JP2021170975A - アデノ随伴ウイルスベクターを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび当該プライマーを用いた前記ベクターの検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを迅速、高感度に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いた前記ベクターの特異的検出方法を提供すること。【解決の手段】 ＡＡＶベクターの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを最適化することで、前記課題を解決する。【選択図】 なし

Description

本発明は、アデノ随伴ウイルスベクターを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよび当該プライマーを用いた前記ベクターの特異的検出方法に関する。

遺伝子疾患の治療において、当該治療のための遺伝子を含むウイルスベクターを用いて細胞に導入する方法が、当該細胞への導入効率がよい点で広く用いられている。ウイルスベクターの中でもアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ＡＡＶ自体に病原性がなく、当該ベクターに挿入した遺伝子を効率よく非分裂細胞に導入でき、かつ導入した遺伝子の発現が長期間持続するため、近年特に注目されている（非特許文献１）。

ＡＡＶはゲノムがカプシドタンパク質に内包された直径２０ｎｍから２６ｎｍの粒子である。ＡＡＶのゲノムは４．７ｋｂの線状の一本鎖ＤＮＡであり、その３’末端側および５’末端側には逆位反復（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ、以下ＩＴＲと略記）配列と呼ばれるＴ字型のループ構造が存在する。遺伝子治療用のＡＡＶベクターとして前記ゲノムを用いる際は、前記ゲノムの両末端側にあるＩＴＲ配列に挟まれたＲｅｐ遺伝子とＣａｐ遺伝子を、遺伝子を導入したい組織に特異的なプロモーター配列、遺伝子治療に用いる遺伝子、ポリＡシグナル配列などに置換する。

ＡＡＶベクターの製造は、前述した方法で遺伝子治療に用いる遺伝子に置換したＡＡＶゲノムと、Ｒｅｐ遺伝子とＣａｐ遺伝子を含むベクター、およびアデノウイルスやヘルペスシンプレックスウイルスなどのヘルパーウイルスとを、宿主細胞（ＨＥＫ２９３細胞やＨｅＬａ細胞など）へ同時にトランスフェクションし製造する。なお近年では、前記ヘルパーウイルスの代わりに、より安全性の高い、アデノウイルスの複製遺伝子をクローニングしたＡｄｖヘルパープラスミドを用いた方法も行なわれている。

前述した方法で製造したＡＡＶベクターの中には、遺伝子治療に必要なＡＡＶゲノムがないベクター（いわゆる空ベクター）も存在する。したがって、産生したＡＡＶベクターを遺伝子治療に用いるためには、当該ベクター中に前記ＡＡＶゲノムが存在するかの確認や、ＡＡＶベクターを含む試料（細胞培養液など）中に含まれるＡＡＶゲノムの定量が必要とされている。

ＡＡＶベクター中に含まれるＡＡＶゲノムの定性的および／または定量的測定法として、透過型電子顕微鏡によるＡＡＶベクター粒子の画像解析や、分析超遠心法や、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法や、デジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）法や、ドットブロット法や、電気泳動法が知られている。これらのうちｑＰＣＲ法は、操作の簡便性や迅速性から、ＡＡＶベクターの定量に広く用いられている。しかしながら、ｑＰＣＲ法と電気泳動法など他の方法とで定量結果に相関性がとれない点や、測定の対象とする遺伝子領域によっても定量結果が異なる点などの問題があった（非特許文献２から４、ならびに特許文献１および２）。またｑＰＣＲ法やｄｄＰＣＲ法といったＰＣＲを利用した方法は、急激に反応温度を昇降させる必要があるため、自動化の際、反応工程の省力化や反応装置の低コスト化の点で問題があった。

反応工程の省力化や反応装置の低コスト化が比較的容易な核酸増幅方法として、比較的低温（例えば４０℃から５０℃の範囲）の一定温度で核酸増幅が可能な、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法が知られている。これら増幅法は通常一本鎖ＲＮＡを標的核酸とした増幅法であるが、反応系を工夫することでＤＮＡの増幅も可能である。

