CN117867087A - 靶核酸检测用引物探针组、试剂、应用和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶核酸检测用引物探针组、试剂、应用和试剂盒，靶核酸含有二级结构，引物探针组包括探针、第一引物和第二引物，第一引物包括靶标序列结合区和第一靶序列结合区，第二引物包括第二靶序列结合区，探针上修饰有检测基团；其中，第一靶序列结合区和第二靶序列结合区能够与靶核酸序列特异性结合；靶标序列结合区用于造成扩增子二级结构的改变；探针用于与其中一条引物扩增得到的扩增子互补配对。本发明在其中一条引物上引入一段能够在正向引物与反向引物分别与靶标序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物的过程中，造成扩增子区域二级结构的改变的靶标序列结合区，从而改善探针与扩增子的杂交效率，大大提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及靶核酸检测用引物探针组、试剂、应用和试剂盒。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)是不采用活的生物体而对DNA进行酶复制的分子生物学技术。PCR通常用于医学和生物研究实验室以承担多种任务，例如：感染性疾病的诊断、基因克隆、实验动物表型鉴定、转录组研究、遗传疾病的检测、基因指纹的鉴定、亲子鉴定等等。由于其无可比拟的复制和精确能力，PCR被分子生物学家认为是核酸检测的首选方法。上世纪90年代后期，美国ABI公司推出的实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR，qPCR)技术及相关产品更是将PCR发展成为一种高灵敏、高特异性和精确定量的核酸序列分析技术。
目前在qPCR平台应用较多的引物探针设计方式主要为TaqMan水解探针法，其工作原理主要是利用了一条能与模板特异性结合且两端分别标记荧光基团(供体)和淬灭基团(受体)的寡核苷酸探针，同时在探针的上游和下游分别设计一条特异性PCR引物。在PCR反应开始之前，由于荧光共振能量转移(FRET)原理，TaqMan探针一端的荧光基团发射的荧光信号被另一端的淬灭基团吸收，从而使得荧光信号不被仪器检测到；而PCR扩增开始后，TaqMan探针与模板特异性结合，当DNA聚合酶(Taq酶)在延伸到探针结合模板的位点时，其5’-3’核酸外切酶活性会将TaqMan探针切断，使得探针上标记的荧光基团远离淬灭基团，不再形成FRET结构，因此荧光基团发射的信号能够被仪器检测到，同时如果我们提升探针杂交链的引物浓度，针对上下游引物浓度做不对称设计，同时提升探针浓度，则可以看到靶标的熔解曲线。
在目前的PCR试验过程中，会存在扩增效率相对较低，灵敏度与特异性相对较差的问题。因此，基于其相对较低的灵敏度，需要更高的起始模板量参与扩增反应，这造成样本的供给需求大大提高。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于在样本需求不变的情况下，克服PCR反应中灵敏度和特异性较差的问题，从而提供一种能够有效提升检测灵敏度的靶核酸检测用引物探针组、试剂、应用和试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供了一种靶核酸检测用引物探针组，所述靶核酸含有二级结构，所述引物探针组包括探针、第一引物和第二引物，所述第一引物包括靶标序列结合区和第一靶序列结合区，所述第二引物包括第二靶序列结合区，所述探针上修饰有检测基团；其中，
所述第一靶序列结合区和所述第二靶序列结合区能够与靶标序列特异性结合；
所述靶标序列结合区用于造成扩增子二级结构的改变；
所述探针用于与其中一条引物扩增得到的扩增子互补配对。
优选地，所述探针的互补配对位置在靶核酸的二级结构处，所述第一引物和第二引物的设计方法具体包括：
S100、在靶核酸上下游位置设计两条扩增引物；
S200、根据靶核酸二级结构及其附近40bp范围内设计多条互补片段；
S300、根据S200的多条互补片段，分别计算出对应的互补片段下的探针与靶核酸结合的ΔG绝对值，选择ΔG绝对值最大的互补片段，即为靶标序列结合区；
