CN117899240B - 一种适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型及其构建方法和应用，包括（1）肿瘤活组织样本筛选；（2）数据质量控制；（3）肿瘤活组织的挑选、复苏及传代；（4）NSG小鼠的免疫系统重建；（5）HIS‑PDTX（HLA配型）建模；（6）小鼠模型中树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的引入，获得适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型。该模型构建方法不仅利用人源肿瘤活组织生物样本库提供足量的、符合药物作用机制要求的肿瘤活组织样本；此外，还利用人源肿瘤活组织数据库内的WES、RNA‑Seq数据筛选mRNA肿瘤疫苗的靶点。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型及其构建方法和应用。
背景技术
肿瘤相关抗原（在肿瘤细胞以及正常细胞都存在的一类抗原）以及肿瘤特异性抗原（仅表达于某种肿瘤细胞而不在正常细胞表达的一类抗原）是临床前开发抗肿瘤药物的靶点，如mRNA肿瘤疫苗、过继性免疫疗法、免疫检查点阻断剂、抗体偶联药物等。抗体偶联药物（antibody drug conjugate，ADC）类药物能够靶向并强力抑杀快速增殖的肿瘤细胞，但有时会因稳定性而误伤正常自然增殖的人体细胞（如骨髓细胞、消化道黏膜和毛囊等），有关不良反应常常限制其临床应用。随着免疫学的发展、人类基因组学和对肿瘤发生发展机制研究的不断深入，精准医学和个体化治疗的理念已深入人心并且在临床实践中得以成功验证。在此背景下，mRNA肿瘤疫苗的临床前研发以及筛选有待进一步研究和优化。
mRNA肿瘤疫苗（mRNA tumor vaccine）属于核酸疫苗，是旨在靶向肿瘤抗原。这些抗原通常由肿瘤细胞所表达或为肿瘤细胞所特有，释放后被抗原呈递细胞（antigenpresentation cell，APC如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞），随后T细胞通过识别肿瘤组织的特异性抗原发挥杀伤作用。但是这种肿瘤抗原表达水平较低，无法激活强有力的免疫反应。而mRNA肿瘤疫苗往往是一段编码肿瘤相关抗原或者肿瘤特异性抗原的模板信使RNA（mRNA），以此为基础完成制备并注射进入体内，被抗原呈递细胞吞噬后，依靠细胞的蛋白质合成系统翻译出特异性蛋白，作为“靶标”，诱导机体产生对“靶标”的免疫应答，进而针对性攻击肿瘤细胞。
由于mRNA肿瘤疫苗在选取靶抗原、运输载体等方面各有不同，使其结构上存在多样性和复杂性；mRNA肿瘤疫苗并不简单地等同于抗体药物和ADC类药物，在临床前研发中存在诸多挑战，包括药代动力学（生物分布）的复杂性、肿瘤靶向和疗效的评估等。
所以本技术利用人源肿瘤活组织生物样本库和数据库为抗肿瘤药物临床前试验提供足量的、合适的生物样本来源，通过基于样本库和数据库的小鼠临床试验可提前确认真实世界的临床试验的适应症患者入组方案，并基于肿瘤活组织生物样本库和数据库及多种PDTX技术建立一套适用范围广、客观准确的适用于mRNA肿瘤疫苗的适应症筛选方法，为肿瘤药物临床前试验提供合适的临床试验前研究模型，可极大程度的缩短临床试验的周期、降低总体费用的同时提高临床试验的成功率。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型及其构建方法和应用。该模型构建方法不仅利用人源肿瘤活组织生物样本库提供足量的、符合药物作用机制要求的肿瘤活组织样本；此外，还利用人源肿瘤活组织数据库内的WES、RNA-Seq数据筛选mRNA肿瘤疫苗的靶点。同时分析肿瘤活组织内的免疫微环境，降低肿瘤免疫微环境带来的药效影响；更针对mRNA肿瘤疫苗作用机制建立具有人源化免疫系统的PDTX动物模型；并且通过引入与动物模型内免疫细胞相同来源的树突状细胞来避免MHC限制性的发生，以此在反应mRNA肿瘤疫苗在动物体内真实的疗效。还能通过脐带血与肿瘤活组织的HLA配型，延长mRNA肿瘤疫苗动物实验的窗口期；最终，该模型通过重建人源化免疫系统以及补充树突状细胞满足mRNA肿瘤疫苗的发挥作用的免疫环境。
