CN117887702A - 一种固定化酶及其在葡萄糖酸钠制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化学工程领域，具体涉及一种固定化酶及其在葡萄糖酸钠制备中的应用。本发明提供的固定化酶是以明胶‑壳聚糖微球为载体，将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶共固定，可用于催化葡萄糖氧化制备葡萄糖酸钠的反应。所述固定化酶受产物抑制效应的影响减弱，且酶的稳定性增强、催化效率提高，在最适温度、最适pH值下进行反应，重复反应5次后仍具有较高的酶活，能够缩短反应周期、减少反应成本，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学工程领域，具体涉及一种减弱葡萄糖氧化酶产物抑制的方法及其应用。
背景技术
葡萄糖酸钠又名五羟基己酸钠，是一种水溶性非常好、不溶于大多数有机溶剂的有机酸钠盐。葡萄糖酸钠可被用作食品添加剂、混凝土缓凝剂、水质稳定剂、印染均色剂等，在食品、医药、化工等行业有广泛的应用前景。
葡萄糖酸钠的制备方法包括均相化学氧化法、电解法、催化氧化法、微生物发酵法和双酶催化法，考虑到生产成本、生产效率、环境污染等多重因素，目前主要以为生物发酵法和双酶催化法为主。对于微生物发酵法，一般以黑曲霉为菌株、葡萄糖为原料进行发酵，成本较低，反应条件温和。但存在生产周期长、产品纯度低等问题。
而采用双酶催化法制备葡萄糖酸钠，是向葡萄糖原料中加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下脱氢生成葡萄糖酸内酯和过氧化氢，葡萄糖酸内酯在水中自发水解生成葡萄糖酸，而过氧化氢在过氧化氢酶的作用下被分解，生成氧气。相较于黑曲霉发酵法，双酶催化法的优点是生产周期短、反应体系简单、产品纯度高等。但是，酶法的应用主要受限于酶制剂的成本，此外，反应过程中葡萄糖氧化酶受产物抑制影响严重，导致反应速率下降、反应周期延长，不利于生产。通过定点突变技术能够解决产物抑制的问题，但突变体的筛选、纯化成本较高、周期较长，且可能出现突变株稳定性差、活力低等问题；常规分离技术则难以将产物葡萄糖酸钠从葡萄糖中分离出来。因此，提出一种减弱产物抑制、减少加酶量、缩短反应周期的方法很有必要。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种固定化酶及其在葡萄糖酸钠制备中的应用。本发明采用明胶-壳聚糖固定化载体微球对葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行固定化，用于氧化葡萄糖制备葡萄糖酸钠，能够有效减弱葡萄糖酸钠对葡萄糖氧化酶的产物抑制效应、缩短反应周期。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明一方面提供了一种明胶-壳聚糖固定化载体微球，其制备方法包括如下步骤：
(1)将液体石蜡中与Span-80按100：1的体积比混匀，得石蜡乳液；
(2)在体积比为3％的醋酸溶液中加入明胶和壳聚糖，得明胶-壳聚糖混合溶液，其中明胶和壳聚糖的质量体积比分别为10％-15％和1％-2％；
(3)在50℃、800rpm搅拌条件下，向石蜡乳液中缓慢加入明胶-壳聚糖混合溶液，搅拌10min，形成乳液；
(4)温度降至37℃，以1：50的体积比向乳液中加入体积比为0.5％的戊二醛，持续搅拌交联4-6h；
(5)将温度降至4℃后，经丙酮洗、乙醇洗、水洗、过滤、干燥，制得固定化载体微球。
进一步优化的，所述步骤(2)明胶和壳聚糖的质量体积比分别为10％和2％。
进一步优化的，所述步骤(4)中持续搅拌交联为时间4h。
本发明还提供了所述明胶-壳聚糖固定化载体微球在制备固定化酶中的应用。
本发明还提供了一种固定化酶，通过采用明胶-壳聚糖固定化载体微球对葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行共固定化制得的。
所述固定化酶的制备方法包括如下步骤：
(1)按1：4-10的酶活比将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶混匀，得复合酶液；
