CN117883456A - 川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途，涉及医药技术领域，本发明首次发现川牛膝甾酮类化合物能够显著减轻AIA大鼠的炎症反应、抑制滑膜细胞的增殖，迁移和侵袭等类肿瘤生物学行为、并明显减轻类风湿关节炎的病理损伤，发现并证实川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的新用途，同时也为类风湿关节炎治疗提供了一种新的手段。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途。
背景技术
类风湿关节炎(RA)是一种慢性、复杂、常见的关节疾病。根据世界卫生组织提供的统计，全球约有1-2％的人口患有类风湿关节炎。这种疾病的特征是滑膜组织的肿瘤样扩张，以及关节的持续和破坏性炎症。在类风湿关节炎的早期阶段，单核细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞以及成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)参与到滑膜炎中。重要的是，成纤维细胞样滑膜细胞在类风湿关节炎的发展中起着至关重要的作用。成纤维细胞样滑膜细胞可以刺激炎症因子如白细胞介素IL-1b、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子的表达，导致滑膜发生炎症反应、异常增殖和迁移的类肿瘤生物学行为。此外，成纤维细胞样滑膜细胞分泌的基质金属蛋白酶可进一步降解关节的胶原基质成分，加重类风湿关节炎的症状。因此，预防滑膜细胞增殖、迁移和侵袭，降低炎症细胞因子表达水平可能是治疗类风湿关节炎的重要替代方案。
目前，临床上尚无逆转类风湿关节炎发展的有效治疗药物。化学药物具有严重的毒副作用，如长期使用非甾体抗炎药会导致胃肠道溃疡和肾脏疾病。对许多患者来说，生物制剂价格昂贵，难以负担。因此，迫切需要一种新的、更经济的、副作用更小的治疗策略。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途。
本申请实施例提供了川牛膝甾酮类化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备用于治疗和/或预防类风湿关节炎的药物中的用途。
进一步地，所述川牛膝甾酮类化合物包括cyasterone、28-epi-cyasterone和cyathsterone C。
进一步地，所述川牛膝甾酮类化合物的制备方法包括以下步骤：
将川牛膝进行粉碎过筛，后进行乙醇回流提取并将所得提取液进行浓缩，得到浸膏；
将所得浸膏溶于有机溶剂中进行萃取，得到有机溶剂萃取物；
将所述有机溶剂萃取物上大孔树脂柱，采用乙醇梯度洗脱液进行梯度洗脱，梯度洗脱至流出液为无色，收集洗脱液并浓缩干燥，得到所述川牛膝甾酮类化合物。
进一步地，所述将川牛膝进行粉碎过筛，后进行乙醇回流提取并将所得提取液进行浓缩，得到浸膏的步骤包括以下过程：
将川牛膝药材粉碎成粗粉，所得粗粉过3号筛，得到药材粉末；
在所述药材粉末中加入体积分数为95％的乙醇，按照料液比为1:10的比例，回流提取3次，每次提取2h；提取后的残渣再加入体积分数为50％的乙醇，按照料液比为1:10的比例，回流提取3次，每次提取2h；提取完成后合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到所述浸膏。
进一步地，萃取有机溶剂包括正丁醇。
进一步地，所述乙醇梯度洗脱液包括体积分数为10％的乙醇和体积分数为30％的乙醇；收集体积分数为30％的乙醇洗脱液浓缩干燥，得到川牛膝总甾酮。
进一步地，所述川牛膝甾酮类化合物具有呈浓度依赖性的抑制MH7A细胞的增殖、迁移和侵袭作用。
进一步地，所述川牛膝甾酮类化合物具有抑制PEG2、NO、IL-6、IL-8、iNOS和COX-2的释放的作用；所述川牛膝甾酮类化合物具有减弱PI3K/AKT信号通路的磷酸化水平的作用。
进一步地，所述药物包括：
(i)有效量的川牛膝甾酮类化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物；
(ii)药用辅料。
进一步地，所述药物的剂型包括注射制剂、口服制剂、喷雾制剂和冲洗制剂中的至少一种。
本发明实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：
本发明实施例提供了川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途，本发明首次发现川牛膝甾酮类化合物能够显著减轻AIA大鼠的炎症反应、抑制滑膜细胞的增殖，迁移和侵袭等类肿瘤生物学行为、并明显减轻类风湿关节炎的病理损伤，发现并证实川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的新用途，同时也为类风湿关节炎治疗提供了一种新的手段。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为川牛膝各组分对MH7A细胞活力的影响；图1中：A：石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇层样品对MH7A细胞的细胞毒性影响；B：乙酸乙酯和正丁醇层样品对MH7A细胞的抗增殖作用影响；C：样品A、样品B、样品C、样品D对MH7A细胞的细胞毒性影响；D：样品B、样品D对MH7A细胞的抗增殖作用影响；以上所有数据均以三个独立重复的平均值±SD表示；***p<0.001,****p<0.0001vs对照组；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs模型组。
图2为HPLC法鉴定川牛膝样品B的测试结果；图2中：A：样品B的HPLC谱图；B：混合对照品HPLC图；C：化合物的特征吸收曲线；D：化合物结构式，Ⅰ：Cya，Ⅱ：28-e-Cya，Ⅲ：Cya-C。