技术方案：一种适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型的构建方法，步骤为：（1）肿瘤活组织样本筛选：选择通过PDTX技术进行传代后可稳定扩增的活组织并保存在气相液氮存储罐中；（2）数据质量控制：记录PDTX建模获得的接种有肿瘤活组织的免疫缺陷型小鼠模型体内肿瘤组织体积变化及小鼠的体重变化，保留体重减轻不超过20%和肿瘤生长体积不超过2000mm3的小鼠数据；（3）肿瘤活组织的挑选、复苏及传代：在肿瘤活组织生物样本库中选取目标肿瘤活组织进行复苏，记录接种有目标肿瘤活组织的NSG小鼠模型内肿瘤组织体积变化及小鼠的体重变化，当肿瘤体积达到100mm3时，即表示肿瘤组织复苏成功；（4）NSG小鼠的免疫系统重建：获取具有与肿瘤活组织HLA分型相匹配的脐带血，将获取的脐带血用磷酸盐缓冲液按照1:3的体积比稀释脐带血，使用微珠试剂盒分离纯化得到CD34+HSCs细胞；使用三周龄的NSG小鼠，用功率为100cGy/min的X射线照射3周龄NSG小鼠全身2.4min进行清髓，随后通过尾静脉注射5×105 cells/mL的CD34+ HSC细胞液，然后在尾静脉注射后的第4周开始每隔两周对NSG小鼠进行免疫学指标检测，当NSG小鼠血液中的hCD45+ 大于或等于25％，得到重建免疫系统的NSG小鼠模型；（5）HIS-PDTX（HLA配型）建模：记录接种有复苏成功的肿瘤组织的重建免疫系统的NSG小鼠模型内肿瘤组织体积变化及小鼠的体重变化，当肿瘤体积达到100mm3时，即表示HIS-PDTX（HLA配型）建模成功；（6）小鼠模型中树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的引入：在体外的情况下，通过以下3种方式中的任一种获取DCs：1、通过磁珠在脐带血中分选DCs细胞；2、从脐带血中分选出单核细胞进而在IL-4和GM-CSF的刺激下分化为DCs；3、从脐带血中分选出CD34+造血前体干细胞进而在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、Flt3 ligand的刺激下分化为DCs；随后将成熟的DCs通过尾静脉注射至HIS-PDTX（HLA配型）的动物模型体内，获得适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型。
上述构建方法获得的适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型。
上述模型在mRNA肿瘤疫苗筛选中的应用。
上述筛选的方法包括药效评估，模式为DASCTM，设定入组的药物方案数量、癌种数量、同癌种活组织数量，计算所有试验组所需的PDTX模型数量N，计算公式如下：
N=D×C×T×M+A×C×T×M+S×C×T×M
根据试验入组癌种数量、同癌种活组织数量，计算所有空白组所需的PDTX模型数量X，计算公式如下：
X=C×T×M
根据试验入组癌种数量、同癌种活组织数量，计算所需肿瘤活组织生物样本库中的肿瘤活组织数量Y，计算公式如下：
Y=C×T
根据试验入组所涉及的mRNA肿瘤疫苗的数量、免疫检查点抗体数量，计算PDTX动物模型给药的方案数量S，计算公式如下：
S=D×A
上述D：mRNA肿瘤疫苗的药物方案数量，D为整数，D≥1；A：抗体种类，A为整数，A≥0；S：联合治疗方案的数量=mRNA肿瘤疫苗的药物方案数量+免疫检查点抑制剂的数量，S为整数，S≥1；C：癌种数量，C为整数，C≥1；T：同癌种活组织数量，T为整数，T≥1；M：每份活组织建模数量，M为整数，M≥3；每份活组织对应一个具有独立表型信息的个体；所以，药效评估体系所需的PDTX模型数量为N+X，其中每个空白组和药物试验组的模型数量为T×M。
上述筛选的方法包括药效评估，方式采用自体比较TGI：在试验组到达预期给药周期时，记录试验组小鼠模型的终点时间肿瘤体积与对应个体的起始时间体积进行差异性比较，计算自身的肿瘤生长抑制率（Tumor Growth Inhibition， TGI）；