例えば特許文献３には、ＴＲＣ法によるＲＮＡ増幅で用いる酵素群およびプライマーセット、ならびに鎖置換酵素および／または増幅した核酸を一本化するためのプライマーを含む試薬を用いた、Ｂ型肝炎ウイルス核酸の増幅を開示している。しかしながら、ＡＡＶゲノムといった、末端に相補領域を有した一本鎖核酸の増幅については、特許文献３を含め、これまで開示がない。

特開２００３−２３５５６２号公報 ＷＯ２０１５／０８０２２３号 特開２０１５−１１６１３６号公報

小澤敬也、ウイルス、５７（１）、４７−５６（２００７） Ｐ．Ｆａｇｏｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｂ、２３、１−７（２０１２） Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５、１１５−１２５（２０１４） Ｓ．Ｄ’Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ５、１６０１９（２０１６）

本発明の課題は、アデノ随伴ウイルスベクターを迅速、高感度に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマー、および当該プライマーを用いた前記ベクターの特異的検出方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを迅速、高感度に増幅可能なオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせ（プライマーセット）を見出し、本発明を完成するにいたった。

すなわち本発明の第一の態様は、
ＡＡＶベクターの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
第一のプライマーが、配列番号５８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号５９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
前記プライマーセットである。

また本発明の第二の態様は、
第一のプライマーが、配列番号６０に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１０塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号６１に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１０塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
前記第一の態様に記載のプライマーセットである。

また本発明の第三の態様は、
第一のプライマーが、配列番号１１から３１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
第二のプライマーが、配列番号３２から３４および３６から５０のいずれかに記載の塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
前記第二の態様に記載のプライマーセットである。

また本発明の第四の態様は、第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、前記第一から第三の態様のいずれかに記載のプライマーセットである。

さらに本発明の第五の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した、特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なプローブを用いて、ＡＡＶベクターを検出する方法である。

また本発明の第六の態様は、プローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号５１もしくは５２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、前記第五の態様に記載の方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において特定塩基配列とは、ＡＡＶベクターのうち、第一のプライマーとの相補領域の３’末端から第二のプライマーとの相同領域の５’末端までの塩基配列のことをいう。すなわち本発明では前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が増幅されることになる。

本発明における「ストリンジェントな条件」の例としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性（例えば、同一性や類似性）が高いポリヌクレオチド同士、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより低い相同性を示すポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件である。限定されないが、具体的には、ハイブリダイゼーション条件として、４２℃において、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（商品名）、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムが存在する条件や、本明細書の実施例に記載の核酸増幅条件があげられる。また、洗浄条件として、６０℃、１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ等のストリンジェントな条件に相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件等が挙げられる。さらに、当業者であれば、本明細書の記載、および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｗｏｏｄｂｕｒｙ， ＮＹ （２００１））等を参照し、本発明の第一のプライマー（配列番号５８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）、および、本発明の第二のプライマー（配列番号５９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド）を容易に取得することができる。

本発明は、ＡＡＶベクターの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーとして、配列番号５８に記載の塩基配列（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５６０番目から１６５０番目までの塩基配列）とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとして、配列番号５９に記載の塩基配列（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１３５６番目から１５１６番目までの塩基配列の相補配列）とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いることを特徴としている。すなわち、前述したストリンジェントな条件下で、これら塩基配列と、十分に特異的かつ高効率にハイブリダイゼーション可能であれば、塩基配列の置換、欠失、付加、修飾があってもよい。プライマーの長さは任意に設定できるが、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１２塩基から４５塩基までの範囲、さらにより好ましくは１３塩基から４３塩基までの範囲である。

配列番号５８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号６０に記載の塩基配列（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５６０番目から１６５０番目までの塩基配列の相補配列）中、少なくとも連続する１０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。さらに具体的な例として、
配列番号１１（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６３３番目から１６５０番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１２（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６３２番目から１６４９番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１３（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６３１番目から１６４８番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１４（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６３０番目から１６４７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１５（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６２５番目から１６４２番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１６（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６２０番目から１６３７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１７（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６１５番目から１６３２番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１８（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６１０番目から１６２７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号１９（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６００番目から１６１７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２０（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５９５番目から１６１２番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２１（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５９１番目から１６０８番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２２（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５９０番目から１６０７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２３（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５８５番目から１６０２番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２４（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５８０番目から１５９７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２５（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５７５番目から１５９２番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２６（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５６０番目から１５７７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２７（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５９５番目から１６３７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２８（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６００番目から１６３７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号２９（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６１０番目から１６３７番目までの塩基配列の相補配列）、
配列番号３０（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６１５番目から１６３７番目までの塩基配列の相補配列）および、
配列番号３１（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１６２５番目から１６３７番目までの塩基配列の相補配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