S400、将S300筛选的靶标序列结合区与S100其中一条扩增引物连接形成第一引物，另一条扩增引物为第二引物。
优选地，当探针与S300选择的靶标序列结合区有交叉时，靶标序列结合区的交叉区ΔG绝对值大于探针与二级结构的ΔG绝对值。
优选地，所述第一引物的靶标序列结合区与靶核酸结合的位置与靶核酸上的二级结构之间的距离不大于20bp。
优选地，所述第一引物的靶标序列结合区与靶核酸结合的位置与靶核酸上的二级结构之间的距离为0bp-12bp。
优选地，所述第一引物的长度为20bp-80bp，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％，其中，所述第一引物的靶标序列结合区的长度为7bp-20bp；
和/或，所述第二引物的长度为20bp-80bp，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％；
和/或，所述探针的长度为20bp-100bp，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％。
优选地，所述检测基团包括一组配合设置的第一检测基团和第二检测基团，所述第一检测基团与所述第二检测基团间隔3-240埃，优选3-140埃。
优选地，所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为荧光猝灭基团。
本发明还提供了一种靶核酸检测用试剂盒，所述靶核酸含有二级结构，所述靶核酸检测用试剂盒包括如上所述的核酸检测用引物探针组，以及DNA聚合酶和反应缓冲液。
本发明还提供了一种如上述所述的靶核酸检测用引物探针组或如上所述的靶核酸检测用试剂盒在制备靶核酸检测试剂盒中的应用；
所述应用过程具体包括：
S100、采用所述核酸检测用引物探针组特异性地扩增靶标，得到双链扩增产物；
S200、扩增结束后，进行熔解曲线分析，获得荧光信号变化曲线。
优选地，所述扩增过程中的条件为：90℃-96℃预变性5-15分钟，90℃-95℃变性10s-60s，50℃-75℃退火及延伸30s-90s，35-50个循环；
和/或，熔解曲线分析过程中的条件为：于35℃-95℃进行熔解曲线分析，升温速率为0.03℃/s-0.07℃/s。
优选地，所述第一引物的浓度为30nmol/L-1000nmol/L；
和/或，所述第二引物的浓度为30nmol/L-1000nmol/L；
和/或，所述探针的浓度为150nmol/L-1200nmol/L。
优选地，其中一条引物的浓度高于另一条引物的浓度，且所述探针用于与浓度高的引物扩增得到的扩增子互补配对。
本发明还提供了一种用于呼吸道腺病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的靶核酸检测用试剂，其中，所述引物探针组包括：
如SEQ ID No:1所示的探针，如SEQ ID No:3所示的正向引物，以及如SEQ ID No:4所示的反向引物。
优选地，采用的检测基团为荧光报告基团ROX和荧光猝灭基团BHQ2。
本发明还提供了一种用于人表皮生长因子受体基因的L858R突变的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的靶核酸检测用试剂，其中，所述引物探针组包括：
如SEQ ID No:5所示的探针，如SEQ ID No:6所示的正向引物，以及如SEQ ID No:8所示的反向引物。
优选地，采用的检测基团为荧光报告基团FAM和荧光猝灭基团BHQ1。
本发明还提供了一种用于呼吸道合胞病毒的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述的靶核酸检测用试剂，其中，所述引物探针组包括：
所述核酸检测用引物探针组包括如SEQ ID No:9所示的探针，如SEQ IDNo:10所示的正向引物，以及如SEQ ID No:12所示的反向引物。
优选地，采用的检测基团为荧光报告基团HEX和荧光猝灭基团BHQ1。