图3为CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C对细胞活力的影响；图3中：(A-B)CES(6.25、12.5、25、50、100和200μg/ml)、Cya、28-e-Cya和Cya-C(1.5625、3.125、6.25、12.5、25和50μM)对MH7A细胞24小时和48小时的细胞毒性。(C-D)CES(6.25、12.5、25和50μg/ml)、Cya、28-e-Cya和Cya-C(1.5625、3.125、6.25和12.5μM)对IL-1β刺激的MH7A细胞24小时和48小时的抗增殖作用。以上所有数据均以三个独立重复的平均值±SD表示。**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001vs对照组；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001vs模型组。
图4为CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C对迁移和侵袭的影响；图4中：CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C对迁移和侵袭的影响。(A)MH7A细胞的迁移作用(B)MH7A细胞的侵袭作用。MH7A细胞和CES(25和50μg/ml)、Cya、28-e-Cya和、Cya-C(6.25和12.5μM)共培养24小时。以上所有数据均以三个独立重复的平均值±SD表示。****p<0.0001vs对照组；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001vs模型组。
图5为CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C对IL-6、IL-8、PGE2和NO水平的影响；图5中：(A-C)用CES(25、50mg/ml)、Cya、28-e-Cya和Cya-C(6.25、12.5mM)处理IL-1β激活的MH7A细胞后，用ELISA法检测IL-6、IL-8和PGE2的水平(D)用Griess法测定NO的产生。数据以三个独立实验的平均值±SD表示。****p<0.0001vs对照组；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001vs模型组。
图6为CES对AIA大鼠体重、爪肿和关节炎评分的影响；图6中：(A)动物实验设计示意图。(B-D)每三天测量一次体重、爪肿胀和关节炎评分。数值以平均值±SD表示(n＝8)，*p<0.05，**p<0.01vs对照组；#p<0.05，##p<0.01vs模型组。
图7为CES对AIA大鼠足趾部位特征、组织病理学变化和细胞因子的影响；图7中：(A)大鼠右后足趾的宏观变化(B)踝关节的代表性病理图像的HE染色和评分。黑色箭头表示滑膜组织，黄色箭头表示炎性细胞。(C)ELISA法监测大鼠血清中细胞因子(IL-6、IL-8和PGE2)的水平，Griess试剂分析NO的水平。(D)滑膜组织中的COX-2和iNOS表达情况。数值以平均值±SD表示(n＝8)。**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001vs对照组；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，####p<0.0001vs模型组。
图8为AIA大鼠滑膜组织中IL-6、IL-8、MMP2和MMP9表达情况；图8中：(A-D)免疫组化染色用于评估滑膜组织中IL-6、IL-8、MMP2和MMP9的蛋白表达。(E)定量分析IL-6、IL-8、MMP2和MMP9的AOD值。数值以平均值±SD表示(n＝8)。***p<0.001,****p<0.0001vs对照组；#p<0.05,##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001vs模型组。
图9为CES对PI3K/Akt通路的影响；图9中：(A-B)免疫组化检测Akt、P-Akt、PI3K和P-PI3K蛋白水平。(C-D)Akt、P-Akt、PI3K和P-PI3K蛋白的AOD值定量分析。(E)PI3K/Akt信号通路上的关键蛋白进行了Western印迹分析。数值以平均值±SD表示(n＝8)。***p<0.001vs对照组；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001vs模型组。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请实施例提供了川牛膝甾酮类化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备用于治疗和/或预防类风湿关节炎的药物中的用途。
本发明实施例提供了川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的用途，本发明首次发现川牛膝甾酮类化合物能够显著减轻AIA大鼠的炎症反应、抑制滑膜细胞的增殖，迁移和侵袭等类肿瘤生物学行为、并明显减轻类风湿关节炎的病理损伤，发现并证实川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的新用途，同时也为类风湿关节炎治疗提供了一种新的手段。
本申请中，“互变异构体”是指某些化合物中的一个官能团改变其结构成为另一种官能团异构体，并且能迅速地相互转换，成为两种异构体处在动态平衡中，而这两种异构体，称为互变异构体。
本申请中，本发明化合物可包括一个或多个不对称中心，且因此可以存在多种立体异构体形式，例如，对映异构体和/或非对映异构体形式。例如，本发明化合物可为单独的对映异构体、非对映异构体或几何异构体(例如顺式和反式异构体)，或者可为立体异构体的混合物的形式，包括外消旋体混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。异构体可通过本领域技术人员已知的方法从混合物中分离，所述方法包括:手性高压液相色谱法(HPLC)以及手性盐的形成和结晶；或者优选的异构体可通过不对称合成来制备。
本申请中，“前药”也称前体药物、药物前体、前驱药物等，是指药物经过化学结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效的化合物。前药包括，例如，其中羟基、氨基或疏基与任意基团键合的本发明化合物，当将其给予患者时，可以裂解形成羟基、氨基或疏基。因此，前药的代表性实例包括(但不限于)式(I)化合物的羟基、疏基和氨基官能团的乙酸酯/酰胺、甲酸酯/酰胺和苯甲酸酯/酰胺衍生物。另外，在甲酸(-COOH)的情况下，可以使用酯，例如甲酯、乙酯等。酯本身可以是有活性的和/或可以在人体体内条件下水解。合适的药学上可接受的体内可水解的酯基包括容易在人体中分解而释放母体酸或其盐的那些基团。