配列番号５９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの一例として、配列番号６１に記載の塩基配列（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１３５６番目から１５１６番目までの塩基配列）中、少なくとも連続する１０塩基からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。さらに具体的な例として、
配列番号３２（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４９９番目から１５１６番目までの塩基配列）、
配列番号３３（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４７９番目から１４９６番目までの塩基配列）、
配列番号３４（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４２９番目から１４４６番目までの塩基配列）、
配列番号３６（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１３５６番目から１３７３番目までの塩基配列）、
配列番号３７（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１３７４番目から１３９１番目までの塩基配列）、
配列番号３８（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１３７０番目から１３８７番目までの塩基配列）、
配列番号３９（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１３９２番目から１４０９番目までの塩基配列）、
配列番号４０（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１３９１番目から１４０８番目までの塩基配列）、
配列番号４１（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４１０番目から１４２７番目までの塩基配列）、
配列番号４２（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４１３番目から１４３０番目までの塩基配列）、
配列番号４３（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４２８番目から１４４５番目までの塩基配列）、
配列番号４４（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４４６番目から１４６３番目までの塩基配列）、
配列番号４５（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４５９番目から１４７６番目までの塩基配列）、
配列番号４６（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４２９番目から１４６６番目までの塩基配列）、
配列番号４７（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４２９番目から１４６１番目までの塩基配列）、
配列番号４８（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４２９番目から１４５６番目までの塩基配列）、
配列番号４９（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４２９番目から１４５１番目までの塩基配列）および、
配列番号５０（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４２９番目から１４４１番目までの塩基配列）に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセット（前記第一のプライマーと前記第二のプライマーとの組み合わせ）は、ＰＣＲ法など当業者が通常用いる核酸増幅法を利用したＡＡＶベクターの特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットとして有用である。なお第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターをさらに付加させると、前記プロモーターに対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを付加した特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸が合成されるため、これら核酸から、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法といった一定温度でＲＮＡを増幅する方法により、ＲＮＡを増幅できる点で好ましい。プライマーの５’末端側に付加するプロモーターは、ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼ（例えば、分子生物学の分野で汎用される、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）に対応したプロモーターを用いればよい。また前記プロモーターに、転写効率に影響を及ぼすことが知られている転写開始領域をさらに付加してもよい。ＲＮＡ増幅に用いるＲＮＡポリメラーゼとしてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたときの、プライマーの５’末端側に付加するプロモーター（Ｔ７プロモーター）の具体例として、配列番号５７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

本発明のプライマーセットを用いて増幅したＡＡＶベクターの特定塩基配列またはその相補配列を含む核酸の検出は、従来から知られた核酸検出方法を利用することができる。具体的には、
（Ａ）電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、
（Ｂ）検出可能な標識で標識された、前記核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーション法、
（Ｃ）前記核酸の一部とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることで蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた方法、
などがあげられる。中でも前記（Ｃ）の方法は、前記核酸の増幅および検出を一段階かつ密閉容器内で行なえる点で好ましい。

前記（Ｃ）の蛍光色素標識プローブの一例として、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した蛍光標識プローブや、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、ＴａｑＭａｎ（商品名）プローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブがあげられる。

前記プローブを構成するオリゴヌクレオチドの好ましい例として、配列番号５１（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１４７７番目から１４９２番目までの塩基配列）に記載の塩基配列もしくは配列番号５２（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列のうち、１５９０番目から１６０５番目までの塩基配列）に記載の塩基配列またはそれら塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドがあげられる。さらに具体的な例として、配列番号５１もしくは５２に記載の塩基配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。