通过上述技术方案，本发明在其中一条引物上引入一段能够在正向引物与反向引物分别与靶标序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物的过程中，造成扩增子区域二级结构的改变的靶标序列结合区，从而改善探针与扩增子的杂交效率，大大提高检测灵敏度。本发明试剂可以在单管中完成检测，无需借助额外的下游仪器辅助，因此大大降低了检测成本；同时，本发明试剂的样本消耗少，特别适合用于稀有样本的检测。同时也为后续进一步进行免提取一管法检测提供了可能。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1和对比例1的熔解曲线分析图；
图2是实施例2和对比例2的熔解曲线分析图；
图3是实施例3和对比例3的熔解曲线分析图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明中所使用到的专业术语为本领域技术人员常规理解的相应定义。在未作特殊说明的情况下，本领域技术人员能够根据本领域的现有技术对其进行理解。具体地：
本发明所用术语“目标(靶)序列”、“目标(靶)核酸”、“目标(靶)核酸序列”和“所感兴趣的核酸”可互换使用，它们是指将对其进行扩增或者检测或者既扩增又检测的一段目标(靶)区域。目标(靶)序列作为扩增和检测的对象可以是任何核酸。目标(靶)序列可以是RNA、cDNA、基因组DNA，或者来自如一种致病的微生物或病毒的DNA或RNA。目标(靶)序列还可以是经化学试剂、各种酶类以及物理暴露处理过的DNA。一份样品中令人感兴趣的目标(靶)核酸序列可以以单链DNA或RNA如cDNA、mRNA、其他RNA，或以分离的互补链的形式存在。可以通过物理的、化学的或酶学的方法实现目标(靶)核酸互补链的分离。为了便于描述和理解，当提及所感兴趣的核酸或目标(靶)核酸时，既指在一份待测样品中所发现的这些部分，也指这些核酸的部分的扩增拷贝，除非有相反的特别说明。
本发明所用术语“引物”是在模板依赖性过程中能够引导新生核酸合成的核酸。靶标特异性引物是指设计用于引导特定靶核酸合成的引物。引物对是指两条引物，通常称为“正向引物”和“反向引物”或者“上游引物”和“下游引物”，其设计用于扩增模板核酸分子上位于两条引物结合位点之间的靶序列。
本发明中所称的“扩增”是指在核酸序列的混合物中令一种特定核酸序列的浓度升高的任何扩增过程。本发明中所用术语“扩增产物”或“扩增子”，是指在一种扩增方法，如PCR中，利用一对引物，由一种聚合酶扩增出的DNA片段。
本发明中所用术语“与……互补”是指一个核苷酸能与另一个特定的核苷酸碱基配对。即腺苷与尿苷或胸苷互补，鸟苷与胞苷互补。根据本说明书的目的应当认为，尽管在某些情况下胸苷与鸟苷可以碱基配对，亦不应将它们视为互补的。根据本发明的目的，术语“充分互补”是指探针的一条链上大于或等于70％，优选大于80％，更优选大于90％，最优选大于95％或99％的核酸碱基，在一种匹配方式下能在探针的另一条链(或者所感兴趣的核酸)上找到其Watson-Crick结合伴侣，使得相应的核苷酸能够彼此杂交。确定相同或相似的方法在公众可获得的计算机程序中被编码。优选的决定两条序列间相同及相似的计算机程序方法包括，但不限于：在GCG Pileup程序包中可找到的GCG Pileup程序，所述程序使用Needleman和Wunsch算法，以gap creation penalty＝12和gap extension penalty＝4为所述算法的标准缺省值(Devereux等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)12：387-395(1984))，BLASTP，BLASTN，以及FASTA(Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)85：2444-2448(1988))。所述BLASTX程序是从NCBI和其他来源可公开获得的(BLAST手册，Altschul等人，Natl.Cent.Biotechnol.Inf(美国国立生物技术信息中心)，Natl.Library Med.(美国国立医学图书馆)(NCBI NLM)，NIH(美国国家卫生研究院)，Bethesda，MD；Altschul等人，J.MoI.Biol.(分子生物学杂志)215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402(1997)).
