CN117887590A

CN117887590A - 一种南华松茸促生菌及其应用

Info

Publication number: CN117887590A
Application number: CN202410229222.4A
Authority: CN
Inventors: 姚春馨; 田果廷; 陶南; 余萍
Original assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2024-02-29
Filing date: 2024-02-29
Publication date: 2024-04-16
Anticipated expiration: 2044-02-29
Also published as: CN117887590B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开一种南华松茸促生菌及其应用，所述菌株保藏名称为：Umbelopsis dimorpha NhTmF02，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间：2024年01月12日；保藏编号：GDMCC No:64276，分类学命名：Umbelopsis dimorpha，该菌株具有促进南华松茸菌丝生长的特点。

Description

一种南华松茸促生菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，涉及一种南华松茸促生菌及其应用，具体公开为食用菌南华松茸的促生微生物NhTmF02菌株。

背景技术

松茸，学名松口蘑Tricholomamatsutake(S. Ito&S. Imai) Singer，又称松菌、剥皮菌，是口蘑科，口蘑属真菌，被列入《中国生物多样性红色名录—大型真菌卷》（Redlistof China’s Biodiversity - Macrofungi），为受保护的珍贵野生食用菌，在云南广为分布且经济价值较高。其中，“南华松茸”（DB53/T 858-2018）生长周期长、产量高、品质好，具有外观色泽鲜明、体态壮硕、菌肉肥厚、肉质细嫩，香味醇浓，生食脆、嫩、香、甜，熟食有韧劲、润滑爽口回甘等特点，钾高钠低，富含多种人体必需氨基酸，营养价值丰富，国家质检总局以2016年第128号公告，批准南华松茸为国家地理标志保护产品，成为国际上极具特色的一张松茸名片。

南华松茸与楚雄州境内分布广、储量丰富的松类、杉类、栎类等树种形成独特的共生关系，目前无法进行人工种植。近年来资源因受到各种因素的影响，难以实现可持续性开发利用。作为与植物共生的菌根菌，松茸在自然条件下的生长机制不明，纯培养生长缓慢，对环境、生物因素要求苛刻，至今没能实现人工栽培。目前生产方面的研究主要集中于原生境的保育，菌丝体发酵等，在松茸保育促繁的技术上还仍停留在林地管护等方面，微生态系统研究甚少，难以实现人工干预技术的突破。

在松茸生态微系统中，除了土壤、温度、湿度等非生物因素外，生物因素如植物、真菌、细菌、线虫等组成了一个微妙的协和共同体，它们之间互利互惠，共生共长，如真菌促进共生植物菌根的生长，植物又输送一些特殊的营养给真菌，真菌之间也相互促进。也有研究表明，自然条件根际微生物可能对大型真菌的子实体形成有一定的促进作用，其作用机制包括改善野生菌养分吸收、与病原菌竞争生态位、提高野生菌抗性、促进孢子萌发和菌丝生长等多个方面。

本发明采集自然生境下的菌塘土壤，对菌塘土中的优势微生物进行分离，实验室内开展促生菌的筛选，并结合形态学与基因组DNA扩增子测序，对原位筛选的促生菌株进行了鉴定。通过实验室开展促生菌对松茸共培养的应用，为野生菌人工菌塘促繁技术、微生态控制技术找到新途径，为松茸保育促繁的人工干预奠定基础。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明以原位筛选的方法，从分离自南华野生松茸菌塘土的优势微生物中筛选到松茸促生菌NhTmF02菌株，鉴定为接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科伞形霉属二型伞霉(Umbelopsisdimorpha)。

为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：

一种南华松茸促生菌株，其特征在于，保藏名称为：UmbelopsisdimorphaNhTmF02，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间：2024年01月12日；保藏编号：GDMCC No: 64276，分类学命名：Umbelopsisdimorpha。

进一步的，本发明提供一种产品，含所述的南华松茸促生菌株或菌株培养液。

进一步，所述菌株培养液的制备方法为：将所述菌株接种至YPD液体培养基中培养获得的菌液经无菌过滤后获得的滤液。

进一步的，培养条件为：温度28℃、转速150r/min，摇瓶培养48h。

进一步的，所述的菌株或所述的产品在促进南华松茸菌丝生长、孢子萌发或孢子生长中的应用。

本发明还提供了一种南华松茸促生液体培养方法，包括以下步骤：

S1：制备促生菌株培养液，所述促生菌株的保藏编号为GDMCC No: 64276；将促生菌株接种至YPD液体培养基中制备成浓度为0.20~0.25g/L的菌液，经无菌过滤后获得促生菌株培养液；

