼠进行经典的内侧半月板不稳术构建小鼠骨关节炎模型，术后4周，关节腔注射PBS，5×105WT-ASCs，5×105OB-ASCs，术后8周对小鼠膝关节收样，进行组化染色(图2A)。番红固绿染色及HE染色显示对照组软骨层连续致密，潮线清晰，软骨细胞均匀分布。DMM造模后PBS注射组软骨表层不连续，垂直裂缝到达钙化软骨，番红O染色减少，软骨细胞成簇存在、排列紊乱，表明骨关节炎模型构建成功。与PBS注射组相比，WT-ASCs注射组软骨表面仅存在轻微纤维化，软骨层较为连续，软骨损伤减轻，但OB-ASCs注射组软骨层不连续，垂直裂隙到达钙化软骨，软骨细胞成簇存在，表明WT-ASCs可有效减轻OA小鼠软骨损伤，OB-ASCs疗效较差(图2B)。对番红固绿染色进行OARSI组织学评分用于量化软骨损伤的严重程度，评分越高损伤越大，结果显示与Control对照组相比，DMM造模后PBS注射组评分升高了4倍左右；与PBS注射组相比，WT-ASCs注射组评分显著降低，OB-ASCs注射组则没有显著变化；与WT-ASCs注射组相比，OB-ASCs注射组评分显著下降(图2C)，以上结果说明关节腔注射WT-ASCs有效缓解OA小鼠软骨损伤，疗效优于OB-ASCs。
研究表明骨关节炎小鼠模型常伴有疼痛，表现为步态异常及痛阈的下降，因此我们想要比较WT-ASCs及OB-ASCs对骨关节炎小鼠疼痛的治疗作用。我们对小鼠右侧膝关节进行DMM造模，术后4周关节腔注射5×105WT-ASCs及5×105OB-ASCs，术后8周将老鼠放置在相对安静的黑暗环境下，对小鼠进行Catwalk步态实验，收集数据进行分析比较。结果显示与对照组相比，PBS注射组小鼠右后肢和左后肢的步态参数比值站立相(Stance Phase)、爪印面积(Print Area)、脚爪悬空速度(Swing Speed)、支撑时相比(Duty Cycle)均显著下降，表明DMM手术造模引发小鼠步态异常；与PBS注射组相比，WT-ASCs注射组步态参数比值Stance Phase、Print Area、Swing Speed、Duty Cycle显著增加，且Print Area及DutyCycle接近对照组的100％，OB-ASCs注射组步态参数比值Stance Phase，Swing Speed没有差异，但Print Area及Duty Cycle显著增加；与WT-ASCs注射组相比，OB-ASCs注射组步态参数比值Stance Phase，Swing Speed，Duty Cycle显著下降(图2D)，结果表明关节腔注射WT-ASCs与OB-ASCs可以改善小鼠的步态异常，但WT-ASCs疗效优于OB-ASCs。同时用冯弗雷细丝测量小鼠痛阈，与对照组相比，PBS注射组机械性刺激缩足阈值显著降低，表明DMM手术造模引发小鼠疼痛敏感度增加；与PBS注射组相比，WT-ASCs注射组和OB-ASCs注射组机械性刺激缩足阈值显著升高；与WT-ASCs注射组相比，OB-ASCs注射组机械性刺激缩足阈值显著降低(图2E)。综上，关节腔注射WT-ASCs及OB-ASCs可以减轻OA小鼠的疼痛，WT-ASCs疗效优于OB-ASCs。
4.2 WT-ASCs与OB-ASCs体外细胞功能差异比较
前文结果表明WT-ASCs缓解小鼠骨关节炎软骨损伤及疼痛疗效优于OB-ASCs，本发明进一步探索产生此差异的机制。脂肪干细胞促进组织修复主要通过在受损部位的存活、再生潜能、抗炎能力从而发挥作用，因此本发明从脂肪干细胞的增殖、软骨分化潜能、抗炎三个方面进行研究。
首先取出WT和OB小鼠皮下脂肪组织，用Ⅷ型胶原酶分离提取皮下脂肪干细胞，贴壁培养至P2代，镜下观察发现WT-ASCs及OB-ASCs于培养瓶底部贴壁生长，呈长梭形，细胞形态没有显著差异(图3A)。体外培养至P2代，通过胰酶消化成单细胞悬液，铺到96孔板，每孔3000个细胞，静置6h，待完全贴壁后记为0h，使用CCK8方法检测脂肪干细胞的增殖能力，分别检测0h，24h，48h，72h，96h的数据(图3B)。结果表明WT-ASCs增殖能力高于OB-ASCs。
脂肪干细胞能够促进骨关节炎软骨修复，与其软骨分化潜能密切相关。为了进一步研究WT-ASCs及OB-ASCs疗效差异是否与脂肪干细胞成软骨潜能相关，本发明体外诱导WT-ASCs及OB-ASCs成软骨分化。首先取诱导0天、7天、14天及21天的细胞进行阿利新蓝染色，观察软骨细胞基质硫酸化蛋白聚糖的形成，结果表明随着诱导时间的延长，细胞团直径逐渐增加，染色呈深蓝色，提示成功诱导成软骨细胞(图3C)。对WT-ASCs及OB-ASCs体外成软骨诱导21天，Western Blot检测软骨标记物Sox9的表达，结果显示WT-ASCs的Sox9蛋白表达水平显著高于OB-ASCs(图3D)。实时定量PCR检测软骨合成相关基因Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan的表达，结果表明WT-ASCs软骨合成相关基因的表达高于OB-ASCs(图3E)。综上，WT-ASCs体外成软骨潜能高于OB-ASCs。