(2)将步骤1制备得到的固定化载体微球按1：10的质量体积比加入复合酶液中，4℃、400-800rpm搅拌条件下交联2-4h后，过滤、洗涤，得到固定化酶。
本发明还提供了所述固定化酶在制备葡萄糖酸钠中的应用。
本发明还提供了一种制备葡萄糖酸钠的方法，包括如下步骤：
(1)将浓度为300-350g/L的葡萄糖溶液加入发酵罐中，升温至40℃，并调pH至5.5-6.0；
(2)按40g/L比例向罐中加入固定化酶，设置搅拌速度为400-600r/min、罐压为0.1MPa、通风量为1200L/h；反应过程中流加NaOH溶液，将pH维持在5.0-6.0；
(3)残糖浓度低于1g/L时视为反应结束，过滤回收固定化酶，投入下一次反应。
进一步优化的，所述步骤(1)中葡萄糖溶液为300g/L。
相对于现有技术，本发明提供固定化酶具有以下优点及效果：
(1)通过将双酶共固定化，明显减弱了葡萄糖酸氧化酶受到的的产物抑制，且提高了葡萄糖氧化酶的温度和pH稳定性。
(2)将固定化酶用于葡萄糖酸钠的制备，能够使加酶量下降40％，反应周期缩短至16h以内，达到降本增效的目的。
附图说明
图1为葡萄糖酸钠对葡萄糖氧化酶的抑制效果；
图2为葡萄糖酸钠对葡萄糖氧化酶抑制类型分析；
图3为固定化酶对葡萄糖氧化酶受产物抑制的影响。
具体实施方式
结合具体实施案例对本发明做出进一步的说明，本领域相关的技术人员可以借此更好地理解和掌握本发明，而非对本发明进行限制。若无特殊指出，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：葡萄糖酸钠对葡萄糖氧化酶的抑制类型分析
配制浓度分别为0、10、30、50g/L的葡萄糖酸钠溶液，分别以1、2.5、5、10U/mL的浓度添加葡萄糖氧化酶，添加过量过氧化氢酶，40℃充分搅拌30min。加入葡萄糖溶液使体系葡萄糖浓度为100g/L，添加过氧化氢以供氧、滴加氢氧化钠以维持pH，40℃反应30min后立即测定葡萄糖浓度，确定初始反应速率。以酶浓度(U/mL)为横坐标，反应初速度V0[g/(L·min)]为纵坐标作图，发现葡萄糖酸钠对葡萄糖氧化酶的抑制作用为可逆抑制。
配制浓度分别为0、10、30、50g/L的葡萄糖酸钠溶液，以5U/mL的浓度添加葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶的添加量为300U/mL，40℃充分搅拌30min。加入葡萄糖溶液使体系葡萄糖浓度分别为25、50、75、100g/L，添加过氧化氢以供氧、滴加氢氧化钠以维持pH，40℃反应30min后立即测定葡萄糖浓度。以底物浓度的倒数(1/[S])为横坐标，反应初速率的倒数(1/v)为纵坐标，绘制Lineweaver-Burk双倒数曲线，发现葡萄糖酸钠对葡萄糖氧化酶的抑制作用为反竞争抑制。
实施例2：一种固定化酶及其制备方法
1、明胶-壳聚糖固定化载体微球的制备：
(1)将液体石蜡中与Span-80按100：1的体积比混匀，得石蜡乳液；
(2)在体积比为3％的醋酸溶液中加入明胶和壳聚糖，得明胶-壳聚糖混合溶液，其中明胶和壳聚糖的质量体积比分别为10％-15％和1％-2％；
(3)在50℃、800rpm搅拌条件下，向石蜡乳液中缓慢加入明胶-壳聚糖混合溶液，搅拌10min，形成乳液；
(4)温度降至37℃，以1：50的体积比向乳液中加入体积比为0.5％的戊二醛，持续搅拌交联4-6h；
(5)将温度降至4℃后，经丙酮洗、乙醇洗、水洗、过滤、干燥，制得固定化载体微球；
2、固定化酶的制备：
(1)按1：4-10的酶活比将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶混匀，得复合酶液；
(2)将步骤1制备得到的固定化载体微球按1：10的质量体积比加入复合酶液中，4℃、400-800rpm搅拌条件下交联2-4h后，过滤、洗涤，得到固定化酶。
实施例3：一种固定化酶及其在葡萄糖酸钠制备中的应用
1、明胶-壳聚糖固定化载体微球的制备：
(1)将液体石蜡中与Span-80按100：1的体积比混匀，得石蜡乳液；
(2)在体积比为3％的醋酸溶液中加入明胶和壳聚糖，得明胶-壳聚糖混合溶液，其中明胶和壳聚糖的质量体积比分别为10％和2％；
(3)在50℃、800rpm搅拌条件下，向石蜡乳液中缓慢加入明胶-壳聚糖混合溶液，搅拌10min，形成乳液；