S2: 制备南华松茸发酵液，将南华松茸菌种接入MMN液体培养基中，培养获得菌种浓度为0.5g/L的南华松茸发酵液；

S3：按照体积比1:20~80将促生菌株培养液加入南华松茸发酵液中，继续南华松茸液体发酵培养。

进一步的，步骤S3中，按照体积比1:50将促生菌株培养液加入南华松茸发酵液中，继续南华松茸液体发酵培养。

本发明还提供了一种南华松茸孢子促生培养方法，包括以下步骤：

（1）制备促生固体培养基，采用保藏编号为GDMCC No: 64276的促生菌株；将促生菌株接种至YPD液体培养基中制备成浓度为0.20~0.25g/L的菌液，经无菌过滤后获得促生菌株培养液；促生菌株培养液按体积百分比5~50%添加至MMN固体培养基中，配制成促生固体培养基；

（2）制备南华松茸孢子悬浮液；将悬浮液涂布于MMN促生固体培养基上，进行南华松茸孢子萌发或孢子菌丝培养。

进一步的，步骤（1）中，促生菌株培养液按体积百分比30%添加至MMN固体培养基中，配制成促生固体培养基。

本发明的有益效果：

1.本发明提供的一种南华松茸促生菌NhTmF02菌株，与分离到的其它优势菌相比，具有促进南华松茸菌丝生长的特点。

2.本发明提供的NhTmF02菌株与松茸在平板上的对峙培养，表现了其活菌体促进南华松茸菌丝生长的作用。

3.本发明提供的NhTmF02菌株的培养液应用于松茸液体发酵培养，最优选 1:50体积比的添加量能够有效促进松茸菌丝的液体培养。

4.本发明所述NhTmF02菌株的培养液应用于松茸孢子萌发，能够促进松茸孢子萌发及孢子菌丝生长，菌滤液最适添加比例为30%。

附图说明

图1是本发明中目标菌株NhTmF02与南华松茸的平板培养对比图，图注：a为南华松茸对照CK，b为南华松茸与NhTmF02的对峙；

图2是本发明中促生菌株NhTmF02的形态特征图，图注：a为菌株平板初期图，b为菌株平板后期图，c为菌落图，d为40倍显微图；

图3是本发明中NhTmF02菌株与二型伞霉(Umbelopsisdimorpha)基于ITS测序的序列比对图；

图4是本发明中NhTmF02菌滤液培养南华松茸孢子生长15d对比图，图注：a 为对照CK，b为添加30%菌滤液。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

本发明提供的生物材料，南华松茸促生菌，保藏名称为：UmbelopsisdimorphaNhTmF02，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间：2024年01月12日，保藏编号为：GDMCC No: 64276，分类学命名：Umbelopsisdimorpha，该生物材料于2024年01月12日由保藏中心收到，并登记入册，根据请求，由该日起保藏三十年，该生物材料的存活性经保藏中心于2024年01月12日检测，结果是存活。

实施例1

步骤Ⅰ：松茸培养及菌塘优势菌的分离

1）松茸的采集

以楚雄州南华县内松茸主产区域五街镇作为本次南华松茸调查和样品采集地，该地位于100^o99’11” E，25^o16’45” N，海拔2532.1±124.1m，山坡面朝向西、菌窝生境树种壳斗科栎属、华山松。选取分散分布的野生松茸菌塘，收集其新鲜子实体（50g以上）装入无菌袋，低温保存。

2）松茸的组织分离与活化

采用MMN固体培养基，配方：NaCl 0.025g/L，葡萄糖 10.0g/L，KH₂PO₄0.5g/L，麦芽浸粉 3.0g/L，维生素B1 0.1mg/L，CaCl₂0.05g/L，(NH₄)₂HPO₄0.25g/L，FeCl₃0.012g/L，MgSO₄·7H₂O 0.15g/L，琼脂20g/L，pH5.7±0.1，无菌操作台上，取松茸菌褶处生长点0.5cm的组织块于试管斜面培养基上，记为“南华Tm01”，22℃恒温暗培养，1个月后转管2次即可。