なお配列番号５１は配列番号６１（すなわち第二のプライマーの領域）に、配列番号５２は配列番号５８（すなわち第一のプライマーの領域）に、それぞれ含まれる。したがって、
第一のプライマーとして、配列番号５２よりも５’末端側にあるオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号２３から２６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を用いる場合は、前記プローブを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号５１に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを用いればよく、
第二のプライマーとして、配列番号５１よりも３’末端側にあるオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号３２または３３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を用いる場合は、前記プローブを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号５２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを用いればよい。

本発明のプライマーセットを用いてＡＡＶベクターを検出するには、例えば以下の（１）から（８）に示す工程により実施すればよい。
（１）ＡＡＶベクター核酸のうち、第一のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記核酸に相補的なＤＮＡを合成する工程
（２）鎖置換活性を有する酵素を用いて、前記（１）で合成したＤＮＡを３’末端側に相補領域を有した一本鎖ＤＮＡとする工程
（３）第二のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素と、鎖置換活性を有する酵素とを用いて、前記核酸に相同的なＤＮＡを合成する工程
（４）第二のプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素とを用いて、第一のプライマーおよび第二のプライマーのうちいずれか一方が有するＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を付加した前記（３）で合成したＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを合成する工程
（５）前記プロモーター配列に対応したＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記（４）で合成した二本鎖ＤＮＡからＲＮＡ転写産物を合成する工程
（６）第一のプライマーおよび第二のプライマーのうち前記ＲＮＡ転写産物と相補的な配列を有したプライマーと、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を用いて、前記ＲＮＡ転写産物に相補的なｃＤＮＡを合成する工程
（７）リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を用いて、前記ｃＤＮＡを一本鎖ＤＮＡとする工程
（８）前記（７）で得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として、連続的にＲＮＡ転写産物を合成する工程。

前記（１）、（３）および（４）の工程で用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、前記（６）の工程で用いるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、および前記（７）の工程で用いるリボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素は、それぞれ別個あるいは種々の組合せで添加してもよいが、前記活性を併せ持つレトロウイルス由来の逆転写酵素を使用すると好ましい。前記逆転写酵素の一例として、分子生物学の分野で汎用される、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＭＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＲＡＶ（Ｒｏｕｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素があげられる。中でもＡＭＶ逆転写酵素およびその誘導体が特に好ましい。なおこれら逆転写酵素は単独で使用してもよく、２種以上組み合わせて使用してもよい。各酵素の反応系への添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。

前記（２）および（３）の工程で用いる鎖置換活性を有する酵素は、鋳型となる二本鎖ＤＮＡの水素結合を自ら解離しつつ、新しいＤＮＡ鎖を合成する酵素のことをいう。なお、前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素が鎖置換活性を有する酵素としても機能するものであれば、これらの活性を併せ持つ酵素を、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよび鎖置換活性を有する酵素として、使用してもよい。鎖置換活性を有する酵素の一例として、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７またはＴ５バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ ＤＮＡポリメラーゼ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、９６−７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼがあげられる。中でも９６−７ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。またヘリカーゼも、鎖置換効果、すなわち、同じ配列の核酸合成と結びつけられた核酸の置換を生じることから、本発明における鎖置換活性を有する酵素として用いることができる。さらにＲｅｃＡや一本鎖結合蛋白質も、本発明における鎖置換活性を有する酵素として用いることができる。なおこれら逆転写酵素は単独で使用してもよく、２種以上組み合わせて使用してもよい。鎖置換活性を有する酵素の添加量は、本明細書の記載および公知の核酸増幅技術を参照し、反応系に応じ適宜決定すればよい。

前述した態様によるＡＡＶベクター検出方法における反応温度は、使用する各酵素の耐熱性や活性、ならびにプライマー／プローブのＴｍ等に依存するが、使用する酵素がＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよび９６−７ ＤＮＡポリメラーゼであり、プライマー／プローブの長さが１３塩基から４３塩基の範囲である場合は、３５℃から６５℃の範囲で反応温度を設定すればよく、４０℃から５０℃の範囲で設定するとより好ましい。

本発明のプライマーセットは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに特異的な配列（特定塩基配列）およびその相補配列の一部にそれぞれハイブリダイスすることにより、ＡＡＶベクターの特定塩基配列またはその相補配列を迅速、高感度に増幅できる。