自身TGI计算公式如下：
TGI1(%) = (V0 - Vt) / V0 ×100%
V0：每只小鼠起始给药时测量所得肿瘤体积（单位：mm3），Vt：每只小鼠在时刻t时测量时的肿瘤体积（单位：mm3）；
根据实体瘤疗效评价标准评价每只小鼠肿瘤药效结果mPD、mPR、mSD、mCR；当TGI＞95%时，判断为mCR；当95%≥TGI＞30%时，判断为mPR；当30%≥TGI＞-20%时，判断为mSD；当TGI≤-20%时，判断为mPD。
上述方式为试验组与空白组的组间比较TGI：在试验组到达预期给药周期时，记录试验组小鼠模型的终点时间肿瘤体积与空白组小鼠模型的终点时间肿瘤体积进行差异性比较，计算组间的肿瘤生长抑制率（Tumor Growth Inhibition， TGI）；
如果空白组与试验组的记录时间周期相同，组间TGI计算公式如下：
TGI2 (%) = (1 - RTVT / RTVC) ×100%
RTVT = (Tt - T0) / T0
RTVC = (Ct - C0) / C0
T0：试验组小鼠起始给药时测量所得肿瘤体积（单位：mm3）；Tt：试验组小鼠在时刻t时测量时的肿瘤体积（单位：mm3）；C0：空白组小鼠起始给药时测量所得肿瘤体积（单位：mm3）；Ct：空白组小鼠在时刻t时测量时的肿瘤体积（单位：mm3）；
如果空白组与试验组的记录时间周期不同，组间TGI计算公式如下：
TGI2 (%) = (1 -RTVT / RTVC) × 100%
RTVT = Tt1 / T0 / t1
RTVC = Ct2 / C0 / t2
t1：实际试验组小鼠记录时间周期（单位：day）；t2：实际空白组小鼠记录时间周期（单位：day）；Tt1：试验组t1时刻肿瘤体积（单位：mm3）；Ct2：空白组t2时刻肿瘤体积（单位：mm3）；T0：试验组t0时刻肿瘤体积（单位：mm3）；C0：空白组t0时刻肿瘤体积（单位：mm3）；根据肿瘤药物PDTX药效检测评估标准，当TGI≥60%时，判断为药效阳性；当TGI＜60%时，判断为药效阴性。
有益效果：本发明通过肿瘤活组织生物样本库提供足量的、具有mRNA肿瘤疫苗靶标抗原的肿瘤活组织样本；同时利用人源肿瘤活组织数据库的WES， RNA-Seq数据筛选mRNA肿瘤疫苗设计的靶点。进而实现了通过分析肿瘤活组织内的免疫微环境，降低肿瘤免疫微环境带来的药效影响；更为重要的是针对mRNA肿瘤疫苗作用机制建立具有人源化免疫系统的PDTX动物模型；所构建动物模型内抗原呈递细胞与T细胞表面的TCR的相互识别避免了MHC限制性，更能呈现mRNA肿瘤疫苗的疗效；通过脐带血与肿瘤活组织的HLA配型，延长mRNA肿瘤疫苗动物实验的窗口期；所构建的动物模型通过重建人源化免疫系统以及补充树突状细胞满足mRNA肿瘤疫苗的发挥作用的免疫环境，同时，丰富了树突状细胞的获取渠道，使其能够通过脐带血分离、PBMC诱导、CD34+造血干细胞等多种方式获取。
附图说明
图1为适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的动物模型构建技术路线图；
图2为分析药物疗效分组实验流程图；
图3为实验动物疗效判定依据图；
图4为药效结果判定图；
图5为HIS-PDTX（HLA配型）动物模型的体重变化图；
图6为HIS-PDXT（HLA配型）动物模型hCD45+细胞与CD45+细胞内hCD3+、hCD19+细胞含量图；
图7为HIS-PDTX（HLA配型）动物模型的生存曲线图；
图8为PBMC动物模型体重变化图；
图9为PBMC动物模模型体内hCD45+细胞与CD45+细胞内hCD3+含量图；
图10为PBMC动物模模型生存曲线；
图11为His-PDTX(HLA配型)与PBMC-PDTX动物模型肿瘤生长图；
图12为通过HIS-PDTX（HLA配型）mRNA肿瘤疫苗筛选药效图；
图13为通过HIS-PDTX（HLA配型）探究mRNA肿瘤疫苗与免疫检查点抑制剂联合药效试验。
具体实施方式
下面通过实例对本发明进行具体描述，实施例给出详细的实施方式和具体的操作步骤，只用于对本发明的进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1：在评估HIS-PDTX（HLA配型）动物模型时，我们主要从三个方面进行了考量：小鼠的生存状态与时间、体内免疫细胞的种类，以及肿瘤的生长状态。