3）松茸菌塘土壤的采集

选取5个子实体发育期的野生松茸菌塘，按5点取样法，除去表层腐殖质、石砾等，灭菌小铲采集深度2cm、周围10cm范围内的土壤，组成混合土样20g，置采样封口袋中，全部样本均4℃低温保鲜，在24 h之内进行后续处理。

4）菌塘共生优势菌的分离

通过稀释及平板划线法分离菌塘土可培养微生物。细菌分离用牛肉膏蛋白胨培养基，配方：牛肉膏 3 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20g/L，pH 7.2-7.5；真菌分离用孟加拉红琼脂培养基，配方：蛋白胨 5g/L，葡萄糖 10g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，琼脂20g/L，1/3000孟加拉红溶液100mL/L，自然pH值。

5支装有9ml无菌水的试管，编号分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，称取1g土样加入编号为10^-1试管中，充分震荡摇匀后用移液枪吸取1ml转移到编号为10^-2中充分震荡摇匀依次稀释至10^-5。细菌稀释至10^-5，真菌稀释至10^-4。移液枪吸取稀释样液0.1ml，加入培养基表面，用涂布棒均匀地涂布在培养基表面，每个样液重复3个平板。把涂好的培养基放入培养箱倒置培养，细菌在37℃恒温培养箱培养，真菌在28℃恒温培养箱培养。细菌培养24h后长出单菌落，真菌培养3d-5d长出单菌落。以试验设计的对照组与试验组做比较，在样品的梯度平板上进一步挑优势单菌落划线纯培养，做优势菌的分离与纯化。

结果：本实验对采集的野生松茸子实体进行组织分离，在实验室成功实现了松茸“南华Tm01”菌丝体的培养及活化；对采集的野生松茸菌塘开展优势菌的分离，经纯化和初步的形态鉴定，筛选优势菌株。为实验室内开展促生菌的筛选研究提供了稳定的试验供试材料。

步骤Ⅱ：促生菌的筛选与鉴定

1. 优势菌株与松茸菌丝体的平板对峙试验

采用MMN加富培养基（MMN配方+蛋白胨0.5%），以松茸菌株“南华Tm01”为指示菌，将步骤Ⅰ分离获得的优势菌，各菌株与其采用平板对峙培养法进行促生试验，开展松茸菌丝体促生菌的筛选。取生长良好的“南华Tm01”5mm²大小的菌丝块，接入MMN+平板一侧，于22℃恒温培养箱中培养15d。取培养后长势一致的松茸平板，处理组在距松茸菌丝体边缘4cm处分别接种经活化24 h的优势菌，不接菌的作为对照组CK，3次重复。22℃恒温继续培养，每10 d十字交叉划线法测量松茸菌落直径，连续测量5次，获得松茸菌丝的日均长速(mm/d)，计算增长率以测定优势菌对松茸菌丝生长影响。

计算公式：

菌丝的日均长速(mm/d)=[(菌落直径－5)÷2] /菌丝生长天数（1）

增长率%＝[（处理菌丝长速－对照菌丝长速）/对照菌丝长速]×100 （2）

结果：试验中筛选到的菌塘优势菌与松茸菌丝的对峙培养结果见图1及表1。

表1 菌塘优势菌对南华松茸菌丝生长的影响

表1所示为步骤I中筛选到的目标菌株NhTmF02对松茸“南华Tm01”菌丝生长的影响，与对照CK相比，NhTmF02菌株的促生作用（增长率）高达77.01%。

图1展示了目标菌株NhTmF02与松茸“南华Tm01”平板对峙试验，由NhTmF02菌株在松茸菌丝平板上的培养情况可以明确，NhTmF02菌株表现了促进松茸菌丝生长的作用。

2. 促生菌株物种鉴定

优势菌中筛选获得的促生菌株NhTmF02，经平板培养后直接作菌落形态学观察。促生菌株NhTmF02的分子生物学鉴定：供试菌株经纯化，采用ITS序列分析法进行分子系统学鉴定。用Fungal gDNA Isolation Kit（Biomiga 公司）试剂盒提取菌株基因组DNA并保存。采用真菌ITS通用引物对进行扩增：ITS1 / 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4 / 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR 引物合成和扩增产物测序由擎科生物(昆明)完成，获得的序列经双向测通并拼接处理，在NCBI数据库中进行 BLAST序列比对，下载高相似度序列。利用Clustalx、DNAStar等软件进行多序列比对，生成多重序列比对图。

