CN117890495A - 一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法，通过采集需要测定甘薯品种叶片制备成甘薯叶片样品提取物，量取甘薯叶片样品提取物进行气质联用分析，得到原始数据；对原始数据进行数据分析得到甘薯叶片样品代谢物，对甘薯叶片样品代谢物鉴定并注释，得到测定甘薯品种叶片的上调表达代谢产物中邻乙酰丝氨酸的相对表达量，及其下调表达代谢产物中草酸的相对表达量；本发明通过对旱胁迫下甘薯叶片代谢产物相对表达量进行测定，可以快速辅助鉴定甘薯耐旱性，相比现有的方法和技术，该方法效率更高，通量更大。
Description
技术领域
本发明属于植物抗逆鉴定评价技术领域，涉及一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法。
背景技术
干旱是一种反复出现的自然现象，给农业生产造成巨大损失，直接威胁农业的可持续发展。随着全球气候变化加剧，干旱发生的频率和持续的时间在逐年上升，因此造成的危害也在逐渐加重。甘薯作为一种重要的粮食作物，虽然抗旱性相对较好，但为获得优质高产仍需要提高其耐旱性。因此，面对当前农业水紧张，筛选耐旱甘薯种质资源，对于培育具有节水抗旱特性甘薯新品种，研究甘薯耐旱分子机理，提高水分利用效率，促进甘薯产业可持续发展具有重要作用。
为促进甘薯耐旱资源等材料的筛选、鉴定，前人已通过遮雨模拟干旱处理，进行甘薯耐旱性鉴定，并且自甘薯定植后就不再浇水，导致大部分品种形不成有效产量，并且没有对甘薯生育期不同需水时期进行逐级鉴定，容易导致耐旱资源材料的漏选，筛选方法对甘薯生产没有直接指导作用，筛选出的材料不能直接应用于甘薯生产。针对抗旱耐旱鉴定效率的低下极大影响了耐旱甘薯材料的筛选及耐旱新品种选育的进程，本团队先后研发了室内辅助鉴定甘薯耐旱性的方法和一种甘薯田间耐旱鉴定方法两种耐旱鉴定新技术，获国家发明专利授权，这两种技术相互配合，取得了较好的应用效果。但是，随着长时间的应用，发现已研发的技术受限于田间鉴定需要遮雨或者选择降雨量较少的新疆等地进行，并且需要经历1-2个生长周期；室内辅助鉴定尽管不受季节限制，但是需要培养组培苗，需要一定操作技术储备；鉴定效率还需要提高，鉴定的通量还不太大。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法，以干旱胁迫下耐旱品种潮薯1号差异表达代谢产物为标准；所述潮薯1号为现有甘薯品种，通过测定甘薯品种叶片上调表达代谢产物中邻乙酰丝氨酸的相对表达量，及其下调表达代谢产物中草酸的相对表达量，从而判断确定甘薯品种的耐旱性；具体为一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法。
需要说明的是，甘薯品种“潮薯1号”记载于作物品种资源，1987年，第2期，47页，属于现有甘薯品种，容易被公众所获得。
本发明是通过如下技术方案实现的，一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法，通过采集需要测定甘薯品种叶片制备成甘薯叶片提取物，量取甘薯叶片提取物进行气质联用分析，得到原始数据；对原始数据进行数据分析得到甘薯叶片代谢物，对甘薯叶片代谢物鉴定并注释，得到测定甘薯品种叶片的上调表达代谢产物中邻乙酰丝氨酸的相对表达量，及其下调表达代谢产物中草酸的相对表达量；
鉴定甘薯耐旱性判断依据：是以干旱胁迫下耐旱品种潮薯1号差异表达代谢产物为标准；
当干旱胁迫下测定甘薯品种叶片中上调表达代谢产物的邻乙酰丝氨酸相对表达量为潮薯1号十倍及以上，且下调表达代谢产物的草酸相对表达量为潮薯1号十分之一及以下时，则可判定该测定甘薯品种是耐旱品种，反之则该测定甘薯品种是不耐旱品种。
作为本发明所述的一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法的优选方案：所述甘薯叶片样品提取物的制备方法如下：