本发明中的“ΔG”为吉布斯自由能，其为两个互补的(多/寡)核苷酸链内和之间的所有非共价相互作用的总和，单位为kcal/mol。这个数值越负，探针与目标的结合就越强。例如，双链d(ACGG/CCGT)的ΔG是:ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)+ΔG(CG)+ΔG(GG)。其具体计算方式可以由本领域技术人员根据实际情况针对性地选择其能够理解和使用的任意合适的方式。例如，在本发明中，可以采用如下方式计算：
1、设计互补片段：根据探针和靶核酸的序列，设计互补片段，使得互补片段可以与探针或靶核酸形成额外的氢键；
2、确定反应参数：确定探针、靶核酸和互补片段的反应浓度、反应温度等参数；
3、测量结合信号：通过实验手段，如荧光检测、电泳等方法，测量探针与靶核酸结合的信号；
4、计算结合常数：结合常数是指探针与靶核酸结合的平衡常数，可以通过测量结合信号和已知的反应参数计算得到；
5、计算ΔG：根据结合常数和已知的反应参数，利用热力学方程式计算ΔG的绝对值。
需要说明的是，正如前所述，这里的计算方式并不局限于此，本领域技术人员能够根据实际情况进行相应的选择。
以下对本发明的具体实施例进行进一步的说明。
本发明提供了一种具体的核酸检测用引物探针组的结构示意图，其包括一对引物(正向引物和反向引物)，以及探针。具体地，包括：
正向引物：从5’端至3’端依次包含靶标序列结合区和第一靶序列结合区(需要说明的是，这里包含靶标序列结合区的引物不必须为正向引物)，第一靶序列结合区为靶标特异性序列，能够与靶标序列特异性结合；靶标序列结合区则为一段与第一靶序列结合区不同的特异性序列，用于改变扩增子的二级结构，从而提升产物链(即扩增子)与探针的杂交效率，提升检测的灵敏度。
反向引物：从5’端至3’端为第二靶序列结合区，其中第二靶序列结合区为靶标特异性序列，能够与靶标序列特异性结合。
探针：为一段与靶序列配对结合的序列，在探针的任意位置修饰第一检测基团，在与第一检测基团间隔3-140埃(0-40bp)的位置修饰第二检测基团；其中第一检测基团可以为荧光报告基团，第二检测基团可以为淬灭基团或其它能够与第一检测基团通过荧光共振能量转移(FRET)产生信号变化的修饰基团；第一检测基团和第二检测基团也可以相互调换位置。
在PCR扩增时，正向引物与反向引物分别与靶标序列特异性结合并延伸产生双链预扩增产物，基于靶标序列结合区的引入，从而造成扩增子二级结构的改变。
产生双链扩增子后，探针与扩增子互补配对，进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，探针将在一定温度下解链，此时第一检测基团与第二检测基团之间的距离发生变化，产生信号，可被仪器检测到。
为了进一步提高扩增的特异性和扩增效率，这里进一步对引物对和探针的参数进行限定，具体地：每条引物各自的长度为20bp-80bp，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％；探针的长度为20bp-100bp，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％。
进一步地，每条引物和/或探针的长度各自不大于60bp。
在具体的检测过程中，上述引物对对待测样品(例如，可以为病原)靶标进行特异性扩增时，正向引物和反向引物扩增靶核酸得到双链扩增子产物，探针与其中一条单链扩增子产物反向互补配对。在扩增结束后进行熔解曲线分析，在温度变化的过程中，探针与单链扩增子产物形成的双链产物将在一定温度下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的探针将变为单链状态，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。
基于此，本发明进一步提供了一种核酸检测用试剂盒，其包括上述引物探针组，以及DNA聚合酶和反应缓冲液。当然，根据具体试验的需要，这里的试剂盒中还可以选择性地包括UDG酶。反应缓冲液包括dNTP、镁离子。在整个反应体系中，对核酸模板中的靶标进行特异性扩增以及荧光信号检测。其反应过程具体包括：