结果：由图2可以看出，分离并经筛选的NhTmF02菌株，在孟加拉红琼脂培养基上生长快，菌丝白色（图2中a、图2中b），菌落不规则扁圆形，初期呈粉红色，表面带光泽（图2中c），后产生大量白色菌丝，菌丝分枝多，可观察到纵膈（图2中d），孢子囊长于菌丝端，孢囊孢子卵圆形，形态结构与接合菌亚门接合菌纲毛霉目毛霉科伞形霉属二型伞霉(Umbelopsisdimorpha)基本相似。由图3可见，NhTmF02菌株ITS扩增序列片段大小为617bp，NCBI数据库中下载最高相似度序列LC206599（序列号），经Clustalx序列比对，与二型伞霉(Umbelopsisdimorpha)的序列相似度为99 %以上。

结合NhTmF02菌株的形态学特征及 ITS序列比对结果，将本研究分离到的NhTmF02菌株确定为一种南华松茸促生菌，分类学命名：Umbelopsisdimorpha，已于2024年1月12日提交广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏名称为：Umbelopsisdimorpha NhTmF02，保藏编号为：GDMCC No: 64276。

应用例1促生菌株NhTmF02在松茸发酵培养上的应用

1）促生菌株NhTmF02活化后采用常规YPD液体培养基（配方：10g/L酵母膏，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖）液体摇瓶培养：温度28℃、转速150r/min，培养48h后，干重法测菌液浓度达0.20~0.25g/L即可；菌液经无菌纱布过滤后0.22μm无菌过滤器收集滤液，记作A液；

2）将松茸“南华Tm01”菌种（菌丝块）切细碎后接入100ml MMN液体培养基中（MMN固体培养基的基础上去除琼脂），24℃摇床（130r/min）培养10d后，各取均匀菌液5ml转接至15个100ml MMN液体培养基中继续发酵培养15d，干重法测菌液浓度达0.5g/L即可，培养条件为温度24℃、转速180r/min，记作B液；

3）按体积比1:10，1:20，1:50，1:80的4组处理将促生菌滤液A加入到松茸发酵液B中，以不加A液为对照CK，每组处理重复3个，24℃摇床（180r/min）30d；

4）松茸菌丝体生物量的测定：以上5组试验共15份促生菌共培养的菌液，在3000r/min下离心20min 用去离子水反复洗涤菌丝体，于105℃烘干至恒重，分析天平称重。

结果：

表2 NhTmF02菌液与松茸发酵共培养比较

表2比较了NhTmF02菌液与松茸“南华Tm01”发酵共培养的结果，促生菌滤液A与松茸发酵液B在不同浓度水平上促生效果不同，随着滤液A浓度从高到低的下降，松茸菌丝生物量的积累趋势由先下降再升高，在体积比1:10的高浓度水平下表现为抑制松茸菌丝生长，生物量变化率为 -43.97%，在体积比1:50的水平下则表现为促进作用，增长率达46.72%。结果表明，促生菌株NhTmF02能够以滤菌液的形态应用于松茸发酵培养上，无菌促生菌滤液1:50体积比的添加量有效促进松茸菌丝的液体培养。

应用例2 促生菌株NhTmF02在松茸孢子萌发上的应用

1）松茸孢子的采集：取开伞成熟的南华松茸子实体的菌盖，室温扣置在20cm×20cm 赛璐玢膜上，避光避风静置5d 后获得孢子印，剪下0.5 cm²的孢子印放入1.5ml带盖离心管中，用生理盐水清洗并定容，获得孢子液；

2）镜检与孢子混悬液配制：移液枪吸取孢子液滴入细胞计数板，显微镜下对孢子计数，定量孢子液浓度，并用生理盐水适当稀释至浓度2×10⁴个/ml（添加1%链霉素）；

3）促生固体培养基的制备：用应用例1促生菌株NhTmF02液体培养并无菌过滤后获得的促生菌株培养液“A液”，按体积百分比分别为5%、15%、30%、50%添加到灭菌并冷却至50℃～60℃的MMN固体培养基中，混合均匀，倒平板制成 4种浓度的MMN促生固体培养基，每个浓度设置3个重复，以未添加“A液”的MMN固体培养基为对照(CK)；