本発明のプライマーセットを用いたＡＡＶベクター検出法により、当該ベクターを迅速、高感度、かつ特異性高く検出できる。

以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の実施の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。

実施例１ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターモデル一本鎖ＤＮＡの調製
ＡＡＶベクターモデル一本鎖ＤＮＡ（以下、単に「ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡ」とも表記する）を、Ｌｏｎｇ ｓｓＤＮＡ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ ３．０ ｋｂ（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を用いて下記の方法で合成した。

（１）鋳型として前記キット付属のｐＬＳＯＤＮ−３（配列番号３）を、プライマーとして配列番号１および２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、ＰＣＲにより核酸増幅した。具体的には、以下の組成からなる反応液を滅菌水で２０μＬとなるようＰＣＲチューブ１６本それぞれに調製し、９８℃で２分間加熱後、９８℃で１０秒−６５℃で５秒−７２℃で３５秒のサイクルを４０回行ない、その後７２℃で１分間加熱することでＰＣＲを実施した。

反応液の組成：
１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ製）
０．２μＭ プライマー（配列番号１）
０．２μＭ プライマー（配列番号２）
１ｎｇ 鋳型（配列番号３）
（２）得られたＰＣＲ産物を、０．８％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いた電気泳動に供し、ＰＣＲ産物に相当するバンドを切り出し後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて精製した。

（３）鋳型としてｐＡＡＶ−ＣＭＶ（配列番号４）を、プライマーとして配列番号６および配列番号７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、ＰＣＲにより核酸増幅した。具体的には、以下の組成からなる反応液を滅菌水で２０μＬとなるようＰＣＲチューブ８本それぞれに調製し、９８℃で２分間加熱後、９８℃で１０秒−６０．４℃で５秒−７２℃で１２秒のサイクルを４０回行ない、その後７２℃で１分間加熱することでＰＣＲを実施した。増幅したＰＣＲ産物は、前記（２）と同様な方法で精製した。

反応液の組成：
１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ製）
０．２μＭ Ｆプライマー（配列番号６）
０．２μＭ Ｒプライマー（配列番号７）
１ｎｇ 鋳型（配列番号４）
（４）プライマーとして配列番号８および５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記（３）と同様な方法でＰＣＲを実施した。増幅したＰＣＲ産物は、前記（２）と同様な方法で精製した。

（５）鋳型として前記（４）で得られた精製ＰＣＲ産物を、プライマーとして配列番号９および１０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、前記（３）と同様な方法でＰＣＲを実施した。増幅したＰＣＲ産物は、前記（２）と同様な方法で精製した。

（６）前記（１）、前記（３）および前記（５）で得られた精製ＰＣＲ産物を混合後、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ試薬（タカラバイオ製）を用いて以下に示す方法でプラスミドを合成した。本方法により目的のインサート（ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡ）が含まれていたプラスミドを得た。
（６−１）Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｅｎｚｙｍｅ（タカラバイオ製）を前記精製ＰＣＲ混合溶液に添加し、５０℃で１５分間反応後、その一部で大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（６−２）カルベニシリンナトリウムを含む寒天培地に塗布し、３７℃で一昼夜培養した。（６−３）コロニーダイレクトＰＣＲにより目的のインサートを含むコロニーを再度培養し、プラスミドを抽出後、塩基配列を解析し、目的のインサートが含まれていることを確認した。インサート（ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡ）の塩基配列を配列番号５６に示す。

（７）前記（６）で得られた各プラスミドを、ニッキング酵素Ｎｔ ＢｓｐＱＩおよびＮｂ ＢｓｒＤＩ（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）を用いて、インサート部位にニックを挿入した。

（８）エタノール沈殿後、Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ Ｇｅｌ−Ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製）を添加し、一本鎖ＤＮＡを遊離した状態で、アガロースゲル電気泳動により泳動した。一本鎖ＤＮＡと思われるバンドを切り出し、ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを得た。

（９）前記（８）で得られた一本鎖ＤＮＡを、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いて吸光度測定により濃度を求め、塩基長から疑似コピー数を算出した。