步骤一、首先在PCR扩增反应的循环内，正向引物与反向引物可以特异性地扩增靶核酸序列。扩增后，会得双链扩增产物。
步骤二、在PCR扩增结束后，进行熔解曲线分析，探针与单链扩增子形成的双链产物将在一定温度下解链，此时带有第一检测基团与第二检测基团的探针将变为单链状态，使得荧光信号发生变化，可被仪器检测到。
在扩增过程中，其反应条件进一步优选为：90℃-96℃预变性5-15分钟，90℃-95℃变性10s-60s，50℃-75℃退火及延伸30s-90s，35-50个循环。更为优选地，扩增过程的反应条件为：95℃预变性2分钟，94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环。
在进行熔解曲线分析过程中，其反应条件进一步优选为：于35℃-95℃进行熔解曲线分析，升温速率为0.03℃/s-0.07℃/s。更为优选地，于40℃-95℃进行熔解曲线分析，升温速率为0.05℃/s。在上述条件下进行荧光信号的采集。
在整个反应体系中，引物与探针的浓度进一步优选为：正向引物的浓度为30nmol/L-500nmol/L，反向引物的浓度为30nmol/L-1000nmol/L，探针的浓度为150nmol/L-1200nmol/L。
以下通过具体实施例对本发明的方案进行详细的说明。在本发明中，使用的标准样品(本发明中主要为抗原)质粒、引物探针组均由通用生物(安徽)股份有限公司合成并提供。荧光检测采用上海宏石医疗科技有限公司SLAN实时荧光定量PCR仪进行检测。以下表1为本发明实施例的反应体系，整个反应体系的总体积为25μL。
表1
| 试剂组分 | 浓度 |
| 2×PCR Reaction Buffer | 1× |
| DNA Polymerase | 3U |
| 探针 | 400nM |
| 正向引物 | 100nM |
| 反向引物 | 500nM |
| 核酸模板 | 50拷贝 |
| 超纯水 | 补齐至25μL |
其中，2X PCR Reaction Buffer至少包括：3mmol/L的MgCl2、pH为8.3的30mmol/L的Tris-HCl、0.5mmol/L的dNTP和70mmol/L的(NH4)2SO4。
实施例1、呼吸道腺病毒(ADV)的检测
按照表1所示的反应体系配制于PCR管中。其中，探针序列如SEQ IDNo:1所示，正向引物序列如SEQ ID No:3所示，反向引物序列如SEQ ID No:4所示。核酸模板为呼吸道腺病毒(ADV)质粒，定量并稀释后按50拷贝/反应与反应体系混合。上述引物和探针序列具体如表2所示：
表2
其正向引物中5’端的第1-19个碱基为靶标序列结合区，3’端的第1-20个碱基为第一靶序列结合区。
其中，探针的3’端修饰有ROX，5’端修饰有BHQ2。
将配制好的PCR管盖封好后轻轻混匀样本，然后短暂离心后置于室温中静置5min。再次将PCR管置于掌上离心机中，短暂离心后转移到荧光定量PCR仪的托盘中。所使用程序为：95℃预变性3分钟；94℃变性10秒，56℃退火延伸30秒，共进行45个循环；45-85℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光。得到的结果如图1所示，其中，实施例1对应图1中峰值位于上方的熔解曲线。
实施例2、人表皮生长因子受体基因(EGFR)突变(L858R)的检测
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，探针序列如SEQ ID No:5所示，正向引物序列如SEQ ID No:6所示，反向引物序列如SEQ ID No:8所示。核酸模板为人表皮生长因子受体基因(EGFR)突变(L858R)型质粒，定量并稀释后按50拷贝/反应与反应体系混合。采用45-85℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光。上述引物和探针序列具体如表3所示：
表3
其反向引物中5’端的第1-10个碱基为靶标序列结合区，3’端的第1-20个碱基为第一靶序列结合区。
其中，探针的3’端修饰有FAM，5’端修饰有BHQ1。
得到的结果如图2所示，其中，实施例2对应图2中峰值位于上方的熔解曲线。
实施例3、呼吸道合胞病毒(RSV)的检测