关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质组成，细胞外基质主要成分是胶原蛋白、蛋白多糖、非胶原蛋白及水。骨关节炎发展过程中，软骨细胞分解和合成代谢失衡，基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase,MMP-13)，解聚蛋白样金属蛋白酶-5(adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS-5)表达增加，降解细胞外基质中Ⅱ型胶原及蛋白聚糖，导致关节软骨损伤。已有研究报道间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以抑制MMP-13及ADAMTS-5表达，促进Ⅱ型胶原CollagenⅡ及蛋白多糖Aggrecan的表达。Sox9是软骨稳态失衡时响应的一种转录因子，能够促进CollagenⅡ、Aggrecan的转录，抑制MMP、ADAMTS的表达，调控细胞外基质稳态。因此本发明进一步探究WT-ASCs及OB-ASCs对体内软骨合成代谢是否具有影响，DMM术后4周，注射5×105WT-ASCs及5×105OB-ASCs，术后8周，我们收集各组小鼠关节软骨组织，检测合成代谢标记Aggrecan、Sox9、CollagenⅡ的蛋白表达。结果显示，与Control对照组相比，OA小鼠PBS注射组Aggrecan、Sox9、CollagenⅡ蛋白表达出现显著下调；与PBS注射组相比，WT-ASCs注射组Aggrecan、Sox9、CollagenⅡ蛋白表达显著增加，OB-ASCs注射组Aggrecan蛋白表达上调，Sox9、CollagenⅡ蛋白表达没有显著变化；与WT-ASCs注射组相比，OB-ASCs注射组Aggrecan、Sox9、CollagenⅡ蛋白表达显著下调(图3F)，结果表明WT-ASCs可以有效促进软骨合成代谢，维持细胞外基质稳态，效果优于OB-ASCs。
脂肪干细胞具有较强的增殖能力及分化潜能，同时还可以分泌多种生物活性分子发挥免疫调节和抗炎作用，从而缓解骨关节炎炎症。白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一种强大的促炎因子，在OA的病理变化中发挥重要作用，其中白细胞介素-1β在短时间内激活MMP基因表达，促进MMP蛋白质的合成，加重骨关节炎的发生。为了进一步研究WT-ASCs及OB-ASCs在骨关节炎疗效的差异是否与脂肪干细胞抗炎能力有关，本发明体外培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7，加入1ug/mL的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激24h诱导炎症模型，使用来自WT-ASCs及OB-ASCs的上清孵育RAW264.7 24h，实时定量PCR检测炎症相关基因IL-1β、IL-6的表达。结果显示LPS刺激后炎症基因IL-1β、IL-6显著上调，炎症模型构建成功；与LPS组相比，WT-ASCs上清处理组IL-1β、IL-6表达显著下降，OB-ASCs上清处理组没有差异；WT-ASCs上清处理组IL-1β、IL-6表达显著低于OB-ASCs上清处理组(图3G-H)，结果表明WT-ASCs抗炎能力优于OB-ASCs。
4.3 WT-ASCs及OB-ASCs特性差异机制
脂肪干细胞是一群异质性细胞，不同亚群细胞特性不同。前文已经证明WT-ASCs增殖能力、软骨分化潜能、抗炎能力优于OB-ASCs，本发明进一步探究两种脂肪干细胞特性差异是否与其异质性相关。
本发明分离WT及OB小鼠皮下脂肪组织的SVF，进行单细胞测序。对测序结果进行聚类分群，根据表面标记不同，将SVF分为八个亚群分别为脂肪干细胞、B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)、髓样细胞(myeloid cell)、内皮细胞(endothelial cells)以及其他不识别细胞(not available，NA)(图4A)。将脂肪干细胞进一步聚类分群，分为0，2，3，11，12亚群，对每个亚群分别进行定量分析，其中相比较3，11，12亚群，0和2亚群在血管基质组分比例较高，并且发现WT小鼠SVF中2亚群比例较高，OB小鼠SVF中0亚群比例较高(图4B-C)。通过UMAP降维可视化单个标记基因的表达水平和分布，结果显示脂肪干细胞标记CD140a、CD140b主要在0、2亚群表达，间充质祖细胞标记DPP4主要在2亚群表达，脂肪前体细胞标记CD142、PPARγ在0、2亚群表达较低，脂肪前体细胞标记ICAM1主要在0亚群表达，成熟脂肪细胞标记aP2主要在0亚群表达(图4D)。
分离WT及OB小鼠皮下脂肪组织SVF，提取RNA检测脂肪干细胞标记CD140a、CD140b，脂肪前体细胞标记ICAM1、CD142、PPARγ，成熟脂肪细胞标记aP2的基因表达水平。结果显示WT及OB小鼠皮下脂肪组织SVF中CD140a，CD140b，ICAM1，aP2基因表达没有差异，但间质祖细胞DPP4，脂肪前体细胞PPARγ，CD142基因在WT小鼠SVF中表达显著高于OB小鼠(图4E)。结合单细胞测序结果PPARγ，CD142表达量较低，DPP4表达量较高，且DPP4主要在脂肪干细胞亚群表达，因此，本发明进一步选择DPP4+细胞亚群进行研究。