実施例２ ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡのｑＰＣＲによるコピー数算出
（１）ＡＡＶｐｒｏ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（タカラバイオ製）に含まれるＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌを標準濃度として、実施例１で調製したＡＡＶ一本鎖ＤＮＡ溶液の濃度をｑＰＣＲで算出した。具体的には、下記組成からなる反応液１８μＬに対し、各種濃度に希釈した前記Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ、および前記一本鎖ＤＮＡまたはプラスミドを２μＬ添加し、２５℃で２分−５３℃で１０分−９５℃で２分加熱後、９５℃で３秒−６０℃で３０秒のサイクルを４０回繰り返す条件でｑＰＣＲを実施した。

反応液の組成：２０μＬ中の最終濃度
ＴａｑＰａｔｈ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
９００ｎＭ プライマー（配列番号１６）
９００ｎＭ プライマー（配列番号３４）
２５０ｎＭ ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号５２）
（２）前記Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌの検量線より、前記一本鎖ＤＮＡやプラスミドの濃度を算出した。以降の実施例においてコピー数は、本実施例で算出したコピー数を使用している。

実施例３ ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡの検出（ＴａｑＭａｎプローブ使用）
実施例１で調製し、実施例２で濃度決定した、ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡ溶液を試料とし、当該試料中に含まれる前記一本鎖ＤＮＡを、ＴＲＣ法による増幅とＴａｑＭａｎプローブによる検出を試みた。

（１）前記ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡ溶液（以下、「ＮＳ３溶液」とも表記する）を、０．０１％（ｗ／ｖ）コール酸ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）バッファーを用いて３×１０^４コピー／２μＬとなるように希釈し、これをＤＮＡ試料とした。

（２）以下の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ製）に分注した後、前記（１）で調製したＤＮＡ試料２μＬを添加した。なお本明細書の実施例において、第一のプライマーは、その５’末端側にＴ７プロモーターである、配列番号５７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを付加している。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
６７ｍＭ トレハロース
５０ｎＭ ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号５１または５２）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号１４から１６および２１のいずれか）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号３２から３５のいずれか）
１．３３Ｕ ９６−７ ＤＮＡポリメラーゼ
４．３Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
９５Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。

開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１９．０ｍＭ 塩化マグネシウム
９５．０ｍＭ 塩化カリウム
３．８％（ｗ／ｖ） Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
１０．５％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。

（５）開始剤添加時を０分として、３０分後の反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）と、同様な条件で陰性コントロール（０コピー）を測定したときの蛍光強度比との差が０．３を超えたとき、検出可と判定した。

結果を表１に示す。第一のプライマーが配列番号１４から１６および２１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３２から３４のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、プライマーセットを用いることで、３×１０^４コピー／ｔｅｓｔのＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを増幅できた。一方、第二のプライマーとして配列番号３５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いると、３×１０^４コピー／ｔｅｓｔのＡＡＶ一本鎖ＤＮＡは増幅できなかった。なおＴａｑＭａｎプローブを構成するオリゴヌクレオチドは、配列番号５１および５２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、いずれを用いても増幅したＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを特異的に検出した。

実施例４ ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡの検出（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ使用、その１）
（１）ＮＳ３溶液を、０．０１％（ｗ／ｖ）コール酸ナトリウムおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＴＥバッファーを用いて、３×１０^４コピー／２μＬまたは３×１０^３コピー／２μＬとなるように希釈し、これらをＤＮＡ試料とした。

（２）以下の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、前記（１）で調製したＤＮＡ試料２μＬを添加した。なおＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブを構成する、配列番号５３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号５１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの両末端に、ステムループ構造を形成させるためのオリゴヌクレオチド（５’末端側６塩基、３’末端側７塩基）を付加させたものである。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各３．０ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
３．４ｍＭ ＩＴＰ
６７ｍＭ トレハロース
１００ｎＭまたは７５ｎＭ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ（配列番号５３、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号１４から１６および２１のいずれか）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号３４または３５）
１．３３Ｕ ９６−７ ＤＮＡポリメラーゼ
４．３Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
９５Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、実施例３（３）に記載の組成からなる開始剤８μＬを添加した。