4）移液枪吸取孢子悬浮液0.1ml，用涂布棒轻柔均匀地涂于MMN促生固体培养基表面，23℃暗培养；15 d后统计孢子萌发数，比较萌发率；

5）对萌发的孢子进行镜检观察，将确认萌发生长的松茸孢子菌落转接至相同的MMN促生固体培养基上，继续23℃暗培养，每10d观察菌丝生长情况，通过十字法测量菌落直径，连续测量5次获得孢子菌丝的日均长速(mm/d)。

计算公式：

孢子菌丝的日均长速(mm/d)=菌落直径÷2 /菌丝生长天数（3）

结果：促生菌NhTmF02菌滤液的添加影响了松茸孢子的萌发与生长，菌滤液A不同浓度的处理水平，松茸孢子的萌发率和孢子菌丝长速差异显著。

表3 NhTmF02菌液的添加对松茸孢子生长的影响

表3结果显示，菌滤液对南华松茸孢子萌发率与菌丝长速的影响趋势不同，在较低添加比例5%~15%浓度范围内，对孢子萌发率有一定的促进作用，但菌丝长速受影响较小，在添加高比例50%浓度水平下萌发率受抑制（-26.63%），但菌丝长速有增长。随着菌滤液A浓度的增加，孢子萌发率上升趋势明显，在菌滤液添加比例30%浓度水平下达68.20%；孢子菌丝的长速变化趋势则是缓慢增加，在菌滤液添加比例30%浓度水平下增加46.82%，其它水平与对照差异不显著。结果表明：NhTmF02菌株能够促进南华松茸孢子萌发与生长，表现为其菌滤液添加到MMN固体培养基上，菌滤液最适添加比例为30%时，松茸孢子萌发率和孢子菌丝长速表现最佳。

图4显示促生菌株NhTmF02菌滤液培养松茸孢子的萌发情况，对照与添加30%菌滤液A，影响松茸孢子的萌发和生长，呈显著差异。

综上，本发明以原位筛选的方法，从分离自野生松茸菌塘土壤的优势微生物中筛选到南华松茸促生菌NhTmF02菌株，结合形态学与基因组ITS测序，鉴定为二型伞霉(Umbelopsisdimorpha)。本发明在实验室开展促生菌NhTmF02对南华松茸共培养的应用，结果表明，NhTmF02菌株在松茸菌丝平板上表现了其活体菌落促进松茸菌丝生长的作用；NhTmF02菌株在松茸发酵培养上表现其菌滤液1:50体积比的添加量，可以有效促进松茸菌丝的液体培养；NhTmF02菌株在松茸孢子培养上表现其菌滤液在最适添加比例为30%时，松茸孢子萌发率和孢子菌丝长速表现最佳。本发明提供的南华松茸促生菌及其促生特点，可以应用于松茸的人工培养，为人工菌塘促繁技术、微生态控制技术找到新途径，为松茸保育促繁的人工干预奠定基础；同时丰富了功能微生物资源，为农林作物的微生态构建积累了菌种资源与应用技术。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种南华松茸促生菌株，其特征在于，所述菌株保藏名称为：Umbelopsis dimorphaNhTmF02，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；保藏时间：2024年01月12日；保藏编号：GDMCC No: 64276，分类学命名：Umbelopsis dimorpha。

2.一种产品在促进南华松茸菌丝生长、孢子萌发或孢子生长中的应用，其特征在于，所述产品含权利要求1所述的南华松茸促生菌株培养液，所述菌株培养液的制备方法为：将所述菌株接种至YPD液体培养基中培养获得的菌液经无菌过滤后获得的滤液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，培养条件为：温度28℃、转速150r/min，摇瓶培养48h。

4.一种南华松茸促生液体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：制备促生菌株培养液，所述促生菌株的保藏编号为GDMCC No: 64276；将促生菌株接种至YPD液体培养基中制备成浓度为0.20～0.25g/L的菌液，经无菌过滤后获得促生菌株培养液；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中，按照体积比1:50将促生菌株培养液加入南华松茸发酵液中，继续南华松茸液体发酵培养。

6.一种南华松茸孢子促生培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备促生固体培养基，采用保藏编号为GDMCC No: 64276的促生菌株；将促生菌株接种至YPD液体培养基中制备成浓度为0.20～0.25g/L的菌液，经无菌过滤后获得促生菌株培养液；促生菌株培养液按体积百分比5~50%添加至MMN固体培养基中，配制成促生固体培养基；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，促生菌株培养液按体积百分比30%添加至MMN固体培养基中，配制成促生固体培养基。