准确称取80 mg甘薯叶片冻干样，放进2.0 ml离心管，随后加入360μl在4 ℃下预冷的甲醇和使用浓度为0.3 mg/ml的L-2-氯-苯丙氨酸40μl，混合后放入组织研磨仪内，60Hz匀浆2 min，之后超声提取30 min，按序加入200μl的氯仿和400μl的水，再次超声提取30min，在4℃、14000 rpm离心10 min，之后吸取700μl离心后的上清液，装入经过处理的玻璃衍生瓶中，再放入高速离心浓缩仪，转速1400rpm，真空度4000Pa，外接泵1200Pa进行浓缩挥干，浓缩结束后向玻璃衍生瓶中加入浓度为15 mg/ml的甲氧胺盐酸吡啶溶液80μl，进行震荡2 min，接着放入恒温培养箱中，在37℃震荡肟化反应90 min；肟化完成后，再向衍生瓶中分别加入含有1%三甲基氯硅烷的双（三甲基硅基）三氟乙酰胺80μl和正己烷20μl；然后震荡混匀2 min，再放入70℃恒温培养箱中反应60 min，取出处理样品，放置在室温条件下30min，得到甘薯叶片样品提取物，待气质联用分析。
作为本发明所述的一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法的优选方案：所述气质联用分析具体为：量取上述甘薯叶片样品提取物，采用无分流模式，直接注入气质联用系统进行分析，样品首先通过非极性的DB-5MS毛细管柱，完成分离后的小分子化合物进入质谱检测；质谱检测所选用的在载体气体为高纯氦气，气体流速为1.0 ml/min。设定的升温程序为：60-125℃，8℃/min；125-210℃，4℃/min；210-270℃，5 ℃/min；270-305 ℃，10℃/min；305℃维持时间为3 min；保持进样口温度为260℃，同时，EI源温度260℃，电压为-70V；质量扫描范围为m/z＝50-600，延迟5-8 min开始采集，采集速度为30谱/秒，得到原始数据。
作为本发明所述的一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法的优选方案：所述数据分析具体为：原始数据首先需要采用ChromaTOF（v 4.34, LECO, St Joseph, MI）软件进行预处理进行格式转换，导出可用于分析的逗号分隔值格式的三维数据矩阵；
所述三维数据矩阵的主要信息为：样品信息、保留时间-质核比和质谱响应强度；内标用于数据的质量控制，内标峰以及检测到的每一个已知的假阳性峰均从上述数据矩阵中删除，并进行去冗余，峰合并，最后分析样本共计得到195个代谢物；
所述假阳性峰包括噪音、柱流失和衍生物化试剂峰；
然后，利用用峰面积归一化法，对甘薯叶片样品提取物所获质谱峰的响应强度进行归一化，得到新的的数据矩阵；
将完成归一化后的新数据矩阵导入SIMCA-P+14.0分析软件包（Umetrics, Umeå,Sweden），第一步先进行无监督的主成分分析，初步观察各检测样本之间的大概总体分布和整个分析过程的稳定性；第二步，再用有监督的偏最小二乘法分析来进一步区分各测定组间代谢物情况的总体差异，找出不同组间的差异代谢物。偏最小二乘法分析中，变量权重值VIP大于1的变量被认为是差异变量。
作为本发明所述的一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法的优选方案：所述的代谢产物鉴定包括：采用多维分析OPLS-DA和单维分析t检验、差异倍数相结合的办法，在分析结果中，根据VIP＞1，显著性p＜0.05，来筛选组间差异代谢产物；使用HMDB数据库、METLIN数据库、NIST11标准光谱数据库和与Chroma TOF软件链接的Fiehn数据库对代谢物进行注释，得到测定甘薯品种叶片的上调表达代谢产物中邻乙酰丝氨酸的相对表达量，及其下调表达代谢产物中草酸的相对表达量。