(4)温度降至37℃，以1：50的体积比向乳液中加入体积比为0.5％的戊二醛，持续搅拌交联4h；
(5)将温度降至4℃后，经丙酮洗、乙醇洗、水洗、过滤、干燥，制得固定化载体微球；
2、固定化酶的制备：
(1)按1：4的酶活比将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶混匀，得复合酶液；
(2)将步骤1制备得到的固定化载体微球按1：10的质量体积比加入复合酶液中，搅拌交联2h后，过滤、洗涤，得到固定化酶；
3、葡萄糖酸钠的制备：
(1)将浓度为300g/L的葡萄糖溶液加入发酵罐中，升温至40℃并调pH至5.5-6.0；
(2)按40g/L比例向罐中加入固定化酶，设置搅拌速度为600r/min、罐压为0.1MPa、通风量为1200L/h；反应过程中流加NaOH溶液，将pH维持在5.5-6.0；
(3)残糖浓度低于1g/L时视为反应结束，过滤回收固定化酶，投入下一次反应。
本实施例中，反应周期为17.6h，反应全程最低葡萄糖浓度下降速率为15.10g/L·h，未出现明显产物抑制现象。反应一次后回收固定化酶进行葡萄糖氧化酶酶活测定，相对酶活为89.75％，重复使用4次后，相对酶活为55.12％。
实施例4：一种固定化酶及其在葡萄糖酸钠制备中的应用
1、明胶-壳聚糖固定化载体微球的制备：
(1)将液体石蜡中与Span-80按100：1的体积比混匀，得石蜡乳液；
(2)在体积比为3％的醋酸溶液中加入明胶和壳聚糖，得明胶-壳聚糖混合溶液，其中明胶和壳聚糖的质量体积比分别为10％和2％；
(3)在50℃、800rpm搅拌条件下，向石蜡乳液中缓慢加入明胶-壳聚糖混合溶液，搅拌10min，形成乳液；
(4)温度降至37℃，以1：50的体积比向乳液中加入体积比为0.5％的戊二醛，持续搅拌交联4h；
(5)将温度降至4℃后，经丙酮洗、乙醇洗、水洗、过滤、干燥，制得固定化载体微球；
2、固定化酶的制备：
(1)按1：6的酶活比将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶混匀，得复合酶液；
(2)将步骤1制备得到的固定化载体微球按1：10的质量体积比加入复合酶液中，搅拌交联2h后，过滤、洗涤，得到固定化酶；
3、葡萄糖酸钠的制备：
(1)将浓度为300g/L的葡萄糖溶液加入发酵罐中，升温至40℃并调pH至5.5-6.0；
(2)按40g/L比例向罐中加入固定化酶，设置搅拌速度为600r/min、罐压为0.1MPa、通风量为1200L/h；反应过程中流加NaOH溶液，使pH维持在5.5-6.0；
(3)残糖浓度低于1g/L时视为反应结束，过滤回收固定化酶，投入下一次反应。
本实施例中，反应周期为15.8h，反应全程最低葡萄糖浓度下降速率为17.25g/L·h，未出现明显产物抑制现象。反应一次后回收固定化酶进行葡萄糖氧化酶酶活测定，相对酶活为90.98％，重复使用4次后，相对酶活为61.63％。
实施例5：一种固定化酶及其在葡萄糖酸钠制备中的应用
1、明胶-壳聚糖固定化载体微球的制备：
(1)将液体石蜡中与Span-80按100：1的体积比混匀，得石蜡乳液；
(2)在体积比为3％的醋酸溶液中加入明胶和壳聚糖，得明胶-壳聚糖混合溶液，其中明胶和壳聚糖的质量体积比分别为10％和2％；
(3)在50℃、800rpm搅拌条件下，向石蜡乳液中缓慢加入明胶-壳聚糖混合溶液，搅拌10min，形成乳液；
(4)温度降至37℃，以1：50的体积比向乳液中加入体积比为0.5％的戊二醛，持续搅拌交联4h；
(5)将温度降至4℃后，经丙酮洗、乙醇洗、水洗、过滤、干燥，制得固定化载体微球；
2、固定化酶的制备：
(1)按1：6的酶活比将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶混匀，得复合酶液；
(2)将步骤1制备得到的固定化载体微球按1：10的质量体积比加入复合酶液中，搅拌交联2h后，过滤、洗涤，得到固定化酶；
3、葡萄糖酸钠的制备：
(1)将浓度为300g/L的葡萄糖溶液加入发酵罐中，升温至40℃并调pH至5.5-6.0；
(2)按40g/L比例向罐中加入固定化酶，设置搅拌速度为600r/min、罐压为0.1MPa、通风量为1200L/h；反应过程中流加NaOH溶液，将pH维持在5.5-6.0；