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，探针序列如SEQ ID No:9所示，正向引物序列如SEQ ID No:10所示，反向引物序列如SEQ ID No:12所示。核酸模板为呼吸道合胞病毒(RSV)质粒，定量并稀释后按50拷贝/反应与反应体系混合。采用45-85℃熔解曲线分析，升温速率为每秒0.05℃，采光。上述引物和探针序列具体如表4所示：
表4
其反向引物中5’端的第1-10个碱基为靶标序列结合区，3’端的第1-20个碱基为第一靶序列结合区。
其中，探针的3’端修饰有HEX，5’端修饰有BHQ1。
得到的结果如图3所示，其中，实施例3对应图3中峰值位于上方的熔解曲线。
对比例1、呼吸道腺病毒(ADV)的检测
按照实施例1的方法进行操作，不同的是，其正向引物序列如SEQ IDNo:2所示，即仅含有实施例1中的第一靶序列结合区。引物序列具体如下所示：
SEQ ID No:2：5’-ACTGACAGCGGCGCGCTCCG-3’。
得到的结果如图1所示，其中，对比例1对应图1中峰值位于下方的熔解曲线。
对比例2、人表皮生长因子受体基因(EGFR)突变(L858R)的检测
按照实施例2的方法进行操作，不同的是，其反向引物序列如SEQ IDNo:7所示，即仅含有实施例2中的第一靶序列结合区。引物序列具体如下所示：
SEQ ID No:7：5’-CCTTCTGCATGGTATTCTTT-3’。
得到的结果如图2所示，其中，对比例2对应图2中峰值位于下方的熔解曲线。
对比例3、呼吸道合胞病毒(RSV)的检测
按照实施例3的方法进行操作，不同的是，其反向引物序列如SEQ ID No:11所示，即仅含有实施例3中的第一靶序列结合区。引物序列具体如下所示：
SEQ ID No:11:5’-CAGTAACTGCCAGTCTATTG-3’。
得到的结果如图3所示，其中，对比例3对应图3中峰值位于下方的熔解曲线。
通过图1可以看出，对比例1在对照孔出现Tm值为69°的阳性熔解峰，而实施例1不仅在同一位置出现熔解峰，且峰高有了明显的提升；图2中，对比例2在对照孔出现Tm值为49.5°的阳性熔解峰，而实施例2不仅在同一位置出现熔解峰，且峰高有了明显的提升；图3中，对比例3在对照孔出现Tm值为70.5°的阳性熔解峰，而实施例3不仅在同一位置出现熔解峰，且峰高有了明显的提升。
综上可以看出，本发明提出的核酸检测用引物探针组在检测中对扩增子区域存在二级结构的情况，能够有效地改变二级结构，从而改善探针与扩增子的杂交效率，大幅提升灵敏度；其在检测过程中具有强的特异性，能够有效实现针对性检测；整个检测过程只需要通过荧光定量PCR反应即可在单管反应中完成，操作简便，大大降低检测成本，且对样本消耗少，为后续进行免提取一管法检测提供了可能性；进一步地，操作过程对样本类型无特殊要求，因此，其适用于多种样本类型的检测，适用范围广泛。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (10)
1.一种靶核酸检测用引物探针组，所述靶核酸含有二级结构，其特征在于，所述引物探针组包括探针、第一引物和第二引物，所述第一引物包括靶标序列结合区和第一靶序列结合区，所述第二引物包括第二靶序列结合区，所述探针上修饰有检测基团；其中，
所述第一靶序列结合区和所述第二靶序列结合区能够与靶核酸序列特异性结合；
所述靶标序列结合区用于造成扩增子二级结构的改变；
所述探针用于与其中一条引物扩增得到的扩增子互补配对。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针的互补配对位置在靶核酸的二级结构处，所述第一引物和第二引物的设计方法具体包括：
S100、在靶核酸上下游位置设计两条扩增引物；
S200、根据靶核酸二级结构及其附近40bp范围内设计多条互补片段；
S300、根据S200的多条互补片段，分别计算出对应的互补片段下的探针与靶核酸结合的ΔG绝对值，选择ΔG绝对值最大的互补片段，即为靶标序列结合区；
S400、将S300筛选的靶标序列结合区与S100其中一条扩增引物连接形成第一引物，另一条扩增引物为第二引物；
优选地，当探针与S300选择的靶标序列结合区有交叉时，靶标序列结合区的交叉区ΔG绝对值大于探针与二级结构的ΔG绝对值。