本领域技术人员将理解，有机化合物可以与溶剂形成复合物，其在该溶剂中发生反应或从该溶剂中沉淀或结晶出来。这些复合物称为“溶剂合物”。当溶剂是水时，复合物称为“水合物”。本发明涵盖了本发明化合物的所有溶剂合物。
本申请中，“药学上可接受的盐”是指在可靠的医学判断范围内，适合与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应等等，并且与合理的益处/危险比例相称的那些盐。药学上可接受的盐在本领域是众所周知的。例如，Berge等人在J.Pharmaccutical Sciences(1977)66:1-19中详细描述的药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和无机和有机碱的盐。药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例是与无机酸形成的盐，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，或与有机酸形成的盐，例如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、枸株酸、琥珀酸或丙二酸。也包括使用本领域常规方法形成的盐，例如，离子交换方法。其它药学上可接受的盐包括:已.二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、重硫酸盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-蔡磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟蔡酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十-一烷酸盐、戊酸盐，等等。衍生自合适的碱的药学上可接受的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N(C4烷基):盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁盐，等等。如果合适的话，其它的药学上可接受的盐包括与反离子形成的无毒的铵盐、季铵盐和胺阳离子，反离子例如卤离子、氢氧根、甲酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根。
本申请中，“溶剂合物”是指通常由溶剂分解反应形成的与溶剂相结合的化合物或其盐的形式。常规溶剂包括包括水、甲醇、乙醇、乙酸、乙醚等。本文所述的化合物可制备成，例如，结晶形式，且可被溶剂化。合适的溶剂合物包括药学上可接受的溶剂合物且进一步包括化学计量的溶剂合物和非化学计量的溶剂合物。在一些情况下，所述溶剂合物将能够分离，例如，当一个或多个溶剂分子掺入结晶固体的晶格中时。“溶剂合物"包括溶液状态的溶剂合物和可分离的溶剂合物。代表性的溶剂合物包括水合物、乙醇合物和甲醇合物。
本申请中，上述“或其互变异构体、立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物”应当理解为“或所述式(I)化合物的糖类化合物、所述式(I)化合物的肽类化合物、所述式(I)化合物的互变异构体、所述式(I)化合物的立体异构体、所述式(I)化合物的前药、所述式(I)化合物的药学上可接受的盐、所述式(I)化合物的水合物或所述式(I)化合物的溶剂合物”。
在一些具体实施例中，所述川牛膝甾酮类化合物包括cyasterone、28-epi-cyasterone和cyathsterone C。
在一些具体实施例中，所述川牛膝甾酮类化合物的制备方法包括以下步骤：
将川牛膝进行粉碎过筛，后进行乙醇回流提取并将所得提取液进行浓缩，得到浸膏；
将所得浸膏溶于有机溶剂中进行萃取，得到有机溶剂萃取物；
将所述有机溶剂萃取物上大孔树脂柱，采用乙醇梯度洗脱液进行梯度洗脱，梯度洗脱至流出液为无色，收集洗脱液并浓缩干燥，得到所述川牛膝甾酮类化合物。
在一些具体实施例中，所述将川牛膝进行粉碎过筛，后进行乙醇回流提取并将所得提取液进行浓缩，得到浸膏的步骤包括以下过程：
将川牛膝药材粉碎成粗粉，所得粗粉过3号筛，得到药材粉末；
在所述药材粉末中加入体积分数为95％的乙醇，按照料液比为1:10的比例，回流提取3次，每次提取2h；提取后的残渣再加入体积分数为50％的乙醇，按照料液比为1:10的比例，回流提取3次，每次提取2h；提取完成后合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到所述浸膏。
在一些具体实施例中，萃取有机溶剂包括正丁醇。
在一些具体实施例中，所述乙醇梯度洗脱液包括体积分数为10％的乙醇和体积分数为30％的乙醇；收集体积分数为30％的乙醇洗脱液浓缩干燥，得到川牛膝总甾酮。
在一些具体实施例中，所述川牛膝甾酮类化合物具有呈浓度依赖性的抑制MH7A细胞的增殖、迁移和侵袭作用。
在一些具体实施例中，所述川牛膝甾酮类化合物具有抑制PEG2、NO、IL-6、IL-8、iNOS和COX-2的释放的作用；所述川牛膝甾酮类化合物具有减弱PI3K/AKT信号通路的磷酸化水平的作用。
在一些具体实施例中，所述药物包括：
(i)有效量的川牛膝甾酮类化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物；
(ii)药用辅料。
本申请中，“有效量”又可称为“治疗有效量”，是指足以提供希望的生物结果的试剂的量。该结果可为疾病的征兆、症状或原因的减少和/或减轻，或任何其它希望的生物系统的变化。例如，治疗用途的“有效量”是指包含作为本发明活性成分的化合物的临床上显著减少疾病所需要的化合物的量。在任何个案中，适当的“有效”量可由本领域普通技术人员使用常规实验来测定。因此，表达方式“有效量""通常是指活性物质具有治疗效果时的量。