（４）実施例３（４）と同様の方法で３０分間測定し、実施例３（５）と同じ基準で検出の可／不可を判定した。

結果を表２に示す。なお表２において「±（一部検出）」は、複数回測定し、その結果の一部で「検出可」と判定されたことを示している。検出用プローブを、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号５１、実施例３）からＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ（配列番号５３）に変えても、増幅した３×１０^４コピー／ｔｅｓｔのＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを特異的に検出した。なおプライマーセットとして、配列番号１６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（第一のプライマー）と、配列番号３４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（第二のプライマー）との組み合わせを用いた場合、３×１０^３コピー／ｔｅｓｔのＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを増幅できた。

実施例５ ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡの検出（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ使用、その２）
（１）ＮＳ３溶液を、０．０１％（ｗ／ｖ）コール酸ナトリウムおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＴＥバッファーを用いて３×１０^４コピー／２μＬとなるように希釈し、これをＤＮＡ試料とした。

（２）以下の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、前記（１）で調製したＤＮＡ試料２μＬを添加した。なおＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブを構成する、配列番号５４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、配列番号５３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのうち、ステムループ構造を形成させるため３’末端側に付加したオリゴヌクレオチドを「ＣＣＣＣＧＧＧ」から「ＣＣＣＧＧＧ」としたものである。

反応液の組成：濃度は後述の開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６５）
各０．３ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．７５ｍＭ ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
４．０ｍＭ ＩＴＰ
６７ｍＭ トレハロース
７５ｎＭ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ（配列番号５４、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託）
１．０μＭ 第一のプライマー（配列番号１１から２０および２２から２６のいずれか）
１．０μＭ 第二のプライマー（配列番号３４）
１．３３Ｕ ９６−７ ＤＮＡポリメラーゼ
１．４２Ｕ ＡＭＶ逆転写酵素
９５Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。

開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（２０μＬ中）の最終濃度
１９．０ｍＭ 塩化マグネシウム
８０．０ｍＭ 塩化カリウム
３．８％（ｗ／ｖ） Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
１０．５％（ｖ／ｖ） ＤＭＳＯ
（４）実施例３（４）と同様の方法で３０分間測定した。開始剤添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が２．８を超えた時間を検出時間とした。

結果を表３に示す。第一のプライマーが配列番号１１から２０および２２から２６のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、プライマーセットを用いることで、３×１０^４コピー／ｔｅｓｔのＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを増幅できた。

実施例６ ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡの検出（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブ使用、その２）
（１）ＮＳ３溶液を、０．０１％（ｗ／ｖ）コール酸ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＴＥバッファーを用いて３×１０^４コピー／２μＬ、３×１０^３コピー／２μＬまたは３×１０^２コピー／２μＬとなるように希釈し、これらをＤＮＡ試料とした。

（２）実施例５（２）に記載の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、前記（１）で調製したＤＮＡ試料２μＬを添加した。ただし前記組成のうち、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブを構成するオリゴヌクレオチドは配列番号５４または５５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（いずれもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに合成委託）を、第一のプライマーは配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、第二のプライマーは配列番号３２から４５のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブの濃度は、配列番号５４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合５０ｎＭであり、配列番号５５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの場合１００ｎＭである。

（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、実施例５（３）に記載の組成からなる開始剤８μＬを添加した。

（４）実施例３（４）と同様の方法で３０分間測定し、実施例５（４）と同様な方法で検出時間を求めた。

結果を表４に示す。第二のプライマーとして配列番号３５に記載の塩基配列（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列（ＮＳ３）のうち、１３３８番目から１３５５番目までの塩基配列）からなるオリゴヌクレオチドを用いた場合は、ＡＡＶ一本鎖ＤＮＡが３×１０^４コピー／ｔｅｓｔあっても増幅しなかった。一方、第一のプライマーが配列番号１６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３２から３４および３６から４５のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである、プライマーセットを用いることで、３×１０^２コピー／ｔｅｓｔのＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを増幅できた。なおＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブを構成するオリゴヌクレオチドとして、配列番号５５に記載の塩基配列（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列（ＮＳ３）のうち、１５６４番目から１５７９番目までの塩基配列の両末端にステムループ構造を形成させるためのオリゴヌクレオチド（５’末端側６塩基、３’末端側６塩基）を付加した配列）からなるオリゴヌクレオチドを用いた場合、プライマーセットによっては偽陽性が発生することから、当該プローブではＡＡＶ一本鎖ＤＮＡの特異的検出は困難といえる。