生存状态与时间、免疫系统重建（图2）：其中一组小鼠接受了hCD34+造血干细胞的注射，以重建其体内的免疫系统。这些小鼠在六个月的观察期内显示出体重增加的趋势，并且只有一只小鼠死亡（总数为12只）（图5、图7）。这表明hCD34+造血干细胞注射能有效稳定生命体征，并提供较长的给药周期。相比之下，另一组接受了外周血单核细胞（PBMC）注射的小鼠显示出持续下降的体重趋势（图8）。在注射后的第一周，小鼠开始死亡，一个月内仅有一只存活（总数为14只）（图10）。此外，hCD34+造血干细胞注射的小鼠体内存在T细胞和B细胞（图6），而PBMC注射的小鼠体内仅存在T细胞（图9），表明前者在免疫系统重建方面更为有效。
肿瘤生长的状态：在对同种肿瘤活组织移植的实验中，两组小鼠在相同条件下接受了观察。给予标准饲料和水后，记录了它们的肿瘤体积生长情况。第三十一天时，接受HIS-PDTX（HLA配型）的小鼠模型肿瘤体积为558.7±76.24mm³。与此相反，接受PBMC-PDTX的小鼠模型中近半数在第13天死亡，只有一只存活至第24天，其肿瘤体积仅为353.7mm³，远小于HIS-PDTX组（图11）。这些结果表明，与PBMC注射相比，hCD34+造血干细胞注射的小鼠模型具有更好的生存质量，生命周期长，且给药周期更长。
实施例2：本实施例为两种mRNA肿瘤疫苗：A和B（具有相同载体传递系统和不同的肿瘤抗原mRNA序列）为研究对象，目标癌种为胃癌；目的是为了通过PDTX临床试验对比分析mRNA肿瘤疫苗A和mRNA肿瘤疫苗B针对胃癌个体的治疗效果，根据图2、图3和图4中所示的方法路线，初步筛选针对胃癌的药敏反应更优的mRNA肿瘤疫苗。
依据癌种类型在肿瘤活组织生物样本库中选取1份胃癌肿瘤活组织建立模型进行活组织复苏，选择的DASCTM模式具体为：D=2、A=0、S=2、C=1、T=1、M=3；药效评估试验设计所需的肿瘤活组织数量为1，复苏完成后利用肿瘤活组织建立PDTX模型数量为18；复苏建立完成的PDTX模型分配至试验组和空白组，试验组和空白组模型开始给药并同时记录所有模型动物的体重、肿瘤体积，计算并汇总试验组模型的药效检测数据指标，包括TGI1和TGI2。
具体实施步骤如下所述：
1、根据mRNA肿瘤疫苗所编码的肿瘤细胞相关抗原或特异性抗原的种类从生物样本库内筛选合适的人源肿瘤活组织样本。同时需要注意的是，人源肿瘤活组织内存在免疫微环境，有可能会影响后续mRNA肿瘤疫苗药效的评判。因此我们根据测序结果对样本库内肿瘤组织内的免疫细胞进行定性以及定量。随后根据mRNA肿瘤发挥作用的机制挑选低内源性T淋巴细胞的肿瘤组织。
2、人源肿瘤活组织样本具有不同的HLA分型，通过测序结果确定肿瘤组织样本的HLA分型。随后申请可以与人源肿瘤活组织配型的脐带血。通过CD34+磁珠分选并富集CD34+造血干细胞浓度达到5×105 cells/mL。
3、取3 weeks以内的NSG小鼠（100cGy/min×2.4 min，X射线照射，清髓），于清髓后的4~24h内通过小鼠尾静脉向小鼠体内注射5×105 cells/mL的CD34+HSC。
4、在补充CD34+HSC后第四周开始通过流式细胞仪对NSG小鼠外周血内的免疫细胞进行检测。时间间隔为两个周。当NSG小鼠外周血内的hCD45+≥25%时，判定NSG小鼠人源化免疫模型构建成功。同时也通过hCD19+，hCD3+分析动物模型外周血内的B淋巴细胞和T淋巴细胞的数量。
5、值得注意的是，通过此种方法构建的小鼠模型体内存在mRNA肿瘤疫苗所编码的抗原蛋白呈递的场所—淋巴结，以及T淋巴细胞发育的场所—胸腺（未完全发育）。这为后续的实验提供了mRNA肿瘤疫苗发挥作用机制上的保障。
6、在构建NSG小鼠人源化免疫模型的同时，对挑选的人源肿瘤活组织进行复苏。将传至P5代且生长速度稳定的肿瘤组织样本接种至NSG小鼠人源化免疫模型的皮下或者原位。
7、在NSG小鼠人源化免疫系统动物模型移植人源肿瘤组织后，每周两次记录肿瘤组织的体积，在肿瘤组织体积达到80mm3时，随机建立了具有人源化免疫系统以及人源肿瘤组织的动物模型。