(3)残糖浓度低于1g/L时视为反应结束，过滤回收固定化酶，投入下一次反应。
本实施例中，反应周期为16.1h，反应全程最低葡萄糖浓度下降速率为16.93g/L·h，未出现明显产物抑制现象。反应一次后回收固定化酶进行葡萄糖氧化酶酶活测定，相对酶活为91.07％，重复使用4次后，相对酶活为62.94％。对比例1：游离葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶在葡萄糖酸钠制备中的应用
将浓度为300g/L的葡萄糖溶液并加入发酵罐中，升温至40℃并调pH至5.5-6.0；以相同加酶量加入葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶，反应速率下降时补酶；设置搅拌速度为600r/min、罐压为0.1MPa、通风量为1200L/h；反应过程中流加NaOH溶液，将pH维持在5.5-6.0；残糖浓度低于1g/L时视为反应结束，取样测定葡萄糖氧化酶酶活。
对比例的反应周期为24.5h，反应全程最低葡萄糖浓度下降速率为10.75g/L·h，反应进行至6h、11h反应速率下降明显。反应结束后，葡萄糖氧化酶的相对酶活为69.64％。
上述结果表明，本发明提供的固定化酶应用于制备葡萄糖酸钠的过程中，能显著降低葡萄糖酸钠对葡萄糖氧化酶的抑制作用，提高了葡萄糖氧化酶的温度和pH稳定性，有利于降低用酶量，提高生产效率，实现降本增效。
Claims (9)
1.一种明胶-壳聚糖固定化载体微球，其特征在于，所述明胶-壳聚糖固定化载体微球的制备方法包括如下步骤：
（1）将液体石蜡中与Span-80按100：1的体积比混匀，得石蜡乳液；
（2）在体积比为3%的醋酸溶液中加入明胶和壳聚糖，得明胶-壳聚糖混合溶液，其中明胶和壳聚糖的质量体积比分别为10%-15%和1%-2%；
（3）在50℃、800 rpm搅拌条件下，向石蜡乳液中缓慢加入明胶-壳聚糖混合溶液，搅拌10 min，形成乳液；
（4）温度降至37℃，以1：50的体积比向乳液中加入体积比为0.5%的戊二醛，持续搅拌交联4-6 h；
（5）将温度降至4℃后，经丙酮洗、乙醇洗、水洗、过滤、干燥，制得明胶-壳聚糖固定化载体微球。
2.如权利要求1所述的明胶-壳聚糖固定化载体微球，其特征在于，所述步骤（2）中明胶和壳聚糖的质量体积比分别为10%和2%。
3.如权利要求1或2所述的明胶-壳聚糖固定化载体微球，其特征在于，所述步骤（4）中持续搅拌交联为时间4h。
4.权利要求1-3任一所述明胶-壳聚糖固定化载体微球在制备固定化酶中的应用。
5.一种固定化酶，其特征在于，所述的固定化酶是通过采用权利要求1-3任一所述的明胶-壳聚糖固定化载体微球对葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶进行共固定化制得的。
6.如权利要求5所述的固定化酶，其特征在于，所述固定化酶的制备方法包括如下步骤：
（1）按1：4-10的酶活比将葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶混匀，得复合酶液；
（2）将步骤1制备得到的固定化载体微球按1：10的质量体积比加入复合酶液中，4℃、400-800 rpm搅拌条件下交联2-4h后，过滤、洗涤，得到固定化酶。
7.权利要求5或6所述的固定化酶在制备葡萄糖酸钠中的应用。
8.一种制备葡萄糖酸钠的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将浓度为300-350 g/L的葡萄糖溶液加入发酵罐中，升温至40℃，并调pH至5.5-6.0；
（2）按40 g/L比例向罐中加入权利要求5或6所述的固定化酶，设置搅拌速度为400-600r/min、罐压为0.1 MPa、通风量为1200 L/h；反应过程中流加NaOH溶液，将pH维持在5.0-6.0；
（3）残糖浓度低于1 g/L时视为反应结束，过滤回收固定化酶，投入下一次反应。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中葡萄糖溶液浓度为300 g/L。
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