本申请中，药用辅料系指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂；是除活性成分以外，在安全性方面已进行了合理的评估，且包含在药物制剂中的物质。药用辅料除了赋形、充当载体、提高稳定性外，还具有增溶、助溶、缓控释等重要功能，是可能会影响到药品的质量、安全性和有效性的重要成分。具体比如：生理盐水、葡萄糖、维生素C、氨基酸等，是指在药物制剂中除主药以外的附加物。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等。
在一些具体实施例中，所述药物的剂型包括注射制剂、口服制剂、喷雾制剂和冲洗制剂中的至少一种。
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例1川牛膝抗类风湿关节炎有效部位筛选
主要原材料及试剂信息：川牛膝药材于2021年10月在四川省成都市荷花池药材市场购买；该植物由成都大学实验室鉴定为苋科植物川牛膝C.officinalis的干燥根，标本(CO202110)保存于成都大学药学院植物标本室。D101大孔树脂购于青岛海洋化工公司；提取分离所用无水乙醇、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇纯度级别均为分析纯，为成都市科隆化学品有限公司产品；分离纯化所用的甲醇纯度级别为色谱纯，购于成都市科隆化学品有限公司
川牛膝各组分制备：1)将5Kg川牛膝药材粉碎成粗粉，所得粗粉过3号筛。在药材粉末中加入95％乙醇，按照料液比为1:10的比例，回流提取3次，每次提取2h。提取后的残渣再加入50％乙醇，按照料液比为1:10的比例，回流提取3次，每次提取2h。提取完成后合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到浸膏826g。往浸膏中加入500ml纯水混合均匀后，均分为两次进行萃取。每份浸膏萃取两次。在浸膏中按照1:3的比例加入石油醚进行萃取，萃取2h后，从漏斗上方倒出石油醚层，下方放出母液1。母液1按照1:3的比例加入二氯甲烷中进行萃取，萃取2h后，从漏斗上方倒出母液2、下方放出二氯甲烷层。母液2按照1:3的比例加入乙酸乙酯进行萃取，萃取2h后，从漏斗上方倒出乙酸乙酯层、下方放出母液3。母液3按照1:3的比例加入正丁醇进行萃取，萃取2h后，从上方倒出正丁醇层，下方放出母液4。一共得到4个不同的萃取部分。分别将四个部位的样品减压浓缩，得到石油醚层样品4.3g、二氯甲烷层样品7.5g、乙酸乙酯层样品30.2g、正丁醇层样品168g。2)取20g正丁醇部分样品用50ml 10％乙醇稀释后，1200r离心10min，取上清液，上样D101大孔树脂，静置吸附过夜。次日，先用纯水洗脱色谱柱，将没有被吸附的化合物洗涤干净。然后分别使用10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇洗脱至流出液为无色后，并收集各个浓度梯度乙醇洗脱部位，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥样品，制备得到样品A、样品B、样品C、样品D。
川牛膝有效部位筛选：(1)川牛膝各组分样品对MH7A细胞活力的影响：将细胞密度为5×103/孔的MH7A细胞接种于96孔培养板中，在细胞培养箱中培养至贴壁。贴壁后，加入100μl浓度为3.125,6.25,12.5,25,50,100，200μg/ml的石油醚层样品、二氯甲烷层样品、乙酸乙酯层样品、正丁醇样品于96孔板中，每组设置4个复孔。孵育培养24小时，每孔加入10μlCCK-8试剂，两小时后使用微孔板读取器在450nm波长下测量其OD值，根据公式计算其生存率。筛选其存活率在90％以上的提取物浓度进行后续实验。按公式计算细胞存活率：细胞存活率＝(处理组OD值-空白组OD值)/(细胞对照组OD值-空白组OD值)，分析细胞存活率后，选取对细胞生存无影响(存活率>90％)的给药浓度进行下一步活性测定试验。(2)川牛膝各组分样品对MH7A细胞的抗增殖作用：根据上述实验结果确定各组样品的给药浓度后，采用CCK-8法对不同浓度的乙酸乙酯层样品和正丁醇层样品对MH7A细胞的抗增殖作用进行检测。空白组加入RPMI 1640完全培养基，模型组加入10ng/ml IL-1β，给药组加入不同浓度的CES和10ng/ml IL-1β。在5％CO2和37℃的条件下培养24小时，每孔加入10μl CCK-8试剂，两小时后使用微孔板读取器在450nm波长下测量其OD值，根据公式计算细胞存活率。(3)川牛膝正丁醇各组分样品对MH7A细胞活力的影响：按照(1)中的步骤进行实验，分别对样品A、B、C、D进行细胞毒性实验。(4)川牛膝正丁醇各组分样品对MH7A细胞的抗增殖作用：按照(2)中的步骤进行实验，分别对样品B、D进行细胞抗增殖作用实验。
川牛膝正丁醇层样品B指认：采用岛津高效液相色谱系统(i-Series liquid LC-2050系统)和C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm,Shim-pack GIS)对川牛膝总甾酮进行定性分析。取2mg CES，加1ml甲醇溶解，配置成供试品溶液，待用。再取cyasterone、28-epi-cyasterone和cyathsterone C对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。甲醇和水为流动相，流动相洗脱程序设置为0-30min，甲醇，30％-55％(柱温30℃，流速1.0ml/min)，进样10ul，对川牛膝总甾酮中的化合物进行分析。