8、在肿瘤体积达到90~100mm时，开始对mRNA肿瘤疫苗的药效进行评价。根据mRNA肿瘤疫苗的作用机制，动物模型体内需含有DCs，但是目前所存在的能满足mRNA肿瘤疫苗发挥作用的动物模型往往存在严重的GvHD反应以及DCs数量不够，因而严重影响mRNA肿瘤疫苗的药效的发挥以及药效的评价。因此在本发明中通过体外补充与hCD34+造血干细胞同源的DCs以满足mRNA肿瘤疫苗发挥作用的免疫环境。同时避免了上述的问题。值得注意的是，DCs在动物模型体内往往只能存在10~14天，因此要根据mRNA肿瘤疫苗发挥作用的方式或联合给药的方式，按时按量补充DCs。
9、本发明中可以通过三种途径获取与hCD34+造血干细胞同源的DCs。首先是直接从脐带血中分离树突状细胞，并将分离出的树突状细胞存储起来以备用或者补充到动物模型的体内。二是从脐带血中分离单核细胞，并将单核细胞通过粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子和白介素-4刺激下诱导分化为树突状细胞。三是将造血干细胞通过多种生长分化因子刺激下诱导分化为树突状细胞。
10、在向NSG小鼠动物模型补充DCs的同时，将mRNA肿瘤疫苗通过肌肉内、皮下或者静脉内注射的方法进入动物模型的体内（根据mRNA提供者的要求而定），并发挥作用。若有联合给药组则应当在mRNA肿瘤疫苗注射前完成免疫检查点抑制剂的给药。
11、在给药之后记录肿瘤体积和小鼠体重的变化，当给药周期结束之后（动物模型死亡、动物模型体重下降20%以及肿瘤体积＞2000mm3时将该动物模型终止试验）进行TGI的计算，并评判药效结果。
在药效对比分析系统中输入的数据和分析结果如下：
1. 试验组自体肿瘤变化（TGI1，%）
（1）mRNA肿瘤疫苗A：a. -1134.9；b. -1098.5；c. -1502.9
（2）mRNA肿瘤疫苗B：a.-878.7；b. -807.3；c. -660.0
差异性分析：t0.05 = 2.7760；t0.01 = 4.6040；t0.001 = 8.6100。
结果判断：t = 3.225，p = 0.0321，具有显著性差异，mRNA肿瘤疫苗B的药效优于mRNA肿瘤疫苗A（图12）。
2. 试验组与空白组之间肿瘤体积变化（TGI2，%）
（1）mRNA肿瘤疫苗A：a. 48.67；b. 50.30；c. 32.03
（2）mRNA肿瘤疫苗B：a. 60.37；b. 63.47；c. 70.13
差异性分析：t0.05 = 2.7760；t0.01 = 4.6040；t0.001 = 8.6100。
结果判断：t = 3.225，p = 0.0321，具有显著性差异，mRNA肿瘤疫苗B的药效优于mRNA肿瘤疫苗A（图12）。
3. 综合结果分析
根据药效对比分析系统的结果显示，mRNA肿瘤疫苗B针对胃癌的各项药效指标均显著优于mRNA肿瘤疫苗A的药效，则药效排序结果为：mRNA肿瘤疫苗B组＞mRNA肿瘤疫苗A组。根据排序结果得出mRNA肿瘤疫苗B针对胃癌个体效果更优。
实施例3：本实施例为1种mRNA肿瘤疫苗为研究对象，目标癌种为肝癌；目的是为了通过PDTX对比分析mRNA肿瘤疫苗和免疫检查点抑制剂联合使用针对肝癌个体的治疗效果，初步评定mRNA肿瘤疫苗与免疫检查点抑制剂联合使用的疗效（图3、图4）。
具体实施步骤如前所述。
在药效对比分析系统中输入的数据和分析结果如下：
1. 试验组自体肿瘤变化（TGI1，%）
（1）免疫检查点抑制剂: a. -1398.09；b. -1556.67；c. -1288.16
（2）mRNA肿瘤疫苗：a.-1558.9；b. -1604.9；c. -1724.07
（3）mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂：a.-749.0；b. -725.18；c. -774.30
差异性分析：t0.05 = 2.7760；t0.01 = 4.6040；t0.001 = 8.6100。
结果判断：
免疫检查点抑制剂组与mRNA肿瘤疫苗组相比：t = 2.333，p = 0.0800，无显著性差异。