使用HMDB数据库（http://www.hmdb.ca/）、METLIN数据库（https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/metlin）、NIST11标准光谱数据库（https://webbook.nist.gov/chemistry/quant-ir/）和与Chroma TOF软件链接的Fiehn数据库对代谢物进行注释，得到测定甘薯品种叶片的上调表达代谢产物中邻乙酰丝氨酸的相对表达量，及其下调表达代谢产物中草酸的相对表达量。
本发明有益效果为：本发明通过对旱胁迫下甘薯叶片代谢产物相对表达量进行测定，可以快速辅助鉴定甘薯耐旱性，相比现有的方法和技术，该方法效率更高，通量更大。
附图说明
图1 对照潮薯1号GC-MS总离子流图；
图2 南紫薯008 GC-MS总离子流图；
图3 质控样本总离子流图；
图4 对照潮薯1号（B1）和南紫薯008（B2）的PCA得分图；
图5 对照潮薯1号（B1）和南紫薯008（B2）的OPLS-DA得分图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点及功效。
验证实验：不同品种耐旱鉴定试验统计
在甘薯薯蔓并长期和收获期，参考“农作物种质资源鉴定技术规程 甘薯 NY/T1320-2007”和《甘薯种质资源描述规范和数据标准》，分别在水区、旱区调查连续10株薯块鲜产，结合国家甘薯品种鉴定试验薯块干物率测定标准，选取薯块大小约在300 g左右，大小相对均匀一致的薯块，切成细丝，每个重复称取100 g，重复3次，在恒温烘箱中80 ℃烘至恒重，称量，三重复取平均值。根据薯块鲜重及干物率，计算干产。根据旱区产量，水区产量，计算抗旱指数（抗旱系数*旱地产量/所有品种旱地平均产量），对照材料为潮薯1号。
以对照潮薯1号和南紫薯008为实例，进行旱胁迫下差异表达代谢产物分析鉴定：
1. 甘薯叶片样品制备；称取潮薯1号和南紫薯008各80 mg叶片冻干样，放进离心管，加入360 μl在4 ℃下预冷的甲醇和使用浓度为0.3 mg/ml L-2-氯-苯丙氨酸40 μl，后用放入组织研磨仪，60 Hz匀浆2 min；之后超声提取30 min，按序加入200 μl的氯仿和400μl的水，再次超声提取30 min，4 ℃、14000 rpm离心10 min，之后吸取700 μl离心后的上清液，装入经过处理的玻璃衍生瓶中，再放入高速离心浓缩仪，进行浓缩挥干，而后向衍生瓶中加入浓度为15 mg/ml的甲氧胺盐酸吡啶溶液80 μl，进行震荡2 min，接着放入恒温培养箱中，在37°C震荡肟化反应90 min；肟化完成后，再向衍生瓶中分别加入BSTFA（含有1%TMCS）80 μl和正己烷20 μl；然后震荡混匀2 min，再放入70 ℃恒温培养箱中反应60 min；取出处理样品，放置在室温条件下30 min，样品制备完毕，可用于气质联用分析。
2. 气质联用分析，取上述经过衍生的提取物，采用无分流模式，直接注入GC-MS系统进行分析，样品首先通过非极性的DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm I.D., J&WScientific, Folsom, CA，USA），完成分离后的小分子化合物进入质谱检测。所选用的在载体气体为高纯氦气，气体流速为1.0 ml/min。设定的升温程序为：60-125 ℃，8 ℃/min；125-210 ℃，4 ℃/min；210-270 ℃，5 ℃/min；270-305 ℃，10 ℃/min；305 ℃维持时间为3 min；保持进样口温度为260 ℃，同时，EI源温度260 ℃，电压为-70 V。质量扫描范围为m/z＝50-600，延迟5-8 min开始采集，采集速度为30谱/秒。如图1 对照潮薯1号GC-MS总离子流图
，图2 南紫薯008 GC-MS总离子流图，和图3 质控样本总离子流图。
如图3，由对照和旱胁迫处理甘薯叶片提取物混合制备而成，样本质谱峰的保留时间和相应强度重现性都很好，说明整个分析方法（包括前处理方法和仪器分析系统）是稳定可靠的。