测试结果：(1)川牛膝各组分样品对MH7A细胞活力的影响：为了筛选川牛膝不同萃取部位样品的体外细胞毒性，使用不同浓度的石油醚层样品、二氯甲烷层样品、乙酸乙酯层样品、正丁醇层样品处理MH7A细胞24小时。如图1A所示，CCK-8实验检测结果表明，石油醚层样品、二氯甲烷层样品各个浓度的显示都出明显的细胞毒性，乙酸乙酯层样品在浓度大于或等于50μg/ml时，也表现出明显的细胞毒性。正丁醇层样品在浓度大于100μg/ml时，出现细胞毒性。因此，根据以上的实验结果选择乙酸乙酯层样品和正丁醇层样品进行后续的MH7A药效实验筛选。(2)川牛膝各组分样品对MH7A细胞抗增殖作用：如图1B所示，实验结果发现，正丁醇层样品能够明显降低MH7A细胞的恶性增殖，表现出很强的抗增殖作用。但是乙酸乙酯层样品只在浓度为25g/ml时表现出微弱的抗增殖作用。因此，猜测正丁醇层中含有川牛膝抗滑膜细胞恶性增殖的有效部位，采用大孔树脂进一步分离纯化，以期阐明川牛膝中川牛膝抗类风湿关节炎的有效部位。(3)川牛膝正丁醇层各样品对MH7A细胞活力的影响：为了筛选出川牛膝正丁醇中的发挥抗增殖作用的有效部位，首先对正丁醇层各个洗脱组分样品的体外细胞毒性进行检测。使用不同浓度的样品A、样品B、样品C、样品D处理MH7A细胞24小时。如图1C所示，CCK-8实验检测结果表明，各个浓度的样品A显示都出很强的细胞毒性，200g/ml和100g/ml浓度的样品B组细胞存活率低于85％，出现明显的细胞毒性；样品C促进MH7A细胞增殖；相反各浓度的样品D没有出现明显的细胞毒性。根据以上的试验结果，选择样品B和样品D进行下一步MH7A细胞药效试验筛选。(4)川牛膝各组分样品对MH7A细胞抗增殖作用：采用CCK8法进一步检测样品B和样品D对MH7A细胞抗增殖作用的影响。结果如图1D所示，各浓度的样品B能够明显抑制由IL-1β刺激引起的MH7A细胞增殖，但是样品D没有表现出明显的治疗效果。(5)川牛膝样品B化学成分指认：为了确定川牛膝样品B的主要化学成分，采用HPLC进行定性分析(图2)。通过比较对照品的保留时间和特征吸收曲线，确定了川牛膝样品B中为三种杯苋甾酮衍生物，包括cyasterone(Cya)、28-epi-cyasterone(28-e-Cya)和cyathsterone C(Cya-C)。
实施例2川牛膝甾酮类化合物(简称为CES)抗类风湿关节炎的体外研究
在实施例1的基础上，本例考察川牛膝甾酮类化合物抗类风湿关节炎的体外研究。包括以下过程：
CCK-8法检测MH7A细胞活力：(1)不同浓度的CES对MH7A细胞活力的影响：将细胞密度为5×103/孔的MH7A细胞接种于96孔培养板中，在细胞培养箱中培养至贴壁。贴壁后，加入100μl浓度为3.125,6.25,12.5,25,50,100,200,and 400μg/ml的CES于96孔板中，每组设置4个复孔。孵育培养24小时或48小时后，每孔加入10μl CCK-8试剂，两小时后使用微孔板读取器在450nm波长下测量其OD值，根据公式计算其生存率。筛选其存活率在90％以上的提取物浓度进行后续实验；(2)不同浓度的化合物对MH7A细胞活力的影响：待细胞贴壁后，分别加入100μl浓度为1.5625,3.125,6.25,12.5,25,and 50μM的Cya,28-e-Cya，和Cya-C；(3)待细胞贴壁后，分别加入100μl浓度为10、20、40ng/ml的IL-1β刺激物。筛选其存活率在115％以上的最佳造模浓度进行后续实验；(4)不同浓度的CES对MH7A细胞的抗增殖作用：根据上述实验结果确定提取物的给药浓度和IL-1β的最佳造模浓度后，采用CCK-8法对不同浓度的CES对MH7A细胞的抗增殖作用进行检测。空白组加入RPMI 1640完全培养基，模型组加入10ng/ml IL-1β，给药组加入不同浓度的CES和10ng/ml IL-1β。在5％CO2和37℃的条件下培养24小时或48小时后，每孔加入10μl CCK-8试剂，两小时后使用微孔板读取器在450nm波长下测量其OD值，根据公式计算细胞存活率；(5)不同浓度的化合物对MH7A细胞的抗增殖作用。
伤口愈合实验检测MH7A细胞抗迁移能力：使用伤口愈合实验测试CES、Cya、28-e-Cya和Cya-c对IL-1β刺激的MH7A细胞迁移能力的影响。将MH7A细胞接种于6孔板中，其密度为3×106个/孔。在细胞培养箱中培养至融合度为80％左右后，弃去培养基，用PBS洗涤细胞两次，加入不含FBS的培养基处理24小时。随后用200ul的黄色无菌移液管尖端在每孔底垂直划3条竖线，用PBS洗涤，弃去废液。采用2.6.4节的分组进行给药，分别在第0小时和第24小时在显微镜下记录创面宽度，用ImageJ软件计算24h后细胞迁移面积百分比。
Transwell实验检测MH7A细胞的抗侵袭能力：在IL-1β刺激的MH7A细胞中，通过transwell实验检测CES、Cya、28-e-Cya和Cya-c的抗侵袭作用。首先，在直径为10mm(孔径为8μm)的聚碳酸酯小室中加入40ul稀释后的Matrigel基质胶，使其均匀铺满整个上室底部，放入37℃的细胞培养箱中4小时。待transwell上室底部基质胶成膜后，将200ul密度为6×104/孔的细胞悬液分散在transwell上室中，加入不同浓度的CES，Cya,28-e-Cya和Cya-C。在培养皿底部加入800μl含20％ FBS RPMI 1640完全培养基，除对照组外，各组均给予刺激物IL-1β。随后，将处理完成的MH7A细胞在培养箱中侵袭24小时。24小时后，将transwell上室中废液弃去，用棉签轻轻刮掉膜上表面未侵袭的细胞，在PBS中轻轻清洗3次，加入200ul多聚甲醛在4℃条件下固定30分钟。随后用1％结晶紫在室温下对固定细胞染色15分钟，PBS清洗transwell上室3次，使用光学显微镜在五个不同的视野中拍摄被标记细胞的照片。每次试验至少进行三次。
ELISA法检测MH7A细胞的细胞因子的影响：采用ELISA试剂盒检测MH7A细胞释放的IL-6、IL-8和PEG2的含量。首先，将MH7A细胞接种在24孔板中培养至贴壁后，加入用不同剂量的CES、Cya、28-e-Cya、Cya-C和IL-1β(10ng/mL)共同处理12h。根据制造商的方法测量CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C对细胞因子释放的影响。
Griess法检测MH7A细胞NO的含量：按照制造商的方法测量CES,Cya,28-e-Cya和Cya-C对MH7A细胞NO的含量的影响。