免疫检查点抑制剂组与mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂组相比：t = 8.392，p =0.0011，有显著性差异。
mRNA肿瘤疫苗组与mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂组相比：t = 17.18，p <0.0001，有显著性差异。
综合评判mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂的药效优于mRNA肿瘤疫苗组、免疫检查抑制剂组（图13）。
2. 试验组与空白组之间肿瘤体积变化（TGI2，%）
（1）免疫检查点抑制剂a. 34.71；b. 27.31；c. 39.85
（2）mRNA肿瘤疫苗：a.27.20；b. 25.06；c. 19.49
（3）mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂：a.65.02；b. 66.13；c. 68.84
差异性分析：t0.05 = 2.7760；t0.01 = 4.6040；t0.001 = 8.6100。
免疫检查点抑制剂组与mRNA肿瘤疫苗组相比：t = 2.333，p = 0.0800，无显著性差异。
免疫检查点抑制剂组与mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂组相比：t = 8.392，p =0.0011，有显著性差异。
mRNA肿瘤疫苗组与mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂组相比：t = 17.18，p <0.0001，有显著性差异。
综合评判mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂的药效优于mRNA肿瘤疫苗组、免疫检查抑制剂组（图13）。
3. 综合结果分析
根据药效对比分析系统的结果显示，mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂组针对肝癌的各项药效指标均显著优于mRNA肿瘤疫苗组、免疫检查点抑制剂组的药效，则药效排序结果为：mRNA肿瘤疫苗&免疫检查点抑制剂组＞mRNA肿瘤疫苗组=免疫检查点抑制剂组的药效。根据排序结果得出mRNA肿瘤疫苗B针对胃癌个体效果更优。
Claims (4)
1.一种适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型的构建方法，其特征在于，步骤为：（1）肿瘤活组织样本筛选：选择通过PDTX技术进行传代后可稳定扩增的活组织并保存在气相液氮存储罐中；（2）数据质量控制：记录PDTX建模获得的接种有肿瘤活组织的免疫缺陷型小鼠模型体内肿瘤组织体积变化及小鼠的体重变化，保留体重减轻不超过20%和肿瘤生长体积不超过2000mm3的小鼠数据；（3）肿瘤活组织的挑选、复苏及传代：在肿瘤活组织生物样本库中选取目标肿瘤活组织进行复苏，记录接种有目标肿瘤活组织的NSG小鼠模型内肿瘤组织体积变化及小鼠的体重变化，当肿瘤体积达到100mm3时，即表示肿瘤组织复苏成功；（4）NSG小鼠的免疫系统重建：获取具有与肿瘤活组织HLA分型相匹配的脐带血，将获取的脐带血用磷酸盐缓冲液按照1:3的体积比稀释脐带血，使用微珠试剂盒分离纯化得到CD34+HSCs细胞；使用三周龄的NSG小鼠，用功率为100cGy/min的X射线照射3周龄NSG小鼠全身2.4min进行清髓，随后通过尾静脉注射5×105 cells/mL的CD34+ HSC细胞液，然后在尾静脉注射后的第4周开始每隔两周对NSG小鼠进行免疫学指标检测，当NSG小鼠血液中的hCD45+ 大于或等于25％，得到重建免疫系统的NSG小鼠模型；（5）HIS-PDTX建模：记录接种有复苏成功的肿瘤组织的重建免疫系统的NSG小鼠模型内肿瘤组织体积变化及小鼠的体重变化，当肿瘤体积达到100mm3时，即表示HIS-PDTX建模成功；（6）小鼠模型中树突状细胞DCs的引入：在体外的情况下，通过以下3种方式中的任一种获取DCs：1、通过磁珠在脐带血中分选DCs细胞；2、从脐带血中分选出单核细胞进而在IL-4和GM-CSF的刺激下分化为DCs；3、从脐带血中分选出CD34+造血前体干细胞进而在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、Flt3 ligand的刺激下分化为DCs；随后将成熟的DCs通过尾静脉注射至HIS-PDTX的动物模型体内，获得适用于mRNA肿瘤疫苗筛选的肿瘤移植模型。