3. 数据分析，原始数据首先需要采用ChromaTOF（v 4.34, LECO, St Joseph,MI）软件进行预处理进行格式转换，导出可用于分析的CSV格式的三维数据矩阵。内标峰以及检测到的每一个已知的假阳性峰均从上述数据矩阵中删除，并进行去冗余，峰合并，最后分析样本共计得到195个代谢物。然后，利用用峰面积归一化法，对检测样本所获质谱峰的响应强度进行归一化，得到新的的数据矩阵（见表1），消除质谱数据中的仪器响应漂移，样品含量差异和分析操作的影响。将完成归一化后的新数据矩阵导入SIMCA-P+14.0分析软件包(Umetrics, Umeå, Sweden)，第一步先进行无监督的主成分分析(PCA)，初步观察各检测样本之间的大概总体分布和整个分析过程的稳定性，如图4对照潮薯1号（B1）和南紫薯008（B2）的PCA得分图，表明样品分布均匀，分析结果稳定性好；第二步，再用有监督的偏最小二乘法分析(OPLS-DA)来进一步区分各测定组间代谢物情况的总体差异，找出不同组间的差异代谢物。OPLS-DA分析中，变量权重值(VIP)大于1的变量被认为是差异变量，如图5对照潮薯1号（B1）和南紫薯008（B2）的OPLS-DA得分图。
表1 检测样品质谱峰归一化矩阵（部分）
4. 代谢产物鉴定，采用多维分析OPLS-DA和单维分析（t检验）、差异倍数相结合的办法，来筛选组间差异代谢物(VIP>2，p<0.01，Fold change>2) (LC-MS)，(VIP>1, p<0.05)(GC-MS)。使用HMDB数据库(http://www.hmdb.ca/)、METLIN数据库(https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/metlin)、NIST11标准光谱数据库(https://webbook.nist.gov/chemistry/quant-ir/)和与Chroma TOF软件链接的Fiehn数据库对代谢物进行注释。如表2为部分注释的差异代谢产物。
表2 潮薯1号和南紫薯008的差异代谢产物（部分）
按照上述测定分析方法，以潮薯1号为对照，测定不同品种邻乙酰丝氨酸和草酸两种代谢产物在不同甘薯品种中的相对表达量检测结果如下表。
评估甘薯耐旱性与邻乙酰丝氨酸和草酸两种代谢产物相对表达量的相关性。
利用DPS15.1统计分析软件将这10种甘薯耐旱性与甘薯叶片邻乙酰丝氨酸和草酸两种代谢产物相对表达量进行聚类分析、相关性分析。结果显示，甘薯耐旱性与邻乙酰丝氨酸相对含量呈正相关，而与草酸相对含量正好相反，相关系数分别为0.8345和-0.7896.此外，通过聚类分析，我们也可以发现耐旱品种和不耐旱品种存在明显聚类。以干旱胁迫下耐旱品种潮薯1号差异表达代谢产物为标准，当干旱胁迫下待测定甘薯品种叶片的上调表达代谢产物（邻乙酰丝氨酸）相对表达量为潮薯1号十倍及以上时，且下调表达代谢产物（草酸）相对表达量为潮薯1号十分之一甚至更少时，则可判定该品种是耐旱品种，反之则是不耐旱品种。由以上数据可知，甘薯品种南紫薯008、徐紫薯8号、广紫薯8号、桂紫薯1号、浙紫薯3号为耐旱品种，徐紫薯3号、宁紫薯4号、烟紫薯3号、济薯18、印尼紫薯为不耐旱品种。
以上所述仅为解释本发明的较佳实例，凡在相同发明之下所做的有关发明的任何修饰或变更，皆应包括在本发明意图保护保护范畴。
Claims (5)
1.一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法，其特征在于：通过采集需要测定甘薯品种叶片制备成甘薯叶片样品提取物，量取甘薯叶片样品提取物进行气质联用分析，得到原始数据；对原始数据进行数据分析得到甘薯叶片样品代谢物，对甘薯叶片样品代谢物鉴定并注释，得到测定甘薯品种叶片的上调表达代谢产物中邻乙酰丝氨酸的相对表达量，及其下调表达代谢产物中草酸的相对表达量；
鉴定甘薯耐旱性判断依据：是以干旱胁迫下耐旱品种潮薯1号差异表达代谢产物为标准；