测试结果：(1)CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C对MH7A细胞活力的影响：为了评估体外细胞毒性，使用不同浓度的CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C处理MH7A细胞24小时和48小时。如图3A所示，CCK-8实验检测结果表明，用200μg/ml和100μg/ml剂量的CES处理后，细胞存活率低于85％。高剂量的Cya、28-e-Cya和Cya-C(25μM和50μM)对MH7A细胞也显示出明显的细胞毒性作用(图3B)。根据细胞存活率结果提示，选择浓度为6.25、12.5、25和50μg/ml的CES和浓度为1.5625、3.125、6.25和12.5μM的Cya、28-e-Cya和Cya-C进行后续实验。试验结果显示，不同浓度的CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C能够明显抑制由IL-1β刺激引起的MH7A细胞增殖。(图3C、3D)。(2)CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C对迁移和侵袭的影响：不同浓度的CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C处理24小时后，MH7A细胞的迁移能力受到显著抑制(图4A)。重要的是，与模型组相比，50mg/ml的CES可明显抑制MH7A细胞超过50％的迁移率。侵袭试验的结果与伤口愈合试验的结果类似。如图4B所示，结果表明不同剂量的CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C能有效抑制MH7A细胞的侵袭。(3)CES、Cya、28-e-Cya和Cya-C对细胞因子和NO生成的影响：结果显示，所有化合物都能抑制PEG2、IL-6、IL-8和NO水平的升高(图5)。与其他处理组相比，50g/ml的CES能最有效地减少这些靶标的释放。
上述实验结果表明，CES通过抑制IL-1β诱导的MH7A细胞的增殖、侵袭和迁移，并下调炎症因子和NO的水平，具有较强的抗类风湿关节炎作用。
实施例3CES抗类风湿关节炎的体内研究
在实施例1和实施例2的基础上，本例进一步进行CES抗类风湿关节炎的体内研究。
实验取材：(1)血清准备：在AA造模成功后，灌胃21天后，采取各组大鼠腹主动脉血约7-8ml血液，离心并留取血清分装冻存。(2)切片准备：血清采血结束后，抽出针头并将大鼠处死。处死大鼠后取右踝关节，于4％多聚甲醛固定后送样。(3)总蛋白准备：取大鼠相同部位踝关节组织0.5g于离心管中；加入0.5mL含1mM PMSF蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，低温匀浆机上匀浆10min，于冰上裂解30min；将裂解完全的样品置于低温离心机中，12000rpm离心15min取上清，制备得到踝关节总蛋白，每组小鼠制备6份样品。制备好的总蛋白使用BCA法定量蛋白浓度，加入Loading buffer(5x)于100℃水浴锅中煮沸10min，-20℃保存。
实验动物及分组：40只体重在180—220g的雄性Wistar大鼠从北京斯贝福生物技术公司购买(生产许可证号:SCXK,2019-0010)。大鼠购买回来后，在恒温(22±2℃)、恒湿(55±5℃)条件下，给予大鼠充足的食物和水，使其适应新环境。本实验符合美国国立卫生研究院的指导方针(NIH出版物第85-23号，2011年修订)。适应性喂养一周后，将大鼠随机分为5组(n＝8):对照组、模型组、低剂量组(CES,12.5mg/kg)、高剂量组(CES,25mg/kg)和阳性对照组(甲氨蝶呤，MTX、0.1mg/kg)。
AIA模型的建立及给药：大鼠在造模前一天禁食禁水。首先，对大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)进行深度麻醉。为了诱导大鼠类风湿关节炎，在大鼠右后跖脚垫皮内注射0.1ml完全弗式佐剂。同时，对照组大鼠注射等量生理盐水。CES和MTX采用0.5％羧甲基纤维素钠溶液进行溶解，每3天灌胃一次，连续给药21天。正常组和模型组同时给予等量的0.5％CMC-Na。
CES对类风湿关节炎大鼠体重，脚掌肿胀，关节炎严重程度评估：注射完全弗式佐剂后，每3天对大鼠的体重、足肿胀度和关节炎严重程度进行一次测定，直至大鼠安乐死。具体来说，每三天使用水置换法测定一次足趾肿胀度。通常，关节炎的临床严重程度是通过主观评分系统对大鼠的每个肢体进行评估。每只老鼠四只足趾的得分加起来最高为16分。评分方法使用Chondrex提供的Protocol(见表1)，对小鼠四肢进行0-4分评分，将四肢评分结果相加为小鼠的类风湿关节炎评分。
表1Chondrex公司提供的关节炎评分得分
组织学分析：在第35天对大鼠实施安乐死，将大鼠的右踝关节和脚掌分离并用福尔马林溶液固定。用10％EDTA溶液对组织样本脱钙一个月，然后进行石蜡包埋处理。取5mm厚的切片，用苏木精和伊红(HE)染色，然后用光学显微镜观察，并拍照分析。
免疫组化检测：(1)烤片：4℃保存的组织切片置60℃烤箱中烤片120分钟。(2)脱蜡：把切片从烤箱中取出后，立即置于第一缸二甲苯(100％)中，浸泡10分钟后换到第二缸二甲苯，再浸泡10分钟。(3)梯度酒精洗涤：切片从二甲苯取出后置于一号无水酒精中，浸泡5分钟，置于2号无水酒精中，浸泡5分钟；95％酒精中浸泡5分钟；70％酒精中浸泡5分钟；50％酒精中浸泡5分钟；PBS洗涤2×5分钟(置于摇床上，speed为最低，每次洗涤须更换新的PBS,每次要先把切片拿出,避免直接倒把组织冲掉)。(4)抗原修复：将柠檬酸盐抗原修复液(暴露抗原)溶解于1L的蒸馏水中，将切片放入修复液中，用保鲜膜密封烧杯口，在微波炉以中高火煮沸至沸腾后调至中火，持续煮沸20分钟进行抗原修复，及时观察修复液的量,避免煮干。修复完成后自然冷却至室温。PBS浸洗2×5分钟。(5)灭活内源性过氧化物酶：1ml枪头滴加聚台物辅助剂PV-9000试剂盒(中山金桥)中的试剂1内源性过氧化物酶阻断剂，室温10分钟以灭活内源性酶。PBS浸洗3×5分钟。(6)封闭：滴加5％BSA封闭液,室温封闭30分钟。(7)孵育一抗：用5％BSA按照适当的比例稀释一抗，每张切片加300uL稀释后的抗体，放入湿盒(加适量自来水保湿)中4℃过夜。次日以PBS洗涤3×3分钟。(8)孵育二抗：滴加聚合物辅助剂PV-900C试剂盒(中山金桥)中的试剂2，室温孵育30分钟(时间不定)，PBS洗涤3×2分钟。然后加聚合物铺助剂PV-9000试剂盒中的试剂3，室温孵育1.5h，PBS洗涤3×2分钟。(9)DAB显色：将20x AB浓缩液用DAB底物液中稀释至1x，混合均匀，配成DAB工作液置于EP管内备用(此工作液现配现用，配好后避光保存，6小时内使用)，沿组织边缘滴加适当DAB工作液于玻片上，或显微镜下直接观察计时控制显色时间，避免时间太长背景深染(或置于白纸上显色室温显色3分钟)。(10)苏木素复染：滴加适当苏木素于切片上，复染时间约为20秒钟；流水冲洗10min。(11)分化、返蓝，脱水、透明：若复染后过蓝，可将切片至于1％盐酸酒精(75％酒精)中分化一下，水冲洗5分钟。(12)切片置入50％酒精中浸泡3分钟；70％酒精中浸泡3分钟；95％酒精中浸泡3分钟；第二缸无水酒精3分钟；第二缸二甲苯中3分钟。(13)封片：滴加少量的中性树脂于切片上，持镊加盖盖玻片，让中性树脂扩散至全部组织切片(此过程中应避免产生气泡)。(14)镜下阅片：应用光学显微镜对组织中的着色情况进行观察。并拍摄照片分别保存为JPG与TIF格式。(15)切片标记：染色日期，一抗名称与浓度，染色条件。染色完成后的在光镜下观察切片，用平均光密度(AOD)量化滑膜组织中的蛋白质表达，并用ImageJ软件进行分析。