2. 权利要求1所述构建方法获得的肿瘤移植模型在mRNA肿瘤疫苗筛选中的应用，其特征在于，所述筛选的方法包括药效评估，模式为DASCTM，设定入组的药物方案数量、癌种数量、同癌种活组织数量，计算所有试验组所需的PDTX模型数量N，计算公式如下：
N=D×C×T×M+A×C×T×M+S×C×T×M
根据试验入组癌种数量、同癌种活组织数量，计算所有空白组所需的PDTX模型数量X，计算公式如下：
X=C×T×M
根据试验入组癌种数量、同癌种活组织数量，计算所需肿瘤活组织生物样本库中的肿瘤活组织数量Y，计算公式如下：
Y=C×T
根据试验入组所涉及的mRNA肿瘤疫苗的数量、免疫检查点抗体数量，计算PDTX动物模型给药的方案数量S，计算公式如下：
S=D×A
上述D：mRNA肿瘤疫苗的药物方案数量，D为整数，D≥1；A：抗体种类，A为整数，A≥0；S：联合治疗方案的数量=mRNA肿瘤疫苗的药物方案数量+免疫检查点抑制剂的数量，S为整数，S≥1；C：癌种数量，C为整数，C≥1；T：同癌种活组织数量，T为整数，T≥1；M：每份活组织建模数量，M为整数，M≥3；每份活组织对应一个具有独立表型信息的个体；所以，药效评估体系所需的PDTX模型数量为N+X，其中每个空白组和药物试验组的模型数量为T×M。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述筛选的方法包括药效评估，方式采用自体比较TGI：在试验组到达预期给药周期时，记录试验组小鼠模型的终点时间肿瘤体积与对应个体的起始时间体积进行差异性比较，计算自身的肿瘤生长抑制率TGI；
自身TGI计算公式如下：
TGI1(%) = (V0 - Vt) / V0 ×100%
V0：每只小鼠起始给药时测量所得肿瘤体积mm3，Vt：每只小鼠在时刻t时测量时的肿瘤体积mm3；
根据实体瘤疗效评价标准评价每只小鼠肿瘤药效结果mPD、mPR、mSD、mCR；当TGI＞95%时，判断为mCR；当95%≥TGI＞30%时，判断为mPR；当30%≥TGI＞-20%时，判断为mSD；当TGI≤-20%时，判断为mPD。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述方式为试验组与空白组的组间比较TGI：在试验组到达预期给药周期时，记录试验组小鼠模型的终点时间肿瘤体积与空白组小鼠模型的终点时间肿瘤体积进行差异性比较，计算组间的肿瘤生长抑制率TGI；如果空白组与试验组的记录时间周期相同，组间TGI计算公式如下：
TGI2 (%) = (1 - RTVT / RTVC) ×100%
RTVT = (Tt - T0) / T0
RTVC = (Ct - C0) / C0
T0：试验组小鼠起始给药时测量所得肿瘤体积mm3；Tt：试验组小鼠在时刻t时测量时的肿瘤体积mm3；C0：空白组小鼠起始给药时测量所得肿瘤体积mm3；Ct：空白组小鼠在时刻t时测量时的肿瘤体积mm3；
如果空白组与试验组的记录时间周期不同，组间TGI计算公式如下：
TGI2 (%) = (1 -RTVT / RTVC) × 100%
RTVT = Tt1 / T0 / t1
RTVC = Ct2 / C0 / t2
t1：实际试验组小鼠记录时间周期day；t2：实际空白组小鼠记录时间周期day；Tt1：试验组t1时刻肿瘤体积mm3；Ct2：空白组t2时刻肿瘤体积mm3；T0：试验组t0时刻肿瘤体积mm3；C0：空白组t0时刻肿瘤体积mm3；根据肿瘤药物PDTX药效检测评估标准，当TGI≥60%时，判断为药效阳性；当TGI＜60%时，判断为药效阴性。
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