当干旱胁迫下测定甘薯品种叶片中上调表达代谢产物的邻乙酰丝氨酸相对表达量为潮薯1号十倍及以上，且下调表达代谢产物的草酸相对表达量为潮薯1号十分之一及以下时，则可判定该测定甘薯品种是耐旱品种，反之则该测定甘薯品种是不耐旱品种。
2.根据权利要求1所述的一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法，其特征在于：所述甘薯叶片样品提取物的制备方法如下：
准确称取80 mg甘薯叶片冻干样，放进2.0 ml离心管，随后加入360μl在4 ℃下预冷的甲醇和使用浓度为0.3 mg/ml的L-2-氯-苯丙氨酸40μl，混合后放入组织研磨仪内，60 Hz匀浆2 min，之后超声提取30 min，按序加入200μl的氯仿和400μl的水，再次超声提取30 min，在4℃、14000 rpm离心10 min，之后吸取700μl离心后的上清液，装入经过处理的玻璃衍生瓶中，再放入高速离心浓缩仪，转速1400rpm，真空度4000Pa，外接泵1200Pa进行浓缩挥干，浓缩结束后向玻璃衍生瓶中加入浓度为15 mg/ml的甲氧胺盐酸吡啶溶液80μl，进行震荡2min，接着放入恒温培养箱中，在37℃震荡肟化反应90 min；肟化完成后，再向衍生瓶中分别加入含有1%三甲基氯硅烷的双（三甲基硅基）三氟乙酰胺80μl和正己烷20μl；然后震荡混匀2 min，再放入70℃恒温培养箱中反应60 min，取出处理样品，放置在室温条件下30 min，得到甘薯叶片样品提取物，待气质联用分析。
3.根据权利要求1所述的一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法，其特征在于：所述气质联用分析具体为：量取上述甘薯叶片样品提取物，采用无分流模式，直接注入气质联用系统进行分析，样品首先通过非极性的DB-5MS毛细管柱，完成分离后的小分子化合物进入质谱检测；质谱检测所选用的在载体气体为高纯氦气，气体流速为1.0 ml/min。设定的升温程序为：60-125℃，8℃/min；125-210℃，4℃/min；210-270℃，5℃/min；270-305℃，10℃/min；305℃维持时间为3 min；保持进样口温度为260℃，同时，EI源温度260℃，电压为-70V；质量扫描范围为m/z＝50-600，延迟5-8 min开始采集，采集速度为30谱/秒，得到原始数据。
4.根据权利要求1所述的一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法，其特征在于：所述数据分析具体为：原始数据首先需要采用ChromaTOF软件进行预处理进行格式转换，导出可用于分析的逗号分隔值格式的三维数据矩阵；
然后，利用用峰面积归一化法，对甘薯叶片样品提取物所获质谱峰的响应强度进行归一化，得到新的的数据矩阵；
将完成归一化后的新数据矩阵导入SIMCA-P+14.0分析软件包，第一步先进行无监督的主成分分析，初步观察各检测样本之间的大概总体分布和整个分析过程的稳定性；第二步，再用有监督的偏最小二乘法分析来进一步区分各测定组间代谢物情况的总体差异，找出不同组间的差异代谢物；偏最小二乘法分析中，变量权重值VIP大于1的变量被认为是差异变量。
5.根据权利要求1所述的一种利用代谢产物鉴定甘薯耐旱性的方法，其特征在于：所述的代谢产物鉴定包括：采用多维分析OPLS-DA和单维分析t检验、差异倍数相结合的办法，在分析结果中，根据VIP＞1，显著性p＜0.05，来筛选组间差异代谢产物；使用HMDB数据库、METLIN数据库、NIST11标准光谱数据库和与Chroma TOF软件链接的Fiehn数据库对代谢物进行注释，得到测定甘薯品种叶片的上调表达代谢产物中邻乙酰丝氨酸的相对表达量，及其下调表达代谢产物中草酸的相对表达量。
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