ELISA实验检测细胞因子血清水平：取冻存血清，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测大鼠治疗前后相关细胞因子的血清水平。(1)将细胞因子血清ELISA试剂盒置于室温30min后，按照试剂盒中标准品的准备方法制备标准品；(2)分别设置空白孔(不加入任何样品及试剂溶液(作为本底值))、标准品孔、待测样品孔。向板内依次加入100μl标准品或待测样品，加样时不要触及孔壁，将样品加于板孔底部，封板后置于37℃恒温箱孵育2h，弃去板内液体，不洗板；(3)向板内加入100μl生物素标记抗体(1x，10μl生物素标记抗体稀释于90μl生物素标记抗体稀释液)，封板，37℃孵育1h；取板，弃去板内液体后，加入200μl清洗缓冲液(1x，20ml 25x清洗缓冲液稀释于500ml蒸馏水)，静置2min，弃去板内液体，该洗板过程共重复3次；(4)除空白孔外，每孔立即加入50μl HRP-亲和素(1x，10μl HRP-亲和素稀释于990μl亲和素稀释液)，放在摇床上震荡混匀后，置于37℃孵育1h；取板，弃去板内液体，洗板5次；(5)每孔加入90μl TMB底物溶液，37℃避光孵育15-30min；(6)每孔加入50μl终止液，混匀，5min内上机检测，检测波长450nm。(7)根据标准品的吸光值计算、绘制标准曲线，再根据标准曲线及待测样品的吸光值计算待测样品的实际浓度。
Western blot法分析蛋白含量：(1)BCA法蛋白定量：根据BCA蛋白浓度测定试剂盒的操作步骤，配置BCA工作液。在96孔板中加入200ul BCA工作液和20ul待测样品，混合均匀后，在37℃中恒温孵育半小时。然后在562nm波长条件下测试其吸光度值，根据绘制的蛋白浓度-吸光度值标准曲线计算样品中的蛋白浓度。最后使用lysis buffer将所有蛋白浓度按照最低蛋白浓度调整一致。(2)分离胶和浓缩胶的配置：如表2所示，按照上述比例分别配置好分离胶和浓缩胶后，组装电泳槽。用移液枪在电泳槽下层均匀加入7ml分离胶，加入3ml纯水，静置13分钟待下层胶凝固后，弃去上层纯水。再加入3ml浓缩胶，插入齿梳，静置13分钟待上层胶凝固，4℃冰箱保存备用。(3)电泳：在进行电泳之前，将定量好的蛋白样品加入上样缓冲液(5×)在100℃下变性10分钟。取10ul蛋白样品均匀加入上样孔中，每组留一孔加入3ul彩色预染maker。使用220V恒压SDS-PAGE凝胶电泳分离，直至指示剂溴酚蓝到达胶底部时停止电泳。(4)转印：电泳完成后，采用“三明治“法进行转印。将SDS-PAGE胶转移到转膜液中，按照白板(+)→黑网→滤纸→PVDF膜→胶→滤纸→黑板(-)的顺序进行组装，小心排出剩余气泡。置于冰水中，200mA恒流转膜2小时。(5)封闭：转膜完成后，PVDF膜用5％脱脂牛奶室温条件下封闭1小时。封闭完成后，用TBST洗涤PVDF膜三次，每次6分钟。(6)抗体孵育：将一抗(iNOS、COX-2、AKT、P-AKT、PI3K、P-PI3K)按照1:1000的比例用PBST进行稀释，在4℃条件下孵育过夜。次日，根据一抗的反应种属选取合适的二抗，在室温下将PVDF膜在二抗中孵育一小时，再用TBST溶液冲洗三次，每次6分钟。(7)显影：最后用ECL化学发光检测试剂盒检测蛋白条带。使用ImageJ软件量化蛋白条带灰度值，并用GraphPad Prism 8.0.0软件进行作图和显著性分析。
表2分离胶和浓缩胶比例
测试结果：(1)CES对AIA大鼠体重、爪肿和关节炎评分的影响：选择AIA模型观察CES对RA的治疗效果，整个过程如图6A所示。此外，每三天测量一次体重、足趾肿程度和关节炎指数(图6B-D)。注射CFA后，模型组的体重增加减少。然而，经CES(25、50mg/kg)和MTX(0.1mg/kg)治疗后，体重下降的趋势明显被逆转。总之，CES可剂量依赖性地改善AIA大鼠的体重减轻(图6B)。大鼠足趾肿胀程度见图6C。与对照组相比，CFA能够导致大鼠右后脚肿胀和发红。从第14天起，给AIA大鼠口服CES(25、50mg/kg)可缓解大鼠足趾肿胀的程度，其缓解程度呈现时间和剂量依赖性。同时，从第18天起，MTX能够显著改善大鼠足趾肿胀。如图6D所示，对照组大鼠足趾正常，没有发生肿胀。然而，除对照组外，各组大鼠关节炎评分从第0天到第14天均明显升高。随着免疫时间的延长，模型组的关节炎指数明显增加。然而，CES处理组(25、50mg/kg)的关节炎评分连续下降，尤其是50mg/kg剂量。此外，在整个炎症过程中，MTX治疗后的大鼠关节炎评分明显下降。(2)CES对AIA大鼠组织病理学变化的影响：5组大鼠足趾的宏观变化见图7A。结果证实，模型组大鼠的足趾出现红斑和水肿，表明关节炎发展迅速。然而，CFA刺激的大鼠经过CES治疗后，以上这些症状得到缓解。为了进一步研究CES的抗类风湿关节炎作用，运用HE染色法观察了不同组大鼠的踝关节组织(图7B)。对照组的结果显示大鼠踝关节间隙正常，滑膜组织光滑平整，滑膜衬里细胞无炎性细胞浸润和增生。然而，模型组大鼠出现明显的滑膜组织增生并伴有炎性细胞浸润。与模型组相比，CES和MTX治疗后滑膜炎症细胞浸润和滑膜细胞增殖明显减少。此外，高剂量CES(50mg/kg)表现出更好的治疗效果。(3)CES对AIA大鼠血清细胞因子的影响：在体内对大鼠的血清细胞因子进行进一步的监测。结果如图3.2C所示，CFA能显著增加模型组血清细胞因子的生成。与模型组相比，CES(25、50mg/kg)治疗后血清中的上述指标呈剂量依赖性下调。此外，免疫印迹分析结果表明，CES可降低iNOS和COX-2蛋白的表达水平(图7D)。综上所述，CES对过度表达的炎症细胞因子和NO具有抑制作用，尤其高浓度CES下。