実施例７ 第一のプライマー長さの検討
（１）ＮＳ３溶液を、０．０１％（ｗ／ｖ）コール酸ナトリウムおよび０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを含むＴＥバッファーを用いて３×１０^４コピー／２μＬとなるように希釈し、これを一本鎖ＤＮＡ試料とした。

（２）実施例５（２）に記載の組成からなる反応液１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲチューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社製）に分注した後、前記（１）で調製したＤＮＡ試料２μＬを添加した。ただし前記組成のうち、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎプローブを構成するオリゴヌクレオチドは配列番号５４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、第一のプライマーは配列番号１６および２７から３０のいずれかに記載の配列からなるオリゴヌクレオチドまたは「ＣＴＣＣＡＴＣＡ（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列（ＮＳ３）のうち、１６３０番目から１６３７番目までの塩基配列の相補配列）」を、第二のプライマーは配列番号３４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いている。

（３）上記の反応液を４６℃で３分間保温後、実施例５（３）に記載の組成からなる開始剤８μＬを添加した。

（４）実施例３（４）と同様の方法で２０分間測定し、実施例５（４）と同様な方法で検出時間を求めた。

結果を表５に示す。第一のプライマーとして配列番号２７（プライマー長さ４３塩基）、２８（プライマー長さ３８塩基）、２９（プライマー長さ２８塩基）、３０（プライマー長さ２３塩基）、１６（プライマー長さ１８塩基）および３１（プライマー長さ１３塩基）のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、３×１０^４コピー／ｔｅｓｔのＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを増幅できた一方、「ＣＴＣＣＡＴＣＡ（プライマー長さ８塩基）」を用いたときは増幅できなかった。本結果より、第一のプライマーの長さ（ただし、５’末端側に付加するＴ７プロモーター配列は除外）は少なくとも１０塩基必要なことがわかる。

実施例８ 第二のプライマー長さの検討
第一のプライマーとして配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、第二のプライマーは配列番号３４および４６から５０のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたは「ＴＴＧＧＧＡＴＴ（配列番号５６に記載の塩基配列からなるＡＡＶベクター部分配列（ＮＳ３）のうち、１４２９番目から１４３６番目までの塩基配列）」を、それぞれ用いた他は、実施例７と同様な方法で測定した。

結果を表６に示す。第二のプライマーとして配列番号４６（プライマー長さ３８塩基）、４７（プライマー長さ３３塩基）、４８（プライマー長さ２８塩基）、４９（プライマー長さ２３塩基）、３４（プライマー長さ１８塩基）および５０（プライマー長さ１３塩基）のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いたときは、３×１０^４コピー／ｔｅｓｔのＡＡＶ一本鎖ＤＮＡを増幅できた一方、「ＴＴＧＧＧＡＴＴ（プライマー長さ８塩基）」を用いたときは増幅できなかった。本結果より、第二のプライマーの長さは少なくとも１０塩基必要なことがわかる。

Claims (6)

1. アデノ随伴ウイルスベクターの特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第一のプライマーと、前記特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第二のプライマーとからなる、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅するためのプライマーセットであって、
   第一のプライマーが、配列番号５８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号５９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、
   前記プライマーセット。
2. 第一のプライマーが、配列番号６０に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１０塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号６１に記載の塩基配列中、少なくとも連続する１０塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項１に記載のプライマーセット。
3. 第一のプライマーが、配列番号１１から３１のいずれかに記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
   第二のプライマーが、配列番号３２から３４および３６から５０のいずれかに記載の塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
   請求項２に記載のプライマーセット。
4. 第一または第二のプライマーのいずれか一方の５’末端側にＲＮＡポリメラーゼのプロモーターがさらに付加されている、請求項１から３のいずれかに記載のプライマーセット。
5. 請求項１から４のいずれかに記載のプライマーセットで増幅した、特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を、前記核酸の一部とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なプローブを用いて、アデノ随伴ウイルスベクターを検出する方法。
6. プローブを構成するオリゴヌクレオチドが、配列番号５１もしくは５２に記載の塩基配列またはその相補配列とストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。