3.根据权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，所述第一引物的靶标序列结合区与靶核酸结合的位置与靶核酸上的二级结构之间的距离不大于20bp；
优选地，所述第一引物的靶标序列结合区与靶核酸结合的位置与靶核酸上的二级结构之间的距离为0bp-12bp；
更为优选地，所述第一引物的长度为20bp-80bp，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％，其中，所述第一引物的靶标序列结合区的长度为7bp-20bp；
和/或，所述第二引物的长度为20bp-80bp，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％；
和/或，所述探针的长度为20bp-100bp，Tm值为40℃-80℃，GC含量40％-80％。
4.根据权利要求1或2所述的引物探针组，其特征在于，所述检测基团包括一组配合设置的第一检测基团和第二检测基团，所述第一检测基团与所述第二检测基团间隔3-240埃，优选3-140埃；
优选地，所述第一检测基团为荧光报告基团，所述第二检测基团为荧光猝灭基团。
5.一种靶核酸检测用试剂，所述靶核酸含有二级结构，其特征在于，所述靶核酸检测用试剂包括如权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组，以及DNA聚合酶和反应缓冲液。
6.一种如权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组或如权利要求5所述的靶核酸检测用试剂在制备靶核酸检测试剂盒中的应用；
所述应用过程具体包括：
S100、采用所述引物探针组特异性地扩增靶标，得到双链扩增产物；
S200、扩增结束后，进行熔解曲线分析，获得荧光信号变化曲线；
优选地，所述扩增过程中的条件为：90℃-96℃预变性5-15分钟，90℃-95℃变性10s-60s，50℃-75℃退火及延伸30s-90s，35-50个循环；
和/或，熔解曲线分析过程中的条件为：于35℃-95℃进行熔解曲线分析，升温速率为0.03℃/s-0.07℃/s。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述第一引物的浓度为30nmol/L-1000nmol/L；
和/或，所述第二引物的浓度为30nmol/L-1000nmol/L；
和/或，所述探针的浓度为150nmol/L-1200nmol/L；
优选地，其中一条引物的浓度高于另一条引物的浓度，且所述探针用于与浓度高的引物扩增得到的扩增子互补配对。
8.一种用于呼吸道腺病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求5所述的靶核酸检测用试剂，其中，所述引物探针组包括：
如SEQ ID No:1所示的探针，如SEQ ID No:3所示的正向引物，以及如SEQ ID No:4所示的反向引物；
优选地，采用的检测基团为荧光报告基团ROX和荧光猝灭基团BHQ2。
9.一种用于人表皮生长因子受体基因的L858R突变的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求5所述的靶核酸检测用试剂，其中，所述引物探针组包括：
如SEQ ID No:5所示的探针，如SEQ ID No:6所示的正向引物，以及如SEQ ID No:8所示的反向引物；
优选地，采用的检测基团为荧光报告基团FAM和荧光猝灭基团BHQ1。
10.一种用于呼吸道合胞病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求5所述的靶核酸检测用试剂，其中，所述引物探针组包括：
所述核酸检测用引物探针组包括如SEQ ID No:9所示的探针，如SEQ IDNo:10所示的正向引物，以及如SEQ ID No:12所示的反向引物；
优选地，采用的检测基团为荧光报告基团HEX和荧光猝灭基团BHQ1。
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