(4)CES对AIA大鼠关节滑膜中IL-6、IL-8、MMP2和MMP9表达的影响：有大量证据表明，促炎细胞因子和MMPs水平的升高会进一步加重RA的程度。本实验进一步通过免疫组化染色评估大鼠踝关节组织中促炎细胞因子和MMPs的水平(图8)。模型组滑膜细胞和组织中IL-8、IL-6、MMP2和MMP9的表达明显累积。相反，这些靶点的阳性率在CES组和MTX组都有所下降，尤其是在CES高剂量组(50mg/kg)表现出更强的治疗效果。(5)CES对PI3K/AKT通路的影响：分别采用免疫组化染色和Western blot检测PI3K/AKT信号通路，包括PI3K、P-PI3K、Akt和P-Akt蛋白(图9)。结果表明，CFA刺激能显著上调模型组大鼠中PI3K/AKT信号通路的磷酸化水平。然而，经过CES治疗后，P-PI3K/PI3K和P-Akt/Akt在大鼠滑膜组织中的表达水平能够呈剂量依赖性的被抑制。同时，滑膜组织切片的免疫组化染色也观察到了类似的结果。图9A和图9B显示，对照组和实验组的AKT和PI3K总蛋白均无明显变化。然而，在模型组中，P-PI3K和P-AKT蛋白的表达水平很高。相反，在不同剂量的CES中，这些靶点的过度表达均被下调，尤其是在高剂量组(50mg/kg)十分显著。综上所述，研究结果表明，CES可通过抑制PI3K/AKT信号通路的磷酸化水平来减轻RA症状。
综上所述，本发明首先将川牛膝用95％和50％乙醇进行回流提取获得醇提物。采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇对川牛膝醇提物进行萃取，获得四个不同极性的萃取部位。进行细胞毒性和药效筛选后发现，正丁醇层样品表现出明显的抗MH7A细胞恶性增殖的作用。因此，正丁醇层中含有川牛膝抗滑膜细胞恶性增殖的有效部位，采用大孔树脂进一步分离纯化，以期阐明川牛膝中川牛膝抗类风湿关节炎的有效部位。正丁醇层样品粗提物经大孔吸附树脂进行富集，得到不同乙醇洗脱部位的提取物。采用CCK8法对各个组分进行活性筛选，结果发现30％乙醇洗脱部位治疗效果最好。随后使用HPLC法对其进行定性分析。经鉴定发现30％乙醇洗脱部位主要含有川牛膝甾酮类化合物，含有cyasterone(Cya),28-e-cyasterone(28-e-Cya),和cyathsterone C(Cya-C)三个化合物。
体外实验发现川牛膝总甾酮及其化合物能够呈浓度依赖性的抑制MH7A细胞的增殖、迁移和侵袭作用。同时对其炎性因子检测发现，川牛膝总甾酮及其化合物能够有效降低MH7A细胞中炎性因子的水平。其中，50g/ml的川牛膝总甾酮能最有效地减少这些靶标的释放，因此选择川牛膝总甾酮进行后续的体内实验。体内实验结果表明，川牛膝总甾酮可减轻AIA大鼠类风湿关节炎评分和足跖肿胀。此外，川牛膝总甾酮可改善组织病理恶化，抑制PEG2、NO、IL-6、IL-8、iNOS和COX-2的释放。Western blot和免疫组化结果显示，川牛膝总甾酮可以减弱PI3K/AKT信号通路的磷酸化水平。
本发明首次发现川牛膝甾酮类化合物能够显著减轻AIA大鼠的炎症反应、抑制滑膜细胞的增殖，迁移和侵袭等类肿瘤生物学行为、并明显减轻类风湿关节炎的病理损伤，发现并证实川牛膝甾酮类化合物在制备治疗类风湿关节炎的药物中的新用途，同时也为类风湿关节炎治疗提供了一种新的手段。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.川牛膝甾酮类化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物在制备用于治疗和/或预防类风湿关节炎的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述川牛膝甾酮类化合物包括cyasterone、28-epi-cyasterone和cyathsterone C。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述川牛膝甾酮类化合物的制备方法包括以下步骤：
将川牛膝进行粉碎过筛，后进行乙醇回流提取并将所得提取液进行浓缩，得到浸膏；
将所得浸膏溶于有机溶剂中进行萃取，得到有机溶剂萃取物；
将所述有机溶剂萃取物上大孔树脂柱，采用乙醇梯度洗脱液进行梯度洗脱，梯度洗脱至流出液为无色，收集洗脱液并浓缩干燥，得到所述川牛膝甾酮类化合物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述将川牛膝进行粉碎过筛，后进行乙醇回流提取并将所得提取液进行浓缩，得到浸膏的步骤包括以下过程：
将川牛膝药材粉碎成粗粉，所得粗粉过3号筛，得到药材粉末；
在所述药材粉末中加入体积分数为95％的乙醇，按照料液比为1:10的比例，回流提取3次，每次提取2h；提取后的残渣再加入体积分数为50％的乙醇，按照料液比为1:10的比例，回流提取3次，每次提取2h；提取完成后合并提取液，减压浓缩至无醇味，得到所述浸膏。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，萃取有机溶剂包括正丁醇。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述乙醇梯度洗脱液包括体积分数为10％的乙醇和体积分数为30％的乙醇；收集体积分数为30％的乙醇洗脱液浓缩干燥，得到川牛膝总甾酮。
7.根据权利要求1～6任一项所述的用途，其特征在于，所述川牛膝甾酮类化合物具有呈浓度依赖性的抑制MH7A细胞的增殖、迁移和侵袭作用。
8.根据权利要求1～6任一项所述的用途，其特征在于，所述川牛膝甾酮类化合物具有抑制PEG2、NO、IL-6、IL-8、iNOS和COX-2的释放的作用；所述川牛膝甾酮类化合物具有减弱PI3K/AKT信号通路的磷酸化水平的作用。
9.根据权利要求1～6任一项所述的用途，其特征在于，所述药物包括：
(i)有效量的川牛膝甾酮类化合物，或其互变异构体、立体异构体、前药、药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物；
(ii)药用辅料。
10.根据权利要求1～6任一项所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型包括注射制剂、口服制剂、喷雾制剂和冲洗制剂中的至少一种。
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