4.4 DPP4+细胞有效缓解骨关节炎疼痛
研究报道DPP4+细胞是多潜能的间质祖细胞，可以发育分化成CD142+及ICAM1+脂肪前体细胞，具有较强的增殖能力和多向分化潜能。前期结果证明WT-ASCs具有较强的增殖能力，与DPP4+细胞高增殖能力一致。同时，基于前文证明WT-SVF中间质祖细胞DPP4+细胞亚群及基因表达显著高于OB-SVF/HFD-SVF，基于此，本发明推测DPP4+细胞亚群含量可能是造成健康与肥胖小鼠ASCs疗效差异的原因。为了进一步验证WT-ASCs及OB-ASCs在骨关节炎疗效差异是否是由于DPP4+细胞亚群含量引起的，本发明分离WT小鼠皮下脂肪组织的血管基质组分，通过流式分选DPP4+及DPP4-细胞进行体外培养(图5A)。两种细胞平铺于皿底，呈长梭形，细胞形态没有显著差异(图5B)。体外培养两种细胞亚群至P2代，通过胰酶消化成单细胞悬液，同时对8周龄小鼠进行DMM手术构建骨关节炎模型，术后4周，关节腔内注射PBS，5×105DPP4+细胞，5×105DPP4-细胞，术后8周进行Catwalk步态实验，收集数据进行分析比较(图5C)。结果显示与对照组相比，PBS注射组小鼠右后肢和左后肢的步态参数比值站立相(Stance Phase)、爪印面积(Print Area)、脚爪悬空速度(Swing Speed)、支撑时相比(DutyCycle)均显著下降，表明DMM手术造模引发小鼠步态异常；与PBS注射组相比，DPP4+细胞注射组步态参数比值Stance phase、Print area、Swing speed、Duty Cycle增加，DPP4-细胞注射组步态参数比值没有变化；DPP4+细胞注射组步态参数比值显著高于DPP4-注射组，表明DPP4+细胞亚群可以改善小鼠的步态异常，DPP4-细胞亚群没有此作用(图5D)。术后8周，用冯弗雷细丝测量小鼠痛阈，结果显示与对照组相比，DMM术后PBS注射组机械性刺激缩足阈值显著降低表明DMM手术造模引发小鼠疼痛敏感度增加；与PBS注射组相比，DPP4+细胞注射组机械性刺激缩足阈值升高，DPP4-细胞注射组没有变化；DPP4+细胞注射组机械性刺激缩足阈值高于DPP4-细胞注射组(图5E)。综上，DPP4+细胞有效改善小鼠的步态异常，减轻OA小鼠的疼痛，DPP4-细胞没有此作用。
Claims (10)
1.一种包含治疗有效量的分离的脂肪干细胞和药学上可接受的载体的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗骨关节炎，所述的分离的脂肪干细胞是DPP4阳性脂肪干细胞。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述DPP4阳性脂肪干细胞为CD31-CD45-DPP4+的特异性脂肪干细胞。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述DPP4阳性脂肪干细胞采用流式细胞仪分选技术获得。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述骨关节炎为膝骨关节炎。
5.DPP4阳性脂肪干细胞在制备用于治疗骨关节炎药物中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述DPP4阳性脂肪干细胞为CD31-CD45-DPP4+的特异性脂肪干细胞。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述骨关节炎为膝骨关节炎。
8.一种DPP4阳性脂肪干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将经胶原酶消化获得的脂肪组织血管基质组分，加入红细胞裂解液裂解去除红细胞后离心；
(2)PBS重悬清洗后离心；
(3)加入10％羊血清封闭30min；加入5％羊血清稀释的抗体100μL/只，4℃避光放置40min，其中包含抗体CD31(1:1000)，抗体CD45(1:1000)，抗体DPP4(1:200)；
(4)加入含有2％羊血清的PBS清洗，离心后弃上清；
(5)用含有2％羊血清的PBS重悬细胞，细胞悬液用300目筛网过滤，上流式细胞仪分选后获得DPP4阳性脂肪干细胞。。
9.根据权利要求8所述的分离方法获得的DPP4阳性脂肪干细胞在制备治疗骨关节炎药物的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述骨关节炎为膝骨关节炎。
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| PB01 | Publication | ||
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